Создание эффективного процесса биотрансформации L-изолейцина в 4-гидроксиизолейцин методами метаболической инженерии Escherichia coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат биологических наук Киверо, Александр Дмитриевич

• Киверо, Александр Дмитриевич
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Киверо, Александр Дмитриевич

Оглавление

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы

1.4. Цели и задачи работы

1.3. Научная новизна и практическая значимость работы

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Введение

2.2. Сахарный диабет II типа как эволюционный вызов современной цивилизации

2.3. Молекулярно-биологические основы инсулиновой регуляции гомеостаза глюкозы

2.3.1. ИНЗСД и гомеостаз глюкозы

2.3.2. Инсулин и его секреция ß-клетками

2.3.3. Инсулиновая регуляция гомеостаза глюкозы

2.4. Немедикаментозная терапия и профилактика ИНЗСД

2.4.1. Физические упражнения

2.5. Современная медикаментозная терапия и профилактика ИНЗСД: препараты, корректирующие инсулиновую регуляцию метаболизма глюкозы

2.5.1. Секретагоги инсулина

2.5.2 Ингибиторы синтеза глюкозы в печени

2.5.3. Сенсибилизаторы инсулинового действия и инсулиномиметики

2.6.4-гидроксиизолейцин как современное средство лечения и профилактики ИНЗСД

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Бактериальные штаммы и плазмиды

3.2. Среды, условия культивирования штаммов и проведения ферментативных реакций

3.3. Определение относительных метаболических потоков углерода

3.4. Генно-инженерные методики

3.5. Конструирование штаммов и плазмид

3.6. Очистка IDO и его идентификация методом "finger printing"

3.7. Анализ результатов ферментативных реакций и ферментационного культивирования

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Выбор оптимальной стратегии промышленного синтеза 4-HIL: история вопроса

4.2. Идентификация гена ido из Bacillus thuringiensis (2-е-2)

4.2.1. Выбор стратегии

4.2.2. Оптимизация культивирования Bacillus thuringiensis 2-е-2 с целью получения биомассы с максимальной удельной активности IDO

4.2.3. Очистка ШО из грубого клеточного лизата Bacillus thuringiensis 2-е-2

4.3. Клонирование гена ido и его экспрессия в клетках Е. coli

4.4. Разработка "динамической" биотрансформации L-изолейцина в 4-HIL: сопряжение клеточного роста и гидроксилирования L-изолейцина в штамме 2А

4.5. Повышение экономичности процесса биотрансформации: перераспределение углеродного потока от синтеза биомассы к реакции гидроксилирования L-изолейцина

5. ВЫВОДЫ

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

4-HIL - (2S, 3R, 48)-4-гидроксиизолейцин

сАМР (цАМФ) - циклоаденозинмонофосфат (аденозин-3',5' - циклофосфат)

DTT - дитиотреитол (т/?ео-2,3-дигидрокси-1,4-димеркаптобутан)

E.coli - Escherichia coli

GLP-1 - глюкагон-подобного пептида-1

GLUT2-4 - транспортеры глюкозы

HEPES - !чГ-2-Гидроксиэтилпиперазин-М'-2-этансульфоновая кислота

IDO - Ь-изолейцин-4-гидроксилаза (диоксигеназа)

IPTG (ИПТГ) - изопропил - ß-D-тиогалактопиранозид

IRS-1 - субстрат инсулинового рецептора

RBS — участок связывания рибосом

SDS - додецилсульфат натрия

АТФ - аденозин 5'- трифосфат

ИНЗСД - инсулиннезависимый диабет II типа

ОВПФП - окислительная ветвь пентозофосфатного пути катаболизма глюкозы

ПААГ - полиакриламидный гель

ПСМ - производные сульфонилмочевины

ПФП - пентозофосфатный путь катаболизма глюкозы

ПЦР - полимеразная цепная реакция

X-gal - 5-бромо-4-хлоро-3~индоил-бета-0-галактопиранозид ЦТК - цикл трикарбоновых кислот(цикл Кребса)

ЭДП - 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатный путь катаболизма глюкозы (путь Энтнера-Дудорова)

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Создание эффективного процесса биотрансформации L-изолейцина в 4-гидроксиизолейцин методами метаболической инженерии Escherichia coli»

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы.

