Разработка и использование препаратов растительного происхождения в технологиях создания гриппозных вакцин тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, доктор биологических наук Мазуркова, Наталья Алексеевна

• Мазуркова, Наталья Алексеевна
• доктор биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации доктор биологических наук Мазуркова, Наталья Алексеевна

Главы Стр.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕН™

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гриппозные вакцины в современном арсенале иммунопрофилактики

1.1.1. Инактивированные гриппозные вакцины

1.1.2. Живые аттенуированные гриппозные вакцины

1.2. Эффективность и объемы современного производства гриппозных вакцин

1.3. Подходы к созданию гриппозных вакцин нового поколения

1.3.1. Рекомбинантные вакцины

1.3.2. ДНК-вакцины

1.3.3. Растительные вакцины

1.3.4. Синтетические вакцины на основе пептидов

1.3.4.1. Вакцины на основе консервативных последовательностей протеинов М2е и NP вируса гриппа

1.3.4.2. Вакцины на основе консервативных последовательностей протеина НА

1.3.4.3. Вакцины на основе комбинаций вариабельных и консервативных эпитопов различных протеинов вируса гриппа

1.4. Культуральные гриппозные вакцины

1.4.1. Клеточные линии в качестве субстрата культуральных гриппозных вакцин

1.4.2. Инактивированные культуральные гриппозные вакцины

1.4.3. Живые культуральные гриппозные вакцины

1.4.4. Питательные среды, ферменты, стабилизаторы, используемые при производстве культуральных гриппозных вакцин

1.5. Адыованты для повышения иммуногенности гриппозных вакцин

1.6. Иммуномодуляторы, используемые для повышения эффективности гриппозных вакцин

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.2. Методы

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 107 3.1. Разработка технологии приготовления питательной среды на основе соевого гидролизата

3.1.1. Конструирование питательной среды на основе соевого гидролизата, полученного с использованием бромелаина, для перевиваемых линий клеток MDCK и Vero

3.1.2. Изучение влияния экспериментальных питательных сред на биологические свойства перевиваемых линий клеток MDCK и

3.1.2.1. Изучение пролиферативных, морфологических и кариологических характеристик перевиваемых линий клеток MDCK и Vero при культивировании в экспериментальных питательных средах

3.1.2.2. Контроль контаминации перевиваемых линий клеток MDCK и Vero при культивировании в экспериментальных питательных средах

3.2. Оценка возможности использования питательных сред на основе растительных компонентов для выращивания вакцинных штаммов вируса гриппа в перевиваемых линиях клеток MDCK и Vero

3.2.1. Исследование репродукции вакцинных штаммов для изготовления инактивированной гриппозной вакцины на перевиваемых линиях клеток MDCK и Vero, выращенных в экспериментальных питательных средах

3.2.2. Исследование репродукции вакцинных штаммов для изготовления живой гриппозной вакцины на перевиваемых линиях клеток MDCK и Vero, выращенных в экспериментальных питательных средах

3.2.3. Изучение влияния ферментов растительного происхождения на репродуктивную активность вакцинных штаммов вируса гриппа в перевиваемых линиях клеток

3.2.3.1. Изучение возможности замены трипсина на растительные протеазы папаин и бромелаин при культивировании вакцинных штаммов вируса гриппа в клетках MDGK ;

3.2.3.2. Оценка возможности применения растительных протеаз для культивирования вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 в перевиваемых линиях клеток

MDCK и Vero

3.2.4. Оценка наработки вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 в перевиваемых линиях клеток

MDCK и Vero при использовании растительных препаратов

3.2.5. Ультраструктурные характеристики репликации вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 в перевиваемых линиях клеток MDCK и Vero при использовании растительных препаратов

3.2.6. Фенотипическая и генетическая стабильность холодоадаптированных реассортантных вакцинных штаммов вируса гриппа при культивировании на клеточных линиях

MDCK и.Vero с использованием растительных препаратов

3.2.6.1. Определение фенотипических признаков са+25 и ts".)0 реассортантных вакцинных штаммов вируса гриппа A/H1N1, A/H3N2 и В

3.2.6.2. Оценка фенотипической и генетической стабильности вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 при культивировании на клеточных линиях MDCK и Vero с использованием растительных препаратов

3.3. Изучение особенностей культивирования клеточных линий MDCK и Vero в экспериментальных питательных средах в роллерах

3.4. Изучение особенностей культивирования вакцинных штаммов вируса гриппа, используемых для производства инактивированной вакцины, в роллерах с использованием растительных препаратов

3.5. Изучение особенностей культивирования вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 в роллерах с использованием растительных препаратов

3.5.1. Изучение особенностей культивирования вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 в роллерах на клеточных линиях MDCK и Vero с использованием растительных препаратов

3.5.2. Изучение влияния растительных препаратов на генетическую и фенотическую стабильность полученного в роллерах на клеточных линиях MDCK и Vero вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/

3.6. Изучение возможности использования растительных компонентов в составе защитных сред при сублимационном высушивании полученного в перевиваемых клеточных линиях вакцинного штамма вируса гриппа

А/17/утка/Потсдам/86/

3.7. Изучение иммуногенности и протективной активности на лабораторных животных сухих вакцинных образцов, содержащих штамм вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92, приготовленных с использованием растительных препаратов

3.8. Изучение изменений иммунного ответа лабораторных животных на пептид-белковые копъюгаты под влиянием пептидогликана растительного происхождения Иммуномакс 235 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 254 ВЫВОДЫ 269 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 271 ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АБ - антибиотики

АК - аминокислота

АМН - Академия медицинских наук

АТ - антитело

БОЕ - бляшкообразующая единица

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВАЖ - вирусаллантоисная жидкость вг - вирус гриппа вкж - вируссодержащая культуральная жидкость

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения впгп - высокопатогенный грипп птиц

ГНЦВБ - Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии

ГФ - Государственная фармакопея

ЖГВ - живая гриппозная вакцина

ИТВ - инактивированная гриппозная вакцина ид50 - 50 %-ная инфицирующая доза ип - индекс пролиферации

ИФА — иммуноферментный анализ

КЗ - коэффициент защиты

КРИМ - конкурентный радиоиммунологический метод

ЛДзо - 50 %-ная летальная доза мАТ - моноклональное антитело

МГУ — Московский Государственный Университет

МЗиСР - Министерство здравоохранения и социального развития

МИБГТ - медицинский иммунобиологический препарат

НИИ - научно-исследовательский институт

НПО - научно-производственное объединение

ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция

ПЛ1С - перевиваемая линия клеток

ПС - питательная среда

ПСРТ - питательная среда на основе гидролизата риса, полученного с помощью трипсина

ПССБ - питательная среда на основе гидролизата сои, полученного с помощью бромелаина

ПССТ - питательная среда на основе гидролизата сои, полученного с помощью трипсина

