Усовершенствование технологий производства вакцин против бешенства животных тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Красуткин, Сергей Николаевич

• Красуткин, Сергей Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Красуткин, Сергей Николаевич

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Бешенство животных: этиология, распространенность и средства профилактики.*.

2.1.1. Этиология и распространенность бешенства животных.

2.1.2. Средства профилактики.

2.2. Биотехнология производства противовирусных вакцин.

2.2.1. Питательные среды и ингредиенты, используемые при культивировании вирусов.

2.2.2. Технологические процессы культивирования вирусов.

2.2.3. Методы и средства инактивации и концентрирования вирусов.

2.2.4. Защитные среды, используемые при производстве лиофилизированных противовирусных вакцин.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Усовершенствование технологий производства вакцин против бешенства животных»

Биологическая промышленность является отраслью агропромышленного комплекса, призванной обеспечить животноводство средствами специфической профилактики против инфекционных заболеваний животных и птиц.

Постоянное повышение качества вакцин и эффективности их производства, с осуществлением технического и технологического перевооружения, является актуальной задачей. Это позволяет повысить надежность и экологическую безопасность работы предприятий. Внедрение новых и усовершенствование существующих технологий при промышленном производстве биопрепаратов требует решения не только биологических, но и экономических вопросов.

Качеству биопрепаратов отводится значительное место в обеспечении ветеринарного благополучия животноводства по многим инфекционным болезням, которые продолжают наносить существенный экономический ущерб во многих странах мира, включая Россию. К таким заболеваниям относится бешенство животных.

Наибольшее распространение этой инфекции отмечено на территориях Поволжского, Северо-Кавказского, Центрально-Черноземного округов, а также в Центральном, Волго-Вятском, Уральском и Западно-Сибирском регионах Российской Федерации.

В настоящее время для профилактики бешенства животных в России и странах СНГ применяют инактивированные моновакцины, которые получают на основе роллерного культивирования культуры клеток ВНК 21/13 и репродукции в ней вируса бешенства из штамма "Щежово-51".

Основными компонентами биотехнологического процесса изготовления выпускаемых препаратов являются: биологический агент, субстрат, целевой продукт, аппаратура и совокупность методов для управления процессом. Конечным критерием любой промышленной биотехнологии является биологическая активность и себестоимость целевого продукта.

Существующая технология производства вакцины против бешенства животных, созданная B.C. Ивановым и П.П. Кузнецовым в 70-х гг., требует усовершенствования с учетом современных достижений биотехнологии, особенностей конструирования питательных сред, методов культивирования клеток и вирусов, а также необходимости применения новой аппаратуры .

Цель и задачи исследований

Целью работы являлось усовершенствование существующей промышленной технологии производства вакцины против бешенства животных из штамма "Щелково-51" сухой культуральной, вакцины против бешенства кошек и собак "Рабикан", инактивированной жидкой культуральной вакцины "Рабиков" с использованием современных методов исследования, оборудования и технических средств контроля, включая стадии приготовления питательных сред, культивирования, концентрирования и приготовления защитных сред.

В ходе проведения исследований по разработке современной промышленной технологии производства вакцины против бешенства животных из штамма "Щелково-51" решались следующие задачи:

- усовершенствовать технологию изготовления питательной среды и найти эффективное соотношение ингредиентов, входящих в ее состав (среда Игла, среда 199, сыворотка крови крупного рогатого скота, ферментативный гидролизат мышечных белков (сухой);

- усовершенствовать процесс роллерного культивирования вируса бешенства штамма "Щелково-51";

- разработать метод получения вирусного посевного материала;

- подобрать сыворотку крови животных с высокими ростовыми свойствами;

- провести сравнительные исследования по определению титра ин-фекционности титра вируса бешенства штамма "Щелково-51" при культивировании в разных временных режимах;

- разработать методы концентрирования и режимы инактивации вирусной суспензии при конструировании антирабических вакцин;

- усовершенствовать защитную среду, используемую при производстве лиофилизированных антирабических вакцин;

- апробировать новый метод культивирования клеток ВНК 21/13 и вируса бешенства штамм "Щелково-51" с помощью клеточной фабрики фирмы "Nunc".

Научная новизна

Предложена новая рецептура и технология изготовления питательных сред с улучшенными ростовыми свойствами для культивирования клеточной культуры и вируса бешенства. Оптимизированы условия роллерного культивирования вируса бешенства штамм "Щелково-51". Подобрана сыворотка крови крупного рогатого скота с высокими ростовыми свойствами. Определена зависимость инфекционной активности вируса бешенства штамм "Щелково-51" от времени культивирования.

Разработаны методы и режимы инактивации вирусной суспензии при конструировании вакцин против бешенства животных, а также методы концентрирования вирусной суспензии при конструировании жидкой антираби-ческой вакцины с использованием ГОА и метода ультрафильтрации.

Разработана новая защитная среда дня производства лиофилизированных антирабических вакцин на основе замены сахарозы, позволяющая снизить себестоимость конечного продукта.

Для культивирования вируса бешенства испытана с целью внедрения в технологический процесс изготовления антирабических вакцин клеточная фабрика фирмы "Nunc".

Научная новизна исследований и технологических решений подтверждена положительным решением на изобретение "Способ получения анти-рабических вакцин" № 2001134269.

Практическая значимость работы

Усовершенствована промышленная технология изготовления инакти-вированных лиофштизированной и жидкой вакцин против бешенства животных из штамма "Щелково-51".

Результаты исследований и технологические решения вошли в следующие нормативно-технические документы, которые рассмотрены и утверждены в установленном порядке:

1. Регламент по изготовлению сухой инактивированной культуральной антирабической вакцины из штамма "Щелково-51" (Приложение 1).

2. Регламент по изготовлению сухой инактивированной культуральной антирабической вакцины из штамма "Щелково-51" для собак и кошек (Рабикан) (Приложение 1).

3. Регламент по изготовлению жидкой инактивированной культуральной антирабической вакцины из штамма "Щелково-51" (Рабиков) (Приложение 1).

4. Методические рекомендации по концентрированию вирусной суспензии при конструировании жидкой антирабической вакцины (Приложение 2).

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и получили положительную оценку на:

- научно-производственном совете межотраслевой лаборатории по разработке и внедрению новых технологий ВНИТИБП и ФГУП "Щелковский биокомбинат" ( Щелково, 2000г.);

- II-ой Конференции "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" (Новосибирск, 2002).

Положения, которые выносятся на защиту:

- результаты испытания предложенных рецептур ростовой и поддерживающей сред при роллерном культивировании вируса бешенства штамм "Щелково-51";

- результаты исследований по усовершенствованию производственного процесса роллерного культивирования;

- результаты разработки метода получения вирусного посевного материала;

- результаты сравнительной оценки инфекционной активности вируса бешенства штамм "Щелково-51" при культивировании в разных временных режимах;

- методы концентрирования вирусной суспензии при конструировании жидкой и лиофилизированной антирабических вакцин;

- методы и режимы инактивации вируса бешенства при производстве антирабических вакцин;

- результаты исследований по применению усовершенствованной защитной среды при производстве лиофилизированных антирабических вакцин;

- результаты исследований по культивированию вируса бешенства штамм "Щелково-51" в клеточных фабриках фирмы "Nunc".

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Красуткин, Сергей Николаевич

5. ВЫВОДЫ

1 .Экспериментально обоснованы соотношения ингредиентов и разработана технология конструирования питательных сред для крупномасштабного (или промышленного) культивирования клеток ВНК 21/13 и вируса бешенства штамм "Щелково-51" при производстве антирабических вакцин.

2.Разработан и внедрен в производство новый способ получения вирусного посевного биоматериала при помощи термообработки с целью получения термостабильной вирусной популяции, где преобладают наиболее устойчивые полноценные вирионы.

3.Предложены эффективные способы концентрирования вируса бешенства на основе сорбции его на гидроокиси алюминия, а также с помощью ультрафильтрации на полых волокнах при промышленном производстве жидких и сухих антирабических вакцин. Показано, что применение указанных методов концентрирования вирусного антигена обеспечивает сохранение его антигенной и иммуногенной активности, снижение затрат времени и себестоимости конечного продукта при производстве вакцин против бешенства животных.

4.Разработан и внедрен в производство метод инактивации вируса бешенства с использованием отечественного препарата димера этиленимина в конечной концентрации 0,03%. Показана его экономическая и биологическая целесообразность использования вместо В-пропиолактона при промышленном производстве антирабических вакцин.

5.Предложена измененная рецептура защитной среды на основе замены в ее составе сахарозы на лактозу, что позволило сохранить качество вакцины (антигенные и иммуногенные свойства) при снижении себестоимости конечного продукта.

