Диагностическая эффективность ELISA и dot-ELISA с антигенами клеточных культур при цистном гидатидозе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.19, кандидат биологических наук Сивкова, Татьяна Николаевна

• Сивкова, Татьяна Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Сивкова, Татьяна Николаевна

Введение.6.

1. Обзор литературы.11.

1.1. Антигены эхинококка и их характеристика.11.

1.2. Клеточная технология получения антигенов эхинококка.18.

1.3. Применение ELISA и dot-ELISA для диагностики гельминтозов.22.

2. Собственные исследования.38.

2.1. Материалы и методы.38.

2.1.1. Подготовка лабораторной посуды, инструментов и растворов для проведения культуральной работы.39.

2.1.2. Получение гельминтного материала для культивирования.40. а) Приобретение цист E.granulosus от людей и животных.40. б) Заражение белых крыс протосколексами E.multilocularis, получение вторичных ларвоцист.40.

2.1.3. Приготовление первичной клеточной культуры E.granulosus и E.multilocularis и проверка ее жизнеспособности. Получение перевиваемой клеточной культуры.41.

2.1.4. Контроль клеточных метаболитов на стерильность, безвредность, определение содержания белка.42. 1.5. Проверка инвазивности клеточной культуры E.multilocularis.43.

2.1.6. Определение антигенной активности клеточных метаболитов E.granulosus и E.multilocularis .44.

2.1.7. Диагностическая эффективность метаболитов клеточных культур E.granulosus и E.multilocularis.45. а) Сбор патологического материала от свиней.45. б) Исследование сывороток крови свиней в реакции ELISA.46. в) Исследование сывороток крови людей в реакции ELISA.47. г) Исследование сывороток крови людей коммерческим тестом "Эхинококк IgG-стрип".48.

2.1.8. Статистическая обработка результатов.48.

2.1.9. Разработка диагностической тест-системы на основе dot-ELISA.48.

2.1.10. Диагностическая эффективность dot-ELISA при цистном гидатидозе.50. а) Исследование сывороток крови свиней.50. б) Исследование сывороток крови людей.51.

2.2. Результаты исследований.52.

2.2.1. Анализ данных по культивированию протосколексов E.granulosus и вторичных ларвоцист E.multilocularis.52.

2.2.2. Характеристика и контроль метаболитов клеточных культур протосколексов E.granulosus и вторичных ларвоцист E.multilocularis.57.

2.2.3. Отбор и характеристика антигеноактивных метаболитов клеток протосколексов Е.granulosus и вторичных ларвоцист E.multilocularis в иммуноферментной реакции.58.

2.2.4. Оценка диагностической эффективности антигенов -метаболитов клеточной культуры при цистном гидатидозе.60. а) Диагностическая эффективность иммуноферментной реакции с антигенами клеточной культуры E.granulosus при цистном гидатидозе свиней.60. б) Диагностическая эффективность иммуноферментной реакции с антигенами клеточной культуры E.multilocularis при цистном гидатидозе свиней.61. в) Диагностическая эффективность антигенов клеточной культуры E.granulosus при цистном гидатидозе человека.62. г) Диагностическая эффективность антигенов клеточной культуры E.multilocularis при цистном гидатидозе человека.68.

2.2.5. Исследование сывороток крови человека коммерческим тестом "Эхинококк IgG-стрип".72.

2.2.6. Разработка диагностической тест-системы на основе dot-ELISA.73. а) Диагностическая эффективность dot-ELISA с антигеном цистной жидкости при цистном гидатидозе человека.76. б) Диагностическая эффективность dot-ELISA с антигеном клеточной культуры E.granulosus при цистном гидатидозе свиней.77. в) Диагностическая эффективность dot-ELISA с антигеном клеточной культуры E.multilocularis при цистном гидатидозе свиней.81. г) Диагностическая эффективность dot-ELISA с антигеном клеточной культуры Е.granulosus при цистном гидатидозе человека.82. д) Диагностическая эффективность dot-ELISA с антигеном клеточной культуры E.multilocularis при цистном гидатидозе человека.85.

2.2.7. Сравнение диагностической эффективности реакций ELISA, dot-ELISA и "Эхинококк IgG-стрип" при цистном гидатидозе.86.

2.2.8. Результаты заражения беспородных белых мышей клеточной культурой E.multilocularis.97.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Диагностическая эффективность ELISA и dot-ELISA с антигенами клеточных культур при цистном гидатидозе»

Актуальность темы. Цистный гидатидоз (эхинококкоз) является одним из наиболее опасных гельминтозоонозов. Болезнь протекает бессимптомно, клинические признаки проявляются на поздних стадиях заболевания и зависят от локализации и размеров цист. Распространение в России цистной и альвеолярной форм гидатидоза за 1986-1995 годы остается примерно на одном уровне - около 1,1 случаев на 100 тысяч населения. За последние годы этот показатель может несколько увеличиться по причине усиления урбанизации, возросшей миграции населения, развала устоявшихся экономических отношений, а также в связи с ухудшением социальной жизни и снижением санитарно-эпидемиологического контроля (Маркин А.В., 1999; Мусаев Г.Х., 1999).

Невозможность ранней клинической диагностики эхинококкоза приводит к необходимости разработки и усовершенствования иммунологических методов, так как полученная с их помощью информация может служить для оценки эпидемической и эпизоотической ситуации. В процессе инвазии в организме хозяина синтезируются антитела различной специфичности, причем некоторые из них являются продуктом действия антигенных компонентов, являющихся общими для большинства гельминтов, что значительно затрудняет разработку имму но диагностических методов. Экспериментально установлено, что диагностическая эффективность иммунореакций в большой степени зависит от качества используемых антигенов. Физико-химические и иммунохимические методы получения диагностических антигенов цестод хотя и находят широкое применение, требуют значительных количеств исходного гельминтного материала, приобретение которого в последние годы становится особенно проблематичным. Получение стандартизированных видоспецифичных антигенов гельминтов является одной из актуальных задач, в решении которых большое значение имеют биотехнологические методы. С развитием биотехнологии стало возможным конструирование иммунодиагностических и иммунопрофилактических препаратов нового поколения, основанных на использовании генной инженерии и гибридомной техники. Применение этих технологий позволило создать рекомбинантные пептиды, обладающие свойствами антигенов.

К числу перспективных направлений биотехнологии относится и клеточная инженерия, которая позволяет использовать культуры клеток для решения многих научных и прикладных задач биологии, медицины и сельского хозяйства. Преимущества клеточной технологии в получении антигенов гельминтов и других биологических объектов сводятся к тому, что клеточные культуры можно приготовить из различных антигеноактивных субстанций паразитов и длительное время сохранять в функциональном состоянии в искусственных питательных средах путем их многократного пассирования. Хотя работ по культивированию клеток тканей и органов гельминтов немного, подобные исследования проводились давно и были сделаны конкретные выводы о такой возможности (Sakamoto Т. et al., 1967; Sakamoto Т., Kotani Т., 1967; Rickard M.D., Bell K.J., 1971; Sakamoto Т., 1978; Smith M.A., 1979). Очищенные экскреторно-секреторные антигены, полученные при культивировании гельминтов рода Echinococcus, используются для изучения иммунитета и вакцинации животных (Heath

D.D., 1976; Rickard M.D., 1978; Onawunmi О.А., Coles G.C., 1980; Osborn О .J., Heath D.D., 1982).