РАМН - Российская академия медицинских наук

РГА - реакция гемагглютинации

РИА - радиоиммунологический анализ

РКЭ - развивающийся куриный эмбрион

РМН - реакция микронейтрализации

РН - реакция нейтрализации

РНП - рибонуклеопротеид

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

РФ - Российская Федерация

САЖ - сахарозо-желатиновая среда

СЗО - Северо-Западное отделение

СКПК - сыворотка крови плодов коровы

СПЖ - средняя продолжительность жизни

ТЦД50 - 50 %-ная тканевая цитопатическая доза

ФБУН - Федеральное бюджетное учреждение науки

ФГБУ - Федеральное государственное бюджетное учреждение

ФГУГТ - Федеральное государственное унитарное предприятие

ФС - фармакопейная статья

ЦТЛ - цитотоксический лимфоцит

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭП - эритроциты петуха

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

ЭИД50 - 50 %-ная эмбриональная инфицирующая доза

А - аденин

С - цитозин

Е - глутаминовая кислота

G - глицин

Glu - глутаминовая кислота

Gly - глицин

НА - гемагглютинин вируса гриппа

НА1 - тяжелая цепь гемагглютинина

НА2 - легкая цепь гемагглютинина

IgA - иммуноглобулин А

IgG - иммуноглобулин G

М1 - матриксный белок вируса гриппа

М2 - белок ионного канала вируса гриппа

MDCK - культура клеток почки взрослой самки кокер-спаниеля

МНС - белки главного комплекса гистосовместимости

NP - нуклеопротеидный белок вируса гриппа

NS1 - неструктурный белок 1 вируса гриппа

РА - полимеразный белок РА вируса гриппа

РВ1 - полимеразный белок РВ1 вируса гриппа

РВ2 - полимеразный белок РВ2 вируса гриппа

Т - тимин

Vero - культура клеток почки взрослой африканской зеленой мартышки

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка и использование препаратов растительного происхождения в технологиях создания гриппозных вакцин»

Грипп является одним из самых распространенных вирусных респираторных заболеваний человека, поражающим, по данным ВОЗ, во время сезонных эпидемий от 10 до 20 % всего населения и до 40-60 % пожилых людей. Число случаев тяжелой формы заболевания гриппом доходит до 3-5 миллионов в год, а количество летальных исходов - до 250-500 тыс. [318]. В России ежегодно регистрируют от 27,3 до 41,2 млн. случаев гриппа и других ОРВИ [407]. Во время пандемий эти показатели могут возрастать в 3-4 раза. В прошлом столетии отмечено три пандемии гриппа, вызванные вирусами субтипов А/НШ1 (1918 г.), А/Н2Ш (1957 г.), А/НЗЫ2 (1968 г.). В последние годы активно обсуждается вопрос о возможности возникновения новой пандемии гриппа [459, 425, 261]. Из известных 15 субтипов вируса гриппа А субтип А/1-15М1 (грипп птиц, «птичий грипп») обладает наиболее высоким пандемическим потенциалом: высоко летален (смертность людей достигает 60 %), быстро мутирует и вступает в реассортацию с вирусами других субтипов, циркулирующими среди птиц и различных животных, в том числе млекопитающих [135, 444]. Полагают, что генетическая реассортация вируса гриппа субтипа А/Н5Т\Г1 с сезонным вирусом гриппа человека может привести к возникновению нового высоко патогенного пандемического варианта [332].

Важной частью противоэпидемических мероприятий по ограничению распространения инфекции, вызванной вирусом гриппа, и снижению смертности во всех группах человеческой популяции является вакцинопрофилактика, осуществляемая с помощью живых и инактивированных вакцин. В настоящее время в России единственным разрешенным субстратом для производства обоих типов гриппозных вакцин являются развивающиеся куриные эмбрионы. Этот субстрат далеко не идеален: помимо возможной контаминации инфекционными агентами, получение куриных эмбрионов и, соответственно, производство аллантоисных вакцин может быть блокировано при вспышке гриппа птиц. В связи с этим становится особенно актуален перевод производства гриппозных вакцин на иной субстрат, которым могут стать перевиваемые клеточные линии, использование которых позволяет развернуть быстрое и масштабное изготовление культуральных вакцин [305]. Следовательно, разработка эффективных культуральных вакцин, в том числе и против пандемического гриппа, - вопрос крайне важный.

ВОЗ с 1995 г. рекомендует разрабатывать и производить гриппозные вакцины с использованием в качестве субстрата перевиваемых культур клеток, аттестованных в соответствии с международными требованиями к клеточным субстратам [463]. Возможность изготовления инактивированных культуральных вакцин убедительно доказана при использовании клеток Vero и MDCK. Так, в Европе разработаны и разрешены к применению для сезонной профилактики гриппа культуральные инактивированные вакцины, приготовленные на клеточных линиях MDCK (Influvac ТС, Solvay) и Vero (Influject, Baxter) [470]. В России зарегистрирована субъединичная гриппозная вакцина Гриппол®Нео, содержащая иммупоадъювант Полиоксидоний® (производства ФК «ПЕТРОВАКС», Россия) и протективные антигены (гемагглютинин и нейраминидаза) эпидемически актуальных, выращенных в клетках MDCK, штаммов вируса гриппа субтипов A (H1N1 и H3N2) и типа В (производства «Солвей Биолоджикалз Б.В.», Нидерланды) [10]; в настоящее время вакцина Гриппол®Нео не выпускается.

В случае пандемии, когда у большей части населения отсутствует специфический иммунитет, однократная иммунизация живой вакциной может оказаться более эффективной, чем аналогичная инактивированной. В связи с этим ВОЗ рекомендует, учитывая высокую урожайность штаммов ЖГВ, перейти с выпуска ИГВ на ЖГВ. Это позволит в течение 6-и месяцев произвести достаточное количество вакцины для иммунизации всех групп населения [464], а перевод производства ЖГВ с куриных эмбрионов на клеточные культуры позволит сократить эти сроки до 2-3-х месяцев. Важную роль в разработке безопасной и эффективной живой культуральной вакцины против пандемического и сезонного гриппа должны сыграть новые технологии на основе клеточных культур.

Использование культуральных технологий требует наличия сертифицированных клеточных линий. Линия клеток Vero уже более 20 лет разрешена ВОЗ для производства вирусных вакцин для человека [309]. В ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Россия) имеется аттестованный в соответствии с требованиями ВОЗ банк клеточной линии MDCK [58].

В настоящее время в России несколькими исследовательскими группами ведутся разработки живой культуральной гриппозной вакцины. В НИИ гриппа разрабатывается живая рекомбинантная delNS-вакцина на основе штаммов вируса гриппа с делетированным геном NS1 и культуры клеток Vero [28]. В ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» совместно с НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН ведется разработка живой вакцины «Вектор-Флю» против пандемического гриппа A/H1N1 на основе вакцинного штамма А/17/Калифорния/2009/38 с использованием линии клеток MDCK и импортной бессывороточной среды [45].

Безопасность вакцинных препаратов является их важнейшей характеристикой. В 1999 г. государственные агентства, контролирующие производство фармацевтической продукции в Европе (European Medicine Evaluation Agency, EMEA) и в США (Food and Drug Administration, FDA), призвали ведущие фармацевтические компании исключить или ограничить использование компонентов животного происхождения в производстве вакцин [132], что подчеркивает актуальность разработки технологий, позволяющих заменять препараты животного и человеческого происхождения продуктами растительной природы. Ряд исследователей разрабатывают среды для культур клеток млекопитающих, свободные от животных компонентов. Так, при производстве культуральных гриппозных вакцин перевиваемые линии клеток выращивают в бессывороточных питательных средах: MDCK - в средах MDSS2 и MDSS2N (Франция) [305], EpiSerf (Gibco) (Голландия) [92, 330], UltraMDCK (BioWHITTAKER); Vero - в среде ЕМ (Axell Biotechnologies) (Австрия) [257, 258, 259].