6.Для совершенствования биотехнологического процесса культивирования клеток ВНК- 21/13 и вируса бешенства апробированы и внедрены в

107 производство многоярусные клеточные фабрики фирмы «Nunc» (Дания). В сравнительных исследованиях показаны преимущества этого оборудования для культивирования клеток ВНК-21/13: индекс пролиферации в 1,5 раза выше по сравнению с роллерным культивированием.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1.Полученные результаты позволили предложить и внедрить в производство оптимальные соотношения ингредиентов при конструировании питательных сред и новую рецептуру среды высушивания при лиофилизации вирусного антигена против бешенства.

2.Разработан метод получения вирусного посевного материала, который заключается в следующем: первично репродуцируемый вирус подвергают термической обработке до сохранения им в обрабатываемой популяции 0,001-0,0001% интрацеребральных мышиных ЛД50, а полученную вируссо-держащую суспензию, содержащую термостабильные вирусные частицы, используют для инфицирования культуры клеток ВНК-21.

3.При получении инактивированной вирусной суспензии внедрен в производство метод инактивации с помощью отечественного препарата ди-мера этиленимина.

4.Разработаны и внедрены в производство методы концентрирования вируса бешенства на основе сорбции его на гидроокиси алюминия и с помощью ультрафильтрации на полых волокнах при производстве жидких и сухих антирабических вакцин.

5.Для повышения эффективности культивирования клеточной культуры ВНК 21/13 и репродукции вируса апробированы стационарные многоярусные клеточные фабрики фирмы «Nunc» (Дания).

6.На основании изменений, внесенных на различных этапах изготовления антирабических вакцин из штамма 'ТЦелково-51", разработаны и утверждены "Регламент по изготовлению и контролю вакцины антирабической из штамма "Щелково-51" инактивированной жидкой культуральной "Рабиков", «Методические рекомендации по концентрированию вирусной суспензии при конструировании жидкой антирабической вакцины», «Регламент по изготовлению и контролю вакцины антирабической из штамма «Щелково-51»

2.3. Заключение

Обзор литературы и эпизоотологический мониторинг подтверждают, что бешенство животных остается одной из актуальных проблем в инфекционной патологии животных и человека.

Распространенность этой инфекции отмечена на территории Поволжского, Северо-Кавказского, Центрально-Черноземного округов РФ, а также в Центральном, Волго-Вятском, Уральском и Западно-Сибирском регионах Российской Федерации.

Для специфической профилактики бешенства в ветеринарной практике применяют инактивированные и живые вакцины.

Со времени изготовления Пастером в 1884 г. первой вакцины против бешенства, которая представляла собой взвесь тканей мозга кроликов и содержала в своем составе живой вирус, появилось множество модифицированных препаратов. Наиболее популярными оказались инактивированные вакцины типов Ферми (1908) и Семпл (1911), а в период с 1949 г. по 1955 г. -живые аттенуированные вакцины. Начиная с 1956 г. живые или инактивированные вакцины готовили из штаммов вируса бешенства, адаптированных к культуре клеток.

В нашей стране в 1962 г. началась активная экспериментальная работа по созданию инактивированной клеточно-культуральной антирабической вакцины из штамма Внуково-32 под руководством Селимова М.А. Однако, из-за низкой иммуногенности неконцентрированной клеточно-культуральной вакцины, а также множества недостатков энцефалитогенных вакцин, в 1972 г. была начата работа по разработке технологии изготовления, методов контроля, стандартизации и внедрения в промышленное производство и ветеринарную практику более эффективных безвредных антирабических вакцин под руководством Кузнецова П.П. и Иванова B.C.

Антирабические вакцины, которые разрабатывались под руководством вышеназванных авторов, должны были быть безопасны и высокоэффективны для животных, обладать защитной способностью при введении животным уже инфицированным ВБ, быть простыми в изготовлении и стабильными при длительном хранении.

Несмотря на то, что в настоящее время созданы эффективные вакцины против бешенства животных, технология их изготовления в условиях промышленного производства требует постоянного совершенствования. Это обусловлено тем, что, благодаря достижениям современной биотехнологии, стало возможным использование новых технологических решений, новых методов культивирования клеточных культур и вирусов, принципиально новых подходов к отдельным этапам технологического цикла получения готового продукта.

Применительно к созданию вакцин против бешенства, требуют совершенствования такие технологические процессы, как конструирование питательных сред для крупномасштабного культивирования клеточных культур и вируса бешенства, оптимизация условий инактивации и концентрирования вирусной суспензии, а также условий высушивания - с сохранением антигенной и иммуногенной активности вакцинных препаратов. Именно эти задачи и решались нами в настоящей работе при создании высокоэффективных антирабических вакцин нового поколения.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. Материалы и методы

Основной объем исследований при выполнении настоящей работы проведен в 1994-2001 гг. на Федеральном Государственном Унитарном предприятии "Щелковский биокомбинат" в соответствии с научно-производственной программой и производственным планом выпуска биологической продукции соответствующей требованиям ТУ.

Краткая характеристика объекта исследований

В качестве объектов исследования были взяты основные технологические процессы производства вакцины аятирабической сухой инактивирован-ной культуральной из штамма "Щелково-51", вакцины антирабической сухой инактивированной культуральной из штамма "Щелково-51" для собак и кошек (Рабикан), вакцины антирабической жидкой инактивированной культуральной из штамма "Щелково-51" (Рабиков):

- стадия конструирования питательных сред;

- роллерное культивирование вируса бешенства;

- подбор сыворотки крови животных с высокими ростовыми свойствами;

- определение титра инфекционности вируса бешенства при культивировании в разных временных режимах;

- концентрирование вирусной суспензии и инактивирование вируса при конструировании жидкой антирабической вакцины;

- приготовление защитной среды для производства лиофилизирован-ной вакцины;

- новый метод культивирования культуры клеток и вируса бешенства с помощью клеточной фабрики "Nunc".

Штамм

При проведении исследований использовали производственный штамм Fixedrabies virus "Щелково-51", который в лиофштизированном виде в ампулах получали из ВГНКИ с паспортом, характеризующим свойства штамма: вид, род, семейство, преобладающий тропизм, восприимчивых животных, гемагглютинирующие свойства, серологическую характеристику, антигенную активность, основные условия хранения.

Требования безопасности

Научные исследования проводили в соответствии с "Правилами техники безопасности, производственной санитарии и санитарно-противоэпидемического режима для предприятий по производству бактерийных и вирусных препаратов", утвержденными Минздравом СССР 30.08.1979 года и "Правилами безопасности производственной санитарии, охранно-карантинного и ветеринарно-санитарного режимов на предприятиях биологической промышленности", утвержденными Главным управлением ветеринарии Госагропрома СССР от 14.07.1989 года.

Безопасность труда соответствовала требованиям ГОСТ 12.1.008, обеспечивалась производственным процессом по ГОСТ 12.3.002, производственным оборудованием по ГОСТ 12.2.003, средствами защиты персонала по ГОСТ 12.4.011, а также организацией обучения персонала безопасности труда по ГОСТ 12.004.

Процессы и технологическое оборудование

Ростовую и поддерживающую питательные среды готовили в химических реакторах фирмы "Спейтттим" с рабочими объемами 1400 л (фото 1), Стерилизацию питательных сред проводили методом холодной стерилизации: сначала осуществляли предварительную фильтрацию при помощи фильтродержателя типа "Кофрам" (фото 2) с пластинами EKS, затем - стерилизующую фильтрацию с помощью фильтродержателя дискового Д 293 мм фирмы "Миллипор" с мембранными пластинами фирмы "Pall" тип NRG с размерами пор 0,2 мкм. В работе использовали воду, очищенную на установке М 12 и "Super Q" (фото 3).

Культивирование вакцинного штамма фиксированного вируса бешенства "Щелково-51" осуществляли роллерным методом в нержавеющих роллерах отечественного производства: диаметр колеса - 160-165 см, количество ячеек - 110 шт (в каждой ячейке имеется фиксатор в виде прижимной пружины), скорость вращения колеса 8-12 об/час (фото 4) или использовали клеточные фабрики "Nunc" (фото 5). Культивирование осуществлялось в термальном боксе при t =

Концентрирование вируссодержащего сырья при необходимости проводили методом ультрафильтрации на установке УВА-200 (фото 6).

Питательные среды, растворы, реактивы и реагенты

В исследованиях были использованы следующие вирусологические питательные среды:

-питательная среда сухая стерильная Игла (ВМЕ); -питательная среда сухая стерильная 199 М.

Культура клеток

В работе использовали паспортизованную культуру клеток почки сирийского хомячка ВНК-21, поддерживаемую во Всероссийском научно

Фото 1. Химический реактор фирмы "Спейшим" емкостью 1400 л.

Фото 2. Фильтр "Кофрам" для стерилизующей фильтрации питательных сред.

Фото 3. Установка для очистки воды "Super Q".