Кроме того, в качестве источника антигенов для диагностики цистного гидатидоза можно примерять вторичные ларвоцисты

E.multilocularis, используя антигенное сходство этих видов гельминтов.

Особый интерес представляют разработка и усовершенствование новых иммунодиагностических методов. Обзор многочисленных работ по использованию dot-ELISA в диагностических исследованиях при гельминтозах свидетельствует об эффективности этого теста, не уступающего, а в большинстве случаев превосходящего по своим параметрам - чувствительности, специфичности, простоте выполнения и расходу реактивов и биоматериалов, другие иммунодиагностические методы. Перспективность dot-ELISA в сероэпизоотических и сероэпидемических исследованиях не вызывает сомнения, поскольку для его выполнения требуются микроколичества исследуемого образца, а при выполнении самой реакции можно обойтись без электрооборудования, что немаловажно для массовых исследований в полевых условиях и малооснащенных лабораториях.

Исходя из вышеизложенного, считаем целесообразной и актуальной работу по созданию иммунологических диагностических реакций с использованием антигенов клеточных культур паразита.

Цели и задачи исследования. Основной целью наших исследований было оценить диагностическую эффективность иммуноферментных реакций типа ELISA и dot-ELISA с антигенами клеточных культур при цистном гидатидозе.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. подобрать оптимальные условия для культивирования клеток эхинококков в искусственных питательных средах для получения экскреторно-секреторных антигенов;

2. провести отбор антигеноактивных серий клеточных метаболитов;

3. подобрать сыворотки от животных и людей, зараженных

E.granulosus, другими гельминтозами и клинически здоровых;

4. отработать параметры иммунологических реакций типа ELISA и dot-ELISA;

5. оценить диагностические качества антигенов клеточных культур при цистном гидатидозе, используя собранный банк сывороток;

6. провести сравнительный анализ эффективности ELISA и dot-ELISA с клеточными антигенами с коммерческим тестом.

Научная новизна. Проведена оценка параметров культивирования клеток тканей E.granulosus и E.multilocularis, подобран режим постановки диагностической иммуноферментной реакции (ИФР) с полученными экскреторно-секреторными антигенами.

Проведено заражение промежуточных хозяев перевиваемой культурой E.multilocularis.

Впервые проведена оценка диагностической эффективности клеточных антигенов протосколексов E.granulosus и вторичных ларвоцист E.multilocularis при цистном гидатидозе человека и животных.

Разработаны параметры проведения реакции dot-ELISA с антигенами цистной жидкости E.granulosus.

Впервые разработана иммуноферментная реакция типа dot-ELISA с антигенами клеточных культур при цистном гидатидозе и проведена сравнительная оценка диагностической эффективности реакций типа ELISA и dot-ELISA с антигенами клеточных культур с коммерческим тестом.

Практическая ценность работы. По материалам диссертационной работы разработан "Лабораторный регламент на выявление антител к Echinococcus granulosus в реакции dot-ELISA" , одобренный на заседании секции "Инвазионные болезни животных" Отделения ветеринарной медицины РАСХН.

Подготовлен патент на "Способ получения диагностического антигена цестод".

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на:

1. П-ой международной научной конференции «Биотехнология в животноводстве, растениеводстве и ветеринарии» (Москва, 18-19 октября 2000г.).

2. Объединенных сессиях Координационного совещания по ветеринарной паразитологии центрального совета Общества гельминтологов РАН и секции «Инвазионные болезни животных» РАСХН, проводившихся 26.05.00, 01.06.00, 20-22.02.01, 2224.05.02 (Москва).

3. Заседаниях Ученого совета ВИГИС (2000-2002 г.г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Технология получения перевиваемой клеточной культуры E.granulosus и E.multilocularis - продуцентов клеточных метаболитов.

2. Отбор антигеноактивных клеточных метаболитов с использованием иммуноферментной реакции.

3. Оценка диагностической эффективности иммуноферментной реакции с антигенами клеточных культур при цистном гидатидозе.

4. Разработка диагностической реакции типа dot-ELISA с антигенами клеточных культур и цистной жидкости при цистном гидатидозе.

5. Сравнительный анализ иммуноферментной реакции и dot-ELISA с антигенами клеточных культур и коммерческим тестом.

6. Способность перевиваемой клеточной культуры к заражению промежуточных хозяев. и

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 7 работ, в которых отражены основные направления и результаты исследований и 2 работы приняты к публикации.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, включающего материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов, выводы, список использованной литературы, состоящий из 174 источников, в том числе 29 отечественных и 145 зарубежных, приложения.

Заключение диссертации по теме «Паразитология», Сивкова, Татьяна Николаевна

4. ВЫВОДЫ

1. Отработана методика получения перевиваемой клеточной культуры клеток протосколексов Echinococcus granulosus и вторичных ларвоцист Echinococcus multilocularis для получения продуктов метаболизма - клеточных антигенов для иммунодиагностических исследований.

2. Иммуноферментной реакцией с использованием референс положительной и отрицательной сыворотками выделены активные серии клеточных метаболитов, содержащие антигены паразита, имеющие диагностическое значение.

3. Проведена оценка диагностической эффективности иммуноферментной реакции с использованием антигенов клеточных культур протосколексов E.granulosus и вторичных ларвоцист E.multilocularis при цистном гидатидозе животных. Установлена чувствительность теста при диагностике цистного гидатидоза животных

73,3 и 75,6%, специфичность - 65,8 и 71,3%, соответственно. Наибольшее количество ложноположительных реакций зарегистрировали у животных, инвазированных Cysticercus tenuicollis.

4. Определена диагностическая эффективность иммуноферментной реакции с использованием антигенов клеточных культур протосколексов E.granulosus и вторичных ларвоцист E.multilocularis при цистном гидатидозе человека. Чувствительность метода при диагностике цистного гидатидоза человека составила 87,3 и 83,6%, специфичность-83,3 и 86,1%, соответственно.

5. Разработана иммуноферментная реакция типа dot-ELISA с антигенами клеточных культур протосколексов E.granulosus и вторичных ларвоцист E.multilocularis для диагностики цистного гидатидоза животных и человека.

6. Определена чувствительность метода dot-ELISA с клеточными антигенами протосколексов E.granulosus и вторичных ларвоцист E.multilocularis при диагностике цистного гидатидоза животных - 71,1 и 68,9%, при специфичности - 68,1 и 70,4%, соответственно.

