Сравнительная диагностическая эффективность клеточных антигенов протосколексов Echinococcus multilocularis в зависимости от типа клеток в культуре тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.19, кандидат биологических наук Хангалова, Инесса Баторовна

• Хангалова, Инесса Баторовна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Хангалова, Инесса Баторовна

Введение.

I. Обзор литературы.

1.1 Биология клетки: основные понятия, функции клетки, механизмы, контролирующие рост клеток.

1.2 Методы клеточной технологии.

1.3 Характеристика ларвоцисты эхинококка.

1.4 Антигены Echinococcus multilocularis и их эффективность в иммунодиагностике эхинококкозов.

II. Собственные исследования.

2.1 Материалы и методы.

2.1.1 Правила работы в лаборатории с клеточными культурами (в боксе).

2.1.2 Подготовка к опытам лабораторной посуды, резиновых изделий, различных материалов и инструментов.

2.1.3 Получение инвазивного материала Echinococcus multilocularis, заражение белых крыс.

2.1.4 Методика получения вторичных ларвоцист Е. multilocularis, приготовление первичной клеточной культуры протосколексов, культивирование клеток протосколексов в синтетической питательной среде.

2.1.5 Получение клеточных метаболитов протосколексов Echinococcus multilocularis, выделение антигеноактивных серий иммуноферментной реакцией (ИФР).

2.1.6 Исследование антигеноактивных серий клеточных метаболитов («клеточных» антигенов) реакцией иммунодиффузии.

2.1.7 Методы цитологических исследований, типирование культивируемых клеток протосколексов.

2.1.7.1 Фиксация.

2.1.7.2 Методы окрашивания для определения типа клеток в культуре.

2.1.7.3 Типы клеток в неактивных и антигеноактивных сериях клеточных метаболитов протосколексов

Е. multilocularis.

2.1.8 Диагностическая эффективность «клеточных» антигенов протосколексов Echinococcus multilocularis в ИФР при эхинококкозах в зависимости от типа клеток в культуре.

2.1.8.1 с сыворотками крови людей.

2.1.8.2 с сыворотками крови свиней.

2.1.9 Статистическая обработка полученных результатов.

III. Результаты исследований.

3.1 Цитологическая характеристика клеток первичной клеточной культуры.

3.2 Анализ данных по культивированию типов клеток протосколексов Echinococcus multilocularis, получение антигеноактивных клеточных метаболитов (клеточных» антигенов).

3.3 Иммунохимическая характеристика клеточных антигенов протосколексов Е. multilocularis.

3.4 Сравнительная оценка диагностической эффективности клеточных антигенов протосколексов Echinococcus multilocularis в зависимости от типа клеток в культуре.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сравнительная диагностическая эффективность клеточных антигенов протосколексов Echinococcus multilocularis в зависимости от типа клеток в культуре»

Актуальность темы

Культуры клеток животных стали неотъемлемой частью биотехнологии, они используются для решения научных проблем общей биологии, цитологии, генетики, вирусологии, иммунологии и инфекционной патологии. Одной из причин такого интереса специалистов к культивированию клеток из различных органов и тканей животных, человека и растений является возможность использования культуры клеток для диагностики и лечения наследственных заболеваний, в качестве тест-объектов при испытании новых фармакологических веществ, для сохранения генофонда исчезающих видов животных и растений.

Всемирная организация здравоохранения придает большое значение разработке более совершенных методов культивирования возбудителей зоонозов, к числу которых относятся и эхинококкозы, с целью изучения особенностей развития и роста in vitro, для диагностики, а также для использования их в качестве рациональных моделей испытания новых средств против различных болезней. Клеточная технология может с успехом использоваться также для получения биологически активных веществ со свойствами антигенов, имеющих иммунодиагностическое и иммунопрофилактическое значение. Изучение антигенных свойств гельминтов на разных стадиях развития и их экскреторно- секреторных продуктов - одна из важнейших задач современной иммунологии. Создание оптимальных условий жизнедеятельности клеток вне организма, выделение продуктов метаболизма гельминтов в чистом виде, свободными от микроорганизмов и антигенов хозяина — насущная проблема современной биотехнологии в гельминтологии, может осуществляться благодаря методам культивирования гельминтов для получения специфических антигенов (Тараканов, 1985).

Преимущества клеточной технологии в получении антигенов гельминтов и других биологических объектов сводятся к тому, что клеточные культуры можно приготовить из различных антигеноактивных субстанций паразитов и длительное время сохранять в функциональном состоянии в синтетических питательных средах путем их многократного пассирования. Однако необходимо при этом учитывать, что антигенность используемых для культивирования органов и тканей паразитов находится в связи с их систематическим положением. Так, у нематод наибольшую антигенную активность проявляют личинки, особенно в период линьки, что связано с выделением большого количества секретов (Soulsby, 1961; Silverman et al., 1962). В то же время у цестод антигеноактивные субстанции находятся в субтегументальной области пузыря, на присосках вблизи экскреторного отверстия протосколексов, а в онкосферах — под мембраной крючьев и в клетках гексакантных эмбрионов (Machnicka, 1974; Алферова, 1978).

Исходя из вышесказанного для культуральной работы, направленной на получение специфических антигенов цестод, можно использовать два объекта — протосколексы из цисты и яйца, содержащие инвазионные онкосферы. Однако в целях безопасности и с учетом обеспечения необходимой стерильности использование протосколексов или герминативных оболочек является более предпочтительным.

Яйца же с инвазионными онкосферами, хотя и обладают значительной антигенной активностью, для культуры клеток менее применимы. Помимо того, что они небезопасны для исследователей, загрязненность их микрофлорой кишечника хозяина требует более тщательной и длительной стерилизации, что также может отразиться на жизнеспособности клеток в культуре.