Фото 5. Просмотр культуры клеток ВНК-21/13 под микроскопом. Слева клеточная фабрика фирмы "Nunc". исследовательском и технологическом институте биологической промышленности МСХ РФ. Культивирование клеток проводили в течение 5-ти последовательных пассажей с 2-4 дневным циклом при посевной дозе в каждом пассаже 100-120 тыс. кл/мл. После 5-го пассажа осуществляли подсчет среднего значения индекса пролиферации (ИП) и количества жизнеспособных клеток.

Приготовление основного раствора Хэнкса

Для приготовления раствора, содержащего неорганические соли, глюкозу, феноловый красный,использовали реактивы следующей квалификации:

- натрий хлористый - "хч", ГОСТ 4233-77;

- калий хлористый - "хч", ГОСТ 4568-83;

- кальций хлористый 6-водный - "хч", ГОСТ 4460-77;

- магний хлористый 6-водный - "хч", ГОСТ 4209-77;

- магний сернокислый 7-водный - "хч", ГОСТ 4523-77;

- натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - "хч", ГОСТ

-4172-76;

- калий фосфорнокислый однозамещенньтй - "хч", ГОСТ 4198-75;

- бикарбонат натрия - "хч", ГОСТ 4201 -79;

- глюкоза кристаллическая безводная - 'Чда", ГОСТ 6038-79;

- феноловый красный - ТУ 6-09-07-1451-85.

Физико-химический контроль сухих стерильных вирусологических питательных сред и растворов

Контроль осуществляли в соответствии с "Методическими рекомендациями по контролю качества вирусологических питательных сред" по следующим показателям: внешний вид, цвет, запах, растворимость, концентрация ионов водорода, буферная емкость, прозрачность, массовая доля влаги, содержание хлоридов, содержание глюкозы, содержание аминного азота.

Определение внешнего вида, цвета и запаха Внешний вид, цвет и запах оценивали органолептически.

Определение растворимости Растворимость сухих стерильных питательных сред определяли в соответствии с требованием ГФ XI изд., вып. 1, С. 177. Для этого навеску сухой стерильной питательной среды вносили во флакон вместимостью 500 мл и доводили объем среды очищенной водой до 400 мл, герметично закрывали резиновой пробкой и энергично встряхивали в течение 20 мин при температуре 20±2°С. Растворимость препарата определяли визуально в проходящем свете.

Определение показателя концентрации ионов водорода (рН) Определение показателя концентрации ионов водорода (рН) проводили в соответствии с требованием ГФ XI изд., вып. 1, С. ИЗ на рН-метре типа рН-121, диапазон измерения рН 4-9 ед. рН, погрешность измерения рН 0,05 ед. рН.

Определение буферной емкости К 40 мл свежеприготовленной питательной среды добавляли 0,1 М раствор гидроокиси натрия до изменения рН на 1 ед. рН.

Определение прозрачности Прозрачность определяли на нефелометре типа НФР (фильтр №4), согласно инструкции по эксплуатации прибора.

Определение массовой доли влаги Определение массовой доли влаги осуществляли методом высушивания в соответствии с требованиями ГФ XI изд., вып. 1, С. 176 и ГОСТ 2406189.

Определение содержания хлор-иона 0,2 мл питательной среды помещали в колбу вместимостью 50 мл, прибавляли 5 мл раствора нитрата серебра в концентрации 0,01 моль/л и 1 мл концентрированной азотной кислоты, осторожно нагревали с использованием асбестовой сетки до кипения. К испытуемому раствору добавляли по каплям насыщенный раствор калия перманганата до бледно-розового окрашивания, не исчезавшего в течение 5 мин. Далее прибавляли глюкозу (около 10 мг) до исчезновения окраски. После охлаждения раствора, избыток ионов серебра титровали раствором аммония роданида в концентрации 0,01 моль/л до образования розового окрашивания (индикатор - железо-аммонийные квасцы). Параллельно проводили контрольный опыт, используя очищенную воду. Содержание хлор-иона в исследуемом растворе ( X ) в процентах вычисляли по формуле:

Х- ( А - В ) • К • 0,000355 • 100 /С, где А - количество раствора роданида аммония, пошедшее на титрование контрольной пробы, мл;

В - количество раствора роданида аммония, пошедшее на титрование исследуемой пробы, мл;

К - поправка к титру раствора роданида аммония; 0,000355 - количество хлор-иона, соответствующее 1 мл раствора аммония роданида в концентрации 0,01 моль/л, г; С - объём анализируемого образца, мл; 100 - коэффициент пересчёта г в %.

Определение аминного азота формольным титрованием В стакан, вместимостью 50 мл, вносили 10 мл анализируемого раствора среды, добавляли 15-20 мл очищенной воды и доводили рН смеси до 7,0 ед. рН раствором натрия гидроксида или серной кислоты. К нейтрализованному раствору добавляли 2 мл формольной смеси, перемешивали и при постоянном перемешивании потенциометрически титровали раствором натрия гидроксида в концентрации 0,1 моль/л до рН 8,5 ед. рН. Содержание аминного азота в исследуемом образце (XI) вычисляли по формуле: XI =У -К -0,0014- 100/С, где V- количество раствора натрия гидроксида, израсходованного на титрование исследуемого образца, мл;

К - поправочный коэффициент к титру раствора натрия гидроксида; 0,0014 - количество азота, эквивалентное 1 мл 0,1 моль/л раствора натрия гидроксида, мг;

С - объём анализируемого образца, мл;

Определение содержания глюкозы 3,0 г трихлоруксусной кислоты количественно переносили в мерную колбу и доводили объем очищенной водой до 100 мл. В пробирку наливали 0,9 мл 3%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и вносили в нее 0,1 мл исследуемой среды. Центрифугировали смесь с частотой вращения 1000 об/мин. К 0,5 мл центрифугата добавляли 4,5 мл о-толуидинового реактива. Пробирку помещали в кипящую водяную баню на 3 мин, далее охлаждали при комнатной температуре (18-20°С). Оптическую плотность определяли на спектрофотометре при длине волны 625 нм в кювете с величиной поглощающего света 10 мм. По калибровочному графику находили содержание глюкозы в исследуемом образце. Калибровочный график строили, используя данные оптической плотности стандартного раствора глюкозы с концентрацией 100 мг%. Содержание глюкозы (Сопыт,мг%) определяли по формуле: Сопыт = Сет • Доп / Дет, где Сет - концентрация глюкозы в калибровочном растворе, мг%; Допыт - оптическая плотность исследуемого образца; Дет - оптическая плотность стандартной пробы.

Контроль биологических свойств вирусологических питательных сред

Определение ростовой активности ВПС на культуре клеток ВНК-21/13 Оценку ростовой активности питательной среды проводили путем пассирования тест-культуры клеток на испытуемой и контрольной сериях среды в течение пяти последовательных пассажей с учетом индекса пролиферации культуры, морфологии клеточной популяции и сроков образования монослоя. В качестве контрольной серии использовали питательную среду, ранее прошедшую испытания и отвечающую требованиям соответветствующей документации - фармакопейной статьи. От каждой серии питательной среды независимо от объема отбирали по две случайные фасовки по 0,5 л. Пересев клеточного материала проводили на 3-4 сутки роста, когда сформировывался сплошной монослой. Ежедневно с помощью инвертированного микроскопа проводили анализ монослоя, оценивали состояние клеточного пласта и морфологию клеток в культуре. Жизнеспособные клетки должны иметь четкие границы и четкую структуру. Клеточный монослой должен быть представлен клетками, сохраняющими типичные морфологические черты используемой линии, без дегенеративных изменений, симпластов и т.д.

Клетки культивировали в среде с добавлением 10% или 5% сыворотки крови. При проведении исследований использовали сыворотки крови крупного рогатого скота производства ВНИИЗЖ г. Владимир, Омского биокомбината, Конотопского мясокомбината, Ленинградского ООО "Биолог", а также - сыворотки крови суягных овец, плодов овец и сыворотку крови северных оленей.

Культуру клеток перевивали бесцентрифужным методом после формирования сплошного монослоя. Для снятия клеток со стекла в каждую бутыль после удаления питательной среды вносили 20-25 мл 0,25% раствора трипсина. Бутыли помещали в роллерные аппараты и вращали в течение 10-15 минут до полного отделения клеток от стекла. Снятые клетки ресуспендировали в 50-100 мл среды до получения гомогенной суспензии. Каплю клеточной суспензии из пипетки помещали на край покровного стекла камеры Горяева так, чтобы суспензия под действием капиллярных сил проникла в камеру подсчета. Подсчет клеток в камере Горяева проводили при 70-кратном увеличении микроскопа.

Концентрацию клеток в 1 мл (С) определяли по формуле: О а• 2 * 1111 -В, где С - общее количество клеток; а - количество клеток в камере Горяева;

В - объем суспензии, мл; 1111- коэффициент пересчета;

2 - степень разведения.