На протяжении столетий жители Средиземноморья, северной Африки,

Индии использовали семена фенугрека (Т^опеПа /оешт-§гаесит Ь.) в качестве природного лекарственного средства для улучшения пищеварения, лечения лихорадки, бронхита, усиления лактации у кормящих матерей и т. д. Отдельное внимание исследователей привлекали антидиабетические свойства экстрактов из семян фенугрека. Изучение "молекулярных основ" биологической активности фенугрека привело исследователей к открытию инсулинотропной активности (2Б, ЗЯ, 48)-4-гидроксиизо лейцина (4-Н1Ь) - свободной неканонической аминокислоты, в большом количестве содержащейся в его семенах (до 30-50% относительно общего пула всех свободных аминокислот). Было показано, что 4-НТТ, потенцирует секрецию инсулина (3-клетками островков Лангерганса изолированных из поджелудочной железы крысы и человека [1]. Стимулирующее действие 4-Н1Ь строго зависит от концентрации глюкозы, т. е. существенное усиление секреции инсулина в присутствии 4-Н1Ь наблюдалось лишь при концентрации глюкозы от 6 мМ и выше. Таким образом, в отличие от множества современных химических лекарственных препаратов (например - производных сульфонилмочевины), действие 4-Н1Ь строго пропорционально концентрации глюкозы [2-4] Это позволяет регулярно использовать 4-Н1Ь в качестве пищевой добавки, не опасаясь возникновения состояния гипогликемии.

Помимо своей инсулинотропной активности, 4-ШЬ улучшает инсулинорезистентность клеток скелетных мышц и печени посредством активации фосфоинозитид-3 (Р13) киназной активности, ассоциированной с субстратом инсулинового рецептора (ГО.8-1) [5]. Исследования на грызунах показали, что 4-Н1Ь является эффективным средством постоянного контроля над весом тела, гликемией и инсулинемией [5]. Таким образом, 4-Н1Ь является перспективной диетической добавкой для лечения и предотвращения диабета второго типа.

В настоящее время сформировался рынок биологически активных добавок, содержащих 4-HIL. Во-первых, считают, что его инсулинотропная активность (при отсутствии инсулинорезистентности) помогает запасать энергию в мышечной ткани (в виде гликогена) и способствует, таким образом, ее пролиферации у спортсменов, занимающихся наращиванием мышечной массы. С другой стороны, 4-HIL предлагается использовать как антигипогликемический компонент комплексных биологически активных пищевых добавок.

В настоящее время, потребность в 4-HIL удовлетворяется только за счет его экстракции из семян фенугрека. Однако, необходимость введения стадий очистки 4-HIL от сопутствующих биогенных компонентов (включая биологически неактивные изомеры 4-HIL) приводит к существенному удорожанию конечного препарата (~100$/грамм очищенного 4-HIL), что в свою очередь, сказывается на цене содержащих 4-HIL комплексных БАДов и ограничивает рынок их сбыта. Кроме того, на стоимость 4-HIL влияет также сезонность получения сырья (семян фенугрека). Маркетологами подсчитано, что для массового продвижения 4-HIL на рынке пищевых добавок к продуктам питания, необходимо на порядок снизить его себестоимость.

Предложенные на сегодняшний день методы химического синтеза 4-HIL сложны и дороги, а, следовательно, не могут решить поставленную задачу [6, 7]. Кроме того, одним из последних мировых маркетинговых трендов является активное продвижение на рынок "натуральных продуктов" (natural foods), содержащих "биогенные" компоненты и не включающие "химически синтезированные суррогаты ".

Для крупной биотехнологической компании (например, Ajinomoto), специализирующейся на промышленном производстве аминокислот, в том числе L-изолейцина, биотрансформация последнего в 4-HIL является очевидным решением поставленной выше задачи. В этом случае, согласно экономическим расчетам, удалось бы существенно снизить себестоимость 4-HIL, обеспечив,

таким образом, его эффективное продвижение на рынке пищевых добавок.

6

Таким образом, задача создания эффективного процесса биотрансформации L-изолейцина в 4-HIL, пригодного для использования в промышленных масштабах является достаточно актуальной.

1.4. Цели и задачи работы.