Протосколексы, как источник получения первичной клеточной культуры, являются сложным биологическим объектом, состоящим из клеток различных типов и назначения. Неоднородность первичной клеточной культуры влияет на процесс культивирования и на свойства получаемых метаболитов. Как правило, в процессе длительного культивирования одни типы клеток могут расти и активно пролиферировать однако, получаемые при этом клеточные метаболиты не всегда могут соответствовать требованиям, предъявляемым им как антигенным препаратам. С этих позиций возникает необходимость как в научном, так и в практическом плане, установления типов клеток, обеспечивающих в процессе культивирования выделение в среду обитания антигеноактивных метаболитов иммунодиагностической и иммунопрофилактической направленности.

Исходя из вышеизложенного, считаем целесообразной и актуальной работу по сравнительной оценке диагностической эффективности клеточных метаболитов протосколексов Е. multilocularis в зависимости от типа клеток в культуре.

Цели и задачи исследований Основной целью наших исследований было провести культивирование клеток протосколексов Е. multilocularis, получить антигеноактивные клеточные метаболиты с последующим определением типа клеток в культуре и одновременной оценкой их диагностической эффективности.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить вторичные ларвоцисты Е. multilocularis, выделить клетки протосколексов, приготовить первичную клеточную культуру и подобрать оптимальные условия их культивирования в синтетических питательных средах для получения клеточных метаболитов.

2. Провести отбор антигеноактивных серий клеточных метаболитов иммуноферментной реакцией (ИФР).

3. Реакцией иммунодиффузии в агаровом геле установить наличие антигенов паразита в выделенных ИФР сериях клеточных метаболитов.

4. Подобрать оптимальный режим фиксации и окраски культивируемых клеток протосколексов Е. multilocularis, определить типы клеток в культуре.

5. Собрать банк сывороток от животных и людей, инвазированных эхинококками, другими гельминтами и клинически здоровых.

6. Провести сравнительную оценку диагностической эффективности клеточных метаболитов с различной степенью антигенной активности при эхинококкозах в соответствии с типом клеток в культуре.

Научная новизна Впервые проведена цитологическая характеристика культуры клеток протосколексов, выделенных из вторичных ларвоцист Е. multilocularis, в процессе культивирования в синтетической питательной среде с последующей сравнительной оценкой диагностической эффективности полученных клеточных метаболитов при цистном и альвеолярном эхинококкозе.

Иммунохимическим анализом установлено наличие в клеточных метаболитах протосколексов антигеноактивных компонентов идентичных антигенам соматического экстракта протосколексов Е. multilocularis.

Впервые установлена зависимость антигенной активности метаболитов культивируемых клеток протосколексов паразита от типа клеток в культуре: наибольшую активность в ИФР (ОП с сыворотками зараженных Е. multilocularis и Е. granulosus соответственно 1,236 - 1,320) регистрировали в клеточных культурах с преобладанием клеток многогранной формы (клетки типа - 4), наименьшую (ОП с теми же сыворотками в пределах 0,350) в клеточных культурах с преобладанием больших округлых клеток (клетки типа — 2 и 3). Практическая значимость

Материалы диссертационной работы Далаевой И. Б. вошли в «Методику идентификации «клеточных» антигенов эхинококка», одобренную секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН и опубликованную в трудах ВИГИС за 2006., т. 42, с. 578- 585.

По результатам цитологических исследований диссертанта подготовлена «Методика фиксации и окрашивания клеток протосколексов Echinococcus multilocularis в культуре in vitro», одобренная секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины (сентябрь 2006 года).

Апробация работы

Материалы диссертационной работы представлены и обсуждены на:

1. Заседаниях Ученого совета ВИГИС (2003-2006гг).

2. Научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (2004-2006гг).

3. Секции «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2005-2006гг).

Основные положения, выносимые на защиту

• Культивирование клеток протосколексов из вторичных ларвоцист Е. multilocularis в синтетической питательной среде, получение клеточных метаболитов, их оценка ИФР и приготовление препаратов для цитологических исследований.

• Цитологическая характеристика клеток протосколексов в культуре in vitro в процессе культивирования.

• Иммунохимический анализ антигеноактивных серий клеточных метаболитов протосколексов, полученных в процессе культивирования и выделенных ИФР.

• Сравнительная диагностическая эффективность при эхинококкозах клеточных метаболитов протосколексов Е. multilocularis различной степени антигенной активности в зависимости от типа клеток в культуре.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, 3 из них в рекомендуемых ВАК изданиях.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 128 страницах машинописного текста. Состоят из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, включающего: материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложение. Список литературы включает 169 источников, в том числе 74 отечественных и 95 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 23 рисунками.

Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Паразитология», Хангалова, Инесса Баторовна

V. Выводы

1. Проведено культивирование клеток протосколексов Echinococcus multilocularis в синтетической питательной среде RPM3-1640, получено 27 серий клеточных метаболитов; в 23 (85,2 %) иммуноферментной реакцией (ИФР) установлена антигенная активность. На основании показателей оптической плотности (ОП) в ИФР с положительными и отрицательными контрольными сыворотками антигеноактивные клеточные метаболиты распределены на 3 серии: А-1 (наиболее активная, ОП в ИФР 1,236-1,320; 0,182 -0,191); В-2 (средней активности, ОП в ИФР 0,768 - 0,804; 0,1980,201); С-3 (слабой антигенной активности, ОП в ИФР 0,350 — 0,362; 0,219-0,225).

2. Иммунохимическим анализом с использованием гипериммунной кроличьей сыворотки к антигенам соматического экстракта протосколексов Е. multilocularis в антигеноактивных сериях клеточных метаболитов выявлено 2-3 идентичных антигенных компонента.

3. Реакцией иммунодиффузии в агаровом геле в антигеноактивных сериях клеточных метаболитов протосколексов Echinococcus multilocularis с сыворотками людей с подтвержденной хирургически альвеолярной формой эхинококкоза и сыворотками экспериментально зараженных Echinococcus multilocularis крыс определено 1-2 компонента, идентичных функциональным антигенам паразита.