В России в настоящее время не существует отечественных бессывороточных и малосывороточных культуральных питательных сред для клеток MDCK и Vero, а импортные дороги, что делает их использование нерентабельным при масштабном производстве. Следовательно, разработка для клеточного субстрата гриппозных вакцин отечественных культуральных сред, не содержащих сыворотку или содержащих ее в сниженных концентрациях, является крайне актуальной. Среды на основе ферментативных гидролизатов растительного сырья могут быть весьма перспективными для культуральных технологий гриппозных вакцин, которые должны отвечать все более жестким критериям биологической безопасности.

В соответствии с критериями безопасности при производстве культуральной гриппозной вакцины крайне важно вместо препаратов животного происхождения (сыворотки и трипсина в составе питательных сред, желатина (желатозы) в составе стабилизатора для живой вакцины) использовать растительные продукты.

Стоимость вакцинного препарата имеет немаловажное значение для v * обеспечения вакциной против пандемического гриппа всего населения [53], и она может быть значительно снижена при применении отечественных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов доступного растительного сырья.

Биотехнологический подход на основе использования синтетических пептидов, соответствующих АК последовательностям тех сайтов гемагглютинина, которые распознаются иммунной системой и вызывают протективный иммунный ответ, является еще одним способом повышения безопасности гриппозных вакцин. Вакцины на основе консервативных сайтов могут обеспечить защиту против всех типов вируса гриппа, включая появляющиеся пандемические штаммы. ВОЗ одобрила рекомендации по разработке и контролю синтетических пептидных вакцин [203].

Цель исследования. Цель настоящей работы - разработать и апробировать препараты на основе материалов растительного происхождения для получения эффективных и безопасных культуральных и пептидных гриппозных вакцин.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Сконструировать бессывороточные и малосывороточные питательные среды на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с использованием растительного протеолитического фермента бромелаина.

2. Апробировать бессывороточные и малосывороточные питательные среды на основе ферментативных гидролизатов соевой и рисовой муки, полученных с помощью бромелаина и трипсина, для культивирования перевиваемых линий клеток MDCK и Vero и оценить их влияние на морфологические, пролиферативные и кариологические характеристики клеток, а также на чувствительность клеток к штаммам вируса гриппа, используемым для производства инактивированной и живой гриппозной вакцины.

3. Оценить возможность замены трипсина на растительные протеазы папаин и бромелаин в составе питательных сред на основе ферментативных гидролизатов растительного сырья и определить оптимальные условия их применения для максимального накопления в перевиваемых линиях клеток MDCK и Vero штаммов вируса гриппа для производства инактивированной (субтипов A/H1N1, A/H3N2 и типа В) и живой вакцины (субтипа A/H5N2).

4. Провести сравнительное исследование ультраструктурных параметров репродукции вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) в культурах клеток MDCK и Vero при культивировании в экспериментальных средах на основе растительных компонентов и контрольных средах и при замене трипсина на папаин и бромелаин.

5. Разработать и апробировать стабилизатор на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с помощью бромелаина, в качестве средства сохранения в процессе лиофильного высушивания максимальной инфекционной активности выращенного в перевиваемой линии клеток MDCK вакцинного штамма вируса гриппа субтипа A/H5N2.

6. Определить оптимальные условия использования растительных препаратов (питательных сред, ферментов и стабилизатора) на основных стадиях разработки живой культуральной вакцины против вируса гриппа субтипа A/H5N2 в роллерах.

7. Оценить генетическую и фенотипическую стабильность вакцинного штамма вируса гриппа субтипа A/H5N2, выращенного на перевиваемой линии клеток MDCK с использованием растительных препаратов (питательных сред, ферментов и стабилизатора), а также его иммуногенность на экспериментальных моделях животных.

8. Оценить влияние растительного имуномодулятора Иммуномакс на иммунный ответ экспериментальных животных при иммунизации их синтетическими пептидами НА1 гемагглютинина вируса гриппа субтипа A/H3N2.

Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые:

- сконструирована культуральная малосывороточная питательная среда на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с помощью растительного протеолитического фермента бромелаина, и изучены ее физико-химические свойства;

- доказана пригодность и перспективность применения разработанной питательной среды на основе ферментативного гидролизата соевой муки для наработки перевиваемых линий клеток MDCK и Vero и вируса гриппа;

- экспериментально обосновано применение растительных протеаз (папаина и бромелаина) в составе гидролизатных питательных сред и определены оптимальные биотехнологические условия их использования для накопления в перевиваемых линиях клеток MDCK и Vero вируса гриппа в производстве инактивированной и живой вакцины, позволяющие обеспечить выход вирусной массы, сравнимый с таковым при применении трипсина;

- экспериментально установлено, что использование экспериментальных сред на основе ферментативных растительных гидролизатов и растительных протеаз не влияет на морфогенез и репродуктивную активность вируса гриппа субтипа A/H5N2 при культивировании его в клетках MDCK и Vero; экспериментально показано, что применение стабилизатора, сконструированного на основе ферментативного гидролизата сои, полученного с помощью бромелаина, обеспечивает в процессе лиофильного высушивания максимальное сохранение инфекционной активности наработанного в клетках МБСК вакцинного штамма вируса гриппа субтипа А/Н5Ы2; экспериментально показано, что использование растительных препаратов не влияет на генетическую стабильность вакцинного штамма вируса гриппа субтипа А/Н5Ы2 и на параметры иммунного ответа при введении этого штамма лабораторным животным; экспериментально показано, что применение растительного иммуномодулятора Иммуномакс в качестве адъюванта усиливает иммунный ответ на синтетические пептиды из вариабельного и консервативного сайтов НА1 гемагглютинина вируса гриппа А/НЗЫ2.

Приоритет и новизна научных разработок диссертации защищены 2 патентами РФ (№ 2330885, № 2377295).

Практическая значимость работы. Экспериментально обосновано использование растительных препаратов (питательных сред, ферментов, стабилизатора) на основных стадиях роллерной технологии разработки безопасной и эффективной культуральной живой вакцины против гриппа субтипа А/Н5Ш.

Показаны экономические преимущества применения питательной среды на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с использованием бромелаина, для создания и производства культуральных гриппозных вакцин.

Установленные параметры применения растительных препаратов при разработке и производстве культуральных гриппозных вакцин обеспечат повышение их безопасности.

Внедрение растительных препаратов в производство культуральных гриппозных вакцин позволит отказаться от дорогостоящих импортных компонентов.

Положения, выносимые на защиту.

1. Экспериментальная питательная среда на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с помощью растительного протеолитического фермента бромелаина, содержащая сниженное количество (с 5-10 % до 2 и 3 %) сыворотки, пригодна для культивирования перевиваемых линий клеток MDCK и Vero, являющихся субстратом для культуральных гриппозных вакцин.

2. Использование растительных ферментов бромелаина и папаина в составе питательных сред на основе ферментативных гидролизатов сои и риса позволяет получать высокие инфекционные титры вирусов гриппа (9,0-9,5 lg ТЦД50/мл) для производства инактивированной и живой вакцин в перевиваемых линиях клеток MDCK и Vero. Максимальное накопление вакцинных штаммов вируса гриппа для живой и инактивированной гриппозной вакцины в клеточных линиях MDCK и Vero при использовании растительных препаратов (сред и ферментов) зависит от множественности инфекции, вида и концентрации протеазы, адаптации штаммов вируса к ¡слеткам. Для живой гриппозной вакцины критическим является время сбора «урожая» вируса.

