Разработка технологии получения мяса in vitro и перспективы его использования тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.18.04, кандидат технических наук Волкова, Ирина Михайловна

• Волкова, Ирина Михайловна
• кандидат технических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат технических наук Волкова, Ирина Михайловна

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Понятие об искусственных продуктах питания. Искусственные мясопродукты

2.2. Культуральное мясо

2.3. Предпосылки для создания культурального мяса

2.4. Мышечные ткани

2.4.1. Гладкая мышечная ткань мезенхимного происхождения. Гладкий миоцит29

2.4.2. Химический состав мышечной ткани. Белки мышечной ткани

2.5. Культивирование клеток животных in vitro

2.6. Тканевая инженерия. Культивирование мышечной ткани in vitro

2.7. Мультипотентные мезенхимные стволовые клетки

2.7.1. Методы выделения ММСК из костного мозга и жировой ткани

2.7.2. Особенности морфологии и роста ММСК in vitro

2.7.3. Направленной дифференцировка ММСК в клетки мышечной ткани

in vitro

2.8. Заключение

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1.1. Материалы исследований

3.1.1.1. Приборы и оборудование

3.1.1.2. Культуральная посуда

3.1.1.3. Культуральные среды, растворы и реактивы

3.1.2. Методы исследований

3.1.2.1. Выделение ММСК из КМ КРС

3.1.2.2. Выделение ММСК из ЖТ КРС

3.1.2.3. Оценка морфологических особенностей ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС, в культуре

3.1.2.4. Анализ экспрессии поверхностных антигенов

3.1.2.5. Направленная дифференцировка ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС, в клетки костной и жировой тканей in vitro

3.1.2.6. Депонирование полученных культур клеток в Специализированную Коллекцию постоянных соматических клеточных культур (СХЖ РАСХН) ВИЭВ с последующим получением патентов

3.1.2.7. Получение клеток мышечной ткани in vitro посредством направленной дифференцировки ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС

3.1.2.7.1. Обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) для анализа полученных клеток мышечной ткани in vitro по продуктам мРНК генов-маркёров миогенеза: MYOD1 и MYOG

3.1.2.7.2. Полимеразная цепная реакция с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для оценки уровня экспрессии генов-маркёров миогенеза: MYOD1 и MYOG в полученных клетках мышечной ткани in vitro

3.1.2.8. Получение мяса in vitro

3.1.2.9. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот в полученной клеточной биомассе

3.1.2.9.1. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле (ПААГ)

3.1.2.9.2. Определение общего аминокислотного состава

3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЯ

3.2.1. Выделение колоний ММСК из КМ и ЖТ КРС

3.2.2. Морфо-культуральные характеристики полученных культур ММСК, выделенных как из КМ, так и из ЖТ КРС

3.2.3. Способность ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС, формировать колонии in vitro

3.2.4. Анализ экспрессии поверхностных антигенов-маркеров фенотипа ММСК90

3.2.5. Направленная дифференцировка ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС, в клетки костной и жировой тканей in vitro

3.2.6. Депонирование полученных культур клеток ММСК, выделенных из КМ и

ЖТ КРС

3.2.7. Получение клеток мышечной ткани in vitro путём направленной дифференцировки ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС

3.2.7.1. Сравнительный анализ способности ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС, к направленной дифференцировке в клетки мышечной ткани in vitro

3.2.7.2. Сравнительный анализ действия трёх индукционных сред на ММСК, выделенные из КМ и ЖТ КРС

3.2.7.3. Анализ экспрессии генов-маркёров миогенеза MYOD1 и MYOG в клетках, полученных посредством индукции ММСК

3.2.8. Получение мяса in vitro

3.2.9. Исследование важнейших качественных показателей полученной клеточной биомассы

3.2.9.1. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле (ПААГ)

3.2.9.2. Определение общего аминокислотного состава

4. Экономический расчёт стоимости мяса in vitro

5. Рекомендации по дальнейшему использованию мяса in vitro

6. Выводы

7. Список используемой литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1

Приложение 2

Приложение 3

Приложение 4

Приложение 5

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка технологии получения мяса in vitro и перспективы его использования»

1. ВВЕДЕНИЕ

Почти одновременно перспективность идеи создания культурального мяса стала очевидной для многих зарубежных и российских исследователей, и представителей бизнеса. Так в июне 2007 г. был проведён международный симпозиум по проблемам создания мяса в искусственных условиях, в котором приняли участие учёные из Норвегии, Германии, Израиля, Голландии, Португалии и Бельгии. Журнал «Time» объявил, что производство мяса в пробирке относится к числу 50 прорывных идей 2009 года.

Серьезную проблему современного мира составляет постоянное увеличение численности населения. С каждым годом жителей планеты становится все больше и больше. Еще в середине XX в. на Земле было примерно 3 миллиарда человек. На сегодняшний день, на планете живет приблизительно 6 миллиардов. Понятно, что чем больше становится людей, тем больше территорий, продуктов питания и других жизненных средств потребуется человечеству. Рост объемов производства мяса в глобальном масштабе будет все глубже обострять сопряжённые с ним проблемы, к которым мы относим неэффективное использование энергетических и трудовых ресурсов, фуража и воды в пищевой цепи из расчета на единицу продукции животного белка [14, 67]. Кроме того, будет возрастать нагрузка на окружающую среду. Растёт загрязнение почвы, воды, воздуха испражнениями, растут посевные площади под кормовые культуры за счёт вырубки лесов [67, 69, 83]. Также происходит застройка посевных площадей жилищными и производственными зданиями для нужд животноводства и предприятий отрасли. При чрезмерном употреблении мяса и животных жиров у человека могут развиться заболевания сердечно-сосудистой, эндокринной систем, онкологические заболевания, которые, в конечном счёте, нарушают качество жизни и приводят к летальному исходу. Нельзя полностью исключить токсикоинфекции, зооантропонозы и пищевые токсикозы, связанные с употреблением мяса, а также появление штаммов бактерий, устойчивых к антибиотикам, которые широко применяются в животноводстве [12, 93, 104, 110, 116].

Современное состояние мировой продовольственной проблемы характеризуется главным образом чрезвычайно неравномерным распределением производства и потребления пищи между различными районами мира, странами и группами населения. Более 60% населения земного шара испытывает хронический недостаток в полноценном пищевом белке, особенно в белке животного происхождения. В ходе современной научно-технической революции человек пытается решить проблему питания путём повышения продуктивности животноводства, птицеводства и рыболовства, совершенствования существующей технологии переработки сырья и его более полного использования. Неизбежно будут появляться всё новые методы и способы производства животного полноценного белка. К таким новым методам можно отнести мышечную ткань сельскохозяйственных животных, выращенную in vitro. Этот способ является новым современным направлением альтернативного производства съедобной мышечной ткани животных (т.е. мяса), который приобретает вполне реальные очертания благодаря достижениям в области биотехнологии, клеточной и тканевой инженерии.

За рубежом первые патенты на производство искусственного мяса и мясоподобных продуктов из растительного сырья были получены в США Ансоном, Педером и Боэром в 1956 — 1963 гг. В последующие годы в США, Японии, Великобритании возникла новая промышленность, производящая самые разнообразные искусственные пищевые продукты (ИПП), например, жареное, заливное, молотое и другое мясо разных видов, мясные бульоны, котлеты, колбасы, сосиски и другие мясопродукты, хлеб, макаронные и крупяные изделия, молоко, сливки, сыры, конфеты, ягоды, напитки, мороженое и др.)

Уровень развития науки и практики культивирования клеток, тканевой инженерии, биотехнологии к началу XXI века достиг достаточно высокого уровня, что идея создания культурального мяса почти одновременно стала очевидной для многих зарубежных (Нидерланды, США, Австрия, Великобритания, Индия, Канада и др.) [22, 23, 56, 75, 82, 96, 98, 109, 131, 140] и российских исследователей [32], и представителей бизнеса. Первые исследования, проведенные в России под

руководством академика РАСХН Иосифа Александровича Рогова, позволили предложить оригинальный способ накопления клеток мышечной ткани с использованием отечественных разработок [24]. Представляло интерес продолжить исследования в данном направлении, используя в качестве источника для наращивания клеточной биомассы мультипотентные мезенхимные стволовые клетки (ММСК), выделенные из костного мозга (КМ) и жировой ткани (ЖТ) крупного рогатого скота (КРС).

Учитывая вышеизложенное, тема диссертационной работы является актуальной, а также представляет научный и практический интерес.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы была разработка технологии получения мяса in vitro, наиболее близко отвечающего важнейшим качественным показателям мяса говядины.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи.

1. Выделить из КМ и ЖТ взрослых особей КРС клетки с совокупностью свойств и признаков мультипотентных мезенхимных стволовых.

2. Изучить свойства и признаки полученных ММСК КРС.

3. Депонировать полученные культуры клеток в Специализированную Коллекцию постоянных соматических клеточных культур (СХЖ РАСХН) ВИЭВ с последующим получением патента.

4. Определить способность ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС, формировать in vitro клетки мышечной ткани:

• провести сравнительный анализ эффективности трёх индукционных сред направлять ММСК в клетки мышечной ткани in vitro;

• провести анализ полученных клеток мышечной ткани на уровне экспрессии генов-маркёров миогенеза.

5. Изучить фракционный состав белков и общий аминокислотный состав полученной клеточной биомассы в сравнении с мясом говядины.

6. Разработать рекомендации по дальнейшему использованию полученного мяса in vitro.

Научная новизна работы. Получены и охарактеризованы ММСК, выделенные из КМ и ЖТ КРС, которые являются новым и перспективным источником для создания мяса in vitro. Подобраны рациональные условия выделения этих культур клеток.

Аналитически и экспериментально обоснованы рациональные условия для направленной дифференцировки ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС, в клетки мышечной ткани in vitro. Проведён сравнительный анализ эффективности трёх различных индукторов (5-азацитидин, 5-аза-2'-деоксицитидин и ретиноевая кислота).

Изучены фракционный состав белков и общий аминокислотный состав полученной клеточной биомассы, которые во многом совпадают с показателями мышечной ткани говядины.

Получены новые фундаментальные знания, которые могут применяться во многих областях науки: биотехнология, технология мяса, тканевая и регенеративная медицина, ветеринария.

Практическая значимость работы. ММСК, выделенные из КМ и ЖТ КРС, депонированы в Специализированную Коллекцию перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии (СХЖ РАСХН) под №79 и №80, соответственно.

Получено положительное решение о выдаче патентов РФ по заявкам № 2011149133/10(073706) и № 2011149132/10 (073705) от 02.12.2011 г.

Представленная научно-исследовательская работа закладывает основы будущей биотехнологии получения мяса in vitro в промышленном масштабе.

Методика получения и культивирования ММСК сельскохозяйственных животных отработана и используется в секторе стволовой клетки ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии, а также на кафедре «Технология мяса и мясных продуктов» ФГБОУ ВПО МГУПП в научно-исследовательской работе.

Даны рекомендации по дальнейшему использованию мяса in vitro. Основные положения и результаты, выносимые на защиту:

1. Изучение свойств и признаков ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС.

2. Дифференцировка ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС, в направлении миогенеза in vitro.

3. Электрофоретический анализ фракций белков и общий аминокислотный состав полученной клеточной биомассы.

4. Рекомендации по дальнейшему использованию полученного мяса in vitro.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (М., 2011, 2013); Международной научной конференции молодых учёных и специалистов в Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А. Тимирязева (М., 2011); II Международной Интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий» (Интернет, 2011); IX Международной научно-практической конференции «Технологии и продукты здорового питания. Функциональные продукты питания» (М., 2011); Международных научных конференциях студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (М., 2011, 2012); XII Молодёжной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (М., 2012); Международной виртуальной интернет конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее» (Интернет, 2012); Международной научно-практической конференции «Трансмиссивные болезни животных: актуальные аспекты биобезопасности и контроля» (Украина, АР Крым, г. Алушта, 2012).; 15-ой международной научной конференции памяти В. М. Горбатова «Мясная промышленность - приоритеты развития и функционирования» (М., 2012).

