Рекомбинантный антиген эхинококка EgF: Получение и свойства тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.19, кандидат биологических наук Одоевская, Ирина Михайловна

• Одоевская, Ирина Михайловна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Одоевская, Ирина Михайловна

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Биологические и морфологические особенности эхинококка.

1.2. Антигенный состав эхинококка. 1.3. Иммодиагностика ларвального гидатидоза.

1.4. Особенности строения генома эхинококка.

1.5. Использование методов молекулярной биологии для оптимизации экспрессии клонированных генов.

1.5.1. Амплификация генов в составе рекомбинантных плазмид.

1.5.2. Конструирование "генов гибридных белков" как метод оптимизации трансляции.

1.5.3. Стабилизация мРНК чужеродного гена.

1.5.4. Стабилизация чужеродных белков в E.coli.

1.5.5. Применение методов генной инженерии в гельминтологии.

1.5.6. Генно-инженерные антигены в диагностике и вакцинопрофилактике цистных гидатидозов.

2.Собственные исследования.

2.1. Материалы.

2.2. Используемые реактивы.

2.3. Методы исследований.

2.3.1. Выделение геномной ДНК E.granulosus из протосколексов паразита.

2.3.2. Выделение ДНК векторного бактериофага X,gtl 1.

2.3.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.

2.3.4. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в агарозном геле.

2.3.5. Получение препаративных количеств ДНК векторной плазмиды.

2.3.6. Проведение ДНК- ДНК гибридизации.

2.3.7. Амплификация гомологичных фрагментов из генома эхинококка синтезированными олигонуклеотидными праймерами.

2.3.8. Лигирование плазмидной векторной ДНК с фрагментом эукариотического гена.

2.3.9. Проведение реакции трансформации.

2.3.10. Скрининг рекомбинантных клонов.

2.3.11. Экспрессия гибридного белка рекомбинантной плазмидой.

2.3.12. Электрофорез в денатурирующих условиях.

2.3.13. Электроперенос.

2.3.14. Постановка иммуноферментной реакции.

2.3.15. Иммунное выявление антигенов на фильтре.

2.3.16. Изучение протективных свойств рекомбинантного антигена EgF.

3. Результаты исследований

3.1. Наработка препаративных количеств ДНК Echinococcus granulosus для создания банка генов паразита.

3.1.1.Создание и амплификация библиотеки E.granulosus в фаге Xgtl 1.

3.1.2. Элюция фрагмента кДНК эхинококка из геля легкоплавкой агарозы.

3.1.3. Клонирование фрагмента гена Е. granulosus EgF в векторной системе фаг Xgtl 1- клетки Е. coli Y -1088, Y-1090.

3.1.4. Проведение ДНК-ДНК гибридизации.

3.1.5. Особенности экспрессии рекомбинантых белков в векторной системе X-gtl l/EgF-клетки E.coli Y1089.

3.1.6. Анализ рекомбинантных белков, синтезированных в векторной системе клетки E.coli штамма Y 1089-рекомбинантный фаг Xgtl 1/F.

3.1.7. Иммунологический анализ рекомбинантных белков, получаемых в векторной системе на основе рекомбинантного фага Xgtll/EgF методом Western-blot анализа.

3.1.8. Синтез генно-инженерных белков в векторной системе на основе рекомбинантного фага Xgtl 1/EgF.

3.1.9. Переклонирование фрагмента кДНК эхинококка в плазмидные векторные системы.

3.1.10. Определение нуклеотидной и аминокислотной последовательности клонированного фрагмента EgF.

3.1.11. Конструирование рекомбинантных плазмид EgF с использованием векторов семейства pGEX и pQE.

3.1.12. Векторы семейства pGEX.

3.1.13. Клонирование фрагмента гена EgF E.granulosus в плазмидной векторной системе pQE/SQ 13009.

3.1.14. Использование ПЦР при получении фрагментов генов, кодирующих антигены эхинококка для оптимизации создания плазмидных векторных систем.

3.1.15. Создание продуцента рекомбинантных белков в векторной системе плазмида pQE - клетки Е. coli SQ-13009.

3.1.16. Протективная эффективность рекомбинантного антигена EgF.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Рекомбинантный антиген эхинококка EgF: Получение и свойства»

Актуальность проблемы. Эхинококкоз распространен повсеместно, является серьёзной медицинской, социально-экономической и ветеринарной проблемой (Бессонов А.С., 1979; Геллер Ю.И.,1989), в связи с чем в настоящее время во многих странах мира ведутся интенсивные исследования ларвальных гидатидозов (Fasihi Н.М., Hobbs R.P., Adams P.J., Mobedi I., Morgan-Ryan U.M.,Thompson R.C.A., 2002; Deplazes P., Eckert J., 1996).