3. Стабилизатор, содержащий 10 % сахарозы и 5 % соевого гидролизата, полученного с помощью бромелаина, обеспечивает сохранение инфекционной активности вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2), выращенного в перевиваемой клеточной линии MDCK при использовании питательной среды на основе ферментативного гидролизата сои и в присутствии бромелаина, на стадии сублимационного высушивания и при хранении в течение 1 года.

4. Усовершенствование технологии приготовления живой культуральной гриппозной вакцины субтипа A/H5N2 с использованием растительных препаратов включает (1) наработку клеток MDCK в роллерах в малосывороточной (2 %) среде на основе ферментативного гидролизата сои, полученного с использованием бромелаина; (2) накопление в присутствии 20 мкг/мл бромелаина холодоадаптированного вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) в выращенных клетках; (3) введение в культуральную вируссодержащую жидкость стабилизатора, содержащего 10 % сахарозы и 5 % соевого гидролизата, полученного с помощью бромелаина; (4) сублимационное высушивание.

5. Сухие культуральные (MDCK) вакцинные образцы, содержащие штамм вируса гриппа субтипа A/H5N2, полученные с использованием растительных препаратов, генетически стабильны и иммуногенны для мышей. При двукратной интраназальиой иммунизации животных они индуцируют выработку системных и локальных антител не только к гомологичному вирусу, но и к высокопатогенным вариантам вируса гриппа птиц A/H5N1.

6. Применение растительного иммуномодулятора Иммуномакс обеспечивает усиление иммунного ответа у мышей при иммунизации синтетическими пептидами из вариабельного и консервативного сайтов тяжелой цепи гемагглютинина вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2), без дополнительного введения адъюванта Фрейнда.

Внедрение результатов работы. Разработаны и утверждены в ФБУН ГІ-Щ ВБ «Вектор» СОП на основные стадии создания живой культуральной гриппозной вакцины субтипа A/H5N2 с использованием растительных препаратов: СОП № 3-007/01-12 «Получение ферментативного гидролизата соевой муки с использованием бромелаина», СОП № 3-006/01-12 «Выращивание клеток перевиваемых линий MDCK и Vero в роллерах в питательной среде на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с использованием бромелаина», СОП № 3-005/01-12 «Репродукция холодоадаптированного вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) в присутствии бромелаина или папаина в перевиваемой клеточной линии MDCK, выращенной в роллерах в питательной среде на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с использованием бромелаина». Разработаны технические условия «Ферментативный гидролизат соевой муки, полученный с помощью бромелаина, для научных исследований, сухой». Результаты работы внедрены в практику преподавательской работы кафедры фармацевтической технологии и биотехнологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет».

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 7-й, 8-й и 9-й Международных конференциях «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Гурзуф, Украина, 1999, 2000, 2001), Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию НИИ проблем биологической безопасности «Биотехнология в Казахстане: Проблемы и перспективы инновационного развития» (Алматы, Казахстан, 2008), Международной научно-практической конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа» (Новосибирская область, Кольцово, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2010), Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы науки и образования» (Варадеро, Куба, 2011), Международной научно-практической конференции «Новые технологии, инновации, изобретения» (Мальдивские острова, 2011), Международной научно-практической конференции «Приоритетные направления развития науки, технологий и техники» (Рим-Флоренция, Италия, 2011), Международной научно-практической конференции «Инновационные медицинские технологии» (Москва-Париж, Россия-Франция, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 40 печатных работ, в том числе 21 статья (16 статей - в журналах, рекомендованных ВАК), 2 патента и 17 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 305 страницах текста, состоит из глав: «введение», «обзор литературы», «материалы и методы», «результаты и обсуждение», «заключение», «выводы» и списка литературы, который содержит 482 источника, из них 79 отечественных и 403 -иностранных. Диссертация включает 66 таблиц и 20 рисунков.

Личный вклад автора. Идея, тема и план диссертации сформулированы автором на основании многолетних исследований (1985-2011 г. г.). Основная часть результатов получена и представлена для опубликования автором самостоятельно, а также при участии д-ра мед. наук, проф. Подчерняевой Р.Я. (исследования сред на клеточных линиях MDCK(II) и Vero(B)), д-ра мед. наук, проф. Исаевой Е.И. (вирусологические исследования на клеточных линиях MDCK(II) и Vero(B)), канд. мед. наук Михайловой Г.Р. (кариологический анализ), д-ра биол. наук, проф. Рябчиковой Е.И. (электронно-микроскопические исследования), д-ра биол. наук, проф. Трошковой Г.П. (получение гидролизатов с использованием трипсина), д-ра хим. наук Баратовой J1.A. (аминокислотный анализ), Скарнович М.О. (сублимационное высушивание образцов), канд. хим. наук Самукова В.В (синтез пептидов). Вклад в работу других авторов отражен в публикациях по теме диссертации.

Автором лично или под ее руководством проведены: разработка оптимальных условий проведения гидролиза соевой муки с использованием бромелаина; изучение ростовых свойств питательных сред на основе гидролизатов растительного сырья; определение оптимальных условий роллерного культивирования перевиваемых линий клеток MDCK и Vero в экспериментальных питательных средах на основе гидролизатов растительного сырья; определение оптимальных условий выращивания вакцинных штаммов вируса гриппа для производства живой и инактивированной гриппозной вакцины в роллерах в клетках MDCK и Vero при использовании растительных препаратов; изучение иммуногенных и протективных свойств лиофильно высушенных культуральных вакцинных образцов, содержащих штамм вируса гриппа субтипа A/H5N2, полученных с использованием растительных препаратов; а также изучение иммуногенности вакцинных конструкций на основе синтетических пептидов в экспериментах на животных. Все материалы, использованные в диссертационной работе, проанализированы и обобщены лично автором.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Мазуркова, Наталья Алексеевна

ВЫВОДЫ

1. Разработана питательная среда на основе гидролизата сои, полученного с использованием растительной протеазы бромелаина, с низким содержанием сыворотки (2 % и 3 %), для перевиваемых линий клеток MDCK и Vero, являющихся субстратом культуральной гриппозной вакцины.

2. Показана пригодность питательных сред на основе ферментативных гидролизатов сои и риса, полученных с помощью трипсина и бромелаина, для наработки перевиваемых линий клеток MDCK и Vero. Использование экспериментальных сред не приводит к изменению пролиферативных, морфологических и кариологических характеристик культур клеток, а также их чувствительности к штаммам вируса гриппа, используемым для производства инактивированной и живой гриппозной вакцины по сравнению с контролем.

3. Установлена возможность замены трипсина на растительные протеазы папаин и бромелаин в составе питательных сред на основе ферментативных гидролизатов сои и риса, и определены оптимальные условия их применения для максимального накопления в перевиваемых линиях клеток MDCK и Vero штаммов вируса гриппа, используемых для производства инактивированной и живой гриппозной вакцины.

4. Показано, что использование экспериментальных сред на основе ферментативных растительных гидролизатов и растительных протеаз не влияет на морфогенез и репродуктивную активность вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (II5N2) при культивировании его в клетках MDCK и Vero.