7. Определена диагностическая эффективность метода dot-ELISA с клеточными антигенами протосколексов E.granulosus и

Ill вторичных ларвоцист E.multilocularis при диагностике цистного гидатидоза человека. Установлена чувствительность метода - 72,3 и 70,9% при специфичности 89,4 и 88,2%, соответственно.

8. Проведен сравнительный анализ диагностической эффективности иммуноферментных реакций типа ELISA и dot-ELISA с использованием антигенов клеточных культур протосколексов E.granulosus и вторичных ларвоцист E.multilocularis с коммерческим тестом «Эхинококк IgG- стрип» при цистном гидатидозе человека и животных. Установлена сопоставимость результатов по чувствительности и специфичности сравниваемых тестов.

9. Доказано наличие и жизнеспособность герминативных клеток в перевиваемой культуре E.multilocularis и ее способность вызывать заражение промежуточных хозяев.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Сивкова, Татьяна Николаевна, 2002 год

1. Баллад Н.Е., Гаврилова Е.И., Зорихина В.И./Эффективность применения иммуноферментного метода в диагностике эхинококкоза и альвеококкоза в зависимости от степени очистки антигена.// Мед.паразитол. и паразитарн. бол.-1979.-Т.48.-№2.-С.70-76.

2. Баллад Н.Е., Шамхалов В.М., Белозеров С.Н., Клименко В.В., Шеховцов Н.В., Написанова Л.А./Изучение диагностической эффективности иммуноферментной реакции при эхинококкозе овец в производственных условиях.//Бюлл. ВИГИС.-1991.-Т.53.-С.10-15.

3. Белозеров С.Н./ Иммунологическая диагностика гельминтозов.Автореферат. .дисс. д.в.н.-М.-1990.-44с.

4. Бережко В.К., Бессонов А.С./Изучение метаболитов клеток перевиваемой культуры метацестоды T.crassiceps.//Tp. Всес. ин-та гельминтол.-1996.-Т.32.-С. 18-22.

5. Бережко В.К., Бессонов А.С./Использование клеточных метаболитов E.multilocularis в качестве диагностических антигенов./Ветеринария.-2000.-№2.-С.31-34.

6. Бережко В.К., Кленова И.Ф. /Антигенная активность клеточных метаболитов протосколексов Coenurus cerebralis.//Tp. Всес. ин-та гельминтол.-1999.-Т.35.-С.39-45.

7. Гламаздин И.Г./Культивирование отдельных клеток гельминтов и получение диагностически ценных антигенов.//Актуальные проблемы ветсанконтроля сельскохозяйственной продукции.-М.-МГУПБ.-1997.

8. Гламаздин И.Г., Радина О.В./Первичная клеточная культура D.caninum.//C6. к 100-летию со дня рождения И.В. Орлова.-МГУПБ.-1999.

9. Джанибеков Ж.Д., Одилов А.Х., Шакаров А.Г., Назирова Д.К./Иммунологические реакции в изучении отдаленных результатов эхинококкэктомии легких./ЯТробл. паразитол. и гельминтол.-М.-1989.-68-70.

10. Дьяконов Л.П., Глухов В.Ф., Поздняков А.А., Денисенко Г.Ф., Гололобова М.Т., Панкова Г.Е., Камыкова Т.Т. Культура клеток и тканей животных: Учебно-методическое пособие//Ставрополь.-1980.-112с.

11. Зорихина В.И., Баллад Н.Е./Иммунологический метод (ELISA) в диагностике эхинококкозов.//4-я научн. конф. по паразитол.-Варна.-1983.-С.238-239.

12. Зорихина В.И., Баллад Н.Е./Серологические методы диагностики эхинококкоза.//Эхинококкозы. Методы исслед., леч., проф.-М.-1990.-С.49-61.

13. Зорихина В.И., Баллад Н.Е., Кишинян А.Ш./Сравнительная эффективность ИФР и РНГА в диагностике эхинококкоза.// Мед.паразитол. ипаразитарн. бол.-1982.-№2.-С.21-24.

14. Зорихина В.И., Фатхулина Т.З./Эффективность иммуноферментного метода для диагностики ранней стадии эхинококкозов.// Мед.паразитол. и паразитарн. бол.-1988.-№3.-С.64-67.

15. Ибрагимов Р.М.//Вестник сельск. наук. Алма-Ата.-1970.-Т.1.-С.98-99.

16. Кленова И.Ф. Разработка клеточной технологии получения антигенов цестод (на примере Coenurus cerebralis и Echinococcus multilocularis): Дисс.канд. вет. наук. М.-1999.-125с.

17. Красюкова JI.C. Культивирование клеток ларвоцист эхинококка и использование его протосколексов для отбора антгельминтных препаратов: Дисс.канд. биол. наук. М.-1987.-184с.

18. Маркин А.В.// Теор. и практ. борьбы с паразитарн. болезнями.-1999.-С. 152-154.

19. Михайлов А.Т., Симирский В.Н. Методы иммунохимического анализа в биологии развития.// М.: Наука. 1991.288 с.

20. Мусаев Г.Х.// Теор. и практ. борьбы с паразитарн. болезнями.-1999.-С. 170-171.

21. Написанова Л.А., Бессонов А.С./ Динамика титров антител в ELISA и dot-ELISA при экспериментальном трихинеллезе свиней.// Ветеринария.-1999.-№10.-С. 26-28.

22. Новак М.Д./Иммунодиагностика эхинококкоза овец и крупного рогатого скота.//Мат. докл. научн. конф. «Актуальн. вопр. теор. и прикл. тремат-ии и цестод-ии».-М.-1997.-С. 104-106.

23. Петров П., Юрупова Д., Ешкенази M./ELISA в диагностике трихинеллеза и эхинококкоза.//Эпидемиол., микробиол. и инфекц. Болезни.-1981.-Т.18.-№2.-С. 178-181.

24. Пинаев Т.П. Методы культьвирования клеток. "Наука" 1988.-319с.

25. Раззаков Ш.А./Выявление видоспецифических и перекрестно реагирующих антигенных компонентов эхинококка и альвеококка.//Мед. Паразитол. и паразитарн. болезни.- 1975.-Т.44.-№4.-С.118-155.

26. Спиер Р.Е., Адаме Г.Д., Гриффите Дж.Б. Биотехнология клеток животных: в 2 т. Т. 2/пер. с англ. В.М.Тарасенко; под редакцией Г.А.Сафонова.-М.: Агропромиздат, 1989.-520с.

27. Твердохлебова Т.И., Цыбульская М.А., Кузьменко И.Ю., Васерин Ю.И. //Матер, докл. научн. конф-ции "Ассоциативные паразитарные болезни, проблемы экологии и терапии".М.-1995.-С.171-172.

28. Ali-Khan Z./Host-parasite relationship in echinococcosis. I. Parasite biomass and antibody response in three strains of inbred mice against graded doses of Echinococcus multilocularis cysts.//J.Parasitol.-1974.-V.60.-P.231-235.