Прижизненная диагностика эхинококкозов основывается на эпизотологических данных и результатах иммунологических реакций со специфическим антигеном (Heath D.D., 1986; Irabiena О., Nieto A., Ferreira J.,2000), однако применение последних ограничено отсутствием доступного и стандартного антигенного материала, обладающего высокой специфичностью и чувствительностью в серологических реакциях (Ito A.L et al, 1999; Jiang L.,Wen H., Ito A., 2001). Данным требованиям может отвечать антиген, кодируемый определённым геном в системе, в которой его можно наработать и очистить, т.е. антиген, получаемый генно-инженерным путём in vitro в требуемых количествах (Li J. et al., 2003). Практически ежегодно ВОЗ организует Международные рабочие встречи паразитологов, посвященные проблемам распространения, диагностики, вакцинопрофилактики и лечения ларвальных гидатидозов, причём особое внимание уделяется развитию молекулярно-биологических методов исследования эхинококкозов (Gottstein В., 1987). Во многих странах мира проводятся работы по клонированию генов гельминтов в различных векторных системах, в том числе и эхинококка (Lightowlers М. et al., 1990). Основной целью этих исследований является создание рекомбинантных ДНК, кодирующих гибридные белки-антигены, являющиеся основой для производства генно-инженерных вакцин и диагностикумов (Mamuti W., Yamasaki Н., Sako Y. et al, 2004).

Глобальное значение ларвальных гидатидозов, их большое влияние на экономику и здоровье населения различных стран мира неоднократно подчеркивалось в докладах Всемирной Организации Здравоохранения, на регулярно проходящих Международных конгрессах по гидатидологии. В последнее десятилетие важное место в работе этих симпозиумов занимают молекулярно-биологические аспекты изучения ларвальных гидатидозов, создания генно-инженерных вакцин и диагностикумов для профилактики и прижизненной иммунодиагностики этих опасных гельминтозов (Rishi А.К., McManus D.P., 1987; Gauci С., Merli М., Muller V., Chow С., Yagi К., Mackenstedt U, Lightowlers M.W., 2002; Woollard D. J., Gauci C., Merli M., Muller V., Chow C., Yagi K., Mackenstedt U, Lightowlers M.W., 2002; Gonzalez-Sapienza G., Lorenzo C., Nieto A., 2000).

В последние годы в России отмечается рост заболеваемости людей и животных ларвальными гидатидозами, что связано с резко возрастающими миграционными процессами, массовым и бесконтрольным завозом продуктов из южных регионов. В связи с этим, изыскание биотехнологических способов получения неограниченных количеств стандартного и высокоэффективного антигенного материала, обеспечивающего результативность проведения прижизненной иммунодиагностики и вакцинопрофилактики эхинококкоза, является насущной необходимостью как в научном, так и в практическом плане (Бережко В.К., 1990).

Использование методов молекулярной биологии, в частности технологий рекомбинантных ДНК, позволяет решить эту задачу путем клонирования генов, кодирующих основные антигены эхинококка и экспрессии их in vitro с целью получения стандартных высокоспецифичных белков-антигенов. Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) значительно ускоряет процесс клонирования генов или их фрагментов в оптимальных векторных системах и получения белков-антигенов E.granulosus.

Цели и задачи исследования. Основной целью настоящих исследований было получение рекомбинантных антигенов эхинококка, обладающих высокими диагностическими и протективными свойствами.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- создать представительный банк образцов суммарной ДНК E.granulosus и E.multilocularis;

- получить клонотеку генов кДНК эхинококка в экспрессирующем фаговом векторе и осуществить её иммунологический скрининг; выявить молекулярно-биологическими методами (ДНК-ДНК гибридизацией, реакцией рестрикции эндонуклеазами, электрофорезом в агарозном геле) наличие вставки кДНК эхинококка у рекомбинантных клонов;

- подобрать оптимальную плазмидную векторную систему для экспрессии генов паразита, наработать препаративные количества плазмидной ДНК и фрагмента кДНК эхинококка;

- на основе лианеризованной ДНК векторной плазмиды и фрагмента кДНК паразита создать генно-инженерную конструкцию;

- создать продуцент гибридного белка паразита в экспрессирующей векторной системе рекомбинантная плазмида-клетки E.coli.

- повысить эффективность клонирования за счёт применения полимеразной цепной реакции (ПЦР), определить структуру олигонуклеотидных праймеров, гомологичных фрагменту уникального гена EgF E.granulosus и установить оптимальные условия проведения ПЦР;

- наработать в экспрессирующей векторной системе гибридный белок в препаративных количествах и очистить рекомбинантный антиген EgF;

- дать характеристику иммунохимических свойств рекомбинантного антигена;

- оценить диагностические и протективные свойства наработанного рекомбинантного антигена.

Исследования проведены по программе фундаментальных и прикладных исследований по научному обеспечению АПК РФ, а также по Федеральной целевой НТП Минпромнауки России «Исследования и разработка по приоритетным направлениям развития науки и техники» (проект «Технологии биоконструирования препаратов для ветеринарии», № гос. регистрации 01.20.02 14534).

Научная новизна. Впервые в России клонирован фрагмент гена паразита, кодирующий синтез родоспецифического антигена Echinococcus, определены нуклеотидная и аминокислотная последовательности EgF и изучены свойства рекомбинантного белка. Уникальность полученной нуклеотидной последовательности подтверждена патентом РФ. Рассчитана структура специфических олигонуклеотидных праймеров, отработаны оптимальные условия проведения ПЦР для получения неограниченного количества встройки кДНК эхинококка EgF. Создан продуцент гибридного белка паразита в экспрессирующей векторной системе рекомбинантная плазмида pQE/EgF-клетки E.coli SG-13009. На основе полученного стандартизированного рекомбинантного антигена разработан иммунноферментный диагностикум для прижизненной диагностики ларвальных гидатидозов, обладающий достаточно высокой специфичностью и чувствительностью. Показана высокая протективная эффективность антигена EgF при ларвальном эхинококкозе в опытах на лабораторных животных.