Цель представляемой диссертационной работы - создание на основе клеток

E.coli штамма, обладающего способностью к высокоэффективной биотрансформации L-изолейцина в 4-HIL. В процессе работы решались следующие задачи:

1. Идентификация и клонирование гена ido, кодирующего Ь-изолейцин-4-гидроксилазу (IDO) в штамме Bacillus thuringiensis 2-е-2.

2. Создание экспрессионного плазмидного вектора, обеспечивающего эффективную продукцию L-изолейцин диоксигеназы в клетках E.coli.

3. Метаболическая инженерия Е. coli с целью обеспечения высокой эффективности биотрансформации L-изолейцина в 4-HIL.

4. Оптимизация метаболизма глюкозы в клетках Е. coli для более экономичной биотрансформации L-изолейцина.

1.3. Научная новизна и практическая значимость работы.

В ходе работы был впервые идентифицирован и клонирован ген ido,

кодирующий Ь-изолейцин-4-гидроксилазу в геноме штамма Bacillus thuringiensis (2-е-2). Установлена аминокислотная последовательность, соответствующая процессированной активной форме IDO.

Впервые предложена и реализована схема модификации метаболизма Е. coli для эффективной биотрансформации субстрата в его целевую гидрокси-форму на основе взаимообусловленности клеточного роста и реаЗции гидроксилирования. Сконструированный по указанной схеме штамм Е. coli MG 1655 (sucAB::AattB-Ptoc, aceAKvAvtiñ, zwf,edd,eda\AdtiB, Z>rw0::AattB-PL-6mö)[pEL-IDO(Lys, 2-e-2)] внедряется в настоящее время для промышленного производства 4-HIL. Предложенный подход позволил на порядок снизить себестоимость производства

4-НТТ, по сравнению с технологией его экстракции из семян фенугрека. В дальнейшем, сконструированный штамм может быть использован (при соблюдении ряда условий) для гидроксилирования других субстратов, что имеет очевидное практическое значение.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Введение.

Сахарный диабет является одной из самых острых и сложных проблем современного здравоохранения. С момента признания диабета в качестве самостоятельного заболевания (Индия, около 700 г до н. э), число больных этим опасным недугом на планете неуклонно растёт [8]. "В каждой стране и в каждой общине по всему миру мы проигрываем битву против этой жестокой и смертельной болезни" - сказал Жан-Клод Мбания, президент Международной Диабетической Федерации (IDF) Согласно пресс-релизу 5-го издания мирового атласа диабета IDF, число больных сахарным диабетом возрастёт с 366 млн. в 2011 году до 552 миллионов к 2030 году, если не будут приняты срочные меры. Таким образом, в среднем, каждый десятый взрослый житель планеты будет болен сахарным диабетом к 2030 году (http://www.idf.org/atlasmap/atlasmap).

Таблица 1. Мировая статистика сахарного диабета (по материалам Международной Диабетической Федерации (IDF) за 2011 год).

Страна Население '' (млн.) Кол-во больных диабетом2> Кол-во смертей вызванных диабетом 2> Нарушение толерантности к глюкозе2) Диабет 1 типа у детей3).

(млн.) (%) (тыс.) (%) (млн.) (%) на 100 тыс.

Индия 737 90 12 983 0.13 20 2.7 4.2

Китай 969 61 6 1133 0.11 23 2.4 0.6

США 216 23.7 < 11 180 0.08 26 12 23.7

Япония 95 10.7 11 81 0.08 13.6 14 12.1

Бразилия 128 12.4 9.6 121 0.09 5.3 4.1 7.7

Россия 109 12.6 11.5 217 0.2 12 11 12.1

Украина 34 1.2 3.5 23 0.07 3.8 11 8.1

Беларусь 7.2 0.7 9.7 10 0.13 0.8 11 5.6

Казахстан 11 0.8 7.2 15 0.14 1 9 нет данных

Германия 63 5 7.9 43 0.07 5.5 8.7 18

Франция 44 3.2 7.2 22 0.05 4.2 9.5 12.2

Англия 45 3 6.6 25 0.05 4.1 9.1 24.5

Италия 46 3.6 7.8 26 0.06 4.3 9.3 12.1

Финляндия 3.9 0.3 7.6 3 0.08 0.38 9.7 57.6

Швеция 6.7 0.4 5.9 3 0.04 0.4 5.9 43.1

]) Оценка количества взрослого населения (20-79 лет) по материалам ООН (2010, с корректировкой на 2011).