Работа награждена дипломом и медалью в конкурсе молодых учёных на лучшую научно-исследовательскую работу, проводимого в рамках Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (М., 2013).

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в т.ч. 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Российской Федерации, получено 2 положительных решения о выдаче патента РФ, составлен и издан 1 буклет.

Показаны сюжеты на телевидении: телеканал «Россия 24» передача «Агробизнес»; телеканал «Россия 1» передача «Сельское утро»; телеканал «Россия 2» передача «Человеческий фактор. Умная еда»; телеканал «Культура» передача «Завтра не умрёт никогда. Голод»; телеканал «НТВ» передача «Чудо техники с Сергеем Малозёмовым»; телеканал «Россия 1» передача «Утро России»; телеканал «Москва 24» передача «Познавательный фильм».

Личный вклад соискателя. Автор принимал непосредственное участие во всех этапах работы: подбор и анализ отечественной и зарубежной научно-технической информации по теме диссертационной работы; обоснование выбора источников для получения ММСК (КМ и ЖТ КРС); взятие пункции КМ и биопсии ЖТ у коровы; приготовление питательных сред и рабочих растворов; выделение клеток из КМ и ЖТ КРС; проведение сравнительного анализа их свойств и признаков, депонирование; проведение направленной дифференцировки в клетки жировой, костной и мышечной тканей in vitro; приготовление проб для проведения обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) и ПЦР диагностики в режиме реального времени; наращивание клеточной биомассы из полученных клеток мышечной ткани in vitro, проведение одномерного электрофоретического разделения и определение общего аминокислотного состава; оценка возможностей их дальнейшего использования; обобщение полученных результатов исследований, формулировка выводов; подготовка публикаций и патентов по результатам исследований.

Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи к.т.н. М.П. Артамоновой, к.т.н. Н.Л. Востриковой.

В выполнении отдельных этапов работы принимали участие н.с. Е. В. Викторова, к.б.н. К. В. Кулешов, К. Г. Таранова, за что автор приносит им глубокую благодарность.

Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 148 страницах машинописного текста, которые включают введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, собственные исследования и обсуждение полученных результатов, рекомендации по практическому использованию результатов исследований, выводы. Список литературы состоит из 162 библиографических источников, в т.ч. 110 на иностранных языках. Работа иллюстрируется 13-ю таблицами, 28-ю рисунками и содержит 5 страниц приложений.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Понятие об искусственных продуктах питания. Искусственные

мясопродукты

Производство искусственных продуктов питания является логическим результатом развития традиционных методов переработки пищевого сырья. Термин «искусственные продукты питания» означает, что они получены на основе белков и других пищевых веществ природного происхождения, но их состав, структура, внешний вид и комплекс свойств образованы искусственным путём, т. е. речь идет о «синтезе» физической структуры и свойств продукта, а не о химическом синтезе его компонентов. Еще один вопрос, на котором следует остановиться, состоит в соотношении терминов «натуральные», «традиционные» и «искусственные» продукты. Число действительно «натуральных» продуктов ограничено. К ним можно отнести, например, фрукты, овощи, молоко, орехи. Термин «искусственные» продукты имеет чисто научное содержание. Он отражает прежде всего то обстоятельство, что структура и свойства продукта созданы искусственным путем. Однако подавляющее большинство «традиционных» пищевых продуктов по существу также не являются «натуральными», так как их получают в результате переработки пищевого сырья и отдельных его фракций, т. е. используют для питания после весьма глубоких изменений структуры, свойств и состава, а не в «натуральном» виде. Примерами могут служить кондитерские, хлебобулочные, колбасо-сосисочные изделия, соусы, приправы и т. д.

Потребность в развитии производства искусственных продуктов питания, в частности искусственных мясопродуктов, обусловлена необходимостью устранения ряда недостатков, свойственных как сельскохозяйственному производству мяса, так и промышленному производству мясопродуктов. Новый путь производства пищи позволяет преодолеть отмеченные выше противоречия, свойственные традиционной технологии; сократить пищевые цепи при производстве продуктов питания, решить проблему дефицита белковой пищи.

Производство искусственных продуктов питания требует минимальных производственных площадей, затрат труда и совершенно не зависит от климатических, географических и сезонных факторов. Еще одна особенность искусственных продуктов питания заключается в стандартности их состава, структуры и свойств. Содержание в них белков, жиров, углеводов, минеральных солей, витаминов и микроэлементов регулируемо и может быть чётко установлено. Отсюда прослеживается возможность производить широкий ассортимент искусственных продуктов в соответствии с нормами питания, в том числе продуктов для детского, лечебного и профилактического питания. Потребительские и органолептические свойства искусственных продуктов также можно регулировать в достаточно широких пределах, изменяя, например, параметры технологического процесса. Следующее преимущество обусловлено тем обстоятельством, что стандартность перерабатываемого сырья, а также состава, структуры, технологических и потребительских свойств искусственных продуктов позволяет исключить ручной труд как при производстве за счёт полной автоматизации и механизации, так и при сбыте. Например, при производстве искусственных мясопродуктов (не содержащих хрящей, избытка жировой ткани, костей) отпадает необходимость в отбраковке, решении вопросов использования отходов, упрощается контроль качества, сортности и в итоге отпадает необходимость привлечения высококвалифицированного производственного и торгового персонала. Использование искусственных продуктов питания позволит, например, резко удешевить и облегчить организацию снабжения и питания в тех районах, где производство, подвоз и хранение традиционной пищи затруднены. Учитывая компактность автоматических установок для получения искусственных продуктов питания, удобство хранения и транспортировки сырья, очевидна целесообразность их использования для организации питания людей, работающих в труднодоступных районах, на судах дальнего плавания, в космосе и т. д. Хочется отметить, что соотношение между традиционными и новыми методами производства пищи заключается не в противопоставлении этих методов, а,

напротив, в их одновременной и взаимодополняющем развитии и использовании [20,41].

Подобные исследования были начаты в США в конце 40-х—начале 50-х годов XX в. Р. Боером («Форд моторе ко.»), М. Ансоном и М. Педером («Юнилевер», «Ливер бразерс ко.»), С. Серклом и Д. Джонсоном («Сентрал соя ко.») и другими учёными. Работы в этой области [94, 95, 99, 123, 146] направлены на получение искусственных продуктов, имитирующих традиционные изделия из рубленого мяса (технология сравнительно проста, продукты дешевы и удобны для использования) и нерубленые мясопродукты волокнистой структуры, т. е. одну из наиболее дорогих форм пищи. В СССР идеи о принципиально неограниченных возможностях получения искусственных продуктов питания и необходимости практических работ в этом направлении были сформулированы академиком А. Н. Несмеяновым [20], В. Б. Толстогузовым [41], А. М. Безбородовым [7], В. А. Быковым [9], Г. К. Скрябиным [28], Титовым Ю. А., Ахремом А. А. [4], Уэббом Ф. [42] и т.д.

Говоря о создании искусственных продуктах питания, мы говорим об их производстве методами биотехнологии. Использование научных достижений и практические успехи биотехнологии тесно связаны с фундаментальными исследованиями и реализуются на самом высоком уровне современной науки. В этом плане нельзя не отметить удивительную научную многоликость биотехнологии: ее развитие и достижения теснейшим образом связаны и зависят от комплекса знаний не только наук биологического профиля, но также и многих других (Рисунок 1). Эти технологии базируются на использовании каталитического потенциала различных биологических агентов и систем - микроорганизмов, вирусов, растительных и животных клеток и тканей, а также внеклеточных веществ и компонентов клеток [19, 29].

Биохимия

Генетика

Химия

Микробиология

Научные основы получения пищевых продуктов

Электроника

БИОТЕХНОЛОГИЯ

Биохимическая технология

Биоинженерия

Технология пищевой промышленности

Химическая технология

Механическа° технология

Рис. 1. Междисциплинарная природа биотехнологии.

Задачей наших исследований является разработка методов создания искусственного мяса из клеток сельскохозяйственных животных in vitro для дальнейшего составления пищевых композиций заданного состава и качества.

Культуральное мясо (т. е. мясо, выращенное in vitro с использованием технологий клеточной инженерии, результатов исследований в области культур стволовых клеток, а также стремительным развитием нанотехнологий) было создано как новый подход для получения белоксодержащего продукта животного происхождения. На сегодняшний день это мясо не является альтернативой традиционному животноводству, оно создается как новое перспективное направление на стыке многих наук, задел на будущее. Так как съедобное мясо в большинстве своем представлено скелетной мышечной тканью, то конечным результатом исследований по получению мяса в пробирке является получение именно мышечной ткани сельскохозяйственных животных in vitro.

В 2004 году была основана некоммерческая научно-исследовательская организация New Harvest (http: / / www. new-harvest .or g ), целью которой является поддержка развития исследований по созданию заменителей мяса с долгосрочной

2.2. Культуральное мясо

перспективой получения экономически выгодной и конкурентоспособной альтернативы традиционному производству мяса и мясопродуктов. Данная организация (сайт) служит платформой, форумом для обмена техническими инновациями, публикациями, новостями.

Исследования в данном направлении ведутся в Нидерландах, США, Австрии, Индии, Канаде и России [22, 23, 32, 56, 75, 82, 96, 98, 109, 131, 140]. Изучив имеющуюся литературу по данной теме, в мире можно выделить порядка 9 групп ученых, работающих над проблемой создания культурального мяса. Наиболее успешно в данном направлении работают учёные из Нидерландов. Они активно публикуют свои исследования, как в научной литературе, так и в журналистских изданиях, проводят презентации своих разработок на телевидении, в интернете. Также в Нидерландах очень сильна финансовая поддержка правительства. В 2005 г. оно выделило на эти научные разработки около € 2 ООО ООО. Современные исследования по получению мяса в пробирке в США возникли из экспериментов NASA, в которых ученые пытались найти более совершенные способы долгосрочного питания для астронавтов в космосе. На сегодняшний день основные исследования в этом вопросе ведутся под руководством проф. В. А. Миронова из медицинского университета в Южной Каролине и проф. МакФарланда из университета Южной Дакоты США [82]. В России совместно на базе Московского государственного университета пищевых производств и Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко Российской академии сельскохозяйственных наук под руководством академика РАСХН Рогова Иосифа Александровича ведется научно-исследовательская работа по разработке методов получения культурального мяса [24, 32].

В Нидерландах темой создания мяса в пробирке занимаются ведущие учёные страны. Из основных можно выделить группу ученых под руководством Марка Поста (Маастрихтский Университет), который обещал в начале 2013 года показать первый гамбургер, выращенный в пробирке. Также этими вопросами занимаются ученые под руководством Хенка Хаагсмана (Утрехтский Университет) и под

руководством проф. Эдельмана (Университет Вагенингена). Стоит отметить, что группа ученых проф. Эдельмана очень тесно сотрудничает в этом вопросе с университетами Южной Дакоты и Южной Каролины США. А также ученые тесно сотрудничают между собой. К примеру, в университете Утрехта ведутся работы с культурами клеток, в том числе стволовыми, а в университете Эйндховена разрабатываются биореакторы для наращивания культурального мяса в больших масштабах.