Практическая ценность работы. По результатам исследований по теме диссертации подготовлены и утверждены следующие нормативные документы:

1. Технологический регламент на выявление генома E.granulosus в реакции dot-гибридизации с использованием специфического радиоактивномеченного ДНК-зонда. Утвержден 5 февраля 1996 г. Ученым советом ВИГИС, протокол № 9.

2. Лабораторный регламент на получение рекомбинантных белков для иммунодиагностики цистного гидатидоза. Одобрен Ученым советом ВИГИС 27 октября 2000 г., протокол № 40.

3. Лабораторный регламент на модифицированный способ получения рекомбинантного белка F для иммунодиагностики цистного гидатидоза. Одобрен секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 25 мая 2001 года, опубликован в 38 томе (Труды ВИГИС).

4. Лабораторный регламент на модифицированный способ получения рекомбинантного белка EgB. Утверждён Ученым советом ВИГИС 6 июля 2003 г., протокол №14.

5. Патент на изобретение «Способ получения рекомбинантного антигена F E.granulosus» № 2234533, зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 20.08.2004 г.

Апробация результатов. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

- научных конференциях «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (Москва, 1993, 2001, 2003-2005 гг.); объединённых сессиях Координационного совещания по ветеринарной паразитологии Центрального совета Общества гельминтологов РАН и секции «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (1993-2005 гг.);

- заседаниях Ученого совета ВИГИС 1991-2005 гг.

Основные положения, выносимые на защиту:

- создание представительного банка геномной ДНК Е. granulosus и Е. multilocularis;

- получение клонотеки генов кДНК эхинококка в экспрессирующем векторе Agtl 1 и иммунологический скрининг рекомбинантных клонов;

- идентификация нуклеотидной встройки кДНК эхинококка в полученных генно-инженерных конструкциях методами молекулярной биологии (ДНК-ДНК гибридизации, рестрикции эндонуклеазами, электрофорезом в агарозном и полиакриламидном гелях, иммуноблоттингом);

- создание продуцента гибридного белка EgF в экспрессирующей векторной системе рекомбинантная плазмида pQE/EgF клетки E.coli SG13009;

- поэтапный скрининг рекомбинантных клонов с использованием селективных сред, цветового теста и электрофореза в агарозном геле продуктов рестрикции ДНК эндонуклеазами;

- оптимизация клонирования паразитарных генов за счёт применения ПЦР, разработка структуры олигонуклеотидных праймеров и условий проведения этой реакции;

- получение и иммунохимическая характеристика рекомбинантного белка эхинококка; диагностические и протективные свойства рекомбинантного антигена EgF.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения.

Заключение диссертации по теме «Паразитология», Одоевская, Ирина Михайловна

ВЫВОДЫ

1. Получена библиотека генов E.granulosus на основе бактерофага ^gtll с представительностью 1,5х105. Методом гибридизации in situ выявлены фаги, содержащие нуклеотидные последовательности ДНК, кодирующие синтез иммунологически значимых белков-антигенов эхинококка.

2. Разработан способ выявления генома эхинококка методом dot-гибридизации радиоактивномеченным ( Р) зондом на основе клонированной вставки E.granulosus EgF в реакции ДНК-ДНК гибридизации с суммарными про- и эукариотическими ДНК различных организмов. Полученные радиоавтографы свидетельствуют, что клонированные встройки кДНК эхинококка не гибридизируются с ДНК отрицательных контролей (ДНК из тканей животных-хозяев гельминтов, клеток бактерий, трансформированных нерекомбинантными фагами и плазмидами), но гибридизируется с суммарными геномными ДНК цистного и альвеолярного эхинококка, генно-инженерными конструкциями, имеющими кДНК эхинококка. Аналогичный результат был получен при проведении полимеразной цепной реакции.

3. Секвенирована нуклеотидная последовательность EgF эхинококка размером 453 п.н. Уникальность клонированного фрагмента паразита и отсутствие гомологии с клонированными в других странах нуклетидными последовательностями эхинококка подтверждены результатом проведенного компьютерного аналаза по программе «/JNAsis» фирмы «Фармация» (патент РФ № 2234533 от 20.08.2004 г.).

4. Амплификацией нуклеотидной последовательности EgF в полимеразной цепной реакции с образцами геномной ДНК эхинококка и ДНК рекомбинантных клонов показано, что этот клонированный фрагмент гена не содержит интронов, по крайней мере, в кодирующей части, т.к. при электрофоретической детекции продуктов ПЦР все получаемые фрагменты имеют одинаковую молекулярную массу.

5. Проведенный анализ аминокислотной последовательности антигена EgF показал наличие токсических свойств получаемого рекомбинантного белка: а) белки эхинококка имеют в своём составе крупные гидрофобные блоки, отрицательно воздействующие на клеточную мембрану, что вызывает подавление роста клеток и даже их гибель; б) в состав белков эхинококка входят блоки заряженных аминокислот, имеющих сорбирующие свойства. Они прочно связываются с нуклеиновыми кислотами, что угнетает или вовсе тормозит размножение клетки-хозяина. Полученные данные были учтены при выборе системы вектор-хозяин, пригодной для молекулярного синтеза рекомбинантных белков паразита.

6. Повышена эффективность клонирования фрагмента гена эхинококка за счет использования полимеразной цепной реакции со специфическими олигонуклеотидными праймерами. Получено и очищено 68 мкг нуклеотидной вставки.