29. Ali-Khan Z., Siboo R./ Echinococcus multilocularis: immunoglobulin and antibody response in C57BL/6J mice.//Exp.Parasitol.-1982.-V.53.-P.97-104.

30. Allan J.C., Mencos F., Garsia-Noval J., Sarti E., Flisser A., Wang Y., Liu D., Craig P.S./ Dipstick dot-ELISA for the detection of Taenia coproantigens in humans.//Parasitology.-1993.-V. 107.-P. 79-85.

31. Allintas N., Ozensoy S./Application of biotin-avidin system: determination of antibody response in hydatidosis.//6-th int.helmintol. symp., the High Tatras, CSFR, sept. 23-27.-1991.-P.93.

32. Ambroise-Thomas P., Desgeorges P.T./Vaieur diagnostique et limites du test ELISA applique a l'hydatidose.//BulLSoc.Pathol.Exot.-1980.-V.73.-N1.-P.89-99.

33. Auer L., Aspock H./Studies antigens from in vitro cultivated protoscolices of Ecinococcus multilocularis and their possible use in theserodiagnosis of human echinococcosis.//2-nd Int.Symp. taeniasis.-2-7dec.-1985.-P.7-15.

34. Auer L., Aspock H./Differential serodiagnosis of alveolar and cystic echinococcosis.// 6-th int.helmintol. symp., the High Tatras, CSFR, sept. 23-27.-1991.-P.92.

35. Bareja U.K., Basak S., Thusoo T.K./Immunodiagnosis of human hydatid disease.//J.Commun.Diseases.-1997.-N4.-P.313-319.

36. Bensted H., Atkinson I.// Brit. med. Jour.-1958.-5090.-P.203205.

37. Boctor F.N., Farid Z. El-Scherif N./ Using whole bacteria, LPS, and soluble antigens to detect IgG, IgM, IgA in human brucellosis by Dot-ELISA with nitrocellulose as a solid phase.//Clin. Chemistry.-1987.-V. 33.-P. 1570-1571.

38. Bout D., Fruit J., Capron A./Purification d'un antigene specifique de liquide hydatique.//Anns Immunol.Inst.Pasteur.-1974.-V.125C.-P.775-788.

39. Capron A., Biguet S., Vernes A./Le diagnostic immunoelectrophoretique de l'hydatidose.//J. d^Hydatidiogie Sim. ed. Lion.-1967.-P.27-40.

40. Capron A., Yarzabal L., Vernes A.,Fruit J./Le diagnostique immunologique de l'ehcinococcose humaine.//Path. Bid.-1970.- V.18.-N 7-8.-P.357-365.

41. Chai J.J., Wei M.Y., Chong Q., Fu C., Yang X., Cao H., Mao J.D., Jiao W./A further investigation on the epidemiological significance of antibody detection in hydatid disease.//endemic. Diseases Bull.-1989.-V.4.-N2.-P.l-7.

42. Chordi A., Kagan I./Identification and characterization of antigenic components of sheep hydatid fluid by immunoelectrophoresis.//J. Parasit.-1965.-V.51.-N 1.-P.63-71.

43. Choy W.E., Lim P.L., Ny M.U./ A comparison of immunological methods for the detection of Trichinella spiralis antigen.// J. Immunol. Meth.-1988.- V. 113 (l).-P. 17-24.

44. Clinard E./ Evaluation of soluble-antigen fluorescent antibody test for antibodies to Trichinella spiralis in experimentally infected swine.// Amer. J. Vet. Res.-1975.-V. 36 (5).-P. 615-618.

45. Coltorti E.A./Standardization and evaluation of enzyme immunoassay as a screening test for the seroepidemiology of human hydatidosis.//Amer. J. Trop.Med.Hyg.-1986.-V.35.-N5.-P.1000-1005.

46. Contreras M.del C., Gallo S., Salinas P., Sapunar J., Sandoval L., Solis F./Evaluation of ELISA IgG using a purified antigen in the diagnosis of human hydatidosis.//Bol.Chileno Parasitol.-1994.-V.49.-Nl/2.-P.24-30.

47. Craig P.S., Bailey W., Nelson J.S./A specific test for the identification of cyst fluid samples from suspected human hydatid infectians.//Trans.Ray.Soc.Trop.Med.and Hyg.-1986.-V.80.-N2.-P.256-257.

48. Craig P.S., Rickard M.D./Anti-oncospheral antibodies in the serum of lambs experimentally infected with either Taenia ovis and Taenia hydatygena.//Z.ParasitKde.-1981.-V.64.-P.169-177.

49. Cuesta Bandera C., Guillen Liera J.L., Casado escribano N./Diagnostico de la hydatidosis natural у experimental. Analisis de las resultados obtenidos por diversas pruebas.//Rev.iber. Parasitol.-1982.-P.359-365.

50. Daryl O.M., Benjamin L./ An enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of platelet antibodies using detergent-solubilizedplatelets immobilized on nitrocellulose discs.// J. Immunol. Meth.-1987.-V. 105.-P. 63-70.

51. Derer M.M., Miescher S., Johansson H./ Application of the dot immunobinding assay to allergy diagnosis.//J. Allergy Clin. Immunol.-1984.-V.74.-P. 85-92.

52. Dieckmann A., Frank W./Isolation of viable germinal cells from Echinococcus multilocularis.//Parasitol. Res.- 1988.- V.74.-P. 297-298.

53. Dieckmann-Schuppert A., Ruppel A., Burger R., frank W./Echinoccoccus multilocularis: in vitro secretion of antigen by hybridomas from metacestode germinal cells and murine tumor cells//Experimental Parasitology.- 1989.- V.29.- P. 186-191.

54. Dottorini S., Sparvoli M., Baldelli F., Fiorio M., Tassi С./ Echinococcus granulosus: diagnosis of hydatid disease in sheep.//Riv. Parasitol.-1984.-V.45.-N2.-P.333-340.

55. Dottorini S., Sparvoli M., ballucci C., Magnini M./ Echinococcus granulosus: diagnosis of hydatid disease in man.//Ann.Trop>Med> and parasitol.-1985.-V.79.-Nl.-P.43-49.

56. Dottorini S., Tassi C./ Echinococcus granulosus: characterisation of the main antigenic component (Arc 5) of hydatid fluid.//Exp.Parasitol.-1977.-V.43.-P.307-314.

57. Dottorini S., Tassi C./Echinococcus granulosus: comparison between antigens in scolices and hydatid fluid.//Int.J.Parasitol.-1978.-V.8.-P.259-265.

58. Draelants E., Hotkens E., Harding E., Brandt J., Geerts S./ Development of a dot-enzyme immunoassay for the detection of circulatingantigen in cattle infected with Taenia saginata cysticerci.//Res. Vet. Sci.-1995.-V. 58 (l).-P. 99-100.