Предпосылки для создания искусственного мяса создавались десятилетиями. В 1912 году профессор Алексис Каррел одним из первых смог сохранить кусок куриной сердечной мышцы живой и бьющейся на чашке Петри. Спустя время, в 1950-х годах врач Биллем Фредерик ван Эйлен (Амстердам, Нидерланды) независимо от других исследователей придумал способ использования культуры тканей для производства мясных продуктов, а в 2007 году получил всемирный патент на промышленное производство мяса с использованием культур клеток [23]. Автор предлагает несколько вариантов получения культурального мяса. В качестве клеточного материала он предлагает использовать миобласты, выделенные из биопсии мышечной ткани животного или рыбы. Первый вариант - это выращивание клеток мышечной ткани на коллагеновом спонже и культивирование их на чашке Петри или в цилиндрическом контейнере в питательной среде БМЕМ без Ь-глютамина с добавлением бычьей сыворотки крови. В качестве матрикса можно использовать полиуретан, полилактиды или хитин. Второй вариант - это получение клеток мышечной ткани в большом объеме. Для этого ванн Эйлен предлагает сконструировать ферментер, в котором те же клетки на микроносителе, например, Су1:ос1ех 1 или Су1:ос1ех 3, будут культивироваться в суспензии при строго определенных параметрах: температуре +37°С, содержании С02 газа 5%, рН-7.2, растворенном кислороде в количестве 50% и скоростью вращения 22-25 об./мин. Добавление аминокислот, витаминов, глюкозы, более частое обновление питательной среды по мнению автора только увеличат выход готового продукта. Третий вариант - монослойное культивирование миобластов в среде, содержащей фунгизон. Суть этого метода - отделить фибробласты, которые всегда

присутствуют в культуре миобластов и мешают процессу их дифференцировке. Это достигается за счет способности фибробластов быстрее прикрепляться к поверхности культурального матраса, чем миобластов. Далее полученные миобласты помещают в индукционную среду и через 6-8 дней начинают формироваться миотубы.

В своих работах Марк Пост [60, 61, 131], проф. Эдельман с коллегами из университетов США [82], Хенк Хаагсман из университета Утрехта [96], Марло Люсия Петронела Лангелаан [109] дают описательную характеристику различным типам клеток, условиям культивирования, различным типам матриксов, возможности использовать биореакторы и т.п. Основным вопросом является выбор типа клеток, их плюсы и минусы: эмбриональные стволовые клетки, сателлитные клетки или собственные стволовые клетки мышечной ткани взрослых особей сельскохозяйственных животных, мезенхимные стволовые клетки. Обсуждается, что стволовые клетки являются многообещающими благодаря своей возможности неограниченно делиться и образовывать in vitro большое количество клеток разных тканей организма.

Эмбриональные стволовые клетки имеют неограниченный потенциал к делению и самовоспроизведению, при индукции к дифференцировке могут образовывать клетки любых тканей in vitro. Но существуют проблемы с эмбриональными стволовыми клетками для производства мяса пробирке, которые включают в себя риск неконтролируемой пролиферации и дифференцировки, а также этические вопросы об использовании этого типа клеток. Собственные стволовые клетки мышечной ткани - сателлитные клетки - они находятся в мышечной ткани и запрограммированы на направленную дифференцировку только в клетки мышечной ткани. У данного типа клеток ограниченный пролиферативный потенциал, а также они способны дифференцироваться только в один тип клеток. Большое будущее прогнозируют авторы для мезенхимных стволовых клеток в связи с их основными свойствами и признаками, о которых подробно будет описано в главе 2.7. К сожалению, в настоящее время существует проблема спонтанной дифференцировки in vitro стволовых клеток взрослого организма.

Предполагается, что этот вопрос будет решаться за счет оптимизации условий культивирования.

В 2000 г. американские учёные под руководством М. Аарона Бенжаминсона предприняли попытки создать систему по производству белка мышечной ткани in vitro для питания космонавтов. Для этого они поместили эксплантаты мышечной ткани золотой рыбки (Carassius auratus) в различные культуральные среды и культивировали их в чашке Петри в течение 7 дней. Результаты экспериментов были многообещающими: наблюдали увеличение площади поверхности эксплантатов в пределах от 5,2 до 13,8 %. Когда эксплантаты поместили в среду, содержащую отдельные клетки мышечной ткани золотой рыбки, площадь их поверхности увеличилась до 79 %. Кроме того, культивируемые эксплантаты промывали, смачивали в оливковом масле со специями, панировали в сухарях и обжаривали. Несмотря на то, что не была проведена дегустация в соответствии с правилами её проведения для пищевых продуктов и медикаментов, товар был приемлемым в пищу. Это многообещающее исследование не было продолжено из-за отсутствия дальнейшего финансирования [55].

Американец Джон Вейн также получил патент США [22] на производство мяса in vitro. Он предлагает брать эмбриональные или мезенхимные стволовые клетки млекопитающих, выращивать их на подложке из натуральных биоматериалов, индуцировать в миобласты или в собственные стволовые клетки мышечной ткани. Далее миобласты могут быть дифференцированы в миоциты или в другие клетки мышечной ткани под действием специфичных ростовых или индукторов. Автор предлагает использовать в качестве ростового фактора PGF2a, а в качестве индуктора инсулин. В качестве матрикса рекомендуется использовать натуральные биоматериалы, например, коллаген, фибронектин, ламинин, а также синтетические биоматериалы, например, гидроксиаппатиты, альгинаты, полигликолевые кислоты и т.п. Также в описании патента помимо получения клеток мышечной ткани приведена возможность получения клеток жировой, костной и хрящевой тканей in vitro. Далее автор предлагает выращивать

полученные клетки на комплексной основе, что позволит создавать такие продукты питания, как говядина, курятина и рыба.

Первые исследования, проведенные в России под руководством академика РАСХН Иосифа Александровича Рогова, позволили предложить оригинальный способ накопления клеток мышечной ткани с использованием отечественных разработок [24]. В 2008 г. был получен патент на изобретение № 2314719 «Способ получения мясного продукта». Авторы предлагают способ получения мясного продукта, включающий выделение мезенхимных клеток (в частности мышечных клеток) сельскохозяйственных животных, посев таких клеток на поддерживающий каркас и их выращивание на поддерживающем каркасе под действием электрического поля. Изобретение позволяет получать пищевой продукт, состоящий из скелетных миобластов и фибробластов. Мышечные клетки выделяли из мышечной ткани сельскохозяйственных животных, используя стандартные методы, включая ферментное расщепление. Характерным свойством настоящего изобретения является использование популяции мышечных клеток для получения пищевой композиции. Варианты сред для культивирования клеток могут варьироваться, она может содержать сыворотку, а может быть бессывороточной. В качестве каркасов для роста клеток авторы предлагают использовать каркасы, изготовленные из коллагена, фибронектина, ламинина или синтетических материалов, таких как альгинат, политимидиловая или полиуридиловая кислоты. Также в качестве каркасов могут быть использованы губки, полученные из плазмы крови животных, с высокоразвитой поверхностью. При этом процесс структурирования губки и роста клеток может идти одновременно. Главной отличительной особенностью данного изобретения является воздействие на клеточный монослой переменного электрического тока напряженностью 500-800 В/см с частотой 1-5 МГц в течение 15-20 сек 1-10 раз через каждые 20-40 мин, а затем электрическими импульсами с продолжительностью импульса менее 1 сек при значениях градиента напряжения 1-6 кВ/см, приводящими к разрушению 1-5% клеток. При сравнении мясного продукта, полученного согласно изобретению, и мясного продукта, полученного в качестве контроля, оказалось, что время

удвоения клеток согласно изобретению уменьшилось в 1,6 раза по сравнению с контролем. При этом трансформации клеток не происходит. При этом также клетки могут делиться на протяжении 15-25 циклов in vitro, сохраняя свои характерные признаки, до получения пищевого продукта.

Представляло интерес продолжить исследования в данном направлении, используя в качестве источника для получения клеточной биомассы мультипотентные мезенхимные стволовые клетки (ММСК), выделенные из костного мозга (КМ) и жировой ткани (ЖТ) крупного рогатого скота (КРС) [32].

2.3. Предпосылки для создания культурального мяса

Выращивание скота для удовлетворения потребностей людей в продуктах питания всегда было неотъемлемой частью существования человека на земле, и его воздействия до последнего времени были в основном положительными, и экономически, и социально. Однако современные методы производства становятся все более требовательными. Его влияние может быть прямым, например, выделение метана жвачными животными, или косвенным - расширение посевных площадей под выращивание кормовой сои в Южной Америке за счет вырубания тропических лесов. Около 70 % пресной воды, 35 % пахотных земель и 20 % энергии используются человеком прямо или косвенно для производства пищевых продуктов. Общая площадь суши, свободной ото льда и используемой для выпаса скота, составляет около 30 % от общей площади земли, а также 33 % пахотных земель используются для производства комбикормов. В общей сложности поголовье скота занимает до 70 % сельскохозяйственных земель, и без изменения политики эта доля будет только расти в ближайшем будущем [127, 149, 155].

На рисунке 2 приведена сравнительная диаграмма использования первичных энергетических ресурсов, земли, воды, выбросов парниковых газов при производстве культурного мяса и мяса сельскохозяйственных животных. Как видно на диаграмме, количество потребляемой энергии для производства

культурного мяса существенно ниже по сравнению с условно произведенными говядиной, бараниной и свининой, но требует больше энергии по сравнению с условно произведенной птицей. Расходы землепользования для получения культурального мяса минимальны. Таким образом, больше земли может быть использовано для производства биоэнергии. Как и большинство выбросов парниковых газов при производстве культурного мяса, связанных с использованием топлива и электроэнергии, выбросы могут быть сокращены с помощью возобновляемых источников энергии. В традиционной мясной промышленности потенциал для сокращения выбросов парниковых газов ограничен, так как основные выбросы обусловлены выделением метана из навоза, закиси азота из почвы, а также в процессе кишечной ферментации жвачных животных (Рисунок 2) [69, 84, 156].

120

X 100

«

■

а

5 ВО

2 в

о 60 V» 2

40

20

и

—1 — —

Исполиомпе Выбросы энергии парниковых

■ Говядина

□Баранина □Свинина

■ Мясо птицы

■ Кудьтуралыюе

10СО

Испольэошж« Исподоошпм

Рис. 2. Сравнительная диаграмма использования первичных энергетических ресурсов, земли, воды, выбросов парниковых газов при производстве культурного мяса и мяса сельскохозяйственных животных [156].

Интенсивное развитие народного хозяйства обострило проблему охраны окружающей среды от промышленных загрязнений. Животноводство и

предприятия мясной промышленности нельзя отнести к промышленным производствам, сильно воздействующим на окружающую среду (химические, металлургические и т. д.). Однако в результате содержания скота; переработки биологического сырья они выделяют в окружающую среду значительные количества выбросов в виде сточных вод, загрязнённых продуктами как биологического, так и минерального происхождения. Сельское хозяйство России ежегодно образует 250 млн. т. отходов, из них 150 млн. т. приходится на животноводство и птицеводство, 100 млн. т. - на растениеводство [127, 155].

При чрезмерном употреблении мяса и животных жиров у человека могут развиться болезни сердечно-сосудистой и эндокринной системы, онкологические заболевания, которые, в конечном счёте, нарушают качество жизни и приводят к летальному исходу. Хотя в последние годы этот показатель сокращается, на заболевания сердечно-сосудистой системы по-прежнему приходится более 40% всех случаев смерти в странах с развитой экономикой (Рисунок 3). Как это ни печально, но смертность от сердечно-сосудистых заболеваний значительно выросла и в развивающихся странах главным образом из-за принятия ими «западного» образа жизни. На рисунке 4 показана тенденция, наблюдаемая в настоящее время. Предрасположенность к сердечно-сосудистым заболеваниям зависит от различных факторов риска, включая генетику, питание, артериальное давление, курение и тренированность [12, 38, 47, 116].

К причинам летального исхода вследствие потребления мяса следует отнести болезни желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), вызванные патогенными микроорганизмами - сальмонеллёз, кампилобактериоз, инфекции, вызываемые энтерогеморрагической Е. coli (например, E.coli 0157), прионные и паразитарные заболевания [68, 93, 104, 143].

oUUU 2500 2000 1500 1000 500

I J

U ш

Заключение диссертации по теме «Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств», Волкова, Ирина Михайловна

2.8. Заключение

Таким образом, анализ литературных и патентных источников показал актуальность, перспективность и важность изучаемой темы, а также ее недостаточное изучение, особенно в нашей стране. Для решения задачи по созданию технологии мяса in vitro одним из ключевых вопросов является подбор и получение рациональной культуры клеток сельскохозяйственных животных. Поэтому первым шагом для нас являлись поиск и получение такой культуры клеток, чтобы можно было один раз выделить и потом использовать по необходимости, а также возможность получения различных типов клеток in vitro и создание на их основе трёхмерных структур. В связи с этим представляется необходимым и своевременным совершенствование знаний, полученных учёными в мире, продолжение собственных исследований в данном направлении, создание собственной научной и образовательной базы.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа с культурами клеток ММСК выполнена на базе сектора стволовой клетки ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии. Работа по изучению качественных показателей проводилась на кафедре «Технология мяса и мясных продуктов» технологического факультета ГОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» и в лаборатории научно-методических работ и контрольно-аналитических исследований ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии. Работа выполнена в период с 2008 по 2012 гг.