7. Создан продуцент рекомбинантного белка эхинококка в экспрессирующей векторной системе pQE/EgF-клетки E.coli SG-13009 и получен очищенный рекомбинантный белок EgF в количестве 1800 мг. Синтезируемый под контролем рекомбинантной плазмиды pQE/EgF белок-антиген эхинококка гомогенен и имеет молекулярную массу 16,7 кДа.

8. Разработаны методы анализа иммунологических свойств синтезируемых в векторных системах гибридных белков с использованием иммуноблоттинга, денатурирующего электрофореза и ракетного иммуноэлектрофореза, а также способы физико-химической характеристики рекомбинантного белка.

9. Диагностическая эффективность рекомбинантного антигена EgF в ИФР (ELISA) с использованием сывороток крови людей с подтвержденным диагнозом «эхинококкоз» составила по чувствительности 84,9 % и по специфичности 86,1 %.

10. Проведённые испытания иммунопрофилактических свойств рекомбинантного антигена на белых беспородных мышах выявили высокую степень защиты при ларвальном гидатидозе.

11. Полимеразная цепная реакция с различными олигонуклеотидными праймерами, гомологичными участкам геномной ДНК альвеолярного и цистного эхинококка, кодирующим иммуногенные белки обоих паразитов, выявила высокую степень сходства участков геномов этих двух гельминтов. Полученные данные подтверждают правомочность использования лабораторной модели альвеолярного эхинококкоза для изучения антигенных свойств при цистном гидатидозе.

Практические предложения

Модифициованный способ получения рекомбинантного антигена эхинококка одобрен секцией «Инвазионные болезни животных» отделения ветеринарной медицины РАСХН 25 мая 2001 г., рекомендован для получения стандартизированного антигена, пригодного для иммунодиагностики цистного гидатидоза, и включен в сборник «Современные методы исследований в ветеринарии» (РАСХН, 2005 г, в печати).

Материалы диссертации могут быть использованы в ветеринарных и медицинских лабораториях, проводящих иммунологические исследования на основе паразитарных антигенов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Одоевская, Ирина Михайловна, 2005 год

1. Акматов Б.А., Кенжаев М.Г., Токбаев Н. Методы профилактики и борьбы с эхинококкозами и др. цестодозами человека и животных // Тез.докл.конф.-Москва 16-17 июня 1993 г.- M.-1993.-C.3.

2. Бережко В.К. Иммунодиагностика эхинококкозов животных //Эхинококкозы (Методы исследований, лечения, профилактики).- 1990.-М.-ИМПиТП.-С. 185.

3. Бережко В.К. Иммуноферментная реакция в диагностике эхиноккокоза животных и ее корреляция с эпизоотологической ситуацией // Тез.докл.науч. конф. «Методы профилактики и борьбы с эхинококкозами и другими цестодозами человека и животных».-М.-1993.-С.7.

4. Бережко В.К., Одоевская И.М., Клименко В.В., Качурина Л.И. Оценка диагностической эффективности гибридного белка E.granulosus в клеточном лизате E.coli //Матер, докл. научн. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями»- М.-1999,- С.32-34.

5. Бессонов А.С. Эхинококкоз: распространение, клинические признаки, диагностика, лечение (по материалам симпозиума ОАЭ) // Ветеринария.-М.-1997.-№4.-С.46.

6. Бессонов А.С., Ястреб В.Б. Идентификация штаммов E.granulosus по развитию вторичных ларвоцист мышей //Тр.Всерос.ин-та гельминтол.-М.-1992.-Т.31.-С.31.

7. Брода П. Плазмиды ИМ.- Мир.-1982.-224 с.

8. Геллер Ю.И. Эхинококкозы (медико-экологические аспекты и пути ликвидации инвазии) // М.-Медицина.-1989.-209с.

9. Гловер Д. Новое в клонировании ДНК // Методы. М.-Мир.-1989. -С.138-170.

10. Даугалиева Э.Х. Иммунитет при гельминтозах //Труды Всерос. ин-та гельминтол.-М.-2000.-Т.36.-С.27-50.

11. Девис Р., Ботстайн Д., Рот Дж. Генетика бактерий // М.-Мир.-1984,176с.

12. Дубинин Н.П. Общая генетика // М.- Наука.-1986.-560 с.

13. Кенжебаев С.А. Роль мелких ларвоцист эхинококка в эпизоотологии эхинококкоза // Матер.докл.науч.конф. «Актуальные вопросы теоретической и прикладной трематодологии и цестодологии».-1997.-М. 24-25 сент. 1997 г.-С.64.

14. Лежнин О.А., Прохоров А.Ф., Ермолова Р.С, Гобеджешвили В.К. Социально-экономическая значимость эхинококкоза// Диагностика и лечение эхинококковой болезни. Сборник научных трудов. Ставрополь.-1983. С.196-199.

15. Лейкина Е.С. Эхинококкозы (этиология, эпидемиология, профилактика) // Мед.паразитол.-1985.-№6.-С.62.

16. Лейкина Е.С., Яроцкий Л.С., Озерецковская Н.Н. Итоги и перспективы развития исследований по иммунологии эхинококкоза // Мед.паразитол.-1987.-№2.-С.З-7.

17. Инге-Вечтомов С.Г. Введение в молекулярную генетику //М.-Высшая школа.-1983.-343 с.

18. Курбацкая В.И., Одоевская И.М., Андреянов О.Н. Пассирование природных изолятов Е. multilocularis на лабораторных животных// Матер, докл. научн.-практ. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» М.- 2004.- С.207-211.

19. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование //.-1984.-М.- Мир.-С. 186-205.

20. Мартыненко В.Б., Лосева Т.А., Никифорова Т.П., Дарченкова Н.М. Распространение эхинококкоза в СССР //Мед.паразитол.-1988.-№.-С.84-68.

21. Методы моделирования ларвального гидатидозного эхинококкоза // Эхинококкозы: методы исследования, лечения, профилактики.-М.-ИМПиТП.- 1990.-С.215.

22. Одоевская И.М., Бенедиктов И.И. Амплификация ДНК гена F, кодирующего высокоспецифичный белок-антиген E.granulosus, вполимеразной цепной реакции // Матер, докл. научн. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями»-М.-1999.- С.201-202.

23. Одоевская И.М., Бенедиктов И.И. Опыт получения рекомбинантных белков-антигенов E.granulosus //Тр. Всерос.ин-та гельминтол.-2004.-т.40.- С .256-274.

24. Одоевская ИМ., Качурина Л.И. Получение препаративных количеств вставок кДНК E.granulosus в системе клеток E.coli Y1088 рекомбинантный фаг A,gtll //Матер.докл.науч.конф. «Гельминтозоонозы-меры борьбы и профилактики»-М.-1994. - С.111-113.

25. Остерман Л.А. Активированные спейсеры // В кн.Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М,- Наука.-1985.-С.359-361.

26. Остерман Л.А. Посадка лигандов на активированные матрицы // В кн. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.-Наука.-1985.- С.375-381.

27. Пехов А.П. Плазмиды бактерий // М.-Медицина.-1986.-224 с.

28. Прозоров А.А. Генетическая трансформация и трансфекция // М.-Наука.- 1980.-248 с.

29. Промышленная микробиология и успехи генетической инженерии // Пер. с англ.Под ред. Г.К.Скрябина.- М.: Мир, 1984.-172 с.

30. Сопру нов Ф.Ф. Молекулярные основы паразитизма//М.-Наука.-1987.223 с.

31. Стент Г., Кэлиндар Р. Молекулярная генетика //М.-Мир.-1981.-646с. Стайер Л. Биохимия // Мир.-1984.-Т.1-232 с.

32. Уотсон Дж., Туз Дж., Курц Д. Рекомбинантные ДНК // М.- Мир.-1986.286 с.

33. Хесин Р.Б. Непостоянство генома // М.- Наука.- 1985.-472 с.

34. Чобанян А.Г. О роли зелени в эпидемиологии эхинококкоза у городского населения в Армянской ССР //Материалы научн. конф. Всесоюз.об-ва гельминтол.-М.-1966.-Ч.1.-С.288.

35. Agosin М., Repetto Y. Discowsky L. RNA of E.granulosus protoscolices // Exp.Parasitology.-1971 .-V.30.-P.233-243.

36. Altintas N.: SDS-Polyacrylamide gel elektroforezi ile proteinlerin seperasyonu // T. Parazitol. Derg.-1991.-V.2.-P.l 19-129.

37. Baldock F.C., Thompson R.C.A., Kumaratilake L.M. Stain identification of E.granulosus in determining origin of infection in a case of human hydatid disease in Australia // Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.-1985.-V.79.-P.238-241.

38. Beardsell P.L., Howell M.J. Killing of T.hydatigena oncospheres by sheep neutrophils // Z.Parasitekd.-1984.-V.70.-P.337-344.

39. Bowtell D.D.L., Saint R.B., Rickard M.D., Mitchell G.F. Immunochemical analysis of T.taeniaformis antigenes expressed in E.coli // Parasitology.-1986.-V.93.-P.599-610.

40. Bryant C., Flockhart H.A. Biochemical strain variation in parasitic helminthes // Adv. ParasItol.-1987.-V.25.-P.275-319.

41. Cameron T.W.N. The incidence and diagnosis of hydatid cyst in Canada E.granulosus var. Canadensis // Parasitologia.-1960.-V.2.-P.381-390.

42. Cardozo G., Tucci P., Hernandez A. Characterization of the immune response induced by a carbohydrate enriched fraction from Echinococcus granulosus protoscoleces in patients with cystic hydatid disease // Parasitol. Res.-2002.-V.88.-P.984-990.

43. Carol H., Nieto A., Villacres-Eriksson M., Morein B. Intranasal immunization of mice with Echinococcus granulosus surface antigens iscoms evokes a strong immune response, biased towards glucidic epitopes //Parasite Immunol.-1997.-V.19.-N5.-P. 197-205.

44. Chow C., Gauci C., Cowman A. F., Lightowlers M. W. A gene family expressing a host-protective antigen of Echinococcus granulosus //Mol.Biochem. Parasitol.-2001 .-V. 18.-P.83-88.

45. Craig P. S., M. T. Rogan, J. C. Allan. Detection, screening and community epidemiology of taeniid cestode zoonosis: cystic echinococcosis, alveolar echinococcosis and neurocysticercosis // Adv. Parasitol.l996.-V.38.-P.169-250.

46. Dada B.J.O., Belino E.D. Immunization of sheep against cystic hydatidosis with homologous and heterologous metacestode antigens // Int.J.Zoonoses.-1981 .-V.8.-P.20-25.

47. Deplazes P., Eckert J. Diagnosis of Echinococcus multilocularis infection in final hosts // Appl. Parasitol.-1996.-V.37.-245-252.