59. Dzebenski Т.Н., Bitkowska E., Plonka W./ Detection of a circulating parasitic antigen in acute infections with Trichinella spiralis: diagnostic significance of finding. //Zentralblatt fur Bakteriologie.-1994.-V. 281 (4).-P. 519-525.

60. Eagle H./ Media for animal cell culture //Tissue Cult. Assoc. Manual.-1977.-Vol.3.- P. 517-520.

61. Eliades P., Karagouni E., Stergiatou J., Miras K./A simple method for the diagnosis of human hydatid disease based on the protein A (colloidal conjugate).//J. harasitol. Methods.-1998.-V.218.-Nl-2.-P.123-132.

62. Facon В., Chamekh M., Dissons C., Capron A./Molecular cloning of E.granulosus protein expressing an immunogenetic epitope of antigen 5.//Mol. and Biochem. Parasitol.-1991.-V.45.-N2.-P.233-240.

63. Feng J.J., Wang J.Y., Qu J.A., Xiao S.H.// .//Chin. J. Parasitol. and Parasit. Diseases.-1993.-V.ll, №1.- P.63-65.

64. Feng J.-S., Xiao S.-H., Guo H.-F., Shen B.-G., Xue H.-C./ Выделение зародышевых клеток из вторичных цист мышей с инвазией Echinococcus granulosus //Chin. J. Parasitol. and Parasit. Diseases.-1992.-V.10, №2.- P.86-89.

65. Feng J.-S., Xiao S.-H., Guo H.-F., Shen B.-G., Jiao W./Screening antyhydatid drugs using cultivated germinal cells of Echinococcus granulosus//ZhongguO Ji Sheng Chong Xue Yu Ji Sheng Chong Bing Za Zhi.-1.-1993.-ll(l):12-6.

66. Fischman A./A new whole-scolex complement-fixation test for hydatid disease.//Bull.Wld. Hlth. Org.- 1968.-T.39.-№l.-P.43-48.

67. Franci C., Ingles J. et al./ Further studies on the ELISA-spot technique.Its applications to particulate antigens and potential improvement in sensitivity. // J. Immunol. Meth. 1986. - V. 88.-P. 225-232.

68. Garabedian J.A./Evaluation of the reactivity of hydatid whole-scolex antigen in hydatid disease serology.// Ann. Trop. Med. Parasit.-1971.-V.65.-N 3.-P.385-391.

69. Giannini S.H./ Induction and detection of leishmanial infections in Rattus norvegicus.//Trans.Roy. Trop. Med. Hyg.-1985.-V.79.-P. 458-461.

70. Gottstein B./An immunoassay for the detection of circulating antigens in human echinococcosis.// Amer. J. Trop. Med. a Hyg.-1984.-V.33.- N6.-P.1185-1191.

71. Gottstein В., Eckert J., Fey H./ Serological differentiation between Echinococcus granulosus, Echinococcus multilocularis in man.//Z. Parasitenk.-1983.-V.69.-N 3.-P.347-356.

72. Gottstein В., Schantz P.M., Todorov Т., Saimot A.G., Jacquier P./An internation study on the serological differential diagnosis of human cystic and alveolar echinococcosis.//Dull.W.H.O.-1986.-V.64.-Nl.-P.101-105.

73. Gottstein В., Tshudi K., Eckert J.,Ammann R./Em-2-ELISA for the follow-up of alveolar echinococcosis after complete resection of liver lesions.//Trans.Roy.Soc.Trop.Med.and Hyg.-1989.-V.83.-N3.-P.389-393.

74. Hardman E., Jarvis Н.М./ Nitrocellulose-based assays for the detection of glucolipids and other antigens: mechanism of binding to nitrocellulose.//.!. Immunol. Meth.-1985.-V.33.-P. 113-123.

75. Hariri M.N., Schvabe C.W., Koussa M./Host-parasite relationships in echinococcosis.XI. The antigens in the indirect hemagglutination test for hydatid disease.//Am.J.Trop.Med.-1965.-V.14.-P.592-604.

76. Harrati K., Uner A., Ozzcel M.A./Application of the new methods in diagnosis of cystic echinococcosis.//Parasitol.Intern.-1998.-V.47-Suppl.-P.231.

77. Hassan M.M., Seleem M.A., Eterwa S.E./ Humoral and cellular immune responses in experimental trichinosis.//J. Egypt. Soc. Parasitol.-1994.-V. 24 (2).-P. 363-370.

78. Hawkes R., Niday E., Gordan J.A./ A dot immunobinding assay for monoclonal and other antibodies. //Analyt. Biochem.-1982.-V. 119.-P. 142-147.

79. Heath D.D./Resistance of Taenia pisiformis iarvae in rabbits: Immunisation against infection using non-living antigens from in vitro culture.//Intern.J.Parasitology.-1976.-V.6.-P.19-24.

80. Hira P.R., Bahr J.M., Sheveiki H.M., Behlehani K./An enzyme-linked immunosorbent assay using an arc-5 antigen for the diagnosis of cystic hydatid disease.//Ann.Trop.med. and Parasitol.-1990.-V.84.-N2.-P.157-162.

81. Ibhu В., Lesia В., Sumana В./ Detection of IgE binding to same airborne pollen and fungal allergens using dot immunoassay.//!. E. Mitchell Sci. Soc.-1988.-V. 103.-P. 77-79.

82. Ito A./ Evaluation of alveolar and cystic echinococcus by immunoblot analisis.//Arch. Int.de la hydatidosis., V. 52.-XVIII Int.Congr.Hydatidol.-Lisboa Portugal.-1997.-P. 217.

83. Ivo dos Santos J., Galvao-Castro B. et al./ Dot enzyme immunoassay. A simple, cheap and stable test for antibody to human immunodeficiency virus (HIV).//J. Immunol. Meth.-1987.-V.99.-P. 191-194.

84. Jacona A., Pini C., Vicari G./Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in the serodiagnosis of hydatid disease.// Amer. J. Trop. Med. a Hyg.-1980.- V.29.- N1.-P.95-102.

85. Jenkins D.J., rickard M.D./Specific antibody responses to Taenia hydatigena, Taenia pisiformis and Echinococcus granulosus infection in dogs.//Aust. Vet.J.-1985.-V.62.-№3.-P.72-78.

86. Jiang H.J., Yang L.X., Pang S.H., Sun Т., Xie S.P., Meng J.M., Wen G.Z., Wang G.Z./ Dot-ELISA in the diagnosis of neurocysticercosis.// Chung Kuo Chi Sheng Chung Hsueh Yu Chi Sheng Chug Ping Tsa Chin.-1990.-V. 8(3).-P. 207-209.

87. Jol-Van der Zijde C.M., Labadie J. et al./ Dot immunobinding assay as an accurate and versatile technique for the quantification of human IgG subclasses.//J. Immunol. Meth.-1988.-V.108.-P. 195-203.