5. Разработан стабилизатор, содержащий 10 % сахарозы и 5 % гидролизата сои, полученного с помощью бромелаина, и показана возможность его использования для сохранения в процессе лиофильного высушивания и в течение 1 года хранения максимального инфекционного титра выращенного в перевиваемой линии клеток MDCK холодоадаптированного вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2).

6. Впервые определены технологические приемы использования растительных препаратов (питательная среда на основе гидролизата сои, полученного с помощью бромелаина; растительная протеаза бромелаин; стабилизатор на основе сахарозы и гидролизата сои) на основных стадиях разработки живой культуральной гриппозной вакцины субтипа А/Н5Ы2 в роллерах.

7. Установлено, что использование растительных препаратов при получении лиофильно высушенных образцов вакцинного штамма вируса гриппа субтипа А/Н5Ы2 не влияет на его генетическую и гЬенотипическую стабильность, а также на иммуногенность для лабораторных животных. Штамм индуцирует образование системных и секреторных антител не только к гомологичному вирусу, но и к высокопатогенным вариантам вируса гриппа птиц А/Н5Ы1.

8. Растительный иммуномодулятор Иммуномакс при сочетанном использовании с синтетическими пептидами из вариабельного и консервативного сайтов тяжелой цепи гемагглютинина вируса гриппа А/НЗЫ2 усиливает иммунный ответ на пептиды у лабораторных животных, показаны его адъювантные свойства.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Многолетний опыт применения вакцин против гриппа показал, что они являются основным инструментом предупреждения и борьбы с этим заболеванием. В наши дни производится 300 миллионов доз тривалентной вакцины в год, что является достаточным для профилактики эпидемий в Западном мире, но недостаточным для преодоления пандемии. По данным ВОЗ, в связи с подготовкой к пандемии гриппа значительно увеличился спрос на вакцины, который составляет в настоящее время от 2 до 3 млрд. доз в год. Несмотря на то, что вакцинация в настоящее время остается наиболее эффективным средством профилактики гриппа, существует очевидная необходимость совершенствования вакцин против гриппа, которые должны быть безопасными, эффективными, дешевыми и доступными для всех групп населения. Разработанный ВОЗ стратегический план противодействия пандемии гриппа включает несколько направлений совершенствования вакцин, в том числе разработку новых субстратов для выращивания вируса и усиление безопасности вакцин для обеспечения охвата ежегодной вакцинацией большего контингента с целью создания иммунной прослойки.

Новым субстратом для производства вакцин против гриппа, по рекомендации ВОЗ, были названы перевиваемые линии клеток MDCK и Vero, и в настоящее время уже лицензированы инактивированные вакцины, подготовленные в ПЛК MDCK (Influvac ТС, Solvay) и Vero (Influject, Baxter), выращенных в бессывороточных питательных средах [133, 470].

Важнейшей характеристикой вакцинных препаратов является безопасность, повысить которую можно, исключив. или ограничив использование препаратов животного происхождения в производстве вакцин. Это определяет актуальность разработки технологий, позволяющих заменять препараты животного происхождения продуктами растительной природы.

В настоящее время в России нет лизензировапных культуральных вакцин против гриппа, и единственным разрешенным субстратом для производства как живых, так и инактивироваиных вакцин остаются развивающиеся куриные эмбрионы. Культуральные технологии изготовления вакцин против гриппа требуют наличия бессывороточных питательных сред. В России нет подобных сред, а стоимость импортных высока, что делает их использование нерентабельным при производстве отечественных культуральных вакцин.

Недорогую альтернативу сыворотке при конструировании таких сред могут представлять ферментативные белковые гидролизаты, содержащие смеси компонентов с низкой молекулярной массой, включая аминокислоты, пептиды, витамины и микроэлементы. Среды на основе ферментативных гидролизатов растительного сырья могут представлять наибольший интерес для культуральных технологий вакцин против гриппа, которые должны быть не только рентабельны, но и отвечать все более жестким критериям биологической безопасности. Замена препаратов животного происхождения (сыворотки и трипсина в составе питательных сред, желатина (желатозы) в составе стабилизатора для ЖГВ на растительные продукты является еще одной возможностью повышения безопасности культуральных вакцин против гриппа. Стоимость вакцинного препарата важна для обеспечения вакциной против гриппа всего населения, и она может быть значительно снижена при применении отечественных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов доступного растительного сырья. Так, по нашим расчетам (см. табл. 16) стоимость 1 л экспериментальной среды на основе соевого гидролизата, полученного с использованием бромелаина, меньше в 4,4 и 6,8 раз по сравнению со стоимостью широко используемых (в разных странах, включая Россию) в разработке и производстве культуральных гриппозных вакцин коммерческих питательных сред SFM4MegaVir (США) и Stem Alpha.MDCK (Франция), соответственно.

Нами сконструирована питательная среда на основе ферментативного гидролизата доступного дешевого растительного сырья, соевой муки, для культивирования ПЛК MDCK и Vero. Для создания среды была разработана технология получения ферментативного соевого гидролизата и определены оптимальные параметры процесса гидролиза: температура, рН, продолжительность реакции и соотношение основных компонентов. С целью исключения возможной контаминации гидролизата нежелательными агентами, привнесенными с материалами животного происхождения, процесс гидролиза проводили с использованием растительного протеолитического фермента бромелаина. Были получены образцы гидролизата со стандартными характеристиками по физико-химическим свойствам, которые в дальнейшем, при конструировании питательной среды, были использованы в оптимальных концентрациях, обеспечивающих содержание аминного азота в пределах, характерных для синтетических питательных сред (Игла, Игла MEM, 199 М, RPMI-1640). При разработке сбалансированной питательной среды были также учтены результаты оценки АК состава гидролизата и определены концентрации аминокислот, обеспечивающие оптимальные условия роста и жизнедеятельности ПЛК MDCK и Vero.

Известно [66], что для широкого спектра клеточных линий необходимы 10 незаменимых для животных АК: аргинин, валин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан, фенилаланин, а также тирозин, цистин и глутамин. Необходимость клеток в тирозине и цистине свидетельствует об ограниченности или отсутствии синтеза этих АК клетками in vitro, соответственно, из фенилаланина и метионина. Потребность клеток в глутамине, который наряду с глюкозой является источником углерода, почти на порядок выше, чем в остальных АК [66]. При заражении клеток вирусом значительное количество АК (незаменимых и заменимых) требуется клеткам в связи с производством вирусного белка, которое они восполняют за счет АК среды [66].

В связи с этим результаты определения аминокислотного состава гидролизата были учтены при разработке сбалансированного состава питательной среды для культур клеток MDCK и Vero. В состав питательной среды были введены необходимые для культур клеток недостающие в полученном соевом гидролизате аминокислоты цистин и метионин и отсутствующие в нем аминокислоты глутамин и триптофан.