48. Fadwa M.A., Knobloc J. Isolation and partial characterization of species-specific and cross-reactive antigens of Echinococcus granulosus cyst fluid // Mol. Biochem. Parasitol.-1989.-V.37.-P. 101-108.

49. Fakon В., Chamekh M., Dissous C., Carpon A. Molecular cloning of an Echinococcus granulosus protein expressing an immunogenic epitope of antigen 5 //Mol. Biochem. Parasitol.-1991.-V.45.-P.233-240.

50. Fasihi Harandi M., Hobbs R.P., Adams P.J., Mobedi I., Morgan-Ryan U.M., Thompson R.C.A. Molecular and morphological characterization of Echinococcus granulosus of human and animal origin in Iran // Parasitology.-2002.-V.125.-P.367-373.

51. Felleisen R, Gottstein B. Echinococcus multilocularis: molecular and immunochemical characterization of diagnostic antigen II/3-10 // Parasitology.-1993.-V. 107.-P.335-342.

52. Ferreira H.B., Rodriges J.J.S., Zaha A. Echinococcus granulosus recombinant antigens // Cikncia e Cultura.-1996.-V.48.-P.370-376.

53. Ferreira H.B., Zaha A. Expression and analysis of the diagnostic value of an Echinococcus granulosus antigen gen clone // Int.J.Harasitol.-1994.- V.24.-N6.-C.863-870.

54. French B.T., Maul H.M. Maul G.G. Screening: cDNA expression libraries with monoclonal and polyclonal antibodies using an amplified-biotin-avidin-peroxidase technique // Anal.Biochem.-1986.-V.156.-P.417-423.

55. Frosch P., Hartmann M., Miuhlschlegel F., Frosch M. Sequence heterogeneity of the echinococcal antigen В // Mol. Biochem. Parasitol.-1994.-V.66.-P.171-175.

56. Frosch P.M., Pfister Т., Schaad V., Bitter-Suermann D. Cloning and characterisation of an immunodominant major surface antigen of Echinococcus multilocularis // Mol. Biochem. Parasitol.-1991.-V.48.-P.121-130.

57. Frosch P. M., Siracusano A. Cloning and expression of a cDNA encoding an elongation factor Ш/5 protein from Echinococcus granulosus with immunogenic activity // Parasite Immunol.- 1999.-V.21.-P.485-492.

58. Gamble H.R., Zarlenga D.S. Biotechnology in the development of vaccines for animal parasites // Vet.Parasitol.-1986.-V.20.-Nl-3.-P.237-250.

59. Gasser R.B., Lightowlers M.W., Rickard M.D. A recombinant antigen with potential for serodiagnosis of Echinococcus granulosus infection in dogs // Int.J.Parasitol.-1990.-V.20.-N7.-P.943-950.

60. Gauci C., Merli M., Muller V., Chow C., Yagi K., Mackenstedt U., Lightowlers M.W. Molecular cloning of a vaccine antigen against infection with larval stage of Echinococcus multilocularis // Infect Immun.-2002.-V.70.-N7.-P.3969-3972.

61. Gottstein В., Eckert J., Fey H. Serological differentiation between E.granulosus and E.multilocularis infection in man 11 Z.Parasitenkd.-1983.-V. 69.-P.347-356.

62. Gottstein В., Eckert J., Michael S.A., Thompson R.C.A. E.granulosus antigens: immunoelectrophoretic and Western, blot analysis of hydatid cyst fluids // Parasito 1 .Res.-1987.-V.73 .-P. 186-189.

63. Harlow E., Lane D. Antibodies //A Laboratory Manual.-Cold Spring Harbor Laboratory. -1988.- P.483-509.

64. Heath D.D. Immunobiology of Echinococcus infections//In:The Biology of Echinococcus and Hydatid Desease. Thompson R.C.A. (ed.).-1986,-George Allen andUnwin. London.-P.164-182.

65. Heath D.D., Lawrence S.B. Antigenic polipeptides of Echinococcus granulosus oncospheres and definition of proctetive molecules // Parasite immunol.-1996.-V. 18.- P. 347-367.

66. Heath D.D., Parmeter 3.N., Osborn P J., Lawrence S.B. Resistance to E.granulosus infection in lambs //J.Parasitol.-1981.-V.67.-P.797-799.

67. Helbig M., Frosch P., Kern P., Frosch M. Serological differentiation between cystic and alveolar echinococcosis by use of recombinant larval antigens //J. Clin. Microbiol.-1993.-V.31 .-P.3211-3215.

68. Hemmings L., McManus D. P. The diagnostic value and molecular characterization of an Echinococcus multilocularis antigen gene clone // Mol. Biochem. Parasitol.-1991 .-V.44.-P.53-61.

69. Hira P.R., Hahr G.M., Shweiki H.M., Behbehani K. An enzyme-linked immunosorbent assay using an arc 5 antigen fir the diagnosis of cystic hydatid disease //Ann.Trop. Med. Parasitol.-1990.-V.2.-P.157-162.

70. Jiang L., Wen H., Ito A. Immunodiagnostic differentiation of alveolar and cystic echinococcosis using ELISA test with 18-kDa antigen extracted from

71. Echinococcus protoscoleces // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg.-2001.-V.95.-P.285-288.

72. Kanwar J.R., Kaushik S.P., Sawhney I.M.,Kamboj M.S., Mehta S.K.,Vinayak V.K. Specific antibodies in serum of patients with hydatidosis recognised by immunoblotting // J. Med. Microbiol.-1992.-V.36.-P.46-51.