88. Kagan I., Norman L./Antigenic analisis of Echinococcus antigens by agar diffusion techniques.// Amer. J. Trop. Med. a Hyg.-1961.- V.10.- N5.-P.727-734.

89. Kagan I., Norman L./Analisis of helminth antigens (Echinococcus granulosus and Shistosoma mansoni) by agar gel methods.// Ann. N. Y. Acad. Sci.-1963.-V.113.-P.130-53.

90. Kanwar J.R., KanwarR./Purification and partial immunochemical characterization of low molecular mass diagnostic Echinococcus granulosus immunogen for sheep hydatidosis.//FEMS Immunol, and Med. Microbiol.-1994.-V.9.-N2.-P. 101-108.

91. Kimball S.R., Rannels S.L. et al./ Quantitation of proteins by dot immunobinding assay. A comparison of visualization methods usingeukariotic initiation factor 2 and a monospecific antibody. //J. Immunol. Meth.-1988.-V. 106.- P. 217-223.

92. Knobloch J., Lederer I., Mannweiler E./Species-specific immunodiagnosis of human echinococcosis with crude antigens.//Eur.J.Clin.Micrjbiol.-1984.-V.3.-N6.-P.554-555.

93. Larea M., Denegri M., Garcia A., Silva B./Comparacion de las technicas de ELISA, doble diffusion con detection de arco 5 hemaglutination inderecta en el diagnostico de la hydatidosis humana.//Parasitol. al Dia.-1993.-V.17.-N1/2.-P.25-29.

94. Lauriola L., Piantelli M., Pozzuoli R., Arru E., Musiani P./Echinococcus granulosus: preparation of specific antisera against antigens in sheep hydatid fluid.//Zbl.Bakt.ParasitKde Abt I, Abt.Orig.A.-1978.-V.240>-P.251-257.

95. Lazarovits G., Zutra D., Bar-Joseph M./ Enzime-linked immunosorbent assay on nitrocellulose membranes (dot-ELISA) in the serodiagnosis of plant pathogenic bacteria.//Canad. J. Microbiol.-1987.-V. 33.-P. 98-103.

96. Lefroit- Joliy M., Neven Т./ Description and comparison of three in vitro methods for the detection of guined pig MHC antigen. //J.Immunol. Meth.-1986.- V. 89.-P. 141-148.

97. Leykina E.S., Dalin M.V., Ballad N.E., Tchebyshev N.V., Zorikhina V.I., Poletaeva O.G./Isolation of diagnostical helminth antigens and their use in serodiagnosis.//Helmintologia.-1981.-V.18.-P.273-280.

98. Lightowlers M.W./Cestode infections in animals: Immunological diagnosis and vaccination.//Rev. Sci.et ted. off. Int. Episoot.-1990.-V.9.-N2.-P.463-467.

99. Liu Y.S., Du W.P., Wu Z.X. / Dot-immunogold- silver staining in the diagnosis of cysticercosis.// Int. J. Parasitol. 1996. - V. 26(1).-P.127-129.

100. Lu J.H, Yuo Z.M., Yu X.B., Feng D.Y, Li D.C., Cheng W.X./ The cell line establishment and immunogenic study of Echinococcus granulosus//Acad. J. Sun Yal-Sen Univ. Med. Sci.,- 2001.-№2 (22),- P. 81-84.

101. Lu J.H., Cheng W.X., Guo J.M. et al./ Cultivation of an Echinococcus granulosus larvae cell line// Chin. J. vet. Sci.-1998.-V.18, №5.-P.479-482.

102. HO.Mearus G., Richmond S.J., Storey C.C.I Sensitive immune dot blot test for diagnosis of Chlamidia trachomotis infection.//J. Clin. Microbiol.-1988.-V. 26.-P. 1810-1813.

103. Mc Manus D.F./ Characterisation of teniid cestodes by DNA analysis.//Rev. sci. et tech. int. epizoot.-1990.-P.489-510.

104. Ming Rujng./Application of ELISA to the diagnosis of echinococcosis of sheep and cattle.//Acta Vet. Et Zootechn. Sin.-1986.-V.17.-N1.-P.55-62.

105. Molinaro G.A., Eby W.C., Reimer С.А./ A monoclonal antibody mau show cross reactivities in Ouchterlony assay but not in other assays.//J.Immunol. Meth.-1987.-V. 96.-P. 219-222.

106. Morlow S.J., Handa А.К./ Immuno siot-blot using a membrane which covalently binds protein.//J.Immunol. Meth.-1987.-V. 101.-P. 133-139.

107. Musiani P., Piantelli M., Lauriola L., Pozzuoli R./Echinococcus granulosus: specific quantification of the two most immunoreactive antigens in hydatid fluids.//J.Clin.Path.-1978.-V.31.-P.475-478.

108. Nodet P., Grange J., Fevre M. / Dot-blot assays and their use as direct antigenbinding method to screen monoclonal antibodies to l,4B-and 1,3-B-glucan sunthases. // Analyt. Biochem.-1988.-V. 174.-P. 662-666.

109. Norman L., Kagan I., Chordi A./Further studies on the analisis of sheep hydatid fluid by agar gel methods.//Amer. J. Trop. Med. a Hyg.-1964.-V.13.- N 6.-P.816-821.

110. Pappas M.G./ Recent applications of Dot-ELISA in immunoparasitology.//Vet. Parasitology.-1988.-V. 29.-P. 105-129.

111. Pappas M.G., Hajkowski R., Hockmeyer W.T./ Dot enzyme-linked immunosorbent assay (Dot-ELISA): a micro method for the rapid diagnosis of visceral leishmaniasis.//!. Immunol. Meth.-1983.-V. 64.-P. 205214.

112. Pappas M.G., Schantz P.M., Cannon L.T. Sr., Wahlquist S.P./ Dot-ELISA for the rapid serodiagnosis of human hydatid disease.//Diag. Immunol.-1986.-V. 4.-P. 271-276.

113. Patel J.D., Joseph J.M., Falkler W.A./ Direct detection of Chlamidia trachomatis in clinical cpeciamens by a dot immunobinding technique using monoclonal antibody .//J. Immunol. Meth.-1988.-V.108.-P. 279-287.

114. Pauluzzi S., Baldelli F., Dottorini S., Tassi C.I Standardizzazione quantitative del metodo ELISA nell'idatidosi umana.//Boll.Ist.Sieroter. Milan.-1981.-V.60.-N 2.-P.144-149.

115. Piantelli M., Pozzuoli R., Arru E., Musiani P./ Echinococcus granulosus: identification of subunits of the maior antigens.// J.Immunol.-1977.-V.119.-P.1382-1386.

116. Pozzuoli R., Musiani P., Arru E., Patrono C., Piantelli M./ Echinococcus granulosus: evaluation of purified antigens' immunoreactivity.// Exp.Parasitol.-1974.-V.35.-P.52-60.