т> Приведенные оценки основаны на исследованиях, перечисленных на сайте: http://www.idf.org/diabetesatlas/downloads/backgroundpapers

3) Количество диагностированных случаев диабета в 2011 году у детей в возрасте 0 до 14 лет.

Динамика роста заболеваемости сахарным диабетом имеет характер эпидемии. При этом примерно в 95% случаев диагностируется сахарный диабет II типа. Поэтому сейчас можно смело говорить о мировой пандемии инсулиннезависимого диабета II типа (ИНЗСД).

Так, к 2011 году, количество больных в США составило 26 миллиона человек, что соответствует 47% приросту за 11 лет (Таблица 1). При этом количество американцев в преддиабетическом состоянии оценивается в 78 миллионов человек (National Diabetes Fact Sheet; released Jan. 26, 2011; http://www.diabetes.org/). Иными словами, каждый четвёртый американец является потенциальным диабетиком.

Исследования китайских специалистов показали, что диабет достиг масштабов эпидемии среди взрослого населения Китая. Около 148 200 000 взрослых китайцев (15,5%) находятся в преддиабетическом состояние [9].

Аналогичная экспансия диабета II типа наблюдается в подавляющем большинстве стран мира (см. Таблица 1, интерактивный мировой атлас диабета; 5-е издание http://www.idf.org/atlasmap/atlasmap) [9-13]. Очевидно, что в такой ситуации необходимо принимать срочные меры для борьбы с этим смертельным заболеванием. Очевидно также, что одним из главных направлений борьбы с ИНЗСД является разработка и внедрение в лечебную практику новых эффективных лекарственных форм для лечения и профилактики сахарного диабета II типа, в том числе, на основе природных биологически активных веществ. В контексте общей проблемы ИНЗСД, использование антигипергликемических биологически активных добавок (например, 4-гидроксиизолейцина) в качестве необходимых компонентов диетического питания представляется достаточно эффективным способом профилактики диабета у лиц с нарушенной толерантностью к глюкозе (преддиабетическое состояние). Однако, для того чтобы предположение трансформировалось в уверенность необходимо ясно представлять себе не только молекулярные

механизмы действия активного вещества, но и все причинно-следственные связи в метаболизме человека на которые данное вещество влияет. Только в этом случае можно прогнозировать эффект его пролонгированного использования на организм пациента.

Темой представленной диссертационной работы является создание биотехнологического производства природной инсулинотропной аминокислоты 4-гидроксиизолейцина. В настоящее время сформировался рынок биологически активных добавок, содержащих 4-Н1Ь. Во-первых, считают, что его инсулинотропная активность (при отсутствии инсулинорезистентности) помогает запасать энергию в мышечной ткани (в виде гликогена) и способствует, таким образом, ее пролиферации у лиц, занимающихся бодибилдингом (см., например, http://www.supplementcentral.com/source-naturals-promillin-fenugreek-extract-9Q-1аЫе1). С другой стороны, 4-ШЬ предлагается использовать как антигипогликемический компонент комплексных биологически активных добавок (см., например, http://www.ierodia.fiVcomplement-alimentaire-bio-plante-

тесЛс1па1е/51тр1е-1егос11а-сотр1етеп1-аПтеп1а1ге-Ь1о.р1гр?рге8с=&ргоёик:=512).

Как правило, практическое применение любой новой биологически активной субстанции порождает ряд фундаментальных и прикладных вопросов общего характера. Насколько безопасен 4-Н1Ь и, каковы отдаленные последствия его регулярного использования? Каковы молекулярные механизмы его действия и в чем его отличие от известных препаратов. С целью, хотя бы частично ответить на эти и другие вопросы, мы решили посвятить данный литературный обзор некоторым теоретическим и прикладным аспектам проблемы метаболического синдрома человека, знание которых позволяет оценить перспективы использования 4-Н1Ь для лечения и профилактики диабета II типа.

2.2. Сахарный диабет II типа как эволюционный вызов современной цивилизации.