4. Проведена цитологическая характеристика и определено 4 типа клеток в первичной клеточной суспензии из протосколексов, выделенных из вторичных ларвоцист Е. multilocularis, различающихся по форме, размерам и по количественному содержанию в культуре (из расчета 600 клеток в 1 мкл): 1 тип - 180210 (среднее 205) - 32,5 %; 2 тип - 90-108 (среднее 99) - 16,5%; 3 тип - 24-48 (среднее 36) - 6%; 4 тип - 270-300 (среднее 285) - 47,5%.

5. Оценена диагностическая эффективность ИФР с тремя сериями (А-1, В-2, С-3) клеточных метаболитов протосколексов Е. multilocularis различной степени антигенной активности при цистном и альвеолярном эхинококкозе (гидатидозе) людей. Чувствительность иммунотеста составила 88,0 %; 76,0 % и 56,0 %, специфичность - 86,7%; 77,8 % и 57,8 % соответственно.

6. Проведена оценка диагностической эффективности ИФР с теми же сериями (А-1, В-2, С-3) клеточных метаболитов протосколексов Е. multilocularis при цистном эхинококкозе свиней. Чувствительность ИФР составила соответственно 76,2 %; 66,6 % и 52,4 %; специфичность - 70,8 %; 62,5 % и 47,9 %.

7. Определены типы клеток и их процентное соотношение в трех сериях (А-1, В-2, С-3) клеточных метаболитов протосколексов различной степени антигенной активности в процессе культивирования в течение 3 месяцев: в серии А-1 установлено 2730 % клеток - 1 типа, 12-14 % - 2 типа, 6-8 % - 3 типа и 55-58 % -4 типа; в серии В-2 - 32-35 % - клеток 1 типа, 19-21 % - 2 типа, 811 % - 3 типа, 45-48 % - 4 типа; в серии С-3 - 31-34 % клеток - 1 типа, 17-24%-2 типа, 15-17% - 3 типа, 35-38 %-4типа.

8. Установлена зависимость диагностической эффективности ИФР от типа культивируемых клеток протосколексов Е. multilocularis -источника получения клеточных метаболитов. Наиболее активными в антигенном отношении были культуры клеток, в которых содержалось больше клеток 4 типа.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Хангалова, Инесса Баторовна, 2008 год

1. Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков. М.1983.-264с.

2. Аделыиина Г. Л. Оценка диагностических свойствантигенных комплексов возбудителя альвеококкоза в эксперименте. Волгоград, Автореферат. 1995.

3. Алферова М. Ф. Реакция сколексопреципитации приэкспериментальном цистециркозе крупного рогатого скота // «Болезни с/х животных» труды УзНИВИ, Ташкент. 1978. - Т. 28, ч. 1. - С. 26-28.

4. Анджапаридзе О. Г., Богомолова Н. Н, Моделированиеи исследование хронических форм вирусных инфекций в культурах клеток. — М.: Медицина, 1974. 184 с.

5. Базитов А. А., Поройкова Т. Н. К сравнительнойхарактеристике паренхимы цестод // Паразитология. — 1977.-Вып. 11, № 1.-С. 9-16.

6. Баллад Н. Е., Гаврилова Е. М., Зорихина В. И.

7. Эффективность применения иммуноферментного метода в диагностике эхинококка и альвеококка в зависимости от степени очистки антигена // Мед. паразитол. и паразит, болезни. 1979.— Т. 48., № 2. — С. 70-76.

8. Баллад Н. Е., Лейкина Е. С., Егоров А. М., Гаврилова Е.

9. М., Зорихина В.М. Эффективность различных модификаций иммуноферментного метода сочищенными антигенами альвеококка в диагностике альвеококкоза. Сообщение 1. Микрометод в пробирках // Мед. паразитол. и паразитар. Болезни. -1982а.-№2. С. 15-20.

10. Баллад Н. Е., Лейкина Е. С., Егоров А. М., Гаврилова Е.

11. М., Зорихина В.М. Эффективность различныхмодификаций иммуноферментного метода с очищенными антигенами альвеококка в диагностике альвеококкоза. Сообщение 2. Метод на плашках // Мед. паразитол. и паразитар. болезни. — 19826. №2. — С. 15-20.

12. Баллад Н. Е., Шамхалов В. М., Белозеров С. Н., Клименко

13. В. В., Шеховцов Н. В., Написанова Л. А. Изучение диагностической эффективности иммуноферментной реакции при эхинококкозе овец // Бюллетень ВИГИС. — 1991.-Вып. 53.-С. 10-15.

14. Бердинских М. С., Султанова 3. Д., Куликова К. С. Овидоспецифических антигенах клеток перевиваемых культур // Вопросы вирусологии. — 1969. № 1. — С. 23-27.

15. Бережко В. К., Кленова И. Ф. Антигенная активностьклеточных метаболитов протосколексов СоепишБcerebralis // Тр. Всес. Инс-та гельминтологии. 1999. -Т. 35. - С. 39-45.

16. Бережко В. К., Бессонов А. С. Использование клеточныхметаболитов Echinococcus multilocularis в качестве диагностических антигенов // Ветеринария. — 2000. № 2.-С. 31-34.

17. Бережко В. К., Кленова И. Ф., Коваленко Ф. П.

18. Иммунопрофилактические свойства антигенов клеточной культуры метацестоды Е. multilocularis при экспериментальном альвеолярном гидатидозе мышей // Тр. ВИГИС. 2001. Т. 37. - С. 34-41.

19. Бережко В. К., Руднева О. В., Далаева И. Б.

20. Иммунохимический анализ метаболитов клеточной культуры протосколексов Е. multilocularis // Материалы докл. научн. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарн. болезнями». — 2004. — Вып. 5. — С. 63-66.

21. Бессонов А. С. Альвеолярный эхинококкоз и гидатидоз. —1. М. 2003. - С. 50-52.

22. Бахтин Ю. Б., Кроленко С. А., Черногрядская И. А.