117. Pozzuoli R., Musiani P., Arru E., Piantelli M., Mazzarella R./Echinococcus granulosus: Isolation and characterization of sheep hydatid fluid antigens.//Exp.Parasitol.-1972.-V.32.-P.45-55.

118. Pozzuoli R., Piantelli M., Perucci C., Arru E., Musiani P./Isolation of the most immunoreactive antigens of Echinococcus granulosus from sheep hydatid fluid.//J.Immunol.-1975.-V.115.-P.1459-1463.

119. Prosad S., Thraves P. et al./ A dot-blot method for screening polyclonal and monoclonal antisera to poly (ADP-ribose). // J.Immunol. Meth. 1989.-V. 116.-P. 79-85.

120. Queralt R., Madico A., Mercader M., Pardo A., Sanchez F., March F., Coll P., Munoz C./Purification de antigenos parasitarios a partir de liquido hydatidico. Estudio de su reactividad por "immunoblot".//Rev. iber. parasitol.-1989.-V.49.-N 4.-P.313-319.

121. Rickard M.D.//4-th Intern.Congr. Parasitol. 19-26 Aug. 1978. Warsawa. Short Commun. Sect.-P.134.

122. Rickard M.D., Bell K.J./ Successful vaccination of lambs against infection with Taenia ovis using antigens produced during in vitro cultivation of the larval stages.//Res.Vet.Sc.-1971.-V.12.-N4.-P.401-402.

123. Rickard L.G.//Vet. Parasitol.-1995.-V. 58(l-2).-P. 9-15.

124. Rickard M.D., Harrison G.B.J., Heath D.D., Lightowlers M.W.// Parasitology.-1995.-V.110.-P.5-9.

125. Rickard M.D., Williams J./Hydatidosis/cysticercosis: immune mechanisms and immunisation against infection.// Adv. Parasitol.- 1982.-V.21.-P.229-296.

126. Ris D.R., Hamel K.L., Mackle ZMJ Evaluation of ELISA test for the diagnosis of cystic hydatid disease in sheep.//Res.Vet.Sci.-1987.-V.43.-N2.-P.257-269.

127. Rivera Marrero C.A., Santiago N., Hillyer G.V./ Evaluation of immunodiagnostic antigens in the excretory-secretory products of Fasciola hepatica//J. Parasitol.-1998.- V. 74(4).-P. 646-652.

128. Rogan M.T., Craig P.S., Zeyhle E., Roming Т., Lubano G.M., Deshan L./ Evaluation of rapid dot-ELISA us a field test for the diagnosis of cystic hydatid disease.//Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg.-1991.-V. 85 (6).-P. 773-777.

129. Romia S.A., Youssef M.E., Handoussa A.E., Rizk H.M., Sallam S.M./ Dot-ELISA as a diagnostic test in hydatid disease .//J. Egypt. Soc. Parasitol.-1992.-V. 22(3).-P. 603-610.

130. Roop R.M., Preston-Moore D. et al./ Rapid identification of smooth Brucella species with a monoclonal antibody. //J. Clin. Microbiol.-1987.-V. 25.-P. 2090-2093.

131. Rozeik C., Schulz-Harder В./ The competitive antigen spot test (CAST). A rapid and simple means of quantitatively screening antisera.//J. Immunol. Meth.-1986.-V. 91.-P. 91-97.

132. Sakamoto Т./ Development of echinococcal tissue cultured in vitro and in vivo.//Mem.Fac.Agric.Kagoshima Univ.-1978.-V.14.-P.109-113.

133. Sakamoto Т., Kotani T.//Jap.J.Vet.Res.-1967.-V.15.-N4.-P.165170.

134. Sakamoto Т., Yamashita J., Ohbayashi M./Studies of echinococcosis, XVIII, Observations on tissue cultured germinal cells of larval Echinococcus multilocularis.//Jpn. J. Vet. Res.-1967.-V. 15.-P. 75-83.

135. Silveira F.M.T., Scroferneker M.L., Giorgi S.H., Ferreira H./Enzyme immunoassay reaction in the diagnosis of human hydatidosis reactivity limit and comparison with other techniques.//16-th Int.Congr.of Hydatidology.-1993.-P.280.

136. Siracusano Q., Vuitton D./Immunology and immunopathology of Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis infections// XVIII Int. congr. of Hydatidol., Lisboa-Portugal.-1997.-P. 132-135.

137. Smith М.А./ Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis: in vitro Culture of the Strobilar stages from Protoscoleces.//Angew.Parasit.-1979.-V.20.-P.137-147.

138. Stay M., Wahl R., Beierwaltes W.H./ Dot-based ELISA and RIA: two rapid assay that screen hybridoma supernatants against whole live cells. //J.Immunol. Meth.-1984.- V. 73.-P. 75-81.

139. Steinmetz H.T., Pfreundschuh M.G./ Production of monoclonal antibodies againts glucose oxidase, alcaline phosphatase and peroxidase. //J. Immunol. Meth.-1987.-V. 101.-P. 251-259.

140. Su X.Z., Prestwood А.К./ A dot-ELISA mimicry western blot test for the detection of swine trichinellosis.//J. Parasitol.- 1991.- V. 77 (l).-P. 76-82.

141. Tassi C., Dottorini S., Scalise G., Geranio N./Echinacoccus granulosus: diagnosis of human hydatid disease by the indirect hemagglutination reaction with antigens from hydatid fluid and scoleces.^nt.J.Parasitol.-1981.-V.ll.-P.85-88.

142. Tassi C., Dottorini S., Tolu A.G., De Rosa F./Diagnosis of hydatid disease in sheep by indirect hemagglutination test.//Rev.Parasitol.-1980.-V.41.-P.61-66.

143. Tellez-Giron E., Ramas M.C., Alvarez P., Dufour L.,Montante M./ Detection and characterization of antigens from Taenia solium cysticercus in cerebrospinal fluid.//Acta Leiden.-1989.-V. 57(2).-P. 101-105.

144. Tong W.D., Guo S.J., Sun L.G./ Studies on the rapid diagnosis of the cysticercosis, trichinosis and toxoplasmosis using trace blod dot-ELISA.//Int. Conf. On Parasitic Zoonoses, Sept. 20-24.- 1994.- P. 138.

145. Towbin H., Gordon L./ Immunoblotting and dot immunobinding-current status and outlook.// J. Immunol. Meth.-1984.-V. 72.- P. 313-340.

146. Turcecova L., Kolarova L., Dubinsky P., Martinek К./ Characteristics of antigens in tapeworms of the genus Echinococcus.//Helmintilogia.-1997.-V.34.- N3.- P.188-189.

147. Varela-Diaz V., Coltorti E./Techniques for the immunodiagnosis of human hydatid disease .//Buenos Aires: Pan American Zoonosis Center.-1976.