Сахарный диабет II типа (ИНЗСД), представляет собой сложную гетерогенную группу метаболических расстройств, включая гипергликемию и

11

нарушение действия и/или секреции инсулина. Современные теории развития ИНЗСД рассматривают множество причин его возникновения, главными среди которых являются: дефект инсулин-опосредованного транспорта глюкозы клетками мышечной ткани, дисфункция панкреатических р-клеток, нарушение секреторной функции адипоцитов, а также нарушение действия инсулина в печени [14].

Было подсчитано, что 30% - 70% составляющих риска заболевания ИНЗСД могут быть отнесены к генетическим факторам [15]. Так, риск развития ИНЗСД составляет около 7% в общей популяции, около 40% у потомков, один из родителей которых болен ИНЗСД и около 70%, если оба родителя страдают этим заболеванием [16]. Закономерности наследования ИНЗСД указывают на полигенный (патология определяется мутантными аллелями нескольких генов) и гетерогенный (различные комбинации мутантных аллелей определяют ИНСЗД в разных популяциях) характер этого заболевания [17]. Генетические исследования последнего десятилетия выявили по крайней мере 27 (подтвержденных и потенциальных) генов предрасположенности к ИНЗСД и 20 общих генетических вариантов, связанных с этим заболеванием [18]. Многие выявленные локусы регулируют мощность секреции инсулина (3-клетками в ответ на увеличение инсулинорезистентности или ожирение. Другие гены отвечают за чувствительность к инсулину, транспорт глюкозы, ожирение, а также секрецию инсулина. Роли некоторых локусов в патогенезе ИНЗСД неизвестны.

Большинство генетических маркеров ИНЗСД распространены практически во всех этнических популяциях без явных тендерных различий.

Анализ корреляции между сменой социально-экологических условий жизни

в конкретной популяции человека и ростом заболеваемости диабетом II типа

среди её членов, приводит к неутешительным результатам: ИНЗСД является

имманентным атрибутом современной цивилизации западного типа. Характерным

примером такого анализа является исследование эпидемии ИНЗСД в индийских

общинах на островах Фиджи, Маврикий, в Сингапуре, Южной Африке,

12

Великобритании - то есть там, где индийские эмигранты добились богатства задолго до индийцев, проживающих в самой Индии [10]. В середине 19-го века индийцы были привлечены на о. Маврикий для тяжёлых физически работ на плантациях сахарного тростника. К 1980 году, снижение мировых цен на сахар заставило правительство провести индустриализацию страны и увеличить экспорт промышленных товаров. Это, в свою очередь, привело к увеличению благосостояния и уменьшению физической активности местного населения. В результате, между 1982 и 1986 годами, смертность от диабета выросла втрое, а к 1987 году достигла 13%. Сегодня, Маврикий имеет в четыре раза больший доход на душу населения, чем в Индии, и второй по величине в мире национальный показатель распространённости сахарного диабета, 24% (в сравнении с 12% в Индии, см. Табл. 1). На основе данного анализа в 1996 году были высказаны опасения, что если в течение следующих нескольких десятилетий Индия будет модернизирована до уровня Маврикия, то следует ожидать существенного роста ИНЗСД среди индийского населения [10]. Современные данные показывают, что эти прогнозы сбылись. К 2011 году Индия уверенно лидирует как по абсолютной статистике заболеваемости ИНЗСД, так и по частоте его встречаемости среди развитых стран (Табл. 1).

Таким образом, для любого современного социума основными факторами эпидемического роста ИНЗСД являются: урбанизация, повышение материального уровня жизни, переход на высококалорийную и жирную диету, гиподинамия [911, 19, 20]. При этом, по-видимому, принципы регуляции метаболизма человека оказались несовместимы с образом его современного существования. Результатом этого несоответствия является метаболический синдром человека (синдром X) -комплекс метаболических, гормональных и клинических нарушений, характерными проявлениями которых являются: инсулинорезистентность и компенсаторная гиперинсулинемия, абдоминальное ожирение, артериальная гипертензия, атерогенная дислипидемия и ишемическая болезнь сердца [21-23].

Одним из прямых следствий метаболического синдрома является развитие

13

ИНЗСД. Таким образом, если человечество не преодолеет это противоречие, оно самоуничтожится, и, в этом случае, Homo sapiens может стать тупиковой ветвью эволюции.