Индекс пролиферации (ИП) определяли по формуле: ИП=Х/У, где X - конечная концентрация клеток, ют/мл;

У - концентрация клеток при посеве.

За результат испытания принимали среднее арифметическое значение ИП трех параллельных измерений.

Определение чувствительности культур клеток к вирусам

Образцы культуры клеток ВНК-21/13 заражали общепринятым методом и инкубировали в стандартных условиях при температуре 37°С до момента появления цитопатических изменений. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в lg ТЦ Д 5 О/мл.

Определение стерильности вирусологических питательных сред Стерильность готовых вирусологических питательных сред определяли в соответствии с ГФ XI вып. 2, С. 187 методом прямого посева на тиогли-колевую питательную среду, пробирки с МПБ, МПА, МИНЬ. Инкубирование проводили при температуре 20-22°С и 36-37°С. Результаты учитывали в течение 14 суток инкубирования. Через каждые сутки и по окончании инкубации визуально просматривали посевы на выявление признаков роста микроорганизмов (появление мутности, осадка, хлопьев и др. изменений). При обнаружении роста хотя бы в одной пробирке его подтверждали микроскопи-рованием мазков, окрашенных по Граму.

Контроль ВПС на отсутствие микоплазм Контроль на отсутствие микоплазм осуществляли в соответствии с методическими указаниями МУК 4.1./4.2.588-96.

Испытуемую питательную среду вносили по 0,5 мл в каждую пробирку со специфической средой, предварительно аттестованной на чувствительность к микоплазмам. Посев производили пипеткой вместимостью 1 мл столбиком от дна пробирки. Пробирки выдерживали 14 суток при температуре 37+1 °С. Просмотр производили на 7, 10, и 14 сутки, с целью выявления признаков наличия микоплазм (появление в первичном посеве опалесценции, слабого помутнения среды).

Реактивы и реагенты В процессе производства культуральных инактивированных антираби-ческих вакцин использовали: 0,25% раствор трипсина Дифко, 6% гидроокись алюминия (производства Щелковского биокомбината), димер этиленимина (производства ВНИИЗЖ г. Владимир), Р-пропиолактон (ФРГ).

Биологический контроль готовых препаратов Изготовленные серии вакцин контролировали на соответствие ТУ по следующим показателям:

- внешний вид - сухая пористая масса желтовато-коричневого цвета;

- наличие посторонней примеси, нарушение укупорки и трещин флаконов -не допускается;

- растворимость - при добавлении стерильной дистиллированной воды в объеме равной объему до сушки препарата, вакцина должна раствориться в течение 1-2 минут;

- массовая доля влаги - 1 -3%;

- контаминация бактериальной и грибковой микрофлорой (стерильность) -посевы вакцины на питательные среды не должны давать роста микрофлоры;

59

- безвредность - подкожное введение 10 мышам массой 11-15 г по 0,5 мл, восстановленной до исходного объема вакцины, не должно вызывать гибели животных в течение 14 суток. Допускается неспецифическая гибель 1-2 мышей (без клинической картины бешенства);

- иммуногенность - иммуногенную активность вакцины определяют объемным методом NJH на белых мышах. По этому методу сравнивают 50% конечное разведение (KP) используемой вакцины с 50% KP международной или национальной референс-вакцины. Испытуемая вакцина считается иммуногенной при индексе иммуногенности не ниже 0,3 для сухой анти-рабической вакцины и не ниже 1,0 для вакцины против бешенства собак и кошек "Рабикан" и жидкой культуральной инактивированной антирабиче-ской вакцины из шт. Щелково-51 "Рабиков".

Статистическая обработка результатов Результаты исследований обрабатывали статистически по методу И.П.

Ашмарина и A.A. Воробьева.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Красуткин, Сергей Николаевич, 2002 год

1. Авилов В.М., Седов В.А., Коломыцев С.А. и др. Необходим учет новых особенностей эпизоотологии бешенства // Ветеринария.-1998.-№6,-С.3-6.

2. Адаме Р. Методы культур клеток для биохимиков.-М.Мир, 1983.-246 с.

3. Аксенов С.И. Состояние воды и ее роль в динамике биологических структур: Автореф. дис. д-ра физ.- мат. наук. М.,1979. - 38 с.

4. Аксенов С.Н., Горячев С.Н., Берман Ф.Б., Бабаева И.П., Решетова И.С. Об золированной воде в высушенных микроорганизмах // Микробиология. 1978. - Т.47,- Вып.З. - С. 548-563.

5. Амелункоем Р., Мэдок Э. Жизнь микробов при высоких температурах: механизмы и молекулярные аспекты //Жизнь микробов в экстремальных условиях. М.: Мир, 1961 - С.248-321.

6. Андросов В.В., Клюкина Т.В., Алексеев Н.Г. Определение эвтектических температур сублимируемых материалов // Изв. ВУЗ, Химия и хим. технол. 1962. - Т.25.- №9. - С.1158-1159.

7. Аркадьева Э.А. Факторы, влияющие на жизнеспособность и свойства микроорганизмов при различных условиях хранения // Научн.докл. высш. шк. биол. наук 1963. - №4. - С. 93-105.

8. Бабкин М.В., Прохорятова Е.В., Гадзевич Д.В. Особенности эволюции эпизоотического процесса при бешенстве на Украине.// Тез. докл. Международной научно-практической конференции.- Покров, 2001. -С.21-25.

9. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. М.: Мир, 1989.-Т.1.- 692 с.

10. Бекер М.Е. Биотехнология микробиологического синтеза. Рига: Зи-натне, 1980,- С. 76-89.

11. Бекер М.Е. Обезвоживание микробной биомассы. Рига: Зинатне, 1971.-С.16.

12. Бекетт. Применение замораживания-высушивания в биологии,- М., 1956.- 387 с.

13. Березин И.В., Варфоломеев С.Д. Биокинетика.- М.: Наука, 1979.- С.77.

14. Биотехнология / Под ред. Академика Баева A.A. М.: Наука, 1984.309 с.

15. Биотехнология клеток животных / Под ред. Р.Д. Спиера и Дж.Б. Гриффита. М.:В.О. "Агропромиздат", 1989.-Т. 1.- 365 с.

16. Бирюков В.В., Кантере В.М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза. М.: Наука, 1985.-С.89-97.

17. Бланков Б.И., Клебанов Д.Л. Применение лиофилизации в микробиологии. М.: Медгиз, 1961.- 263 с.

18. Ботвинкин А.Д. Особенности эпидемиологии гидрофобии и экологии вируса бешенства в условиях преобладания очагов природного типа : Автореф. дис. д-ра мед. наук .- М.,1992.- 57 с.

19. Бронштейн В.Л. К механизму взаимодействия растущих кристаллов льда с биологическими структурами при замораживании // ДАН СССР, Сер. биол. 1978 - Т.238,- № 3 - С.722-725.

20. Бугаев М.К., Салимов Х.С., Нурмаматов X. Особенности эпизоотического бешенства в Узбекистане // Тез. докл. Международной научно-практической конференции. Покров, 2001. - С. 24-25.

21. Бучнев' К.Н., Керимбеков К.К., Смаковская Г.Г. и др. Эффективность инактивированной жидкой антирабической вакцины АЗВИ для разных видов животных // Пробл. Вет. иммунологии. М.,1985- С. 145-146.

22. Бучнев К.Н., Турсункулов Ш.Ж., Каримбеков К.К. и др. Усовершенствование методов изготовления высокоактивной сыворотки и иммунопрофилактики бешенства животных // Акт. проб, эпизоотологии .Казань, 1983.- С. 19-20.

23. Вагабов Р. М. Разработка и экспериментальное изучение сухой антира-бической вакцины, инактивированной гидроксиламином: Дис. канд. биол. наук,- М., 1969. С. 44-60.

24. Ванновский Т.Я. Производство и контроль препаратов в ветеринарии. -М., 1937.-111 с.

25. Ведерников В.А. Современная эпизоотология бешенства : Автореф. дис. . д-ра. вет. наук. М., 1988. - 33 с.

26. Ведерников В.А., Седов В.А. Пути повышения эффективности профилактики бешенства животных // Соврем, проблемы зоонозных инфекций: Тез. докл. Всесоюз. межведомств, конф. М.,1981.- С.44-46.

27. Виестур У.Э., Кристансон М.Ж., Былинкина Е.С. Культивирование микроорганизмов. М.: Пищевая промышленность, 1980.- 231 с.

28. Владимиров А.Г., Аллоярова Г.М., Чернов A.B. Методы высушивания // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии. 1965.- Ч.1.- С. 173.

29. Выржиковский И.А. О влиянии желудочного сока на яд бешенства // Архив вет. наук.- 1891.- отд.5 № 4-5 - С.103-144.