23. Руководство по цитологии. — М. Т. 1, 2., Изд-во «Наука», 1966.

24. Бахтин Ю. Б. Генетическая теория клеточныхпопуляций. Л., 1980. С. 168.

25. Гаврилюк Б. К., Сафронов В. П. Органотипическоекультивирование. М.: Наука. — 1983. — 127 с.

26. Гламаздин И. Г. Культивирование отдельных клетокгельминтов и получение диагностических ценных антигенов // Актуальные проблемы ветсанконтроля сельскохозяйственной продукции. М. — МГУПБ. -1997.

27. Гламаздин И. Г., Родина О. В. Первичная клеточнаякультура D. caninum // Сб. к 100-летию со дня рождения И. В. Орлова. МГУПБ. - 1999.

28. Голубев Д. Б., Соминина А. А., Медведева М. Н.

29. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. — Л.: Медицина, 1972. 222 с.

30. Демшин Н. И. Постэмбриональное развитие цестоды

31. Aploparaksis crassikostris (Hymenolepididae)

32. Паразитология. 1984. - Вып. 18, № 1. - С. 40-46.

33. Дьяконов JI. П., Глухов В. Ф., Поздняков А. А.,

34. Денисенко Г. Ф., Панкова Г. Е., Гололобова М. Т., Камыкова Т. Т. Культура клеток и тканей животных. Учебно-методическое пособие // Ставрополь, 1980. -112 с.

35. Дьяконов JI. П., Лобунцова Д. В., Плешакова Г.

36. Ю., Гальнбек Т. В. Методические рекомендации по культивированию первичных культур клеток, субкультур и органных культур из ткани кишечникаплодов крупного рогатого скота и свиней. — М. — 1984. — 8 с.

37. Дьяконов JI. П. Животная клетка в культуре. Методы иприменение в биотехнологии. — М. 2000. — 398 с.

38. Есенгалиев Т. Т. Культивирование неполовозрелых Е.granulosus на искусственных питательных средах. Бюлл. Всес. Инт. Гельминт. 1984. - Вып. 38. - С. 5859.

39. Есенгалиев Т. Т., Андреева Г. Н., Клещинова Е. А.,

40. Тараканов Т. Т. Методические рекомендации по правилам работы с культурами эхинококков. -Уральск, 1986. — 6 с.

41. Залкинд С. Я., Изакова, JI. П. 1959. В сб.: Пластические ивосстановительные процессы. М.: 104-112.

42. Зорихина В. И., Баллад Н. Е., Кишинян А. Ш.

43. Сравнительная эффективность ИФР и РНГА в диагностике эхинококкоза // Мед. паразитол. и паразитарн. болезни. — 1982. №2. — С. 21-24.

44. Зорихина В. И., Баллад Н. Е. Серологические методыдиагностики эхинококкоза // Эхинококкозы. Методы исследования, лечения, профилактика. — М. — 1990. — С. 49-61.

45. Кисели Д. Практическая микротехника и гистохимия.1. Будапешт. 1962. -399 с.

46. Кленова И. Ф. Разработка клеточной технологииполучения антигенов цестод (на примере Coenurus cerebralis Е. multilocularis): Дисс. канд. ветер, наук. М. 1999.- 108 с.

47. Краснощекое Г. П. Лярвогенез и морфологическаяизменчивость тегумента высших цестод: Дисс. докт. биол. наук. Магадан, 1982. - Т. 1,2.

48. Красюкова Л. С. Культивирование клеток ларвоцистэхинококка и использование его протосколексов для отбора антгельминтных препаратов: Дисс. канд. биол. наук. М.-1987.-184 с.

49. Леонов Ф. В., Исламбеков Э. С., Байбеков И. М.

50. Ультраструктура ларвоцисты при неосложненных формах эхинококкоза легких // Мед. Уз. 1985. № 10. -С. 30-33.

51. Лукашенко Н. П. Некоторые наблюдения окультивировании А. multilocularis (Lecart, 1863) in vitro // Мат. к научн. конф. Всес. об-ща гельминт. — М. 1964 а. — Ч. 1. — С. 238-242.

52. Лукашенко Н. П. К изучению развития А. multilocularis1.cart, 1863) in vitro // Мед. паразит, и паразит, болезни. 1964 б. - № 3. - С. 271-278.

53. Лукашенко Н. П. Альвеококкоз (альвеолярныйэхинококкоз) животных и человека // Дисс. докт. биол. наук.-М.-1967.-Т. 1,2.

54. Лукашенко Н. П. Альвеококкоз (альвеолярныйэхинококкоз). М.: Медицина, 1975. —327 с.

55. Максимов А. А. Культивирование in vitro соединительнойткани взрослых млекопитающих // Арх. анат. 1916. — I.-C. 105.

56. Максимов А. А. Основы гистологии: в 2ч. 3 сокр. изд. //

57. Под ред. Заварзина. — Л.: Госиздат, 1925. — 316 с.

58. Носик А. Ф. Эхинококкоз жвачных и меры борьбы сним.: Автореф. дисс. докт. ветер, наук. М. 1953. — С. 35.

59. Оленов Ю. М. Новые методы культуры животных тканей.- М.: Мир. 1976.- 255 с.

60. Осидзе Д. Д. Получение культур клеток из тканей и ихиспользование в вирусологии: (обзорная информация).-ВНИИТЭИСХ. М. 1975. - 42 с.

61. Пинаев Г.П. Методы культивирования клеток. Ленингр.- 1988.-320 с.

62. Подопригора Г. И., Збарский А. И. Перспективыразвития иммунодиагностического и иммунопрофилактического направления в паразитологии // Мед. паразитол. и паразит, болезни. 1990. - № 5. - С. 26-30.

63. Подопригора Г. И., Старкова Т. В., Эккерт Д.,

64. Готстейн Б. Сравнительная эффективностькоммерческих тестов (Российского ишвейцарского производства) иммуноферментного анализа на эхинококкоз // Мед. паразитол. и паразитарн. болезни. 1994. - №3. — С. 51-52.