Возникает два принципиальных вопроса.

1. Почему человек оказался не способен адаптироваться к современным условиям жизни? В данном вопросе содержится важный эволюционный подтекст. Каким образом описанные выше 20 генетических детерминант ИНЗСД сумели

преодолеть сито естественного отбора и стать "миной замедленного действия"

Bíí "

__________чем причина цепной детонации

эпидемии ИНЗСД в современном мире. Это временная "болезнь роста" или эволюционный отбор "нового" (по крайней мере - в смысле организации метаболизма) человека?

2. Каким образом человек сможет преодолеть это несоответствие: сменит цивилизационную парадигму или изменится сам?

Для ответа на первый вопрос было предложено несколько гипотез, первой

из которых можно считать гипотезу генов бережливости (thrifty genes hypothesis).

Суть ее в том, что в процессе эволюции происходил отбор людей с "бережливым

генотипом", склонных к запасанию избыточной энергии (в виде жировой ткани),

что позволяло им легко переносить чередование периодов недостатка и изобилия

пищи [24]. Нил считал, что "бережливый генотип" фенотипически выражался в

более быстрой секреции инсулина ("quick insulin trigger") в ответ на прием пищи,

что должно было способствовать запасанию энергии. Однако, в контексте

современного изобилия продуктов питания и гиподинамии, "бережливый

генотип" приводит к хронической гиперинсулинемии, которая, в свою очередь,

может привести к "истощению" (3-клеток поджелудочной железы,

гипоинсулинемии, гипергликемии и, в финале, диабету. Гипотеза Нила была

сформулирована в то время, когда не делалось различия между диабетом I и II

типов, и не было известно о том, что одним из главных "маркеров" диабета II типа

является инсулинорезистентность. Последний факт явно противоречит исходной

14

посылке Нила: ткани, слабо реагирующие на инсулин, вряд ли запасают сахар эффективней чем в норме, даже в присутствии избытка инсулина. Это заставило Нила переформулировать свою гипотезу. Суть ее осталась неизменной, однако теперь, именно инсулинорезистентность стала фенотипическим преимуществом "компромиссного генотипа" [25, 26].

Однако и в этой редакции, гипотеза Нила противоречит многим антропологическим данным. Многие социумы, которые в настоящее время характеризуются высокими индексами ожирения и диабета, по всей видимости, никогда не испытывали недостатка в пищи (например, жители островов Тихого океана, с богатой растительностью и обилием морской рыбы) [27]. Кроме того, если гипотеза Нила верна, то современные популяции охотников-собирателей должны накапливать жир в период между двумя последовательными периодами голода. Однако это не так [28]. Более того, исторический анализ показывает, что периоды голода увеличивали смертность главным образом стариков и детей, а такой отбор никак не мог привести к селекции "бережливого генотипа". Кроме того, любая адаптивная теория не может объяснить почему за историческое время, достаточное для окончательного отбора "бережливого генотипа", только часть каждой конкретной популяции характеризуется избыточным весом [28].

Другая гипотеза, получившая название гипотезы "бережливого фенотипа"

(thrifty phenotype gypothesis), была предложена Хейлзом и Баркером в 1992 году

[29]. В отличие от Нила, эти исследователи предполагали, что "бережливый"

фенотип обусловлен не специфическим генотипом, а, скорее, определяется

условиями пре- и перинатального развития человека. В более поздней

модификации, с целью учесть очевидный генетический фактор

предрасположенности к диабету, теория утверждала, что условия раннего

развития человека являются эпигенетическим фактором "программирования"

будущей схемы регуляции его метаболизма. Недостаточное "энергетическое"

(глюкоза/кислород) обеспечение развивающегося плода (например, как результат

стрессовых эко-социальных условий протекания беременности), приводит к

15

"перенастройке" его метаболизма (за счет изменения профиля экспрессии генов) в расчете на последующее "голодное существование", давая, таким образом, возможность проявиться "бережливому генотипу".

Главным достоинством этой гипотезы является указание на прямую связь между патогенезом диабета и условиями пре - и перинатального развития человека.