На рисунке 10 представлена схема эксперимента.

3.1.1. Материалы исследований

Для получения клеток со свойствами и признаками ММСК мы использовали костный мозг (КМ) и жировую ткань (ЖТ) крупного рогатого скота (КРС). КМ и ЖТ получали от убойных животных (коровы, 3 года, порода Голштинская) в совхозе «Знаменский» Каширского района Московской области, а также на «Коломенском опытном мясокомбинате», г. Коломна Московской области. Голштинская или голштино-фризская порода — порода КРС молочного направления продуктивности. Голштинская порода является самой распространённой породой среди молочного скота на земном шаре. Забор материала осуществляли не позднее 30 мин после убоя в стерильных условиях.

3.1.1.1. Приборы и оборудование

Манипуляции с клетками проводили в ламинарном боксе биологической защиты Е8СО класса II серии АС2, подающем горизонтальный стерильный поток воздуха. Производство фирмы Е8СО, Сингапур (Рисунок 11, А).

Костный

Получение популяций клеток с фенотипом подобным ММСК мозг

Жировая ткань

Рекомендации по дальнейшему использованию мяса in vitro

Рис. 10. Схема эксперимента.

Культивирование клеток проводили в открытой системе в ССЬ-инкубаторе с воздушной рубашкой типа LCO-266AIP, обеспечивающим определённую влажность воздуха, температуру (+37°С) и содержание С02-газа в воздухе (5%). Производство фирмы Daihan LabTech Co., LTD, Корея (Рисунок 11, Б).

Микроскопирование и микрофотографирование нативных и окрашенных препаратов осуществляли с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа фирмы Carl Zeiss, Германия и программы AxioVision Reí. 4.8 (Рисунок 11, В).

Для подогрева сред и растворов использовали термостат ТС-80М-2, Россия. Для поддержания оптимальной температуры для ММСК во время микроскопирования использовали нагревательный столик «Микростат» фирмы «КБ ТЕХНОМ» г. Екатеринбург, Россия. Центрифугирование клеточных суспензий осуществляли в центрифугах ELMI СМ 6.02 и MPW-251, фирмы MPW Med. Instruments, Польша (Рисунок 11, Г, Д).

Все растворы, среды, реактивы хранили при оптимальной температуре +4°С в холодильнике Indesit, Россия. Высушивание и стерилизацию культуральной посуды проводили в сухожаровом шкафу при температуре +180°С LP-320 фирмы «MLM». Приготовление раствора Версена, ФСБ-2, физраствора и других растворов, автоклавирование резиновых пробок, пластиковых крышек, наконечников осуществляли в автоклаве ВК 75-01 фирмы ОАО «Тюменский завод медицинского оборудования инструментов», Россия.

Бидистиллированную воду получали с помощью дистиллятора ОР-10 фирмы Chirana, Чехословакия. Взвешивание реагентов производили на электронных аналитических весах фирмы Sartorius, Германия. Измерение величины pH проводили при помощи рН-метра рН-2005 фирмы J.P. Selecta, s.a., Испания.

Кратковременное хранение клеток осуществляли в низкотемпературном холодильнике New Brunswick, Англия. Хранение и депонирование клеток осуществляли в жидком азоте при температуре -196°С в сосуде Дьюара (Thermo electron corporation, США) (Рисунок 11, Е).

Рис. 11. Оборудование, используемое для работы с мультипотентными мезенхимными стволовыми клетками:

А - ламинарный бокс класс биологической защиты II тип А; Б - С02-инкубатор; В - инвертированный микроскоп (об.: х10, х20, х40, хбЗ); Г, Д - центрифуги; Е - сосуд Дьюара с жидким азотом для хранения клеток.

Анализ поверхностных клеточных маркёров проводили с помощью проточной цитофлуориметрии на цитометре Epics Elite Culture (Beckman Coulter, США).

Все работы с вредными веществами проводились в вытяжном шкафу Labconco, США.

3.1.1.2. Культуральная посуда

Для сбора КМ и ЖТ использовали одноразовые пробирки с напылением из Li-гепарина, объёмом 4 мл, изготовленные фирмой BD Vacutainer, Англия. Выделение ММСК из КМ и ЖТ КРС, центрифугирование клеточных суспензий проводили в стерильных пластиковых центрифужных пробирках объемом 15 и 50 мл фирмы Corning-Costar, США.

Культивирование клеток осуществляли в стерильных культуральных пластиковых флаконах с вентилируемыми крышками с

1 2 площадью поверхности 25 см , 75 см и 225 см2 (Corning, США) (Рисунок 12). Вентилируемые крышки обеспечивали стерильность, а также контакт с пластиковые флаконы (матрасы) для внешней средой, что позволило культивирования клеток с площадью содержать клетки в атмосфере с поверхности 25 см2, концентрацией С02 5 %.

Также для культивирования клеток использовали стерильные одноразовые пластиковые чашки Петри с диаметром 60 и 100 мм, изготовленные фирмой Corning, США. Дифференцировку ММСК осуществляли в стерильных 6-луночных планшетах с крышкой фирмы SPL, Корея.

Для дозирования точных объемов используемых растворов использовали одноканальные механические дозаторы с варьируемым объемом со стерильными пластиковыми наконечниками фирмы Biohit Oyj, Финляндия. Для различных манипуляций с клетками и для приготовления растворов и сред использовали стерильные пастеровские пипетки объемом 3 мл.

Криоконсервирование ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС, проводили в стерильных пластиковых криопробирках объемом 1,8 мл фирмы Corning, США.

Все расходные материалы одноразового использования.

3.1.1.3. Культуральные среды, растворы и реактивы

Основной средой для культивирования ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС, служила среда Игла в модификации Дюльбекко, содержащая 1 г/л глюкозы (DMEM-LG) (Рисунок 13), дополненная 10% сыворотки крови плодов коров (СКПК) (HyClone, США) и антибиотиками. Конечная концентрация стрептомицина была 100 мкг/мл, а пенициллина - 100 ед./мл.

Среда DMEM с аланил-глутамином стабильна при комнатной температуре, представляет собой растворённую в очищенной воде смесь неорганических солей, аминокислот, витаминов, глюкозы и фенолового красного, простерилизованную через фильтры с размером пор 0,1 мкм. рН в пределах от 7,0 до 7,4; осмолярность: 340 +/- 20 мосмоль/кг; буферная ёмкость: не менее 6,0 мл. Среда хранилась в холодильнике при температуре +4°С, перед использованием подогревалась в термостате до температуры +37°С.

Фосфатно-солевой буфер Дюльбекко без ионов Са~ и Mg2+ (ФБС-2; Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, DPBS) pH-7,2 использовали для разбавления и промывания полученных пункций КМ и ЖТ, для промывки клеточных культур

Рис. 13. Среда DMEM-LG. перед трипсинизацией, а также для промывания культур клеток при окрашивании их антителами. Раствор хранился при комнатной температуре.

Диссоциация клеток при пересевах проводилась с помощью 0,25%-ного стерильного раствора трипсина рН-7,11, который аликвотили и хранили в морозильной камере при температуре -18°С. Перед использованием раствор размораживали и подогревали до температуры +37°С в термостате.

Для дезагрегации ЖТ использовали 0,01%-ный раствор смеси коллагеназ типов I и II на основе DMEM-LG. Раствор готовили заранее в 10-ти кратном разведении, аликвоты хранили при -20°С. Перед использованием размораживали и подогревали до комнатной температуры.

Для криоконсервации ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС, в качестве криопротектора использовали диметилсульфоксид (DMSO) (Sigma, США). В состав криозащитной среды входили: 10% DMSO, 20% СКПК, 70% DMEM-LG.

Для окраски клеток на определение жизнеспособности использовали 0,1% -ный водный раствор трипановой сини. Для оценки морфологии клеток, ядерно-цитоплазматического отношения, гомогенности цитоплазмы и наличия ядрышек в ядре проводили окраску азур Ii-эозином по Романовскому (окраска по методу Романовского-Гимза).

Для направленной дифференцировки in vitro использовали следующие добавки к основной питательной среде: дексаметазон (KRKA, Словения), аскорбиновая кислота, ß-глицерофосфат, инсулин, 5-азацитидин, 5-аза-2'-деоксицитидин, ретиноевая кислота, гидрокортизон (Sigma, США). Для подтверждения морфологических изменений вследствие дифференцировки клетки окрашивали красителем Oil Red О (Bio Optica Milano s.p.a., Италия) для

Для выделения ММСК из КМ КРС использовали раствор фиколла (Ficoll-Paque, Pharmacia, р = 1,077 г/мл) (Рисунок 14). Раствор хранили в холодильнике при температуре +4°С, перед использованием подогревали до комнатной температуры в термостате.

Рис. 14. Раствор фиколла. адипогенной дифференцировки и методом серебрения по von Kossa (Sigma-Aldrich, Германия) для остеогенной дифференцировки.

При анализе поверхностных маркёров ММСК использовали следующие антитела (AT): первичные мышиные AT против антигенов (АГ) мыши: CD44, CD90, CD29, CD34, CD45 и CD31 фирм (Sigma, Германия) и (BD Bioscience Pharmingen, США). В качестве вторичных AT использовали козьи AT против IgG мыши, меченные FITC (флуоресцеин) фирмы (BD Pharmingen, США). Также мы использовали моноклональные антитела (МАТ) кролика против Коллагена 1-го типа КРС, меченные FITC фирмы (Sigma, Германия).

Все оборудование, реактивы и расходные материалы соответствуют международным стандартам ISO 9000/9001/9002.

3.1.2. Методы исследований 3.1.2.1. Выделение ММСК из КМ КРС

КМ в количестве 30 мл получали от убойных животных (клинически здоровые коровы, 3 года, порода Голштинская) в совхозе «Знаменский» Каширского района Московской области, а также на «Коломенском опытном мясокомбинате», г. Коломна Московской области (Рисунок 15).

Забор материала осуществляли не позднее 30 мин после убоя в стерильных условиях. КМ извлекали из бедренной кости. Полученный КМ переносили в 15 мл центрифужные пробирки с Li-гепарином и разбавляли в 4 раза ФБС-2, дополненным антибиотиками (пенициллин 200 ед./мл, стрептомицин 200 мкг/мл). Затем разбавленный КМ осторожно по стенке наслаивали на градиент фиколла в соотношении 1:4. Раствор имел комнатную температуру. Пробирки с КМ, наслоенным на фиколл, центрифугировали при 1000 g в течение 30 мин при комнатной температуре и выделяли фракцию моноядерных клеток. Далее полученную взвесь клеток промывали в растворе ФСБ-2 и снова трижды осаждали центрифугированием при 400 g в течение 10 мин. После последнего осаждения удаляли надосадочную жидкость, полученный осадок разбавляли средой ОМЕМ-Ьв и тщательно перемешивали. Затем полученную клеточную суспензию фильтровали последовательно через фильтры с размером пор 80 мкм (для клеток стромально-васкулярной фракции (СВФ)), а затем 10-7 мкм (для селекции стволовых). Отобранные таким образом клетки снова осаждали при 200 g в течение 5 мин, добавляли питательную среду. Основной средой для культивирования служила среда Игла в модификации Дюльбекко, содержащая 1 г/л глюкозы (ОМЕМ-Ьв), дополненная 10% СКПК и антибиотиками. Конечная концентрация стрептомицина была 100 мкг/мл, а пенициллина - 100 ед./мл. Для выделения использовали методические наставления, разработанные ранее [36]. Число выделенных клеток оценивали подсчётом в камере Горяева. Высевали в концентрации 1,1 х 106 в культуральный флакон с площадью поверхности 25 см2. Через 24 ч производили смену среды, оставшиеся прикрепленные клетки оставляли на доращивание.