65. Руднева О. В. Диагностическая эффективностьклеточных метаболитов антигенов протосколексов ларвоцист Echinococcus multilocularis при цистном эхинококкозе // Труды Всероссийского НИИ гельминтологии. -2005. - Т. 41. -С.305-311.

66. Руднева О. В., Далаева И. Б., Бережко В. К.

67. Иммунохимический анализ и диагностическаяэффективность «клеточных» антигенов Echinococcus multilocularis при эхинокоюсозе свиней // Труды Всероссийского НИИ гельминтологии. 2006. — Т. 42. -С. 290-291.

68. Савченкова И. П., Зиновьева Н. А., Булла Й., Брэм Г.

69. Эмбриональные стволовые клетки, их генетическое изменение путем гомологичной рекомбинации и использование в получении трансгенных животных // Успехи соврем. Биологии. 1996. - Т. 116, № 1. - С. 7892.

70. Сергеев В. А Репродукция и выращивание вирусовживотных. — М.: Колос, 1976. 303 с.

71. Сергеев В. А. Размножение вирусов животных вкультуре ткани. — М.: Колос, 1966. — 311 с.

72. Сивкова Т. Н. Диагностическая эффективностьантигенов клеточной культуры протосколексов Е. granulosus при цистном гидатидозе человека // Труды Всероссийского института гельминтологии им. К. И. Скрябина. 2002. - Т. 38. - С. 206-211.

73. Сивкова Т. Н. Диагностическая эффективность ELISA иdot- ELISA с антигенами клеточных культур при цистном гидатидозе // Диссер. канд. биол. наук. 2002.

74. Сивкова Т. Н., Бережко В. К. Эффективность антигеновклеточной культуры протосколексов Echinococcus granulosus и Echinococcus multilocularis в диагностике цистного гидатидоза свиней // Ветеринария. — 2002. № 10.-С. 32-34.

75. Скворцов И. П. Наблюдения над жизнью гематов внеорганизма // Тр. Мед. секции о-ва опытных наук при императорском Харьковском ун-те за 1885. — Харьков. — 1986.-С. 128-145.

76. Смирнова JI. В. Жизненный цикл и постэмбриональноеразвитие цестоды Hymenolepis hórrida //

77. Паразитология. 1980. - Вып. 23, № 6. - С. 467-471.

78. Спиера Р. Е., Гриффите Д. Б. Биотехнология клетокживотных. М. - 1989. - Т. 1-2.

79. Тараканов В. И. Культивирование гельминтов вискусственных питательных средах. Диссер. докт. биол. наук. М.- 1979.

80. Тараканов В. И., Андреева Г. Н., Клещинова Е. А. Окультивировании Е. granulosus на искусственных питательных средах. В кн.: Биологические основы борьбы с гельминтами животных и растений // Тез. докл. конф. ВОГ АНССР.-М. 1983.-С. 160-162.

81. Тараканов В. И. Культивирование протосколексовэхинококка на двухфазных питательных средах // Материалы IV Закавказской конференции по паразитологии. Тбилиси, 1986.

82. Твердохлебова Т. И., Васерин Ю. И., Цыбульская М. А.,

83. Трибулев Г. П., Подоплелов И. И., Шарый Н. И., Крюкова

84. Трошин А. С. Биология клетки в культуре. Ленинград,

85. Изд-во «Наука», 1984. 278 с.

86. Уосли Д. Д. Новые методы культуры животных тканей:

87. Перевод, с англ. К. И. Фридлянский. М.: Мир. 1976. — 255 с.

88. Уралов М. Физиология и биохимия цестод икультивирование их в искусственных питательных средах. — М. Автореферат. ВИГИС. 1990.

89. Хаертынов К. С., Гальнбек Т. В., Хазипов Н. 3.

90. Методические рекомендации по ускоренному получению сыворотки крови животных для культивирования клеток и вирусологических исследований методом центрифугирования. — М. 1985.-2 с.

91. Хандуев Ц. Ц., Лукьянова 3. М. Тканевые культуры и ихприменение в вирусологии. — Фрунзе: Илим, 1974. 92 с.

92. ХлопинН. Г. Общебиологические и экспериментальныеосновы гистологии Л., 1946. — 491 с.

93. Цыпкин JI. Б. Изучение морфологии и биологическихсвойств однослойных клеточных культур из трипсинизированных тканей // Дисс. Докт. мед. наук: -Т. 1-2. -М., 1968.

94. Эвранова В. Г., Сергеева П. А. Культивированиеличиночной стадии Echinococcus granulosus вне организма // Тезисы докл. научн. конф. Всесоюзн. О-ва гельминтол. 10-14 дек. 1962. М. -1962. - Ч. 1. - С. 221-222.

95. Ястреб В. Б., Скворцова Ф. К. Ультраструктурафертильных ларвоцист Е. granulosus от овец и свиней // Ветеринария. 1986. - № 8. — С. 50-52.

96. Adams А. М. Growth rates of germinal cells of

97. Echinococcus multilocularis and E. vogeli // Bull. Soc. Fr. Parasitol. 1990. - V.8. - Suppl.l. - P. 148.

98. Ali-Khan Z. Host-parasite relationship in echinococcosis. I.

99. Parasite biomass and antibody response in three strains of inbred mice against graded doses of Echinococcus multilocularis cysts // J. Parasitol. 1974. - V. 60. - P. 231235.

100. Ali-Khan Z., Siboo R. Immune complexes experimentalalveolar hydatidosis // «Tropenmed und Parasitol». -1983. -V. 34, N3.-P. 187-192.

101. Ali-Khan Z., Siboo R. Echinococcus multilocularisimmunoglobulin and antibody response in C57BL/6S mice // «Exp. Parasitol». 1982. -V. 53, N 1. - P. 97- 104.