Альтернативная гипотеза "дрейфующих генов" ("drifty genes hypothesis" была предложена Джоном Спикманом в 2007 году [28]. Исследования диких мелких животных показали, что они обладают системой строгой регуляции массы тела, значение которой, в норме, может колебаться в довольно узком диапазоне между двумя пограничными значениями, которые автор определил как нижнюю и верхнюю точки реагирования (upper and lower intervention points). Выход за пределы этого диапазона, меняет метаболизм и поведение животного таким образом, чтобы вернуть его вес в заданный диапазон.

Каким образом определяются обе точки реагирования? По мнению автора, их значения определяются двумя факторами эволюционного отбора. Первый фактор, определяющий нижнюю точку реагирования - это количество энергии (запасенное в виде жировой ткани), необходимое для выживания в условиях ее дефицита (например, в зимний период). Второй фактор, определяющий верхнюю точку реагирования - это угроза со стороны хищников. Избыточный вес животного снижает его шансы успешно убежать или спрятаться от хищника.

В результате такого двойного прессинга, больший шанс выжить имеют особи, для которых оба значения максимально сближены. Это означает, что даже в условиях изобилия пищи, регуляция метаболизма и поведения (двигательная активность, регуляция чувства голода и т. д.) такой успешной особи должны поддерживать оптимальное значение веса тела около нижней границы реагирования.

Если давление со стороны хищников исчезает, то верхняя граница

реагирования может быть смещена вверх. Это означает, что любые мутации,

16

приводящие к подобному фенотипу, не будут элиминироваться и будут "дрейфовать" из поколения в поколение.

Согласно имеющимся данным, далекие предки человека могли испытывать существенное давление со стороны многочисленных хищников. Однако, социализация человека (совместное противостояние хищникам), использование огня и примитивного оружия привело к тому, что это давление исчезло, и именно с этого момента начался дрейф генов, повышающих верхний уровень реагирования. Обладатели такого генотипа в условиях ограниченного питания и больших физических нагрузок фенотипически не будет отличаться от нормального человека. Однако, в условиях изобилия калорий и гиподинамии, такой генотип проявит себя в накоплении избыточного веса и, следовательно, в предрасположенности к диабету.

Таким образом, согласно обеим гипотезам, современная эпидемия диабета это фенотипическое проявление эволюционно - определенного генотипа, выражающаяся в отсутствии механизмов строгого контроля накопления жировой массы в условиях изобилия пищи и гиподинамии. Только, по мнению Нила, такой "компромиссный" генотип - это результат прямого эволюционного отбора фенотипа, наиболее адекватного определенному периоду развития человека как вида. А, по мнению Спикмена, такой генотип никогда не давал эволюционных преимуществ его носителю, и является прямым следствием дрейфа генов за исторический период, последовавший после "освобождения" человека от прессинга хищников.

Все рассмотренные нами до сих пор гипотезы не рассматривали нейро-

поведенческий аспект проблемы метаболического синдрома. Впервые он был

подробно проанализирован в работе [30]. Авторы предложили гипотезу, согласно

которой, резистентность к инсулину является социо-экологической адаптацией к

смене двух поведенческих парадигм человека: 1) переход от репродуктивной

стратегии "г"-типа (большое количество потомков при небольших инвестициях в

каждого) к стратегии "К"-типа (небольшое число потомков с более масштабными

17

инвестициями в каждого) и 2) изменение стереотипа поведения "солдата" на стратегию "дипломата".

Авторы рассматривают явление инсулинорезистентности как способ перераспределения глюкозы в организме человека между инсулинозависимыми органами и тканями (печень, мышцы, жировая ткань) и инсулинонезависимыми -мозгом, плацентой. Несмотря на инсулинонезависимость, клетки различных отделов мозга экспрессируют инсулиновые рецепторы, за счет которых инсулин влияет, как на развитие отдельный нейронов, так и на интегральные когнитивные функции мозга (например, память). Таким образом, гиперинсулинемия рассматривается авторами как способ активации высшей нервной деятельности человека. При этом последовательность событий в новой схеме патогенеза диабета выглядит следующим образом. 1) гиперинсулинемия как реакция на необходимость активации мозга; 2) гипогликемия как следствие увеличения концентрации инсулина; 3) инсулинорезистентность, как реакция на гипогликемию с целью перенаправить глюкозу к мозгу.