30. Гаврилюк Б.К., Рочев Ю.А., Николаева Т.Н. Культура клеток и реконструкция ткани (на примере кожи). Пущино, 1988.- С. 79-112.

31. Гендон Ю.З., Доссер Е.М., Рапопорт Р.И., Генкина Ф.Б. Вирусные инфекции и противовирусные препараты // Тр. Моск. НИИ вирусн. пре-пар.-М., 1965.-Т.З-С.16.

32. Горшкова Т.О., Недосеков В.В., Жестерев В.И., Лаптева О.Г. Технологические разработки инактивированной антирабической вакцины // Тез.докл. Международной научно-практической конференции. Покров, 2001. -С.57-59.

33. ГОСТ 26075-84. Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики бешенства. М.: Изд-во стандартов, 1984.- 9 с.

34. ГОСТ 28085-89. Препараты биологические. Метод бактериологического контроля стерильности.- М.: Изд-во стандартов, 1989.- 10 с.

35. Грибенча Л.Ф., Селимов М.А. Сравнительное изучение ret и патогенного признаков клеточно-культуральных штаммов вируса бешенства // Симпозиум по бешенству / Моск. научн.-исслед. Ин-т полиомиелита и вирусных энцефалитов. М., 1972. - С.43-46.

36. Грибенча C.B. Современные аспекты биологии и профилактики лисса-вирусных инфекций : Автореф. дис. д-ра. мед.наук. М.,1993.- 80 с.

37. Деркач Ю.С., Мясненко A.M. Некоторые аспекты прогнозирования потребности, состояния производства и разработки диагностических препаратов для вирусологических исследований. М.: Лаб. дело, 1982.- №3 - С. 42-46.

38. Долинов К.К. Научные основы производства вакцин и сывороток. М., 1955.-271 с.

39. Долинов К.К. Основы технологии сухих биопрепаратов. М.: Медицина, 1969.-231 с.

40. Доссер Е.М., Дорофеев В.М. Выращивание клеток почечной ткани обезьян макаки-резус глубинным методом // Вирусные инфекции и пртивовирусные препараты. М., 1961.- 232 с.

41. Дубровинский С. Б. Бешенство и борьба с ним в СССР. — М., 1926.129 с.

42. Дытверский Ю.Н. Обратный осмос и ультрафильтрация. М.: Химия, 1978.-352 с.

43. Дьяконов Л.П. Основные достижения и перспективы развития клеточной биотехнологии // Труды ВИЭВ. 1998.- Т.71.- С. 149-161.

44. Еремеев Г.В. Методы адсорбции // Вопросы медицинской вирусологии. -1949.- №2.- С.263.

45. Зибицкер Д.Е. Бешенство и его профилактика. М.: Урожай,1968.-С.76.

46. Иванов B.C., Самуйленко А .Я., Тетеричев В.И., Иванов И.В. Проявление иммуногенной потенции антирабической вакцины из штамма Щел-ково-51 в зависимости от места её введения // Тезисы конф. посвящ. 30-ти летию ВНИТИБП Щелково, 2000. - С. 33-36.

47. Иванов B.C. К вопросу о механизмах защиты центральной нервной системы от вируса бешенства // Тез. докл. науч. конф. "Современные проблемы рабиологии".- М.: Ин-т полиомиелита и вирусных энцефалитов, 1998. С.22-23.

48. Иванов B.C. К вопросу предэкспозиционной и постэкспозиционной иммунизации животных против бешенства // Тез. докл. Конф., поев. 100-летию открытия вируса ящура. Владимир, 1997. - С.188.

49. Иванов B.C. К вопросу профилактики бешенства с помощью инактиви-рованных культуральных антирабических вакцин из штамма Щелково-51 // Мат. 8-го Межд. конгресса по проблеме ветеринарной медицины мелких домашних животных. М., 2000. - С.275-276.

50. Иванов B.C. Некоторые принципы стандартизации технологии комбинированного применения антирабических вакцин и антител // Мат. 5-й конф. "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана",- М.: Изд. ВНИРО, 1999. С.144-146.

51. Иванов B.C. Перспективы совершенствования технологии изготовления культуральных инактивированных антирабических вакцин // Тез. докл. Всерос. науч. практ. конф. "Вирусные болезни с/х животных".-Владимир, 1995. - С.203.

52. Иванов B.C., Кузнецов П.П., Школьников Е.Э. Состояние и перспективы борьбы с бешенством животных и человека // Вестн. Российской академии с/х наук. 2000.- №3.- С.62-65.

53. Иванов B.C., Самуйленко А.Я. К вопросу защиты ЦНС от вируса бешенства и ее роли в этом процессе // Мат. Международной научно-практическ. конференции "Нейроинфекции".- Покров, 2001. С.53-56.

54. Иванов B.C., Хорьков И.А., Кузнецов П.П., Пименов Б.И., Бехтерев С.И. "Способ выращивания культур клеток" Патент РФ № 1182817, 15 апр. 1993, приоритет 12 янв. 1982.

55. Иванов B.C., Школьников Е.Э. Экстренная профилактика бешенства // Тез. докл. Всерос. конф. "Проблемы инфекционных и инвазионных болезней в животноводстве на современном этапе".- М.: Моск. ветерин. акад. им. К. И. Скрябина, 1999.- С. 134-135.

56. Калабеков М.И. Цикличность эпизоотического процесса бешенства животных на Северном Кавказе // Ветеринария. 1998.- №6. - С. 20-21.

57. Калунянц К.А., Голгер Л.И., Балашов В.Е. Оборудование микробиологических производств. -М.: Агропромиздат, 1987,- 398 с.

58. Караваев Ю.Д. Среды высушивания // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии. 1967.- №3.- С. 128.

59. Карпов А.М, Жуков В.Н., Улумнев A.A. Сублимационная сушка в биологической промышленности // Информ. Обзор / ОНТИТЭИ М., 1975,-С.75.

60. Ковалев H.A. Вопросы патогенеза и пути усовершенствования лабораторной диагностики и специфической профилактики бешенства // Ав-тореф. дис. . д-ра. вет. наук. Витебск, 1975. - 32 с.

61. Кузнецов П.П., Иванов B.C., Желтов В.В., Сафаров Р.К. Иммуноген-ность антирабических вакцин против фиксированного и уличного вируса бешенства // Актуальные вопросы ветер, вирусологии. Казань, 1980.- С.113-114.

62. Кузнецов П.П., Иванов B.C., Кузнецова C.B., Антирабическая вакцина из фиксированного штамма вируса бешенства, адаптированного к перевиваемой линии клеток ВНК-21 //21-й Всемирный ветер. Конгресс -M., 1979.-С.38.

63. Кузнецов П.П., Иванов B.C., Кузнецова C.B., Игнатьева B.C. "Штамм Fixedrabies virus Щелково-51 для производства антирабических вакцин" //ПатентРФ № 890591, 11 янв. 1993, приоритет 12 июля 1980.

64. Кузнецов П.П., Иванов B.C., Панов B.C., Соболев В.В., Алехин P.M., Таршис М.Г., Ивановский Э.В., Сафаров Р.К. "Вакцина для профилактики бешенства крупного рогатого скота" // Патент РФ № 955577, 22 апр. 1993, приоритет 3 марта 1981.

65. Кузнецов П.П., Таршис М.Г. Бешенство животных. М., 1981. - С.56.

66. Кузнецова C.B., Исаевич JI.B., Блехерман Б.Е., Кузнецов П.П., Иванов B.C. Получение очищенного и концентрированного культурального вируса бешенства // Вестн. с/х науки. 1981№ 6.- С.65-70.

67. Ламберт Дж., Берг Дж.Р. Среды для выращивания клеток // Биотехнология клеток животных. М.:Мир,1989. - С.98-138.

68. Лежнев Э.И. Теория и методы управляемого культивирования клеток животных и человека // Управляемое культивирование клеток. Пущи-но, 1983.-С.8-32.

69. Лихачев Н.В. Вакцины против бешенства // Биологические и химиоте-рапевтические ветеринарные препараты. М., 1963,- С. 28-38.

70. Медуницын Н.В. Вакцинология. -М., 1999.- С.14-23.

71. Морогова В.И., Селимов М.А., Аксенова Т.А. Поспелова H.A., Гильди-на С.С., Клюева Е.В. Инактивация культуральной антирабической вакцины УФ лучами // Вопр. вирусол. - 1974.- №4.- С. 422-425.

72. Нагасингхе Сампат. Эпидемиология и эпизоотология бешенства в Шри Ланка // Сборник научных статей молодых ученых Российской Федерации и зарубежья. - М., 1999.- С.182-185.