В результате проведенной работы впервые сконструирована питательная среда на основе растительных компонентов, - соевого гидролизата, полученного с использованием бромелаина, в который дополнительно вводят 4 аминокислоты (L-глутамин, L-триптофан, L-цистин и L-метионин), 8 витаминов (холин хлорид, фолиевую кислоту, никотинамид, кальция пантотенат, пиридоксаль гидрохлорид, тиамин гидрохлорид, мио-инозитол и рибофлавин) и глюкозу. Определены основные физико-химические свойства (описание, рН, буферная емкость, содержание хлор-иона, глюкозы и аминного азота) среды, которые находятся в пределах допустимых значений, характерных для синтетических питательных сред (Игла, Игла MEM, 199 М. RPMI-1640) по каталогу «Gibco Invitrogen Corporation». Получены образцы среды на основе соевого гидролизата со стандартными характеристиками по физико-химическим свойствам. Они следующие: описание - прозрачная жидкость красновато-оранжевого цвета без опалесценции и осадка; рН - 7,20±0,10; буферная емкость - 4,20±0,15; содержание хлор-иона - 4,50±0,50 г/л; содержание глюкозы - 1,00±0,05 г/л; содержание аминного азота - 0,12±0,04 г/л.

В дальнейших исследованиях была изучена пригодность среды для культивирования ПЛК MDCK и Vero. Изучение клеток, выращенных в экспериментальной среде, не выявило их микробной, микоплазменной и вирусной контаминации на клеточных линиях, куриных эмбрионах и лабораторных животных, не обнаружены онкогенные потенции клеток. Для выявления возможных изменений культур под влиянием экспериментальной питательной среды были проведены исследования пролиферативных, морфологических и кариологических характеристик ПЛК MDCK и Vero при длительном (в течение 10 пассажей) их культивировании в данной среде. Исследования проводили в сравнении с питательными средами на основе гидролизатов соевой и рисовой муки, полученных с использованием другого фермента - трипсина, и с контрольными синтетическими средами. Установлено, что разработанная рецептура питательной среды на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с использованием бромелаина, позволяет успешно применять среду для культивирования ПЛК MDCK и Vero, используемых, в частности, в качестве клеточного субстрата для культуральных вакцин против гриппа. Среда обеспечивает наработку клеток обеих линий с кариологическими, морфологическими и пролиферативльши параметрами, аналогичными таковым при использовании импортных сред Stem Alpha.MDCK и SFM4 MegaVir, применяемых при производстве вакцин против гриппа на клетках MDCK, а также среды DMEM для клеток Vero. Несомненным достоинством среды является способность поддерживать жизнеспособность и пролиферацию клеток MDCK и Vero при сниженной до 2 и 3 % концентрации сыворотки крови плодов коровы, соответственно, так же эффективно, как и среды, содержащей 5-10 % сыворотки.

Сконструированная питательная среда на основе соевого гидролизата, полученного с использованием бромелаина, прошла проверку на ростовые качества во ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» и в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского МЗСР РФ (Москва). При сравнении ростовых свойств экспериментальных сред на основе растительных гидролизатов, полученных с использованием бромелаина и трипсина, установлено, что среда на основе соевого гидролизата, полученного с использованием бромелаина, обнаруживает более высокую ростстимулирующую активность в отношении клеток MDCK и Vero, чем среды на основе трипсиновых гидролизатов сои и риса. Среда на основе соевого гидролизата, полученного с использованием бромелаина, отличается от других сред на основе растительных гидролизатов, вероятно, пептидными компонентами, которые способствуют более успешному поддержанию этой средой роста клеток MDCK и Vero. Кроме этого, сконструированная с применением бромелаина питательная среда в сравнении с другими экспериментальными средами на основе трипсиновых растительных гидролизатов имеет более высокий уровень безопасности, поскольку для получения гидролизата был использован фермент растительного происхождения.

Учитывая такие преимущества растительных препаратов в технологиях изготовления вакцин против гриппа, как доступность, экономичность, низкая стоимость, безопасность растительных материалов, нами впервые проведены исследования по замене продуктов животного происхождения на растительные препараты на различных стадиях создания живой культуральной вакцины субтипа A/H5N2 (вакцинный штамм вируса гриппа А/17/утка/Г1отсдам/86/92).

В наших исследованиях клетки линий MDCK и Уего, адаптированные к росту в роллерах в экспериментальной малосывороточпой (2 и 3 %, соответственно) ростовой среде на основе соевого гидролизата, полученного с использованием бромелаина, были оценены на предмет их способности продуцировать вакцинный штамм вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) в титрах, достаточных для коммерческой наработки вируса гриппа. Эффективность размножения вируса была также изучена на клетках, выращенных в средах на основе гидролизатов сои и риса, полученных с использованием трипсина, и в синтетических средах.

Мы заменили фермент животного происхождения трипсин, традиционно используемый для наработки штаммов вируса гриппа в клетках, на ферменты растительного происхождения папаин или бромелаин в составе экспериментальных питательных сред. Данный технологический прием в литературе не описан, нами использован впервые, что подтверждается патентом Российской Федерации на изобретение № 2330885, 2008 г., «Способ получения живой культуральной вакцины против вируса гриппа». Обе клеточные линии MDCK и Уего, выращенные в новых средах, в присутствии растительных протеаз поддерживали репликацию вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92. Наибольший инфекционный титр вируса достигался на ПЛК MDCK, выращенных в среде на основе соевого гидролизата, полученного с использованием бромелаина. Оптимизация условий наработки вируса гриппа на клетках MDCK и Vero в присутствии папапна или бромелаина в составе этой среды, таких как множественность инфекции, концентрация растительной протеазы и время сбора урожая, позволила получить урожай вируса с высоким титром (9,0-9,5 lg ТЦДэо). Множественность заражения в диапазоне от 0,01 до 1,0 ТЦД50/кл. не влияла на максимальные значения инфекционной активности, но влияла на динамику накопления вируса в максимальных титрах. Культивирование вируса после достижения пика значений инфекционной и гемагглютинируюш.ей активности сопровождается снижением инфекционных титров, которое через 96 ч после инфицирования составляет 3,5-4,0 lg, снижения гемагглютинирующих титров не происходит. Следовательно, для производства живых вакцин против гриппа необходимо определить для каждого используемого вакцинного штамма оптимальное время сбора максимального урожая инфекционного вируса, тогда как время сбора вирусного урожая при производстве инактивированных гриппозных вакцин не является критическим.

Сравнительное исследование двух клеточных линий MDCK и Vero, выращенных в экспериментальной среде, на эффективность продукции вакцинного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 в присутствии бромелаина показало, что максимальные инфекционные титры штамма на клетках Vero при прочих равных условиях (множественность инфекции, концентрация растительной протеазы) достигались на более поздних сроках по сравнению с клетками MDCK. Следует отметить, что эффективность продукции этого штамма в клетках Vero в присутствии трипсина была ниже в сравнении с клетками MDCK, что может быть обусловлено инактивацией трипсина фактором, который секретируют клетки Vero, и который быстро инакгивирует экзогенный трипсин [237]. Следовательно, успешная наработка вируса гриппа на клетках Vero в присутствии трипсина в сравнении с клетками MDCK зависит не только от множественности инфекции, концентрации фермента и времени сбора урожая, но также от стратегии добавления трипсина, в то время как в присутствии бромелаина эффективность продукции вакцинного штамма была практически одинаковой в клетках MDCK и Vero. Поэтому в технологии производства вакцины против гриппа на клетках Vero с использованием бромелаина, в отличие от технологии с использованием трипсина, отсутствует повторное введение фермента.