73. Kern P., Frosch P., Helbig M., Wechsler J.G., Usadel S., Beckh K., Kunz R., Lucius R., Frosch M. Diagnosis of Echinococcus multilocularis infection by reverse-transcription polymerase chain reaction // Gastroenterology.-1995.-V.109.-P.596-600.

74. Koksal F., Serin M.S., Kekec Y., ve Sadr Y.E. Insan ve hayvankokenli kist hidatik sivilannin SDS-PAGE metoduyla analizi ve Westernlot metodunun klinik onemi//T.Parazitol.Derg.- 1995.-V.19.-P.221-229.

75. Kumaratilake L.M., Thompson R.C.A. Biochemical characterisation of Australian strains of E.granulosus by isoelectric focusing of soluble proteins // Int.J.Parasitol.-1984.-V.14.-P.581-566.

76. Ma L., I to A., Liu Y. H., Wang X. G, Yao Y.Q., Yu D. G., Chen Y.T. Alveolar echinococcosis: Em2plus-ELISA and Eml8-Western blots for follow-up treatment with albendazole // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg.-1997.-V.91.-P.476-778.

77. Maddison S.E., Slemenda S.B., Schantz P.M., Fried J.A.,Wilson M., Tsang V. A specific diagnostic antigen of Echinococcus granulosus with an apparent molecular weight of 8 kDa // Am. J. Med. Hyg.-1989.-V.40.-P.377-383.

78. Mamuti W., Yamasaki H., Sako Y. et al. Molecular cloning, expression, and serological evalution of 8-kilodalton subunit of antigen В from Echinococcus multilocularis // J. Clin. Microbiol.-2004.-P.1088.

79. March F., Enrich C., Mercader M., Sanchez F., Munoz C., Coll P., Prats G. Echinococcus granulosus, Antigen characterization by chemical treatment and enzymatic deglycosylation // Exp. Parasitol.-l991.-V.73.-P.433-439.

80. Mathis A., Deplazes P., Eckert J. An improved test system for PCR-based specific detection of Echinococcus multilocularis eggs // J. Helminthol.-1996.-V.70.-P.219-222.

81. McManus D.P., Bryant C. Biochemistry, physiology and molecular biology of Echinococcus //In: Thompson, R.C.A., Lymbery, A.J. (Eds.), Echinococcus and hydatid disease, CAB International, Wallingford.- P. 135-181.

82. McManus D.P., Knight M., Simpson A.J.G. Isolation of nucleic acides from the hydatiol organisms, Echinococcus spp. (Cestoda) //Mol.Biochem.Parasitol.-1985.-V.16.-N3.-P.251-266.

83. McManus D.P., Simpson A.J.G. Identification of the Echinococcus (hydatid disease) organisms using cloned DNA markers //Mol.Biochem.Parasito 1.-1985.-V.17.-P.171-178.

84. McManus D.P., Smyth J.D. Hydatidosis: changing concepts in epidemiology and speciation// Parasitol. Today.-1986.-V.2.-P. 163-167.

85. Mitchell G.H. An update on candidate malaria vaccines // Parasitology.-1989.-V.98.-S29-S47.

86. Morris D.L., Richardson K.S. Hydatid Disease // Butterworth-Heinemann Ltd. Linarcre House. Jordan Hill. Oxford OX2 8DP. 1992.

87. Nacane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody a new method of conjugation // J.Histochem. Cytochem.-1974.-V.22.-P.l084-1091.

88. Njeruh F.M., Okela G.B.A., Gathuma J.M. Usefulness of indirect haemoglutination (IHA) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in the diagnosis of human hydatidosis // E.Afr.Med. J.-1989.-V.66.-P.310-314.

89. Ortona E., Rigano R., Margutti P. et al. Native and recombinant antigens in the immunodiagn human cystic echinococcosis // Parasite Immunol.-2000.-V.22.-N11.-553-559.

90. Pawlowski Z.S. Epidemiological basis for chemotherapy of human echinococcosis I I IntJ.Clin.Pharmacol.Res.-1985.-V.2.-P.75-78.

91. Potter K.A., Leid R.W. Isolation and partial characterization of an eozinophil chemotactic factor from metacestodes of Taenia taeniaeformis (ECF-Tt) // J.Immunol.- 1986. -V.136.-P.1712-1717.

92. Profumo E., Ortana E., Rigano R., Gioia I., Notargiacomo S., Loppolo S., Siracusano A. Cellular and humoral responses to antigenic subunits of Echinococcus granulosus cyst fluid in hydatid patients // Parasite Immunol.-1994.-V.16.-P.393-398.

93. Rickard M.D., Lightowlers M.W. Immunodiagnosis of hydatid disease. //In:Thompson R.C.A. (ed.). The biology of Echinococcosus and hydatid disease. Allen and Unwin, London.- 1986.-P.217-249.

94. Rishi A.K., McManus D.P. Genomic cloning of human E.granulosus DNA: Isolation of recombinant plasmids and their use as genetic markers in strain characterization // Parasitology.-1987.-V.94.-369-383.

95. Rogan M.T., Horris D.L., Prichard D.I., Percins A.C. E.granulosus: the potential use of specific radiolabeled antibodies in diagnosis by immynoscintygraphy // Clinic.Exp. Immunology.-1990.-V.80.-P.225-231.