73. Нагасингхе Сампат. Эпизоотическая ситуация и совершенствование мероприятий по борьбе с бешенством в Шри-Ланка : Автореф. дис. . канд. биол. наук. М.,2000.- 19 с.

74. Назаров В.В. Бешенство // Вирусные болезни лошадей. М., 1973.-С.40-47.

75. Назаров В.П. Бешенство собак (к вопросу профилактических мероприятий) // Ветеринария 1952. - Т.5.- С.33-36.

76. Наумкина М.А. Разработка методов молекулярной гибридизации и по-лимеразной цепной реакции для идентификации вируса бешенства: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Покров, 1999. - 27 с.

77. Недосеков B.B. Разработка и совершенствование средств и методов оценки эффективности вакцин против бешенства : Автореф. дис. . канд. вет. наук. Покров, 1998,- 24 с.

78. Недосеков В.В., Романова У.Н., Куриннов В.В., Цыбанов Я.С., Тимошенко С.Г Сравнительная оценка лабораторных методов диагностики арктического бешенства //Сборник статей ВНИИВВиМ. Покров, 2000.-С. 157-160.

79. Недосеков В.В., Сливко И.А., Луницин A.B. и др. Разработка способа технологического контроля при производстве антирабических вакцин // Тез. докл. Международной научно-практической конференции. Покров, 2001. - С.59-61.

80. Нежута A.A. Экспериментальное обоснование и совершенствование промышленных режимов сублимационной сушки биопрепатов: Дис. . канд. техн. наук. Одесса, 1981. - 254 с.

81. Никитин Е.Е., Звягин И.В. Замораживание и высушивание биологических препаратов. М.: Колос, 1971. - 342 с.

82. Новиков О.Г., Кашко Л. С., Ухналей В. II. и др. Профилактика бешенства диких плотоядных // Ветеринария. 1996. - № 7. - С. 17-19.

83. Новохатский A.C. Тканевые и клеточные культуры в вирусологии и молекулярной биологии // Итоги науки и техники / Вирусология. -М.Д979.-Т.8.-С. 3-134.

84. Новохатский A.C. Ростовые факторы сыворотки и крови. Новые возможности получения и применения // Цитология. 1994.- Т.36,- №6 - С. 506.

85. Ночевный В.Т. Биологический контроль ростовой активности питательных сред и сыворотки крови животных // Тез. докл. Всесоюзн. конф. "Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток". -Новосибирск, 1991. С.46.

86. Островский Д.Н., Капрельянц A.C., Лукьянова М.А. Прикладные аспекты биохимии мембран // Прикл. биохимия и микробиол. 1963. -Т. 19.-Вып. 1,- С.60-77.

87. Панкратов В.П. Двухтактные культиваторы клеток // Управляемое культивирование клеток. Пущино, 1983. - С. 122-139.

88. Париж Б.М., Орлова Т.Г., Миронов В.А., Бакулина М.И., Селецкий М.А. Высушивание биологических препаратов. М.,1963.- С.39.

89. ЮО.Пермяков Е.А. Кооперативное замораживание внутримолекулярной подвижности белков // Равновесная динамика нативной структуры белка. Пущино, 1977. - С.83-99.

90. Ю2.Пинаев Г.П. Методы культивирования клеток // Научные труды ин-та цитологии АН СССР. Л.:Наука,1988. - 319 с.

91. ЮЗ.Пономарев А.П., Назаров H.A., Рыбаков С.С., Артамонов Т.Н., Михай-лина Н.М. и др. Совершенствование метода очистки и концентрирования вируса бешенства // Тез. докл. Международной научно-практической конференции. Покров, 2001. - С.49-51.

92. Почерняева Р.Я. и др. Вопросы вирусологии. 1990 - №5.- С.433.

93. Ю5.Прилепская Е.П., Анисимова Л.И., Недосеков В.В., Юрков С.Г. Культивирование вируса бешенства в культуре клеток ПС с низким содержанием сыворотки // Тез. докл. Международной научно-практической конференции. Покров, 2001. - С.66-68.

94. Юб.Простяков А.Н., Цыганкова С.И., Злобина Н.З., Кругликов В.А., Титова Е.Г. Разработка принципов и способов стабилизации вирусов // Тез. докл. 5 Всесоюзн. Ветеринарной вирусол. конф. Казань, 1980,- С. 128.

95. Рингерц Н., Сэвидж Р. Гибридные клетки. М.: Мир, 1979. - 416 с.

96. Романова У.Н. Эпизоотологические особенности и диагностика бешенства в республике Саха (Якутия): Дис. . канд. вет. наук.- 2000.- 145 с.

97. Рубан Е.А. Оптимизация и масштабирование процессов глубинного культивирования микроорганизмов и клеток животных с использованием методов системного анализа. Дис. . д-ра биол. наук. М., 1995.324 с.

98. Рубан Е.А., Кафаров Е.А. Модели структуры потоков многофазных систем // Инженерные проблемы микробиологического синтеза / Материалы Всесоюзной конференции по инженерии.- М., 1968.- С.132-137.

99. Рубан Е.А., Раевский A.A. Автоматизация процессов биосинтеза // Тезисы 21 Всемирного ветеринарного конгресса. 1980.- С.26-27.

100. Сафаров Р.К., Джмухадзе В.А., Кузнецов П.П., Иванов B.C. Эффективность сухой культуральной инактивированной антирабической вакцины ВНИТИБП в опытах на собаках // Передовой научно^ производственный опыт в биологической промышленности. М., 1978. -С.10.

101. Свет-Молдавская К.А. Экспериментальное изучение проницаемости слизистых оболочек носа и глаз для вируса уличного бешенства //Вопросы вирусологии. 1957.- № 6. - С.338-341.

102. Селимов М. А. Бешенство. М., 1978. - 318 с.

103. Селимов М. А., Фодор И. И., Грабко В. И. К проблеме генно-инженерной антирабической вакцины // Генно-инженерные и синтетические вакцины. Пущино, 1990. - С. 64-70.

104. Селимов М.А. Современные достижения в области рабиологии // Серия: эпидемиология, вирусология и инфекционные заболевания. М., 1987.-Вып.4,-С 32-36.

105. Селимов М.А., Аксенова Т.А., Клюева Е.В., Рахимова Ф.И. и др. Применение культуральной антирабической вакцины для лечебной иммунизации людей // Журн. микробиол. М., 1969. - №11. - С.63-69.

106. Селюк В.Н., Груничева Т.П., Черкес H.H., Кандудин Я.Г. Современная характеристика бешенства в Калиниградской области // Тез. докл. Международной научно-практической конференции. Покров, 2001. - С. 19-21.

107. Сергеев В.А., Орлянкин Б.Г. Структура и биология вирусов животных. -М.: Колос, 1983 335 с.

108. Славко И.А., Недосеков В.В., Хрипунов Е.М., Горшкова Т.Ф. и др. Изучение условий культивирования и инактивации вируса бешенства // Тез. докл. международн. научно-практической конференции. Покров, 2001.- С.68-70.

109. Соколов М.И. Центрифугирование. М.:Химия, 1976.- 407 с.

110. Справочник по применению бактерийных и вирусных препаратов // Под ред С.Г. Дзагурова, Ф.Ф. Резепова. М.: Медицина, 1975. - 224 с. ■

111. Струмиа Ф.М. Применение замораживания высушивания в биологии. - 1956. -С.182.

112. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В. и др. Диагностика вирусных болезней животных. М.: Агропромиздат, 1991. - С. 255-270.

113. Сюрин В.Н., Карелин В.П. Современные подходы к разработке противовирусных вакцин и диагностикумов // Ветеринария. 1984,- №6. -С.23-26.

114. Тетеричев В.И., Самуйленко А.Я. и др. Эпизоотическая ситуация по бешенству в Тульской и смежных областях Российской Федерации // Тез. докл. Международной научно-практической конференции "Нейроинфекции". Покров, 2001. - С. 10-13.

115. ИЗ.Тихоненко Т.И. Биохимия вирусов.- М.: Медицина, 1966. 295 с.

116. Тихоненко Т.И. Методические основы биохимии вирусов. -М. :Медицина, 1973. 384 с.

117. Товарницкий В.И. Молекулы и вирусы.- М.: Советская Россия,1978.-208 с.

118. Тутов И.К., Ситьков В.И. Основы биотехнологии ветеринарных препаратов. Ставрополь, 1997. - 133 с.

119. Файбич М.М. Стабилизация вакцинных препаратов в процессе высушивания и хранения // Докл. ВИЭВ, 1968. №2. - С.59-66.

120. Фисов И. Стратегическое управление. М.: Экономика, 1989.- 519 с.

121. Хрипунов Е.М., Жестерев В.И, Евсеева С.Д., Хукеров И.Ю., Сливко И. А. Бешенство диких животных, особенности его распространения. // Тез. докл. Международной научно-практической конференции "Нейроинфекции". Покров, 2001. - С.36-38.