102. Allintas N., Ozensoy S. Application of biotin- avidin system:determination of antybody response in hydatidosis // 6 th1.t. Helminthol. Simp. The High Tatras CSFR., Progr. and Abst. — 1991. — P. 93.

103. Auer H., Hermentin K., Aspock H. In vitro production of

104. Echinococcus antigens for diagnosis // «Progr. And Abstr. of the V Europ. Multicolloq. of Parasitol., sept. 4-9, Budapest Hungary», 1988. P. 6-10.

105. Auer L., Aspock H. Differential serodiagnosis ofalveolar and cystic echinococcosis // 6-th int. helmintol. Symp., the High Tatras, CSFR, sept. 23-27.-1991.-P. 92.

106. Benex I. Evolution in vitro d1 explants de membraneproliféré d' E. granulosus. Etude de la formation de veiculus secondaires. — Ann. parasitol. Hum. Comp. 1968. — V. 43, № 5. P. 573-578.

107. Berezhko V. K., Bessonov A. S. Cell metabolites of

108. Echinococcus multilocularis: application as diagnostic antigens // Arch. Int. de la hidatidosis. 1999. - V. 33. -P. 286.

109. Bolla R. T., Roberts L. S. Developmental physiology ofcestodes. IX. Cytological characteristics of the germinative region of Hymenolepis diminuta. J. Parasitol. - 1971. - V. 57. - P. 267-277.

110. Born G. Uber Verwachsungsversuche mit Amphibian1.rven // W. Roux' Arch. Entwiklungsmech. Organism. -1897. — V. 7.-P. 517-623.

111. Bretagne S., Beaujean F., Liance M., Houin R. Rapidtechnique for cryopreservation of Echinococcus multilocularis metacesdodes // Bul. Soc. Fr. Parasitol. — 1990. V. 8. - Suppl. 1. - P. 234.

112. Carrel A., Burrows M. T. Cultivation of adult tissues andorgans outside of the body//J. Amer. Med. Ass.— 1910. -V. 55, N 16. -P. 1379-1381.

113. Casado- Escribano N., Rodriguez- Caabeiro F. Cultivo "invitro" de protoscolex de Echinococcus granulosus en direccion vesicular II Estudio de la idoneidad de diberentes medios // Rev. iber. Parasitol. 1988. - V. 48, N 2. - P. 155-163.

114. Condon J., Rausch R. L., Wilson I. F. Application of theavidin-biotin immunohistochemical method for the diagnosis of alveolar hydatid disease from tissue sections // Trans. Roy. Soc. Trop. Med. and Hyg. — 1988. V. 82, N 5. - P. 731-735.

115. Contreras M. del C., Gallo S., Salinas P., Sapunar S., Sandoval1., Solis F. Evaluation of ELISA Ig G using a purified antigen in the diagnosis of human hydatidosis // Biol. Chileno Parasitol. 1994. - V. 49, N 1/ 2. - P. 24-30.

116. Coutelen F. Histogenese des cellules libres, a glicogene eta graisses, des hydatides echinococciques // Ann. Parasitol. humaine et compare. 1938. - V. 9, N 2. - P. 101- 103.

117. Craig P. S., RicKard M. D., Hocking R. E., Mitchel G. F.

118. Murine hybrodome — derived antibodies in the processing of antigens for the immunodiagnosis of hydatid (Echinococcus granulosus) infection in shepp // Parasitology. 1981. - V. 83, N 2. - P. 303-317.

119. Delaunay P., Petithory J. C. Essai de deux nouvelles irousses

120. ELISA "Echinococcus serology" specifique du genze Echinococcus spp. "Echinococcus multilocularis" de l'espece "Echinococcus multilocularis" // Bull. Soc. Fr. Parasitol. 1994. - V. 12. - Suppl. 1. - P. 23-28.

121. Dieckmann A., Frank W. Isolation of viable germinal cellsfrom Echinococcus multilocularis // Parasitol. Res. — 1988. -V. 74.-P. 297-298.

122. Dieckmann A., Schuppert A., Ruppel A., Burger R., Frank W.

123. Echinococcus multilocularis: in vitro secretion of antigen by hybridomas from metacestode germinal cells and murine tumor cells // Experimental parasitology. — 1989. V. 29.-P. 186-191.

124. Dottorini S., Tassi C. Echinococcus granulosus: comparisonbetween antigens in scolices and hydatid fluid // Int. J. Parasitol. 1978. -V. 8. - P. 259-265.

125. Dottorini S., Tassi C. Echinococcus granulosus:characterization of the main antigenic component (Arc5) of hydatid fluid // Exp. Parasitol. 1977. - V. 43, N 2. - P. 307-314.

126. Dumon H. N., Doundou M. V., Mary Ch., Togo J.,

127. Gambarelli F., Franck I., Faugere B., Quilici M. Obtention d' antigens metaboliques d' Echinococcusgranulosus par culture de scolex, resultants preliminaries // Bull. Soc. Fr. Parasitol.-1984.-N3.-P. 123-125.

128. Eckert I. E., Ramp Th. Cryopreservation of Echinococcus multilocularis metacestodes and subsequent proliferation in rodents (Meriones). Zeitschrift fur Parasitenkunde. — 1985.-V. 71.-P. 777-787.

129. Eckert J., Jacquiler P., Baumann D., Raeber P. A. Echinokokkose des Menschen in der Schweiz, 1984 -1992//Schweiz. Med. Wochenschr. 1995. - 125. - N42. -1989-1998.

130. Facon B., Chamekh M., Dissons C., Capron A. Molecular cloning of E. granulosus protein expressing an immunogenetic epitope of antigen 5 // Mol. and Biochem. Parasitol. -1991. -V. 45, N 2. P. 233-240.

131. Feng J. J., Xiao S. H., Yuo H. F., Shen B. Y., Xue H. C. Isolation of germinal cells from the secondary cysts of E. granulosus harbored in mice // Chin. I. Parasitol. and Parasit. Diseases. 1992. - V. 10, N 2. - P. 86-89.