Рис. 15. Забор материала во время убоя крупного рогатого скота.

3.1.2.2. Выделение ММСК из ЖТ КРС

ЖТ получали от тех же животных сразу после убоя. Полученный кусок ЖТ переносили в 15 мл центрифужные пробирки с физраствором, дополненным антибиотиками (пенициллин 200 ед./мл, стрептомицин 200 мкг/мл) (Рисунок 16, А). Клетки выделяли по методике, описанной ранее [36]. Для этого ЖТ трёхкратно тщательно промывали в ФСБ-2 с антибиотиками (пенициллин 100 ед./мл, стрептомицин 100 мкг/мл), измельчали маленькими острыми ножницами и скальпелем (Рисунок 16, Б) и подвергали ферментативной обработке 0,01%-ным раствором смеси коллагеназ типов I и II на основе БМЕМ-Ьв при температуре +37°С в течение 30 мин (Рисунок 16, В). Коллагеназу нейтрализовали эквивалентным объёмом питательной среды БМЕМ-Ьв, дополненной 10% СКПК, и центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин (Рисунок 16, Г). Клетки еще дважды осаждали центрифугированием при 800 g в течение 10 мин и ресуспендировали в питательной среде. После последнего осаждения полученный осадок ресуспендировали в БМЕМ-ЬО и пропускали последовательно через фильтры с размером пор 80 мкм (для клеток стромально-васкулярной фракции) и затем 10-7 мкм (для селекции стволовых). Отобранные таким образом клетки снова осаждали при 200 g в течение 5 мин, добавляли питательную среду.

Основной средой для культивирования ММСК, выделенных из ЖТ КРС, служила та же среда, что и для культивирования ММСК, выделенных из КМ КРС. Количество полученных клеток оценивали подсчётом в камере Горяева, высевали в концентрации 1,2 х 106 клеток в культуральный флакон с площадью поверхности 25 см . Через 24 ч производили смену среды, оставшиеся прикрепленные клетки оставляли на доращивание. Среду меняли каждые 4 сут.

Длительное культивирование ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС, проводили путем периодического пассирования. Снятие клеток с субстрата осуществляли с помощью 0,25% - ного стерильного раствора трипсина в течение 510 мин в С02-инкубаторе.

Рис. 16. Стадии выделения клеток с фенотипом подобным мультипотентным мезенхимным стволовым из жировой ткани крупного рогатого скота:

А - биопсия жировой ткани крупного рогатого скота в центрифужных пробирках; Б - измельчение кусочков жировой ткани крупного рогатого скота в ФСБ-2; В - ферментативная обработка кусочков измельченной жировой ткани раствором смеси коллагеназ типов I и II; Г - центрифугирование образцов после ферментативной обработки жировой ткани.

Анализ жизнеспособности проводили после ферментативного снятия клеток с культурального флакона. Клетки ресуспендировали в физиологическом растворе, помещали в чашки Петри для окраски, добавляли эквивалентный объем 0,1% раствора трипановой сини, время экспозиции 5 мин. 10 мкл полученной клеточной суспензии после окраски переносили в камеру Горяева и производили оценку сразу после ферментативной обработки клеток. В пяти больших квадратах камеры подсчитывали количество окрашенных (погибших) клеток путем прямого микроскопического наблюдения. Процент жизнеспособности клеток в суспензии определяли по стандартной формуле (1) [43]: п (кол-во окраш. клеток в 5-ти кв.)

Витальность (%) =.х 100% (1)

N (общее кол-во клеток в 5-ти кв.)

3.1.2.3. Оценка морфологических особенностей ММСК, выделенных из

КМ и ЖТ КРС, в культуре

Характеристику ММСК проводили визуально с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа фирмы Carl Zeiss, Германия и программы AxioVision Reí. 4.8. В качестве основных критериев использовали размер и форму клеток, ядерно-цитоплазматическое соотношение, гомогенность цитоплазмы и наличие ядрышек в ядре. Оценку проводили как в нативных препаратах, так и в препаратах, окрашенных по Романовскому-Гимза.

Митотический индекс (интенсивность митотического размножения клеток в культуре, МИ) для каждой популяции клеток рассчитывали в фазе логарифмического роста как отношение числа митозов к общему числу подсчитанных клеток (не менее 1x106), умноженное на 1000 (%о) (2).

МИ = (число митозов/общее число клеток) х 1000%о (2)

МИ выражается обычно не в процентах, а в промилле (%о), поэтому в числителе дроби сумма митозов умножается на 1000.

Время цитогенерации (удвоения), интервал между следующими друг за другом делениями клеток, проводили путем подсчета числа клеток в десяти выбранных и отмеченных квадратах (2x2 мм) культуральной чашки через 18, 24, 36, 48 и 60 ч. Время удвоения было рассчитано относительно первой точки подсчета (18 ч).

Эффективность клонообразования оценивали посредством посева клеток в

3 2 концентрации 1x10 в культуральные флаконы с площадью поверхности 25 см . Эффективность рассчитывали как отношение общего числа посеянных клеток к числу образованных клонов на 7-10 сут.

3.1.2.4. Анализ экспрессии поверхностных антигенов

Для выявления поверхностных антигенов (АГ) полученные популяции ММСК, выделенные из КМ и ЖТ КРС, анализировали с помощью проточной цитофлуориметрии на цитометре Epics Elite Culture. Поскольку не существует специфического маркёра для данного типа клеток, поэтому представляло интерес проанализировать данные клетки по ряду маркеров.

Для этого клетки снимали с субстрата 0,25%-ным раствором трипсина, подсчитывали, отмывали и аликвоты в концентрации 2x105 инкубировали с первичными AT в разведении 1:30 (ФСБ-2, дополненный 2% СКПК) при температуре +4°С в течение 45 мин в темноте. Первичные мышиные AT, используемые в наших экспериментах, были против АГ мыши: CD44 (рецептор гиалуроновой кислоты), CD90 (Thy-1), CD29 (Integrin (3-1), CD34 (CD34 molecule), CD45 (LCA) и CD31 (PECAM) (Sigma, Германия) и (BD Bioscience Pharmingen, США). В качестве вторичных AT использовали козьи AT против IgG мыши, меченные FITC фирмы (BD Pharmingen, США). Также мы использовали моноклональные антитела (МАТ) кролика против Коллагена 1-го типа КРС, меченные FITC фирмы (Sigma, Германия).

3.1.2.5. Направленная днфференцировка ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС, в клетки костной и жировой тканей in vitro

Для подтверждения дифференцировочного потенциала полученных клеток был проведен in vitro анализ. Для этого в среду для культивирования добавлялись специфические индукторы для направленной дифференцировки в клетки тканей мезенхимного происхождения - костной и жировой. Способность ММСК к направленной дифференцировке в остео- и адипо- направлениях проводили согласно методике [36]. Клетки высевали в два 6-луночных планшета в

3 2 концентрации 3x10 кл/см для остео- и адипо- дифференцировок соответственно. По достижении клетками 70-80 % монослоя в 4-х экспериментальных лунках меняли рабочую среду на индукционную. Две лунки с клетками продолжали культивировать в питательной среде (контроль). Все лунки подписывали. Клетки культивировали в индукционных средах в течение 21-28 сут. Каждые 4 сут меняли среду.

Остеогенная днфференцировка. Индукторами остеогенной дифференцировки были дексаметазон, (З-глицерофосфат и аскорбиновая кислота. Состав индукционной среды представлен в таблице 2.

Список литературы диссертационного исследования кандидат технических наук Волкова, Ирина Михайловна, 2013 год

7. Список используемой литературы

1. Адаме, Р. Методы культуры клеток для биохимиков / Р. Адаме; под ред. д.б.н. В. Ю. Полякова; перевод с английского к.б.н. М. А. Панова. - М.: Мир, 1983.-263 с.

2. Албертс, Б. Молекулярная биология клетки, в 3-х томах (Molecular Biology of the Cell. Second edition) / Б. Албертс, Д. Брей, Дж. Льюис, М. Рэфф, К. Роберте, Дж. Уотсон. - 2-е издание, переработанное и дополненное; перев. с англ. Т. Н. Власик, В. П. Коржа, В. М. Маресина, Т. Д. Аржановой, Г. В. Крюковой; под ред. Г. П. Георгиева, Ю. С. Ченцова. - М.: Мир. Редакция литературы по биологии, 1994.

3. Алмазов, И. В. Атлас по гистологии и эмбриологии / И. В. Алмазов, Л. С. Сутулов. - М.: Медицина, 1978. - 544 с.

4. Ахрем, А. А. Стероиды и микроорганизмы / А. А. Ахрем, Ю. А. Титов. - М.: Наука, 1970.-306 с.

5. Балан, О. В. Анализ дифференцировки in vitro сателлитных клеток и миобластов, выделенных из скелетных мышц крыс на разных стадиях онтогенеза: автореф. дис. ... канд. биол. наук : 03.00.30 и 03.00.25/ Балан Ольга Викторовна. - М., 2009. - 24 с.

6. Бахуташвили, В. И. Стволовые клетки и терапия будущего. Новейшие медицинские технологии, проблемы и перспективы / В. И. Бахуташвили, Б. М. Корсантия // Georg. Med. News. - 2004. - № 12. - С. 75-78.

7. Безбородов, А. М. Биосинтез биологически активных веществ микроорганизмами / А. М. Безбородов. - Л.: Медицина, 1969. - 245 с.

8. Блажевич, О. В. Культивирование клеток: курс лекций / О. В. Блажевич. -Минск: БГУ, 2004. - 78 с.

9. Быков, В. А. Микробиологическое производство биологически активных веществ и препаратов / В. А. Быков, И. А. Крылов, М. Н. Манаков, Н. С. Марквичев, Л. М. Орлова, Н. В. Тарасова; под ред. Н. С. Егорова, В. Д. Самуилова. - М.: Высш. шк., 1987. - 143 с.

10. Волкова, И. М. Характеристика мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга и жировой ткани крупного рогатого скота/ И. М. Волкова, Е. В. Викторова, И. П. Савченкова, М. И. Гулюкин //Сельскохозяйственная биология. - 2012. - № 2. - С. 32-38.

11. Гистология, цитология и эмбриология / под ред. Ю. И. Афанасьева, Н. А. Юриной; 5-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2002. - 744 с.

12. Глобальная стратегия по питанию, физической активности и здоровью / Пер. с англ.; Всемирная организация здравоохранения. - Швейцария: WHO Library Cataloguing-in-Publication Data, 2004. - 19 с.

13. Горностаева, С. Н. Миогенная дифференцировка мультипотентных мезенхимных стромальных клеток in vitro и in vivo: дис. ... канд. биол. наук: 03.00.25 / Горностаева Светлана Николаевна. - М., 2006. - 147 с.

14. Доклад о человеческом развитии 2011. Устойчивое развитие и равенство возможностей: лучшее будущее для всех / Пер. с англ.; ПРООН. - М.: Изд-во «Весь Мир», 2011. - 188 с.

15. Дэвени, Т. Аминокислоты, пептиды и белки / Т. Дэвени, Я. Гергей; под ред. д.б.н. Р. С. Незлина; перевод с английского к.м.н. А. Н. Маца. - М.: Мир, 1976.-364 с.

16. Елисеев, В. Г. Атлас микроскопического и ультрамикроскопического строения клеток, тканей и органов / В. Г. Елисеев, Ю. И. Афанасьев, Е. Ф. Котовский, А. Н. Яцковский. - М.: Медицина, 2004. - 448 с.

17. Иванкин, А. Н. Гидролиз нанобиомакромолекулярных систем / А. Н. Иванкин, А. А. Красноштанова. - М.: ГОУ ВПО МГУЛ, 2010. - 396 с.