В целом, полученные результаты показывают, что ПЛК MDCK и Vero активно растут в роллерах в питательной среде, содержащей соевый гидролизат, полученный с использованием бромелаина. Обе клеточные линии при культивировании в экспериментальной среде, не содержащей сыворотку, но в присутствии 4 мкг/мл папаина или 20 мкг/мл бромелаина, эффективно поддерживают продукцию вакцинного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) при множественности инфекции от 0,01 до 1,0 ТЦД50/кл. Однако при разработке промышленного процесса производства вируса выбор клеточной линии диктуется выходом вируса за более короткий период. И в этом плане предпочтительнее оказалась клеточная линия MDCK, позволяющая получать высокие титры вакцинного штамма вируса гриппа А/ 17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) за более короткий период. Возможность роста этих клеток в новой среде с меньшим содержанием (2 %) сыворотки в сравнении с 3 %, необходимыми для клеток Vero, делает линию клеток MDCK еще более перспективной для промышленного производства вакцины против гриппа.

Для обоснования рекомендаций по практическому применению бромелаина, папаина и питательных сред на основе растительных гидролизатов при получении вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) в роллерах на клетках MDCK и Vero была проверена фенотипическая и генетическая стабильность холодоадаптированного вакцинного реассортанта виурса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) при размножении в присутствии этих препаратов. Установлено, что при выращивании реассортанта вируса гриппа А/17/утка/Потс дам/86/92 (H5N2) на клетках MDCK и Vero, культивируемых в роллерах в присутствии растительных препаратов, полностью сохраняются ts"40и са*25-Феч°тип вируса и мутации, ведущие к замене аминокислот в отдельных генах холодоадаптированного реассортанта, что свидетельствует о его генетической стабильности.

Важными факторами, влияющими на качество живой гриппозной вакцины, являются состав стабилизатора и режим сублимационного высушивания. В практике сублимационного высушивания живых аллантоисных гриппозных вакцин используют стабилизаторы, в состав которых входит один или несколько компонентов животного происхождения. В наших исследованиях различные защитные среды, не содержащие компоненты животного происхождения, оценивались по их способности стабилизировать полученный в ПЛК MDCK и Vero холодоадапгированный вакцинный штамм вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) в процессе сублимационного высушивания и хранения. Основой для защитных сред был 10 %-ный раствор сахарозы («Sigma, США»), в который вводили либо 5 % пептона сои («Sigma, США»); либо 5 % полученного нами с использованием бромелаина гидролизата соевой муки; либо оба этих компонента в концентрации 2,5 %. Данные защитные среды сравнивались с сахарозо-желатиновой средой - САЖ (10 % сахарозы и 1,2 % желатина), взятой в качестве контрольной. Наилучшие защитные свойства для всех исследованных вакцинных образцов обнаружил стабилизатор, состоящий из смеси 10 % сахарозы и 5 % ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с помощью бромелаина. Снижение титра у образцов с этим стабилизатором составило (0,5-0,65) lg, что было ниже, чем при использовании САЖ для этих же образцов (0,6-0,95) lg. Значения показателя остаточной влажности всех исследованных лиофилизированных образцов, полученных со стабилизатором на основе смеси сахарозы и ферментативного соевого гидролизата, были в пределах нормативных значений - 1,0-1,6 %, а эксперименты по изучению хранения образцов в течение 1 года и тесты на термостабильность подтвердили эффективность применения данного защитного состава для лиофилизации культуральных вакцинных образцов. Использование стабилизатора, содержащего 10 % сахарозы и 5 % гидролизата соевой муки, полученного с помощью бромелаина, позволяет эффективно проводить процесс высушивания с максимальным сохранением инфекционного титра вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5Ы2), входящего в состав культуральных образцов живой вакцины, наработанных с использованием растительных компонентов. В качестве белкового носителя в стабилизаторе использованы только компоненты растительной природы, что существенно с точки зрения безопасности вакцинного препарата. Иммуногенность вакцинных образцов, приготовленных на основе реассортанта А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5Ы2), изучали в сравнении с иммуногенностью аллантоисной ЖГВ «Ультрагривак», полученной на основе этого же вакцинного штамма. В опытах на животных было показано, что культуральные вакцинные образцы, полученные на клетках МОСК, вызывают иммунный ответ в те же сроки и практически с той же эффективностью, что и вакцина «Ультрагривак». Культуральные вакцинные образцы при двукратном (с интервалом 10 сут) интраназальном введении мышам в дозе 10 6,5 ТЦД50 вызывают образование локальных и системных антител, выявляемых в РТГА и РН не только к гомологичному вирусу, но и к штаммам вируса гриппа птиц Н5Ы1 А/СЫскеп/ЗигсЫка/Коу-11/2005 и А/СЫскеп/Ки^ап/05/2005, а также обеспечивает защиту 71,0-86,7 % животных от заражения 25 ЛД50 вирулентного для мышей штамма вируса гриппа птиц А/СЫскеп/Киг§ап/05/2005 (Н5"Ж). Проведенное исследование позволяет заключить, что иммуногенность культуральных вакцинных образцов, содержащих штамм вируса гриппа субтипа А/Н5Ы2, полученных на клетках МОСК в средах с использованием растительных компонентов, сравнима с иммуногенностью аллантоисной вакцины «Ультрагривак».

Совершенствование технологических подходов, включающих снижение содержания дорогостоящих компонентов в составе вакцины, доступность сырья для получения больших количеств вакцины и замена препаратов животного происхождения на растительные, делает вакцину более безопасной и более дешевой. Создание вакцины с умеренной ценой, которая не препятствовала бы ее массовому применению, особенно важно при пандемических ситуациях. Разработанные нами подходы к созданию культуральной (MDCK) живой вакцины против гриппа с использованием растительных препаратов отвечают экономическим и технологическим критериям такой вакцины.

Не менее важным в настоящее время является перевод производства инактивированной вакцины против гриппа с растущих куриных эмбрионов на клеточный субстрат. Клеточные линии MDCK и Vero считаются наиболее подходящими для этой цели, поскольку они поддерживают репликацию разнообразных штаммов вируса гриппа с высокими титрами. Мы оценили способность клеток MDCK и Vero в присутствии растительных препаратов поддерживать репродукцию штаммов вируса гриппа A/Solomon Islands/03/06 (I-IINI), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) и B/Malaysia/2506/2004, рекомендованных ВОЗ для включения в состав инактивированной вакцины для Северного полушария для сезона 2007-2008 гг. Установлена возможность производства этих штаммов в присутствии бромелаина в ПЛК MDCK и Vero, выращенных в роллерах в среде на основе гидролизата соевой муки, полученного с использованием бромелаина. Показано, что, как для ЖГВ, так и для ИГВ, выход вируса на клетках MDCK и Vero при использовании растительных препаратов может быть увеличен оптимизацией условий процесса культивирования таких, как питательная среда, тип и концентрация протеазы, множественность инфекции. В отличие от технологии производства культуральной ЖГВ, в которой очень важно для каждого вакцинного штамма определить оптимальное время сбора максимального урожая активного вируса, при производстве культуральной ИГВ время сбора вирусного урожая не является критическим. С другой стороны, в технологии производства культуральной ИГВ с использованием растительных препаратов для оптимизации процесса наработки вирусов необходимо предварительно адаптировать их к клеткам, особенно к Vero, в то время, как для холодоадаптированного реассортанта

А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) не требовалась предварительная адаптация ни к клеткам MDCK, ни к клеткам Vero для получения вируса с высоким инфекционным титром. Такие технологические подходы, как выращивание клеток MDCK и Vero в малосывороточной среде на основе соевого гидролизата, полученного с использованием бромелаина, и репродукция в присутствии бромелаина вакцинных штаммов вируса гриппа для ИГВ, могут быть использованы для производства культуральной инактивированной вакцины.