132. Feng J.J., Wang J. Y., Qu J. A., Xiao S. H. ELIB of specific antigens in vitro cultivated germinal cells of Echinococcus granulosus // Chin. I. Parasitol. and Parasit. Diseases. 1993.-V. 11,N l.-P. 63-65.

133. Fiori P. L., Monaco Y., Scappaticci S., Puqliese A., Canu N.,

134. Cappuccinelli P. Establishment of cell cultures from hydatid cysts of Echinococcus granulosus // Int. J. Parasitol. 1988. - N 18. - P. 297-305.

135. Furuya K. An established cell line of larval Echinococcus multilocularis //Int. J. Parasit.- 1991. V. 21, N 2.-P. 233.

136. Furuya K., Honnra H., Kumagai M. A cell line derived from larval Echinococcus multilocularis. Bull. Soc. Fr. Parasitol. 1990. - 8 Suppl., N 1. - P. 159.

137. Gottstein B., Eckert J., Fey H. Serological différenciation between Echinococcus granulosus, Echinococcus multilocularis in man // Z. Parasitenk. 1983. — V. 69, N 3.-P. 347-356.

138. Griffith A. H. International symposium on immunization: Benefit versus risk factors // Dev. Biol. Stand. — 1979. — V. 43.-P.3-13.

139. Gustafsson M. Basic cells types in Echinococcus granulosus (Cestoda, Cyclophylliden) // Acta Zoologica Fennica, -1976.-V. 146.- P. 1-16.

140. Gustafsson M. The histology of the neck region of Echinococcus granulosus // Proc. Ind. Europen Multicolloq. Parasitol. 1-6 sept. 1975.- Trogiz. Yugoslavia. — Belgrad. -1978.-P. 319-320.

141. Hariri M. N., Schvabe C. W., Koussa M. Host- parasite relationships in echinococcosis. XI. The antigens in the indirect hemagglutination test for hydatid disease // Am. J. Trop. Med. 1965. - V. 14. - P. 592- 604.

142. Harrison R. G. Observation on the livpig developing nerve fiber // Proc. Soc. Exptl. Biol, and Med. 1907. - N 4. -P.140-143.llö.Hayflick L. The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains //Exp. Cell Res. 1965.-V. 37.- P. 614-636.

143. Heath D. D., Lawrence S. B. Echinococcus granulosus: Development in vitro from oncosphera to immature hydatid cyst // Parasitology. 1976. - V. 73, N 3. - P. 417423.

144. Heath D. D., Osborn P. J. Formation of Echinococcus granulosus laminated membrane in a defined medium // Int. J. Parasitol. 1976. - V. 6. - P. 474- 471.

145. Hiza P. R., Bahz G. M., Shweiki H. M., Behlehani K. An -enzymelinked immunosorbent assay using an are 5 antigen for the diagnosis of cystic hydatid diseasse // Ann. Trop. Med. And Parasitol. 1990. - V. 84, N 2. - P. 157-162.

146. Hulsmeier A. J., Gehrid P. M., Geyer R., Sack R., Gottstin B., Deplaces P., Kohler P. A major Echinococcus multilocularis antigen is mucin-type glycoprotein // J. Biol. Chem. -2002. V. 277, N 8. - P. 5742-5748.

147. Ito A. Serodiagnosis of echinococcosis in humans and animals // 16th Int. Conf. of the WAAVP. Progr. And Abstr. 10-15 Aug. -1997. Sun. City, South Africa. -1997.-P. 42.

148. Kagan I., Norman L. Antigenic analisis of Echinococcus antigens by agar diffusion techniques. // Amer. J. Trop. Med. a Hyg.- 1961.-V. 10,N. 5.-P. 727-734.

149. Kilejian A., Schinazi L. A., Schwabe C. W. Host- parasite relationships in Echinococcosis. V. Histochemical observations on Echinococcus granulosus // J. Parasitol. — 1961.-V. 47, N2.-P. 181- 185.

150. Knobloch J., Lederer I., Mannweiler E. Species-specific immunodiagnosis of human echinococcosis with crude antigens // Eur. J. Clin. Micrjbiol. 1984. - V. 3, N 6. -P. 554-555.

151. Konigsberg I. R. Clonal analysis of of myogenesis. — Scienc. 1963. - V. 40. - P. 1273-1284.

152. Kruse P. F., Patterson M. K., E. ds. "Tissue Culture Methods and Applications", Academic Press, New York, San Francisco, London, 1973, 868 p.

153. Lascano E. F., Coltorti E. A., Varela-Diaz V. M. Finestructure of the germinal membrane of Echinococcus granulosus cysts // Journal of Parasitology. — 1975. V. 60.-P. 853-860.

154. Leykina E. S., Dalin M. V., Ballad N. E., Tchebyshev N. V., Zorikhina V. I., Poletaeva O. G. Isolation of diagnostical helminth antigens and their use in serodiagnosis // Helmintología. 1981. -V. 18. - P. 273-280.

155. Lightowlers M. W., Roife R., Yanci Ch. Y. Taenia saginata: vaccination against cysticercosis in cattle with recombinant oncosphere antigens // Exp. Parasitol. — 1996. -V. 84, N3.-P. 330-338.

156. Lu J. H., Li D. Ch., Zhang S. Z., Feng D. U., Guo J. M. Иммуногенность и реактогенность экскреторных антигенов из клеточной линии Echinococcus granulosus // Chin. J. Vet. Sei. 1999. - V. 19, N 6. - P. 566-568.

157. Lu J. H., Cheng W. X., You Z. M., Kong Ch. Q., Feng D. H., Li D. Ch., Yuo Y. The cell line establishment of larval Echinococcus granulosus // Chin. J. Vet. Sei. — 1998. — V. 18, N5.- P. 479-482.