18. Лисицын, А. Б. Изучение влияния длительного холодильного хранения на аминокислотный состав мяса / А. Б. Лисицын, И. М. Чернуха, Н. Л. Вострикова, Н. А. Горбунова // Сборник докладов 15-й международной научной конференции памяти В. М. Горбатова. - 2012. - Том 1. - С. 226-232.

19. Лисицын, А. Б. Производство мясной продукции на основе биотехнологии /А. Б. Лисицын, Н. Н. Липатов, Л. С. Кудряшов, В. А. Алексахина; под общ.

ред. академика Россельхозакадемии H. Н. Липатова. - М.: ВНИИМП, 2005. -369 с.

20. Несмеянов, А. Н. Искусственная и синтетическая пища / А. Н. Несмеянов и др. // Вестник АН СССР. - 1969. - № 1.

21. Остерман, J1. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование: практическое пособие / JT. А. Остерман. -М.: Наука, 1981.-288 с.

22. Патент: United States patent № US 6,835,390 Bl. Method for producing tissue engineered meat for consumption / Vein Jon - 28 Dec. 2004.

23. Патент: United States patent № US 7,270,829 B2. Industrial production of meat using cell culture methods / van Eelen W. F. - 18 Sept. 2007.

24. Патент: Пат. 2314719 Российская Федерация МПК7 C12N 5/06, А 23 L 1/31. Способ получения мясного продукта / Рогов И. А., Валихов А. Ф., Демин Н. Я., Кроха Н. Г., Лисицын А. Б., Семёнов Г. В., Титов Е. И., Тутельян В. А., Рогов С. И., Эрнст Л. К.: заявитель и патентообладатель ФАО ГОУ ВПО Московский государственный университет прикладной биотехнологии. - № 2006119540; заявл. 06.06.2006; опубл. 20.01.2008, бюл. №2.

25. Паюшина, О. В. Мезенхимные стволовые клетки: источники, фенотип и потенции к дифференцировке / О. В. Паюшина, Е. И. Домарацкая, В. И. Старостин // Изв. РАН. Сер. биол. - 2006. - № 1. - С. 6-25.

26. Петренко, А. Ю. Свойства мезенхимальных стромальных клеток из разных источников при 2D и 3D культивировании / А. Ю. Петренко, Ю.А. Петренко, А.И. Правдюк [и др.] // Вестник трансплантологии и искусственных органов. Материалы пятого всероссийского съезда трансплантологов. - 2010. - Том XII. - С. 249-250.

27. Практическая химия белка / под ред. А. Дарбре; перевод с англ к.х.н. Н. А. Алдановой, к.х.н. И. В. Назимова, к.х.н. П. Д. Решетова. - М.: Мир, 1989. -623 с.

28. Промышленная микробиология и успехи генетической инженерии: сборник / под ред. Г. К. Скрябина. - М.: Мир, 1984. - 172 с.

29. Рогов, И. А. Биотехнология мяса и мясопродуктов : курс лекций / И. А. Рогов, А. И Жаринов, JT. А Текутьева, Т. А. Шепель. - М.: ДеЛи принт, 2009.

- 296 с.

30. Рогов, И. А. Дифференцировка мультипотентных мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга и жировой ткани крупного рогатого скота, в клетки мышечной ткани in vitro / И. А. Рогов, И. М. Волкова, К. В. Кулешов, И. П. Савченкова // Сельскохозяйственная биология. - 2012. - № 6.

- С. 66-72.

31. Рогов, И. А. Химия пищи / И. А. Рогов, JI. В. Антипова, Н. И. Дунченко. -М.: КолосС, 2007.-853 с.

32. Рогов, И.А. Способ выращивания мяса in vitro. Обзор / И. А. Рогов, И. М. Волкова // Биозащита и биобезопасность. - 2012. - Т. IV, № 3 (12). - С. 2632.

33. Романов, Ю. А. Мезенхимальные стволовые клетки: биология и перспективы клинического применения. В кн. Биология стволовых клеток и клеточные технологии. Том 1. / Под ред. М. А. Пальцева. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», издательство «Шико», 2009. - С. 193-205.

34. Романов, Ю. А. Выбор оптимальных условий культивирования мезенхимальных клеток-предшественников костного мозга и жировой ткани человека / Ю. А. Романов, А. Н. Даревская, Н. В. Кабаева, О. А. Антонова //Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2006. — Т. 4. — С. 206 -211.

35. Савченкова, И. П. Дифференцировка мультипотентных мезенхимных стромальных клеток, выделенных из костного мозга и подкожно-жировой клетчатки человека, в клетки костной ткани / И. П. Савченкова, М. С. Ростовская, Н. И. Чупикова, С. 3. Шарифуллина, А. С. Тепляшин //Цитология. - 2008. - № 50 (10). - С. 855-860.

36. Савченкова, И. П. Методические наставления по выделению мультипотентных мезенхимных стволовых клеток из тканей взрослых особей млекопитающих, изучению их свойств и признаков / И. П.

Савченкова, Jl. К. Эрнст, М. И. Гулюкин, Е. В. Викторова. - М.: Издательство «Спутник+», 2010. - 23 с. ISBN 978-5-9973-0926-8.

37. Савченкова, И. П. Перспективы использования стволовых клеток в ветеринарии / И. П. Савченкова, М. И. Гулюкин // Ветеринария. - 2011.- № 7.-С. 3-5.

38. Сердечно-сосудистые заболевания/ Информационный бюллетень № 317; Всемирная Организация Здравоохранения. - Швейцария: WHO Library Cataloguing-in-Publication Data, 2011. - Режим доступа: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs317/ru/index.html.

39. Тепляшин, А. С. Сравнительный анализ двух клеточных популяций с фенотипом, подобным мезенхимным стволовым клеткам, выделенных из разных участков подкожно-жировой клетчатки / А. С. Тепляшин, Н. И. Чупикова, С. В. Коржикова, С. 3. Шарифуллина, М. С. Ростовская, 3. А. Топчиашвили, И. П. Савченкова // Цитология. - 2005. - № 7. - С. 637-643.

40. Тепляшин, А. С. Характеристика мезенхимальных стволовых клеток человека, выделенных из костного мозга и жировой ткани / А. С. Тепляшин, С. В. Коржикова, С. 3. Шарифуллина, Н. И. Чупикова, М. С. Ростовская, И. П. Савченкова // Цитология. - 2005. - № 47 (2). - С. 130-135.

41. Толстогузов, В. Б. Искусственные продукты питания. Новый путь получения пищи и его перспективы. Научные основы производства / В. Б. Толстогузов. - М.: Наука, 1978. - 232 с.

42. Уэбб, Ф. Биохимическая технология и микробиологический синтез / Ф.Уэбб. - М.: Медицина, 1969. - 358 с.

43. Фрешни, Р. Я. Культура животных клеток: практическое руководство / Р. Я. Фрешни; пер. 5-го англ. изд. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2010. -691 с.

44. Фриденштейн, А. Я. Клетки-предшественники для остеогенной и кроветворной тканей. Анализ гетеротропных трансплантатов костного мозга / А. Я. Фриденштейн, К. В. Петракова, А. И. Куралесова, Г. П. Фролова // Цитология. - 1968. - № 5. - С. 557-567.

45. Фриденштейн, А. Я. Остеогенные клетки-предшественники костного мозга радиохимер. Анализ методом гетеротопной трансплантации / А. Я. Фриденштейн, А. И. Куралесова // Онтогенез. - 1971. - № 2(5). - С. 458-465.

46. Фриденштейн, А. Я. Индукция костной ткани и остеогенные клетки-предшественники / А. Я. Фриденштейн, К. С. Лалыкина. - М.: Медицина, 1973.- 222 с.

47. Хенч, JI. Биоматериалы, искусственные органы и инжиниринг тканей/ JL Хенч, Д. Джонс; пер. с англ. Ю. J1. Цвирко; под ред. А. А. Лушниковой. -М.: Техносфера, 2007. - 303 с.

48. Цыренов, В. Ж. Основы биотехнологии: культивирование клеток человека и животных: учебно-методическое пособие, часть 3 / В. Ж. Цыренов. - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2005. - 48 с.

49. Чайлахян, Р. К. Клонообразование в монослойных культурах костного мозга / Р. К. Чайлахян, А. Я. Фриденштейн, А. В. Васильев // Бюлл. эксп. биол. мед. - 1970. - №2. - С. 94-96.

50. Чайлахян, Р. К. Перенос костномозгового микроокружения клонами стромальных механоцитов / Р. К. Чайлахян, Ю. В. Герасимов, А. Я. Фриденштейн // Бюлл. эксп. биол. мед. - 1978. - № 2. - С. 705-707.

51. Чупикова, Н. И. Получение и биологическая характеристика мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга человека и создание на их основе костных структур : дис. ... биол. наук: 03.00.23 и 16.00.03 / Чупикова Наталия Игоревна. - М., 2007. - 125 с.

52. Шарифуллина, С. 3. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки жировой ткани и использование их в создании трёхмерных трансплантатов хрящевой ткани : автореф. дис. ... канд. биол. наук : 03.00.23 и 16.00.03 /Шарифуллина Светлана Загировна. - М., 2007. - 20 с.

53. Baksh, D. Adult human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells are capable of adhesion-independent survival and expansión / D. Baksh, J. E. Davies, P. W. Zandstra // Experimental Hematology. - 2003. - Vol. 31. - P. 723-732.

54. Baksh, D. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy / D. Baksh, L. Song, R. S. Tuan // Journal of Cellular and Molecular Medicine. - 2004. - Vol. 8 (3). - P. 301-316.

55. Benjaminson, M. A. In vitro edible muscle protein production system (MPPS): Stage 1, Fish / Acta Astronautica. - 2002. - Vol. 51. - № 12. - P. 879-889.

56. Bhat, Z. F. Animal-free meat fabrication / Z. F. Bhat and Hina Bhat // American Journal of Food Technology. - 2011. - Vol. 6 (6). - P. 441-459.

57. Bianco, P. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications / P. Bianco, M. Riminucci, S. Gronthos [et al.] // Stem Cells. - 2001. -№ 19. - P. 180-192.

58. Bianco, P. Mesenchymal stem cells: revisiting history, concepts, and assays / P. Bianco, P. G. Robey, P. J. Simmons // Cell Stem Cell. - 2008. - Vol. 2 (4). - P. 313-319.

59. Bolsover, S. R. Cell Biology: a short course, second edition / S. R. Bolsover, J. S. Hyams, E. A. Shephard, H. A. White, C. G. Wiedemann. - Hoboken, New Jersey: A John Wiley & Sons, Inc., Publication, 2004. - 531 p.

60. Boonen, K. J. Essential environmental cues from the satellite cell niche: Optimizing proliferation and differentiation / K. J. Boonen, K. Y. Rosaria-Chak, F. P. Baaijens, D. W. van der Schaft, M. J. Post // American Journal of Physiology. Cell Physiology. - 2009. - Vol. 296 (6). P. 1338-1345.

61. Boonen, K. J. The muscle stem cell niche: Regulation of satellite cells during regeneration / K. J. Boonen, M. J. Post // Tissue Engineering. Part B, Reviews. -2008.-Vol. 14 (4).-P. 419-431.

62. Bosch, P. Isolation, characterization, gene modification, and nuclear reprogramming of porcine mesenchymal stem cells / P. Bosch, S. L. Pratt, S. L. Stice // Biology of reproduction. - 2006. - Vol. 74. - P. 46-57.

63. Bosnakovski, D. Chondrogenic differentiation of bovine bone marrowmesenchymal stem cells in pellet cultural system / D. Bosnakovski, M. Mizuno, G. Kim, T. Ishiguro [et al.] // Experimental Hematology. - 2004. - Vol. 32.-P. 502-509.

64. Bosnakovski, D. Isolation and multilineage differentiation of bovine bone marrow mesenchymal stem cells / D. Bosnakovski, M. Mizuno, G. Kim, S. Takagi, M. Okumura, T. Fujinaga // Cell Tissue Research. - 2005. - Vol. 319 (2). - P. 243-253.