122. Цвиль Л.А., Родина Л.В., Макенкова Г.М. Состояние эпидемической ситуации по бешенству на территории г. Москвы // Тез. докл. Международной научно-практической конференции "Нейроинфекции".- Покров, 2001. С.26-30.

123. Черкасский Б.Л., Кноп А.Г., Ведерников В.А. и др. Эпидемиология и эпизоотология бешенства на территории бывшего СССР // Журн. мик-робиол.-1995. № 2. - С.1-26.

124. Шврчек Ш. и др. Пероральная инфекция бешенства и перспективы пе-роральной иммунизации диких плотоядных животных // Вопросы мед. вирусологии : Тез. конф. М., 1975.- С.23.

125. Шевкокляе В.Н. Динамика эпизоотического процесса бешенства в Краснодарском крае // Тез. докл. Международной научно практ. конференции "Нейроинфекции". - Покров, 2001. - С. 17-19.

126. Шестопалов А. М., Рассадкин Ю. Н., Аксенов В. И., Устинова Е.И. Бешенство в Новосибирской области // Научн. конф. "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири и Дальнего Востока".- Новосибирск, 1998.- С.82-83.

127. Шестопалов A.M., Аксенов В. И., Рассадкин Ю. Н; Устинова Е. И. Обстановка по рабической инфекции в Новосибирской области // Журн. микробиол. 1999. - № 5. - С. 115-116.

128. Шестопалов A.M., Кисурина М.И., Груздев К.Н. Бешенство и его распространение в мире // Вопросы вирусологии. М., 2001.- Т.46.- С. 712.

129. A1-Qudah K., Al-Rawashdeh O.F., Abul-Majeed M., Al-Ani F.K. An epidemiological investigation of rabies in Jordan. // Acta Vet.- 1997. 12.-V.47. -P. 129-134.

130. Atanasiu P. Transmission de la rage par la vote res piratoire aux animaux de laboratoire // C.R. Acad. Sci. (Pans).- 1965.- P. 261, 277-279.

131. Aubert M. F. Costs and benefit of rabies control in wildlife in France // J. Wildl. Dis. 1999- Vol. 35. - N 4. - P. 687- 695.

132. Aubert M. F. Current status of animal rabies in France // Med. Trop. (Madr.). 1997. - Vol. 57. - Suppl. 3.- P. 45-51.

133. Babes M. Traite de la Rage // Bailliere et Fils. Paris, 1912.-P.44.

134. Bamard B.J.H., Voges S.F. A simple technique for the rapid diagnosis of rabies in formalin-preserved brain. //Onderstepoort J. Vet. Res. -1982. -Vol. 49. 4. - P. 193-194.

135. Barth R., Diderrich G., Weinmann E. NIH-test, a problematic method for testing potency of inactivated rabies vaccine // Vaccine.- 1988.- Vol. 6 1 4,-P.369-377.

136. Bhorgava A., Deshmiikh R., Ghosh Т.К. et al. Profile and characteristics of animal biles in India // J. Assoc. Phycns India.- 1996. Vol. 44, -1 1.- P. 3738.

137. Bingham J., Foggin C. M., Wandeler A. I., Hill F. W. The epidemiology of rabies in Zimbabwe // Rabies in dogs / J. Am. Vet. Med. Assoc.- 1999. -Vol.215-1 9.-P. 1276-1280.

138. Blancou J., Meslin F.-X. Modified live-virus rabies vaccines for oral immunization of carnivores // Laboratory Techniques in Rabies / 4-th Ed. WHO.-Geneva, 1996. P. 324-331.

139. Bourhy H., Kissi B., Audry L. et al. Ecology and evolution of rabies in Europe // J. Gen. Virol.-1999. Vol. 80.-1 10.- P. 2545-2557.

140. Bourhy H., Kissi B., Lofon M. et al. Antigenic and molecular characterization of bat rabies in Europe // J. Clin. Microbiol.- 1992. Vol. 30.-1 9. - P. 2419-2426.

141. Bourhy H., Kissi B., Tordo N. Molecular diversity of lyssavirus genus // Virology. 1993. - Vol. 194.-1 1. - P. 70-81.

142. Burrill P.M., Bemarolini L., Kleinan H.K. Effect of serum, fibropectin, and lumilin on adhesion of rabbit intestinal epithelial cells in culture. // J.Supromol. Struct and Cell Biochem. 1981.-Vol.16.-1 4,- P.385-392.

143. Carrel A. The method of tissue culture and its bearing on pathologic problems//Brit., Med. J. 1924. - Ml.-P. 140.

144. Cleaveland S. Epidemiology and control of rabies. The growing problem in Africa // Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 1998,- Vol. 92, 1 2.- P. 131134.

145. Constantine D.G. Recent advance in our knowledge of bat rabies // Proceedings of the 12-th Intern. Symp. on rabies .-Basel, 1966. P.251-255.

146. Cowley R., Healon P. R. Isolation of European bat lyssavirus in the U. K. // International Rabies Meeting: Abstracts.- Paris, 1997,- P. 403.

147. Debbie J. G., Abelselh M.K., Baer G. M. The use of commercially available vaccines for oral vaccination of foxes against rabies // Am. J. Epidemiol.-1972. Vol. 96,- 1 3. - P. 231-235.

148. Delpietro U. A., Russo R. G. Ecological and epidemiological aspects of the attacks by vampire bats and paralytic rabies in Argentina and analyses of the proposals carried out for their control // Rev. Sei. Tech. 1996. - Vol. 15,- 1 3.-P. 971-974.

149. Deschaux P. Neuro-immunologie: Le sisteme immunitaire est-il un Organe sensoriel //Arch. int. physiol. et biochim. -1988-96.-1 3,- P. 78-89.

150. Doherty Peter C., Zinhemagel Rolf M. Physiology or medicine unveiling an antiviral defense // Sei. Amer. 1997. -Vol. 276.-1 1.- P. 12-13.

151. Eagle H. Amino-acid metabolism in mammalian cell cultures // Scince.-1959.- P.432-437.

152. Edelsien K. M. Epidemiology and control of rabies // Trop. Anim. High Product. 1995.- Vol. 27,-1 3. - P. 155-163.

153. Fearneyhough G., Glark A. et al. Texas oral rabies vaccination program // International Rabies Meeting: Abstracts. Paris, 1997. - P. 503.

154. Fermi C. Die Empfindlichkeit der Muriden der Subcutanen Wutmfectiori gegenüber // Zbl. Bact. Orig. -1907. -1 43.- P. 173.

155. Fischer A. Biology of tissue cells.- New York, 1946. 121 p.

156. Flamand A., Coulon P., Lafay F. et al. Eradication of rabies in Europe // Nair. 1992,- Vol. 360.- 1 6400,-P. 115-116.

157. Fraser G. C., Honper P. T., Lunt R. A. et al. Encephalitis caused by a Lys-savirus in fruit bats in Australia // Emerg. Infect. Dis. 1996. - Vol. 2. - P. 327-331.

158. Fu Z. F. Rabies and rabies research: past, present and future // Vaccine. -1997.-Suppl. 15.-P. 20-24.

159. Fukkaya K. Rabies virus // Nippon Rinsho. 1997.- Vol. 55.-1 4. - P. 891896.

160. Gould A. R., Hyatt A. D., Lunt R. et al. Characterization of a novel lyssavi-rus isolated from Pteroid bats in Australia // Virus Res. 1998. - Vol. 54,- 1 2.-P. 187-265.

161. Ham R.G. Survival and grouth requirements of nontransformed cells // Tissue grouth factors / Ed. R. Baserga. Berlin,1981.- P. 13-88.

162. Ham R.G., Mc Keehan W.L. Media and growth requirements // Methods in Ensymology. New York: Academic Press, 1979. - Vol.58 - P.231-348.

163. Harris M., Collier K. Phenotiypic evolution of cells resistant to bromode-oxiderme // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1980,- Vol.77.- P. 4206-4210.

164. Hirst G. Adsorption of influenza virus on cells of respiratory tract // J. Exp. Med. 1943. - !78. - P.99.

165. John T. J. An ethical dilemma in rabies immunization // Vaccine. 1997. -Suppl. 15. - P. 12-15.

166. Kerkof P.P. Preparation of primary cultures of ovine thyroid gland cells // J. Tissue Cult. Meth. 1982,- Vol.7.- U.- P.23-26.

167. Koetgen F., Stewart C.L. Simple screening procedure to detect gene tag-geting events in embryonic stem cells // Methods in enzymology. 1993.-Vol.225.- P.878-890.

168. Koller B.H. Smithies 0. Altering genes in animals by gene targeting // Ann. Rev. Immunol. 1991.- Vol.10. - P.705-730.