Другим новым подходом в создании безопасных гриппозных вакцин является разработка синтетических вакцин - вакцин на основе пептидных фрагментов, соответствующих аминокислотным последовательностям (АК) тех сайтов гемагглютинина, которые распознаются иммунной системой и вызывают иммунный ответ. Вакцины на основе консервативных антигенов могут обеспечить защиту против всех типов вируса гриппа, включая появляющиеся пандемические штаммы. Использование консервативных эпитопов может быть применимо в ситуациях, когда антигенная вариабельность значимых В-клеточных эпитопов является камнем преткновения для производства эффективных вакцин против гриппа. В настоящее время разрабатываемые универсальные вакцины конструируются как правило на основе консервативных последовательностей М2е, НА и других структурных протеинов вирусов гриппа [277]. В данной работе изучены иммуногенные свойства синтетических пептидов, соответствующих предполагаемому антигенному сайту А и С-концевому фрагменту тяжелой цепи гемагглютинина вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2), конъюгированных с белком-носителем - БСА, in vitro и in vivo. Показано, что короткие синтетические фрагменты тяжелой цепи НА вируса гриппа A/Aichi/2/68, а именно, пептиды 136-147 (сайт А) и 314-328 (из консервативной области С-конца НА1 гемагглютинина), конъюгированные с БСА, при совместном введении с адыовантом Фрейнда способны индуцировать в организме мышей выработку антител, обладающих специфической нейтрализующей активностью по отношению к гомологичному вирусу, при этом коныогат 314-328-БСА индуцировал аналогичную активность к нескольким штаммам субтипа А/НЗЫ2. Конъюгаты 136-147-БСА и 314-328-БСА обладают протективным эффектом при заражении мышей небольшими дозами (10 Ь05()) вируса А/А1сЫ/2/68.

Установлено повышение иммунного ответа на пептид-белковые конъюгаты 136-147-БСА и 314-328-БСА при сочетанном их введении с растительным иммуномодулятором Иммуномаксом, без адъюванта Фрейнда. Наиболее выраженный иммунологический эффект наблюдается при иммунизации животных смесью двух конъюгатов: 136-147-БСА и 314-328-БСА совместно с Иммуномаксом по сравнению с применением каждого их двух конъюгатов в отдельности. Сочетанное введение Иммуномакса и вакцинной композиции па основе двух пептид-белковых конъюгатов 136-147-БСА и 314-328-БСА индуцирует у мышей эффективный иммунитет широкого спектра против вируса гриппа субтипа А/НЗЫ2. Таким образом, на основании экспериментальных данных обоснован новый подход, сочетающий использование двух синтетических пептидов из вариабельного и консервативного сайтов тяжелой цепи гемагглютинина вируса гриппа А/Н3№ и растительного иммуномодулятора Иммуномакса.

В целом, разработанные и используемые нами новые элементы технологии на основе препаратов растительного происхождения (питательная среда на основе гидролизата сои, полученного с использованием бромелаина; растительная протеаза бромелаин; стабилизатор на основе сахарозы и гидролизата сои; растительный иммуномодулятор Иммуномакс), включающие методологию оценки пригодности растительных компонентов для культуральных гриппозных вакцин (рис. 20), должны сыграть важную роль в разработке безопасных и эффективных вакцин против гриппа для всего населения, включая группы риска (табл. 66). В свете угрозы возникновения новой пандемии гриппа необходимо незамедлительно решать задачи, связанные с недостатком производственных мощностей для обеспечения вакциной всего населения планеты и высокой стоимостью вакцинного препарата.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Мазуркова, Наталья Алексеевна, 2013 год

1. Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. Санкт-Петербург: Наука, 1994.-151 С.

2. Артюхин В.И., Шепелин А.П., Киселева Н.В. Белковые гидролизаты в производстве питательных сред. Производство и применение продуктов микробиологических производств. М.: ВНИИСЭНТИ Минмедпрома СССР, 1990. - вып. 9-10. - С. 31-38.

3. Атауллаханов Р.И., Пичугин A.B., Шишкова ILM. и др. Клеточные механизмы иммуномодулирующего действия препарата Иммуномакса // Иммунология. 2005. - № 26(2).-С. 111-120.

4. Аттестация перевиваемых клеточшлх культур. Методические рекомендации ФГБУ ГИСК им. JI.A. Тарасевича МЗиСР. М., 2011. - 35 С.

5. Баратова H.A., Белянова Л.П. Определение аминокислотного состава белков // Методы биохимического эксперимента. МГУ, 1974. - С. 1-36.

6. Борхсениус С.Н., Чернова O.A. Микоплазмы: молекулярная и клеточная биология, патогенность, диагностика. J1.: Наука, 1989. - 156 С.

7. Вирусология. Методы. Пер. с англ. Мейхи Б. М. Мир, 1988. - 344 С.

8. Витакер А. Среды для культивирования клеток млекопитающих // Новые методы культуры животных тканей. Под ред. Фридлянского. М.: Мир, 1976. - С. 18.

9. Войцеховская Е.М., Кузнецова Е.В., Васильева A.A., Вакин B.C. Иммуногенность новой гриппозной вакцины // Лечащий врач. 2010. - № 10. - С. 77-79.

10. Волчек И.В. Профилактическая и лечебная эффективность амиксина при гриппе и других острых респираторных инфекциях // TERRA MEDICA nova. 2004. - № 4. С. 25-28.

11. Гендон 10.3. Успехи в разработке культуральных гриппозных вакцин // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2002. - № 5. - С. 25-30.

12. Гендон Ю.З. Вакцины и химиопрепараты для профилактики гриппа // Вопросы вирусологии. 2007. - № 1. - С. 4-10.

13. Гендон Ю.З., Маркуппш С.Г., Акопова И.И. и др. Разработка культуральной живой холодоадаптированной реассортантной гриппозной вакцины // Вопросы вирусологии. -2003.-№ 2.-С. 12-17.

14. Гендон Ю.З., Маркуппш С.Г., Акопова И.И. и др. Дальнейшая разработка культуральной (MDCK) живой холодоадаптированной гриппозной вакцины: культивирование вакцинных штаммов в производственных ферментерах // Вопросы вирусологии. 2005. - № 2. - С. 4-9.

15. Говоркова Е.А. Селекция клетками хозяина антигенных вариантов гемагппотинина вируса гриппа и выбор оптимальных систем для культивирования // Вопросы вирусологии. 1999. - № 5. - С. 199-206.

16. Грачев В.П., Чапчаев 10.X. Применение перевиваемых линий клеток человека и животных для изготовления вирусных вакцин // Журнал микробиологии. 2008. - № 1. - С. 82-90.

17. Грачева И.М., Кривова АЛО. Технология ферментных препаратов. М.: Элевар, 2000. -512с.

18. Григорьева Е.А. Иммуномодулирующее действие противовирусного препарата фосиренил в норме и при экспериментальной гриппозной инфекции. Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических паук.- Москва, 2004.- 22 С.

19. Дешева Ю.А., Руденко Л.Г., Александрова Г.И. Штамм вируса гриппа21