158. Lu J. H., Yu X. В., Li D. Ch., Zhan Z. X., You Z. M., Pan X. H. Идентификация клеточной линии эхинококка Echinococcus granulosus // Acad. J. Sun. Yat-Set Univ. Med. Sei. 2000. - V.21, N 4. - P. 3 0-33.

159. Machnicka B. The common antigens of Cysticercus bovis and Taenia saginata // Bull. Acad. Pol. Sei. Ser. Sei. Biol. — 1974.-V. 22, N3.-P. 197-199.

160. Moore G. E., Gerner R. E., Franklin H. A. Culture of normal human leukocytes// J. Amer. Med. Assoc. 1967. — V. 199.-P. 519-524.

161. Morgan J. F., Parker R. C., Morton H. J. Media for animal cell culture// Proc. Soc. exp. Biol. Med.- 1950.-V. 1. -P. 73.

162. Moscona A., Folkman J. Role of cell shape in growth control // Nature. 1978. -V. 273. P. 345-349.

163. Prescott D. M. Reproduction of eukaryotic cells. New York. 1976. P. 177.

164. Queralt R., Madico A., Mercader M., Pardo A., Sanchez F., March F., Coll P., Munoz C. Purification de antigenos a partir de liquido hydatidico. Estudio de su reactividad por "immunoblot" // Rev. iber. Parasitol. -1989. V. 49, N 4. -P. 313-319.

165. Rickard M. D. Vaccination of calves against Taenia saginatainfection using antigens collected in vitro cultivation of larve cestodes // 4-th Intern. Congr. Parasitol. 19-26 Aug. 1978. Warszama. ShortCommun. Sect. -P. 134- 135.

166. Rickard M. D., Harrison Y. B. I., Health D. D., Lightowlers M. W. Taenia ovis recombinant vaccine "quo vadit" // Parasitology. - 1995. - V. 110. - P. 5-9.

167. Rickard M. D., Bell K. J. Successful vaccinationof lambs against infection with Taenia ovis using antigens produced during in vitro culture of the lave stages // Res. Vet. Sci.- 1971.-V. 12.-P. 401-402.

168. Rogan M. T., Craig P. S. Immunological approaches for transmission and epidemiological studies in cestode zoonoses the role of serology in human infection //

169. Cestode Zoonoses: Echinococcus and Cysticercosis //10 S Press.-2002.-P. 135-145.

170. Rozengurt E. Stimulation of DNA synthesis in quiescent cultured cells: exogenous agents, internal signals, and early events. In: Current topics in cellular regulation. New York etc., 1980. - V. 17. - P. 59-88.

171. Sakamoto T. Histochemistry and histoenzymology of

172. Echinococcus. I. Histochemical observation on general structure of Echinococcus multilocularis // Mem. Fac. Agr. Kagoshima Univ. 1982. -V. 18, N 27. - P. 127-139.

173. Sakamoto T., Kotani T. Studies on Echinococcus. XX.

174. Preliminary observations of the in vitro cultivation of larval tissues of Echinococcus multilocularis in culture chamber of porous membrane // Jap. J. Vet. Res. — 1967. — V. 15, N4.-P. 165-170.

175. Sakamoto T., SigimuraM. Studies on echinococcosis. XXIII.

176. Electron microscopical observations on histogenesis of larval Echinococcus multilocularis // Jap. J. Vet. Res. -1970.-V. 18, N. 3. P. 131- 144.

177. Smyth J. D. Studies on tapeworm physiology. X. Axeniccultivation of the hydatid organism, Echinococcus granulosus: establishment of a basic technique // Parasitology. 1962. - V. 52, N 3-4. - P. 441- 457.

178. Smyth J. D. Studies on tapeworm physiology. XI. In vitrocultivation of Echinococcus granulosus from the protoscolex to the Strobilate stage // Parasitology. 1967. -V. 57, N1.- P. 111-133.

179. Smyth J. D., Jha R. K. Echinococcus granulosus:

180. Ultrastructure of microtriches // Exp. Parasitol. — 1969. -V. 25. — P. 232-244.

181. Smyth J. D., Davies Z. In vitro culture of the strobilar stageof Echinococcus granulosus (sheep strain): a review of basic problems and results // Int. J. Parasitol. 1974. - V. 4. - P. 631-644.

182. Thompson R. C. A. The development of Brood Capsules and Protoscolices in Secondary Hydatid Cysts of Echinococcus granulosus. A. Histological Study // Z. Parasitenk. 1976. - V. 51, N 1. - P. 31 -36.

183. Threadgold L. T., Arme C. Electron microscope studies of Fasciola hepatica. XI. Autophagy and parenchymal cell function // Exp. Parasitol. 1974. - V. 35. - P. 389-415.

184. Todaro G. J., Lazar G. K., Grenn H. The initiation of cell division in a contact-inhibited mammalian cell line. — J. Cell. Comp. Physiol., 1965.- V. 66. P. 325-334.

185. Turcecova L., Kolarova L., Dubinsky P., Martinek K. Characteristics of antigens in tapeworms of the genus Echinococcus // Helmintologia. 1997. - V. 34, № 3. - P. 188-189.

186. Vogel H. Wie wachst der Alveolar Echinococcus // Tropenmed Parasitol. 1978. - V. 29. - P. 1-11.

187. Vulpian M. A. Note sur les phenomenes de development qui se manifestent dans la queue de jeunes embryons de Grenouille, après qu' on l'a s'eparee du corps par une section transver sale // C. r. Acad. Sei. 1859. - V. 48. — P. 807-811.

188. Wittelsberger S.C., Kleene K., Penman S. Progressive loss ofshape esponsive metabolic controls in cells with increasingly transformed phenotype. — Cell, 1981. V. 24. -P. 859-866.

189. Yamashita J., Ohbayashi M., Sakamoto T., Orihara M. Studies on Echinococcosis. XIII. Observations on the vesicular development of the scolex of Echinococcus multilocularis in vitro // Jap. J. Vet. Res. — 1962. V. 10. -P. 85-96.