65. Bruder, S. P. Growth kinetics, self-renewal and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation / S. P. Bruder, N. Jaiswal, S. E. Haynesworth // The Journal of Cell Biochemistry. - 1997. - № 64 - P. 278-294.

66. Campagnoli, C. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow / C. Campagnoli, I. A. Roberts, S. Kumar [et al.] // Blood. - 2001. - Vol. 98. P. 2396-2402.

67. Capper, J. L. The environmental impact of beef production in the United States: 1977 compared with 2007 / J. L. Capper // Journal of Animal Science. — 2011.— Vol. 89 (12).-P. 4249-4261.

68. CDC estimates of foodborne illness in the United States, 2012. - Режим доступа: http://www.cdc.Rov/foodborneburden/2011 -foodborne-estimates.html.

69. Cederberg, С. Including carbon emissions from deforestation in the carbon footprint of Brazilian beef / C. Cederberg, U. M. Persson, K. Neovius, S. Molander, R. Clift // Environmental Science & Technology. - 2011. - Vol. 45 (5). -P. 1773-1779.

70. Choi, S. C. 5-azacytidine induces cardiac differentiation of P19 embryonic stem cells / S. C. Choi, J. Yoon, W. J. Shim [et al.] // Experimental & Molecular Medicine. - 2004. - Vol. 36 (6). - P. 515-23.

71. Christman, J. K. 5-Azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy / J. K. Christman // Oncogene. - 2002. - Vol. 21. - P. 5483-5495.

72. Colleoni, S. Establishment, Differentiation, Electroporation, Viral Transduction, and Nuclear Transfer of Bovine and Porcine Mesenchymal Stem Cells / S. Colleoni, G. Donofrio, I. Lagutina, R. Duchi, C. Galli, and G. Lazzari // Cloning and stem cells. - 2005. - Vol. 7. - № 3. - P. 154-168.

73. Colter, D. C. Identification of subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells / D. C. Colter, I. Sekiya, D. J. Proctop // PNAS. - 2001. - № 98. - P. 7841-7845.

74. Da Silva, M. L. Murine marrow-derived mesenchymal stem cells: isolation, in vitro expansion, and characterization / M. L. da Silva and N. B. Nardi // British Journal of Hematology. - 2003. - Vol. 123 (4). - P. 702-711.

75. Datar, I. Possibilities for an in vitro meat production system / I. Datar, M. Betti //Innovative Food Science and Emerging Technologies. - 2010. - Vol. 11. - P. 13-22.

76. Dayton, W. R. Cellular and molecular regulation of muscle growth and development in meat animals / W. R. Dayton and M. E. White //Journal of Animal Science. - 2008, 86 (E. Suppl.): E217-E225 doi: 10.2527/jas.2007-045686.-P. E217-E225.

77. De Ugarte, D. A. Comparison of multi-lineage cells from human adipose tissue and bone marrow / D. A. de Ugarte, K. Morizono, A. Elbarbary [et al.] // Cells Tissues Organs. - 2003. - № 174. - P. 101-109.

78. Deans, R. J. Mesenchymal stem cells: Biology and potential clinical uses / R. J. Deans, A. B. Moseley // Exp. Hematology. - 2000. - № 28. - P. 875-884.

79. Di Rocco, G. Myogenic potential of adipose tissue derived cells / G. Di Rocco, M. G. Iachininoto, A. Tritarelli [et al.] // Journal of Cell Science. — 2006. — Vol. 119.-№ 14.— P. 2945-2952.

80. Doi, M. Molecular cloning and characterization of a novel gene, EMILIN-5, and its possible involvement in skeletal development / M. Doi, A. Nagano, Y. Nakamura // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2004. - Vol. 313. - P. 888-893.

81. Dominici, M. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement / M. Dominici, K. le Blanc, I. Mueller // Cytotherapy. - 2006. - Vol. 8. - P. 315-317.

82. Edelman, P. D. In Wiro-cultured meat production / P. D. Edelman, D. C. McFarland, V. A. Mironov and J. G. Matheny // Tissue engineering. - 2005. -Vol. 11 (5/6). - P. 659-662.

83. FAO. Livestock's long shadow — Environmental issues and options : FAO publications. - 2006.

84. Fiala, N. Meeting the Demand: An Estimation of Potential Future Greenhouse Gas Emissions from Meat Production / N. Fiala // Ecological Economics. - 2008. -Vol. 67(3).-P. 412-419.

85. Frazer, J. K. Fat tissue: an underappreciated source of stem cells for biotechnology / J. K. Frazer, I. Wulur, Z. Alfonso, M. H. Hedrick // TRENDS in biotechnology. - 2006. - Vol. 24. - № 4. - P. 150-154.

86. Friedenstein, A. J. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guineapig bone marrow and spleen cells / A. J. Friedenstein, R. K. Chailakhjan, K. S. Lalykina // Cell Tissue Kinet. - 1970. - Vol. 3. - P. 393-403.

87. Fridenshtein, A. J. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method / A. J. Fridenshtein, U. F. Deriglazova, N. N. Kulagina [et al.] // Exp. Hematol. - 1974. -№ 2.- P. 83-92.

88. Friedenstein, A. J. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs / A. J. Friedenstein, U. Gorskaja, N. N. Kulagina // Exp. Hematol. - 1976. - № 4. - P. 267-274.

89. Friedenstein, A. J. Radiosensitivity and postirradiation changes of bone marrow clonogenic stromal mechanocytes / A. J. Friedenstein, N. V. Latzinik, Y. F. Gorskaya [et al.] // International Radiobiol. - 1981. - № 3 (5). - P. 537-546.

90. Friedenstein, A. J. Osteogenic stem cells in bone marrow / A. J. Friedenstein, J. N. M. Heersche, J. A. Kanis // Bone and mineral research. - 1990. - № 24. - P. 32-37.

91. Fukuda, K. Use of adult marrow mesenchymal stem cells for regeneration of cardiomyocytes / K. Fukuda // Bone Marrow Transplantation. - 2003 Aug. - Vol. 32 (l).-P. 25-27.

92. Fukuda, K. Mesenchymal, but not hematopoietic, stem cells can be mobilized and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction in mice / K. Fukuda, J. Fujita // Kidney International. - 2005. - Vol. 68. - P. 1940-1943.

93. Greger, M. The human/animal interface: Emergence and resurgence of zoonotic infectious diseases / M. Greger // Critical Reviews in Microbiology. - 2007. -Vol. 33 (4). - P. 243-299.

94. Gutcho, M. H. Textured foods and allied products / M. H. Gutcho. - N. Y.: Noyes Data Corporation, Park Ridge, 1973. - 315 p.

95. Gutcho, M. H. Textured protein products / M. H. Gutcho. - New Jersey: Noyes Data Corporation, Park Ridge, 1977. - 355 p.

96. Haagsman, H. P. Production of animal proteins by cell systems / H. P. Haagsman, K. J. Hellingwerf, B. A. J. Roelen. - Utrecht: Faculty of Veterinary Medicine, October 2009.-58 p.

97. Heynesworth, S. E. Characterization of cells with osteogenic potential from the human bone marrow / S. E. Heynesworth, J. Goshima, V. M. Goldberg [et al.] //Bone, - 1995. - № 13. - P. 81-95.

98. Hopkins, P. D. Vegetarian meat: could technology save animals and satisfy meat eaters? / P. D. Hopkins, A. Dacey // Journal of Agricultural and Environmental Ethics. - 2008. - Vol. 21. - P. 579-596.

99. Horan, F. E. New protein foods, ch. 8; edited by A. M. Altschul. - New York -London : Acad. Press, 1974. - P. 366-411.

100. Horwitz, E. M. Clarification of the nomenclature for MSC: the International Society for Cellular Therapy position statement / E. M. Horwitz, K. Le Blanc, M. Dominici, I. Mueller, I. Slaper-Cortenbach, F. C. Marini, R. J. Deans, D. S. Krause, A. Keating // Cytotherapy. - 2005. - Vol. 7 (5). - P. 393-395.

101. Hung, S.-C. Isolation and characterization of size-sieved stem cells from human bone marrow / S.-C. Hung, N.-J. Chen, S.-L. Hsieh et al. //Stem Cells. - 2002. -№ 20.-P. 249-258.

102. Jones, P. A. Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation / P. A. Jones, S. M. Taylor // Cell. - 1980. - Vol. 20. - P. 85-93.

103. Kawada, H. Nonhematopoietic mesenchymal stem cells can be mobilized and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction / H. Kawada, J. Fujita, K. Kinjo [et al.] // Blood. - 2004. - Vol. 104 (12). - P. 3581-3587.

104. Key, T. J. Health benefits of a vegetarian diet / T. J. Key, G. K. Davey, P. N. Appleby // Proceedings of the Nutrition Society. - 1999. - Vol. 58 (2). P. 271275.

105. Koch, T. G. Isolation of mesenchymal stem cells from equine umbilical cord blood / T. G. Koch, T. Heerkens, P. D. Thomsen, D. H. Betts // BMC Biotechnology. - 2007. - Vol. 7. - P. 26.

106. Kook, S.-H. Satellite cells isolated from adult Hanwoo muscle can proliferate and differentiate into myoblasts and adipose-like cells / S.-H. Kook, Ki-C. Choi, Y.-Ok Son, K.-Y. Lee [et al.] // Moleculs and Cells. - 2006. - Vol. 22. - № 2. - P. 239-245.

107. Kuznetsov, S. A. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo / S. A. Kuznetsov, P. H. Krebsbach, K. J. Satomura [et al.] / Bone Miner. Res. - 1997. - № 12. - P. 13351347.

108. LaBarge, M. A. Biological progression from adult bone marrow to mononucleate muscle stem cell to multinucleate muscle fiber in response to injury / M. A. LaBarge, H. M. Blau // Cell. - 2002. - Vol. 111. -P. 589-601.

109. Langelaan, M. L. P. Meet the new meat: Tissue engineered skeletal muscle / M. L. P. Langelaan, K. J. M. Boonen, R. B. Polak, F. P. T. Baaijens, M. J. Post, D. W. J. van der Schaft // Trends in Food Science & Technology. - 2009. - doi: 10.1016/j.tifs.2009.11.001.

110. Larsson, S. C. Meat consumption and risk of colorectal cancer: A meta-analysis of prospective studies / S. C. Larsson & A. Wolk // International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. - 2006. Vol. 119 (11). P. 2657-2664.

111. Lennon, D. P. Isolation of rat marrow-derived mesenchymal stem cells / D. P. Lennon and A. I. Caplan // Experimental Hematology. - 2006. - Vol. 34 (11). - P. 1606-1607.

112. Levenberg, S. Engineering vascularized skeletal muscle tissue / S. Levenberg, J. Rouwkema, M. Macdonald, E. S. Garfein [et al.] // Nature biotechnology. - 2005. -Vol. 23,-№7.-P. 879-884.

113. Livak, K. J. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method / K. J. Livak, T. D. Schmittgen //Methods (San Diego, California). - 2001. - Vol. 25 (4). - P. 402-408.

114. Mackay, A. M. Chondrogenic differentiation of cultured human mesenchymal stem cells from marrow/ A. M. Mackay, S. C. Beck, J. M. Murphy, F. P. Barry, C. O. Chichester, M. F. Pittenger// Tissue Engineering. - 1998. Vol. 4. - P. 415-428.

115. Makino, S. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro /S. Makino, K. Fukuda, S. Miyoshi, F. Konishi, H. Kodama, J. Pan, M. Sano [et al.] // The Journal of Clinical Investigation. - 1999. - Vol. 103 (5). P. 697-705.

116. Marlow, H. J. Diet and the environment: does what you eat matter? / H. J. Marlow, W. K. Hayes, S. Soret, R. L. Carter, E. R. Schwab, and J. Sabate // The American Journal of Clinical Nutrition. - 2009. - Vol. 89. - P. 1S-5S.

117. Martin, I. The role of bioreactors in tissue engineering /1. Martin, D. Wendt, M. Heberer // TRENDS in biotechnology. - 2004. - Vol. 22. - № 2. - P. 80-86.