148. Varela-Diaz V., Coltorti E., Ricardes M.I., Guisantes J.A., Yarsabal L.A./The immunoelectrophoretic characterisation of sheep hydatid cyst fluid antigens.//Am.J.Trop.Med.Hyg.-1974.-V.23.- P.1092-1096.

149. Varma Т.К., Malviya H.C./Comparative study of serodiagnosis for hydatidosis in buffaloes.//Riv. Parassitol.-1988.-V.49.-Nl.-P.51-56.

150. Varma Т.К., Malviya H.C., Ahluwalia S.S.//Indian J. Anim.1986.-Sci.56:621.

151. Vertosich F.T., Kelly R.H./ Antibodies to native and denatured DNA. Quantitation using on immuno slot-blot technique.// J.Immunol. Meth.1987.-V. 102.-P. 15-21.

152. Vishawapoka U., Hemachudha T. et al./ Detection of rabies antigen in canine parotid glands by dot-blot technique.//Lancet.-1988.-V. l.-P. 881.

153. Voller A., Bidwell D., Huldt G., Engvall E.// Bull. Wld. Hlth. Org.-1974.-V.l, №2.P.209-211.131

154. Yan X.X., Xu X.F., Ma Y.X./ Changes in T lymphocytes and their subpopulations and IgG in peripheral blood from mice infected with Trichinella spiralis.// Chung Kuo Chi Sheng Chung Hsueh Yu Chi Sheng Chug Ping Tsa Chin.-1992.-V. 10(1).-P. 62-65.

155. Yong W.K., Heath D.D., Van Knapen F./Comparison of cestode antigens in an ELISA for the diagnosis of Echinococcus granulosus, Taenia hydatigena and Taenia ovis in sheep.//Res.Vet.

156. Zalis M., Jaffe C.L./ Routine dot-blot assay of multiple serum samples using a simple apparatus.//.!. Immunol. Meth.-1987.-V. 101.-P. 261264.

157. Zimmerman G.L., Nelson M.J., Clark C.R.B./ Diagnosis of ovine fascioliasis by a dot enzyme-linked immunosorbent assay: a rapid microdiagnostic technique.// Am. J. Vet.Res.-1985.-V.46.-P.1513-1515.

158. Российская академия сельскохозяйственных наук

159. Всероссийский институт гельминтологии имени К.И.Скрябина

160. Одобрен ученым советом ВИГИС 12 октября 2001 года протокол №34

161. Директор ВИГИС, академик РАСХН А.С.Бессонов

162. Лабораторный регламент на выявление антител к Echinococcus granulosus в реакции dot-ELISA1. Москва 2001

163. Реакцию dot-ELISA предлагается использовать для выявления антител к E.granulosus.

164. Сенсибилизация нитроцеллюлозных мембран11 .Нитроцеллюлозные мембраны (НЦ) размечают точками (простым карандашом) вертикально-горизонтальными рядами.

165. Антиген из метаболитов клеточных культур E.granulosus наносят на размеченные точки (доты) в объеме 1 мкл/ дот.

166. НЦ мембраны с нанесенным антигеном высушивают в течение 15 мин. в термостате при +56°С.

167. Блокирование свободных участков поверхности НЦ мембран

168. НЦ мембраны помещают в раствор фосфатно-солевого буфера (ФСБ) 0,01 М РН 7,2-7,4 с 10%-ным содержанием сыворотки крови лошади. Блокируют 1 час на шейкере и далее в течение ночи при комнатной температуре.

169. НЦ мембраны после блокирования отмывают в растворе ФСБ 0,01 М РН 7,2-7,4 с 0,05%-ным содержанием Tween-20.

170. Нанесение образцов сывороток

171. Исследуемые образцы сывороток разводят в соотношении 1:10 в растворе ФСБ 0,01 М РН 7,2-7,4 с 1,0%-ным содержанием бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,05%-ным Tween-20.

172. Сыворотки инкубируют в течение 1 часа 20 минут при комнатной температуре во влажной камере, которая представляетсобой поролон, смоченный ФСБ 0,01 М рН 1,2-1,А, помещенный в чашку Петри.

173. После инкубации с сыворотками НЦ мембраны отмывают 3 раза по 5 мин. в растворе ФСБ 0,01 М РН 7,2-7,4 с 0,05%-ным БСА и 0,05%-ным Tween-20.

174. Нанесение антивидовых антител, меченых пероксидазой, (конъюгата)

175. Делают рабочее разведение конъюгата (предварительно определенное) в растворе ФСБ 0,01 М РН 7,2-7,4 с 1,0%-ным БСА и 0,05%-ным Tween-20.

176. НЦ мембраны помещают в раствор конъюгата и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.

177. После этого мембраны отмывают 3 раза по 5 мин. в растворе ФСБ 0,01 М РН 7,2-7,4 с 0,05%-ным БСА и 0,05%-ным Tween-20.5. Проявление реакции

178. Субстратная смесь состоит из 20 мл буфера Трис-HCl РН 7,6, 5 мг 3,3-диаминобензидина и 6 мкл 30%-ной стабилизированной перекиси водорода. Перекись водорода добавляется непосредственно перед использованием.

179. НЦ мембраны помещают в раствор субстратной смеси на 10-15 мин. при комнатной температуре.

180. После проявления реакцию останавливают промыванием мембран в водопроводной воде.46. Учет результатов

181. Российская академия сельскохозяйственных наук

182. Всероссийский институт гельминтологии имени К.И.Скрябина

183. Одобрен ученым советом ВИГИС29декабря 2001 года протокол №49

184. Директор ВИГИС, академик РАСХН А.С.Бессонов

185. Методика получения и отбора специфических антигенов клеточных культур

186. Исполнители: в.н.с. В.К.Бережко аспирант Т.Н.Сивкова1. Москва 2001

187. Подготовка лабораторной посуды, инструментов и растворов для проведения культуральной работы

188. Получение гельминтного материала для культивирования

189. Заражение белых крыс протосколексами Echinococcus multilocularis, получение вторичных ларвоцист

190. От зараженных животных через 6 месяцев в стерильных условиях получают вторичные ларвоцисты, которые после тщательного промывания в стерильном физрастворе используют для получения первичной клеточной культуры.

191. Приготовление первичной клеточной культуры Е. granulosus и Е. multilocularis и проверка ее жизнеспособности.

192. Получение перевиваемой культуры

193. В процессе культивирования с периодичностью 7-10 дней проводят отбор метаболитов клеток и проверяют их в иммуноферментной реакции с положительными и отрицательнымиконтрольными сыворотками для определения антигеноактивных серий клеточных метаболитов.

194. Контроль клеточных метаболитов на стерильность, безвредность, определение содержания белка

195. Определение содержания белка. Концентрацию белка в метаболитах клеточных культур определяют на спектрофотометре6

196. СФ-26, JIOMO, при длине волны 280 нм. В качестве контроля используют питательную среду для культивирования и дистиллированную воду.

197. Определение антигенной активности метаболитов клеточных культур E.granulosus и E.multilocularis