96. Rollinson D., Walker Т.К., Simpson A.J.G. New approaches to sistosome identification // Parasitology Today.-1986.-V.2.-P.24.

97. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Digesting DNA with Restriction Enzymes // In: Molecular Cloning. A laboratory manual. Second edition. Cold SpringHarbor Laboratory Press.-1989.-P.528-533.

98. Sanchez F., March F., Mercader M., Coll P., Munoz C., Prats G. Immunochenical localizanion of major hydatid fluid antigens in protoscolices and cyst of Echinococcus granulosus from human origin // Parasite Immunol.-1991.-V.13.-P.83-592.

99. Schantz P.M., Schwabe C. Worldwide status of hydatid disease control // J.Am.Veter.Med.Assn. -1969 .-V.155.-N12.-P.2104-2121.

100. Schantz P.M., Van den Bossche H., Eckert J. Chemotherapy for larval echinococcosis in animals and humans: report of a workshop //Z.Parasitenkd.-1982.- V.67.-P.5-26.

101. Shepherd J.C., Aitken A., Mc Manus D.P. A protien secreted in vivo by E.granulosus inhibits elastase activity and neutrophil chemotaxis //

102. Mol.Biochem.Parasitol.-1991 .-V.44.-P.81-90.

103. Shepherd J.C., Mc Manus D.P. Specific and cross-reactive antigenes of E.granulosus hydatid cyst fluid //Mol. and Biochem. Parasitology.-1987.-V.25.-P.143-154.

104. Siles-Lucas M., Gottstein B. Molecular tools for the diagnosis of cystic and alveolar echinococcosis //Trop. Med. Int. Health.- 2001.-V. 6.-P.463-475.

105. Sim B.K.L., Piessens W.F., Wirth D.F. A DNA probe cloned in E.coli for the identification of Brugia malayi // Mol.Biochem. Parasitology.- 1986.V.19.-P.l 17-123.

106. Smith, D.B., K.S. Johnson. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase// Gene.-1988.-V.67.-P.31-40.

107. Smyth J.D., Mc Manus D.P. The Physiology and Biochemistry of Cestodes // Cambridge University Press, Cambridge.-1989.

108. Suquet C.M., Green-Edwards C., Leid R.W. Isolation and partial characterization of a Taenia taeniaeformis metacestode proteinase Inhibitor // Int. J.Parasito 1.-1984.-V. 14.-P. 165-172.

109. Tsudo S., Fukuyama K., Epstein W.L. Low molecular weight eosinophil chemotactic factor in granulomatos liver in murine schistosomiasis //

110. J.Immunol.-1979.-V.122.-P.2554-2557.

111. Vogel M., Gottstein В., Muller N., Seebeck T. Production of a recombinant antigen of Echinococcus multilocularis with high immunodiagnostic sensitivity and specificity//Mol. Biochem. Parasitol. -1988.-V.31.-P.117-125.

112. Waterkeyn J., Gauci C., Cowman A., Lightowlers M. Sequence analysis of a gene family encoding Taenia ovis vaccine antigens expressed during embryogenesis of eggs //Mol.Biochem.Parasitol.-1997.-V.86.-P.75-84.

113. Weiland G. Serology and Immunodiagnostic Methods.Echinococcus // In: Mehlhorn H. (Ed.). Parasitology in Focus. Facts and Trends. Springer-Verlag Berlin Heidelberg.-1988.-P.682.

114. Welling G.W., Wicher J.W., Zee R., Weiling-Wester S. Prediction of sequential antigenic regions in proteins // FEBS Letters.-1985.-V.188.-N2.-P.215-218.

115. Widle N.W., Carlson K.E., Manning D.R., Zigmond S.M. Chemoattractant-stimulated GTPase activity is decrease on membranes from polymorphonuclear leukocytes incubated in chemoattractant // J.Blol.Chem.-1988.-V.264.-P.190-196.

116. Woollard D.J., Gauci C.G., Heath D.D., Lightowlers M.W. Epitope specificities and antibody responses to the EG95 hydatid vaccine // Parasite Immunol. -1998.-V.20-P.535-540.

117. Woollard D.J., Heath D.D., Lightowlers M.W. Assessment of protective immune responses against hydatid disease in sheep by immunization with synthetic peptide antigens //Parasitology.-2000.-V.121.-N2.-P.145-153.

118. Yap K.W., Thompson R.C.A. Non-radioactive DMA probes as diagnostic fools for hydatiodosls/echinococcosis// 12-th Conf. of WAAVP.- 1987 a.-12-15 aug.-Montreal, Canada. Programme and Abstracts.2A-2.

119. Yap K.W., Thompson R.C.A. Isolation of cestode DNAII Parasitol. Today. -1987 b.-V.3.-P.220-227.

120. Young R.A. Davis R.W. Yeast RNA Polymerase II Genes: Isolation with Antibody Probes// Science.-1983b.-V.222.-P.778-782.

121. Zekavat S.Y., Khayat A.A.M. Echinococcus granulosus. Isolation and partial characterisation of sRNA and DNA // Israel Journal of Medicine Sciences.-1971 .-V.7.-N11.-P. 1292-1294.

122. Zhu Y., He W., Liang Y. Development of a rapid, simple dipstick dye immunoassay for schistosomiasis diagnosis // J.Immunol.Methods.-2002.-V.266.-№l-2.-P.l-5.