118. Mathiasen, A. B. Mesenchymal stromal cells for cardiovascular repair: current status and future challenges / A. B. Mathiasen, M. Haack-Sorensen, J. Kastrup //Future Cardiology. - 2009. - Vol. 5 (6). - P. 605-617.

119. Maximov, A. A. Der Lymphozyt als gemeinsame Stammcelle der verchidenen Blutelemente in der embrionalen Entwicklung und im postfetalen Leben den Slugetiere / A. A. Maximov // Folia Haematologica. - 1909. - Vol. 8. - P. 125134.

120. Minguell, J. J. Mesenchymal stem cells : Minireview / J. J. Minguell, A. Erices, P. Conget // Experimental Biology and Medicine. - 2001. - Vol. 226 (6). - P. 507520.

121. Moscoso, I. Analysis of Different Routes of Administration of Heterologous 5-Azacytidine-Treated Mesenchymal Stem Cells in a Porcine Model of Myocardial Infarction /1. Moscoso, J. Barallobre, O. M. de Ilarduya [et al.] // Transplantation Proceedings. - 2009. - Vol. 41. - P. 2273-2275.

122. Noort, W. A. Mesenchymal stromal cells to treat cardiovascular disease: strategies to improve survival and therapeutic results / W. A. Noort, D. Feye, F. van Den Akker [et al.] // Panminerva Medica. - 2010. - Vol. 52 (1). - P. 27-40.

123. Odell, A. D. Meat analogues from modified vegetable tissues / A. D. Odell // Proc. Int. Conf. Soybean Protein Foods. USDA-ARS Rept. — 1967. - № 71-35. - P. 163-169.

124. Opening doors to new possibilities : Key technologies for MSC research [Электронный ресурс]. - Life Technologies Corporation. - 2010. - Режим доступа: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Stem-Cell-Research/Mesenchymal-Stem-Cells/mesenchymal-stem-cell-sourcebook.html.

125. Orlic, D. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium / D. Orlic, J. Kajstura, S. Chimenti [et al.] // Nature. - 2001. - Vol. 410 (6829). - P. 701-705.

126. Owen, M. Marrow stromal stem cells / M. Owen // J Cell Sci. - 1988. - № 10. - P. 63-76.

127. Peters, G. M. Red meat production in Australia: Life cycle assessment and comparison with overseas studies / G. M. Peters, H. V. Rowley, S. Wiedemann, R. Tucker, M. D. Short, M. Schulz // Environmental Science & Technology. - 2010. -Vol. 44 (4).-P. 1327-1332.

128. Picou, A. A. Isolation and characterization of bovine adipose-derived somatic stem cells / A. A. Picou, R. A. MacLean, B. Dresser, R. A. Godke, K. R. Bondioli // Reproduction, Fertility and Development. - 2008. - Vol. 21 (4842). - P. 239240.

129. Pittenger, M. F. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells /М. F. Pittenger [et al.] // Science. - 1999. - Vol. 284. - P. 143-147.

130. Polak, J. Gene therapy progress and prospects: In tissue engineering / J. Polak, L. Hench // Gene Ther. - 2005. - Vol. 12. - № 24. - P. 1725-1733.

131. Post, M. J. Cultured meat from stem cells: Challenges and prospects / M. J. Post //Meat Science. - 2012. - Vol. 92. - P. 297-301.

132. Protein Quality Evaluation. Rep. of Joint FAO/WHO Expert Consultation. -Rome: FAO of UN, 1990. - 66 p.

133. Qi, H. Identification of genes responsible for osteoblast differentiation from human mesodermal progenitor cells / H. Qi, D. J. Aguiar, S. M. Williams, A. la Pean, W. Pan, C. M. Verfaillie // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2003. - Vol. 100. - P. 3305-3310.

134. Qu, C. Osteogenic and adipogenic potential of porcine adipose mesenchymal stem cells / C. Qu, G. Zhang, L. Zhang, G. Yang // In vitro cellular and developmental biology - animal. - 2007. - Vol. 43 (2). - P. 95-100.

135. Raoufi, M. F. Isolation and differentiation of mesenchymal stem cells from bovine umbilical cord blood / M. F. Raoufi, P. Tajik, M. M. Dehghan, F. Eini and A. Barin // Reproduction in Domestic Animals. - 2011. - Vol. 46. - P. 95-99.

136. Rentsch, C. Ovine bone marrow mesenchymal stem cells: isolation and characterization of the cells and their osteogenic differentiation potential on embroidered and surface-modified polycaprolactone-co-lactide scaffolds / C. Rentsch, R. Hess, B. Rentsch [et al.] // In vitro cellular and developmental biology - animal. - 2010. - Vol. 46 (7). - P. 624-634.

137. Ringe, J. Porcine mesenchymal stem cells: induction of distinct mesenchymal cell lineages / J. Ringe, C. Kaps, B. Schmitt, K. Buscher, J. Bartel, H. Smolian, O. Schultz, G. R. Burmester, T. Haupl, M. Sittinger // Cell and Tissue Research. -2002. - Vol. 307 (3). - P. 321-327.

138. Rodriguez L. V. Clonogenic multipotent stem cells in human adipose tissue differentiate into functional smooth muscle cells / L. V. Rodriguez, Z. Alfonso, R. Zhang [et al.] // PNAS. — 2006. — Vol. 103. - № 32. — P. 12167-12172.

139. Savchenkova, I. P. Osteogenic differentiation of multipotent mesenchymal stromal cells isolated from human bone marrow and subcutaneous adipose tissue /1. P. Savchenkova, M. S. Rostovskaya, N. I. Chupikova [et al.] // Cell and Tissue Biology. - 2008. - Vol. 2 (6). - P. 556-571.

140. Schmidinger, K. Worldwide Alternatives to Animal Derived Foods - Overview and Evaluation Models - Solutions to Global Problems caused by Livestock : diss. ... Dr. nat. techn. / Schmidinger Kurt. - Vienna, Austria, 2012. - 256 p.

141. Shim, W. S. Ex vivo differentiation of human adult bone marrow stem cells into cardiomyocyte-like cells / W. S. Shim, S. Jiang, P. Wong [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2004. - Vol. 324. - P. 481-488.

142. Short, B. Mesenchymal stem cells / B. Short, N. Brouard, T. Occhiodoro-Scott [et al.] // Arch Med Res. - 2003. - № 34 (6). - P. 565-571.

143. Slingenbergh, J. Ecological sources of zoonotic diseases / J. Slingenbergh, M. Gilbert, K. de Balogh, W. Wint // Revue Scientifique et Technique (International Office of Epizootics). - 2004. - Vol. 23 (2). - P. 467-484.

144. Smith, J. R. Isolation of a highly clonogenic and multipotential subtraction of adult stem cells from bone marrow stroma / J. R. Smith, R. Pochampally, A. Perry, S. C. Hsu, D. J. Prockop // Stem Cells. - 2004. - Vol. 22. - P.823-831.

145. Smith, R. K. Isolation and implantation of autologous equine mesenchymal stem cells from bone marrow into the superficial digital flexor tendon as a potential novel treatment / R. K. Smith, M. Korda, G. W. Blunn, A. E. Goodship // Equine veterinary journal. - 2003. - Vol. 35 (1). - P. 99-102.

146. Smith, R. L. Gras Flavoring Substances 24 / R. L. Smith, W. J. Waddell, S. M. Cohen [et al.] // Food Technology. - 1973. - Vol. 27. - № 8. - 79 p.

147. Song, L. Transdifferentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow / L. Song, R. S. Tuan // The Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. - 2004. - Vol. 18. - P. 980-982.

148. Song, Y. A prospective study of red meat consumption and type 2 diabetes in middle-aged and elderly women: The women's health study / Y. Song, J. E. Manson, J. E. Buring, S. Liu // Diabetes Care. - 2004. Vol. 27 (9). P. 2108-2115.

149. Steinfeld, H. Livestock in a changing landscape. Vol. 2 / H. Steinfeld, H. A. Mooney, F. Schneider. - Washington D.C: Island Press, 2010.

150. Stem Cells: handbook / edited by Stewart Sell. - Totowa, New Jersey 07512: Humana Press, 2004. - 511 p.

151. Strazzullo, M. Genomic Characterization and Chromosomal Mapping of 5 River Buffalo Skeletal Muscle Differentiation Master Genes / M. Strazzullo, C. Rossetti, G. Fusco [et al.] // Cytogenetic and Genome Research. - 2010. - Vol. 128. - P. 221-227.

152. Su, Z. All-trans retinoic acid promotes smooth muscle cell differentiation of rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells / Z. Su, Y. Li, X. Zhao and M. Zhang // Journal of Zhejiang University-SCIENCE B (Biomedicine & Biotechnology). - 2010. - Vol. 11 (7). - P. 486-496.

153. Suva, D. Non-hematopoietic human bone marrow contains longlasting, pluripotential mesenchymal stem cells / D. Suva, G. Garavaglia, J. J. Menetrey //Cell Physiol. - 2004. - Vol. 198. - P. 110-118.

154. The in vitro meat consortium preliminary economics study. Project 29071. -March 2008,-Vol. 5,- 14 p.

155. Thornton, P. K. Livestock production: recent trends, future prospects / P. K. Thornton // Philosophical transactions of the royal society. - 2010. - Vol. 365. -P. 2853-2867.

156. Toumisto, H. L. Environmental impacts of cultured meat production / H. L. Toumisto and M. J. T. de Mattos // Environmental Science and Technology. -2011.-Vol. 45.-P. 6117-6123.

157. Wakitani, S. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine / S. Wakitani, T. Saito, A. I. Caplan // Muscle & Nerve. - 1995. - Vol. 18. - P. 1417 - 1426.

158. Wang, T. Cell-to-cell contact induces mesenchymal stem cell to differentiate into cardiomyocyte and smooth muscle cell / T. Wang, Z. Xu, W. Jiang, A. Ma //International Journal of Cardiology. - 2006. - Vol. 109. - P. 74-81.

159. Zhao, L. R. Human bone marrow stem cells exhibit neural phenotypes and ameliorate neurological deficits after grafting into the ischemic brain of rats / L. R. Zhao, W. M. Duan, M. Reyes, C. D. Keene, C. M. Verfaillie, W. C. Low //Experimental Neurology. - 2002. - Vol. 174. - P. 11-20.

160. Zhaodi Gong, M. D. Influence of Culture Medium on Smooth Muscle Cell Differentiation from Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells /M. D. Zhaodi Gong, B. S. Geoffrey Calkins, Ee-chun Cheng [et al.] // Tissue Engineering: Part A. - 2009. - Vol. 15. - № 2. - P. 319-330.

161. Zuk, P. A. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells / P. A. Zuk, M. Zhu, P. Ashjian [et al.] // Molecular Biology of the Cell. - 2002. - Vol. 13 (1). -P. 4279-4295.

162. Zuk, P. A. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell based therapies / P.A. Zuk, M. Zhu, H. Mizuno [et al.] // Tissue Engineering. — 2001. —Vol. 7. —P. 211-218.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

И1111 - искусственные пищевые продукты;

ММСК - мультипотентные мезенхимные стромальные/стволовые клетки;

ЖТ - жировая ткань;

КМ - костный мозг;

КРС - крупный рогатый скот;

СК - стволовые клетки;

СКПК - сыворотка крови плодов коров;

ФСБ-2 - физиологический раствор, забуференный фосфатами, без ионов Са2+ и М§2+(рН-7,2);

ВМЕМ-1Хт - среда Игла в модификации Дюльбекко с низким содержанием глюкозы 1 г/л; АГ - антиген; АТ - антитела;

МАТ - моноклональные антитела; ПЦР - полимеразная цепная реакция;

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени; ОТ-ПЦР - обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией;

Ш электрофорез - одномерный электрофорез;

ПААГ - полиакриламидный гель;

ЛЦ - легкие цепи миозина;

НАК - незаменимые аминокислоты;

ЗАК - заменимые аминокислоты.