169. Koprowski H. The mouse inoculation test // Laboratory techniques in rabies / 3-d ed.- Geneva, 1973,- P.85-93.

170. Krebs J. W, Smith J.S., Rupprechf C. E., Childs J. E. Rabies surveillance in the United States during 1997 // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1998. - Vol.213,-1 12.-P. 713-728.

171. Kruse P.P., Patterson M.K. Tissue culture methods and application.- Academic Press: New York, San Francisco, London, 1973.-Vol. 868,- P.101.

172. Linhart S.B., King R., Zamir S., Naveh U., Davidson M., Peri S. Oral rabies vaccination of red foxes and golden jackals in Israel: preliminary bait evaluation. // Rev. Sci. Off. int. Epiz. -1997,- Vol.16.- 13. P.874-880.

173. Lontai 1. The current state of rabies prevention in Europe // Vaccine. -1997. Suppl. 15.-P. 16-19.

174. Luekrajang T., Wangsar J. h Phanuphak P. Production of antirabies serum of equine origin I I Laboratory techniques in rabies. 1996.- P.401-403.

175. Lumio J., Hillbom M., Rome R. et al. Human rabies of bat origin in Europe //Lancet.- 1986. Vol. I. -1 8477. - P. 378. .

176. Masson E., Autherl M. F., Rolivel Y. Human contamination by bats for vaccinating foxes against rabies in France // Sante Publ. 1997. - Vol. 9.- 1 3.-P. 297-313.

177. Mathieu E. La rage vulpine en France // Bilan apres Trois and d'enzootie. Verne conference de la commission regionale de FOIL pour. l'Europe. Rapport 1 203. Prague Tchecoslov.- 1971.- P.21-24.

178. Mc Queen J.L. Rabies diagnosis special application of fluorrescent antibody techniques // Proceedings of the 63d annual Meeting if the U.S. Livestock Sanitary Association.- 1959.- P.356-363.

179. Melnick J.L. Tissue culture methods for the cultivation of poliomyelitis and other viruses // In: Diagnostic prosedures For virus and rickettsial diseases / 11-nd Ed. Am. Publ. Assoc.- New York, 1956. P. 139.

180. Michaels A.S. Ultrafiltration Membranes and Applications // A. Cooper Plenum.- New York, 1980. P.633-636.

181. Miller W. W. Review of reported rabies data in Europe // Rabies Bull. Eur. -1992.-1 4.-P. 19.

182. Morse S.S., Schluederberg A. Emerging viruses: the evalution of viruses and viral diseases // J. Infect. Dis.- 1990,- P.1-7.

183. Mothes T., Muhle W., Muller F., Schmidt W. The cells fetal intestine in tisT sue culture // Biomed. Biochim., Acta. 1985.-Vol.44.-1 4.-P. 561-571.

184. Muller W. W. Where do we stand with oral vaccination of foxes against rabies in Europe // Arch. Virol.- 1997.- Vol. 13.- Suppl. P. 83-94.

185. Murphy F.A. Rabies pathogenesis // Arch. Virol.- 1977.- Vol. 54,- 1 4,-P.279-297.

186. Neveu P. Cerebral neo-cortex modulation of immune functions // Life Science. 1988. - Vol. 42.- »20.- P. 1917-1923.

187. Owens O.H., Gey G.O., G'e'y M.K. A new method for cultivation of mammalian cells suspended in agitated fluid medium // Proc. Am. Ass. Cancer Res. 1953.-xl-P. 41.

188. Pashoret P.P. Epidemiology and control of fox rabies in Europe // Vaccine. 1999. - Vol. 17,-1 13-14. - P. 1750-1754.

189. Pashoret P.P. Evolution of fox rabies in Belgium and the European Union // Bull. Mem. Acad. Roy. Mid. Belg.- 1998. Vol.153.-1 1,- P. 93-99.

190. Pasteur L. Methode pour prevenir la rage apres morsure // C.R. Acad. Sci. (Pans), 1885,- P. 101, 765-772.

191. Perrin P., Jacob Y., Aguilar-Setin A. et al. Immunization of dogs with a DNA vaccine induces protection against rabies virus // Vaccine.-1996 Vol. 18.- 1 5-6. - P. 479-486.

192. Perry B.D. The oral immunization of animal against rabies // The Veterinary animal. 1989. - Vol.29.- P.37-47.

193. Quaroni A., May R. Establishment and characterization of intestinal epithe-lian cell cultures // Meth. Cell. Biol.- New York, 1980. Vol.21.- P.403-427.

194. Rahman A. Rabies prevention and control in India from a veterinary perspective // International Rabies Meeting / Abstracts.- Paris, 1997. P.504.

195. Rao G.L.N. Treatment of dogs, cats and other domestic animals with anti-rabies vaccine // Chest Med. Assoc. India. 1985.- Vol.63.-1 4,- P.280.

196. Renoux G., Renoux M., Biziere K. Brain neocortex and immunoregulate the expression of MHC antigens on mouse T lymphocytes // Immuno-pharmacol. and Immunotoxicol. 1988.- Vol.10.-1 2.- P.219-229.

197. Report of the fourth WHO consultation on oral immunization of dogs against rabies // Bull. WHO Rab. Res.- 1993.- P. 2-14.

198. Riipprecht С. E., Smith J. S., Krebs J. et al. Current tissues in rabies prevention in the United States // Publ. Health Rep.- 1996. Vol. 3. - P. 410433.

199. Rotivel Y., Gowdal M., Wirth S., Tsiang H. Rabies is a risk for traveling children // Arch. Pediatr. 1998,- Vol. 5,-1 5. - P. 561-567.

200. Schneider L.G., Cox J.H. Bat lyssavirus in Europe // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1994. - Vol. 187,-1 2.- P. 207-218.

201. Schneider L.G., Horzinek M., Matheka H.D. Purification of rabies vims from tissue culture. // Arch, fur gesamte virusforschung. 1971.- Vol. 34.-'4. -P. 351-359.

202. Schneider M.C., Almeida G. A., Souga L. M. et al. Rabies control in Brazil from 1980 to 1990 // Rev. Saude Publ.- 1996.- Vol. 30,- 1 2. P. 196-203.

203. Schneider M.C., Santos-Burgoo C., Aron J. et al. Potential force of infection of human rabies transmitted by vampire bats in Amazon region of Brazil // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1996. -Vol. 55,-1 6. - P. 680-684.

204. Seligmann E.B. The NIH test for potency // Laboratory techniques in rabies 3-th ed. Geneva, WHO. 1973. - P. 279-286.

205. Selimov M. A. Specific prophylaxis of rabies in USSR and Russia // International Rabies Meeting: Abstracts.- Paris, 1997. P. 602.

206. Selimov M. A., Marinina V.P., Nikitina L.F. Experimental respiratory infection induced by rabies virus variants adapted to tissue culture // Acha. Viral. 1968,- Vol. 113,-1 2. - P. 135-138.

207. Selimov M. A., Smekhov A.M., Antonova L. A. et al. New strains of rabiesT related viruses isolated from bats in Ukraine // Acta Virol. -1991. -Vol. 35. -1 3. P. 226-231.

208. Shill M., Baynes R.D, Miller S.D. Fatal rabies encephalitis despise appropriate post exposure prophylaxis. A case report // N Engi J. Med. -1987. -!5 P. 1257-1258.

209. Shope P.E. Arboviral infections and rabies // Preventive medicine. 1974.-Vol.3. - P.488-493.

210. Sing T. M., Son M. Y. Imaging findings in rabies // Australas. Radiol. -1996. Vol. 40. -1 3. - P. 338-341.

211. Skirvin R.M., Chu M.C., Mann et al. Plant Cell Reports.-1986,- Vol.5.- 1 4,-P.282-294.

212. Smith J. S. New aspects of rabies with emphasis on epidemiology, diagnosis and prevention of the disease in United States // Clin. Microbiol. Rev. -1996.-Vol. 9.- >2.-P. 166-176.

213. Smith J. S., Orciari L., Yager P. A. Molecular epidemiology of rabies in United States // Semin. Virol.- 1995.- Vol. 6.-1 4. P. 387-400.

214. Smith J. S., Summer L.V., Roumillat S.F., Winker W.G. Antigenic characteristics of isolates associated with a new epizootic of vaccine rabies in the United States // J. Infec. Diseases. 1984.- Vol.149.- P.769-774.

215. Smith J.S., Stiles C.D. Cytoplasmic transfer of the mitogente response to platelet derived growth factor // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1981.- Vol. 78. P. 4363 -4367.

216. Steel P. History of rabies // The Natural History of Rabies / Ed. G.M.Baer. -N.Y.: Academic Press, 1975,- P. 1-29.

217. Tissue culture: methods and applications // Ed. Kruse P.F. Petterson M.K. Jr. New York: Acad. Press, 1973. - P. 869.