Данная теория имеет одно принципиальное и крайне важное с эволюционной точки зрения отличие от рассмотренных выше гипотез. Если в теориях Нила и Спикмена метаболический синдром это следствие эволюционного процесса, то с точки зрения Ватвы и Яжника, явление эпидемии метаболического синдрома можно интерпретировать как начало нового этапа эволюции человека. Действительно, в первом случае мы имеем дело с не сответствием современных социо-экологических условий жизни человека его генотипу (и определяемым им устройству метаболизма) отобранному (неважно каким способом) за время эволюции.

Во втором случае, возможно, мы имеем дело с эволюционным изменением

регуляции распределения энергии в организме человека в пользу работы мозга.

Очевидно, что огромный информационный поток (в самом общем значении этого

слова), воспринимаемый мозгом современного человека, требует значительного

количества энергии для его сознательной и бессознательной обработки. Авторы

18

отмечают, что в процессе такой обработки, по всей видимости, происходит экзаптация разных отделов мозга (в эволюционной биологии, экзаптацией называется процесс, посредством которого формы или структуры, развившиеся в ходе эволюции, чтобы выполнять одну функцию, кооптируются, чтобы обслуживать другие функции). Например, установлено, что орбитофронтальная кора головного мозга, отвечающая за обработку информации, связанную с пищевым стимулом (вознаграждением), также задействована в процессе обработки информации, связанную с денежным стимулом - понятием, возникшим, по историческим меркам, не так давно [31]. Кроме того, показано взаимовлияние чувства голода и "жажды наживы" в денежном эквиваленте [32]. Таким образом, у современного человека, "метаболический сигнал" к приему пищи (чувство голода), может возникнуть не потому, что его реальные энергетические запасы истощены, а вследствие экзаптации отвечающего за этот сигнал отдела мозга для обработки потока информации не связанной (по крайней мере напрямую) с его текущими энергетическим потребностями. При этом, возможно, что если такой процесс требует больших энергетических затрат (на работу соответствующей сети нейронов), то экзаптироваться для этой работы будут, те отделы головного мозга, действие которых приводит к проявлению гипергликемии и/или инсулинорезистентности, обеспечивая, таким образом, мозг требуемой энергией в виде дополнительной глюкозы. Однако, возможно, что на современном этапе эволюции человека, существует дисбаланс между реальной энергетической потребностью мозга и результатом действия экзаптации. Иными словами, только часть мобилизованной организмом глюкозы, потребляется мозгом, остальная глюкоза остается циркулировать в крови, вызывая периодическую или хроническую гипергликемию и/или аккумулируется в жировом депо, вызывая ожирение. Таким образом, явления гипергликемии и инсулинорезистентности могут быть простым следствием рефлексии современного человека. На гипергликемию организм отвечает

гиперинсулинемией, хроническая форма которой, приводит в конечном итоге к ИНЗСД.

Из вышесказанного следует, что для профилактики ИНЗСД необходимы дополнительные меры по поддержанию гомеостаза глюкозы в организме человека. Одними из приоритетных направлений терапии и профилактики ИНЗСД являются физические упражнения и диетическое питание. В первом случае "лишняя" глюкоза сгорает за счет мышечной работы, во втором случае, описанный выше дисбаланс нивелируется за счет невозможности мобилизовать достаточное для его возникновения количество глюкозы. Доказано, что физические упражнения задерживают или предотвращают манифестацию сахарного диабета [33-36]. Однако, социо-экологические условия жизни огромного количества людей (особенно в развивающихся странах) не позволяют проводить регулярные занятия спортом и соблюдать специальные диеты.

В этом случае, на первое место выходят лекарственные средства, позволяющие регулировать гомеостаз глюкозы в организме человека. При этом предпочтение будет отдано эффективным препаратам, допускающим регулярное потребление без токсических побочных эффектов. Одним из таких препаратов, является 4-гидроксиизолейцин.

2.3. Молекулярно-биологические основы инсулиновой регуляции гомеостаза глюкозы.

2.3.1. ИНЗСД и гомеостаз глюкозы.

Глюкоза является основным углеводом крови и всего организма. Ей

принадлежит исключительная роль в обмене веществ человека, то есть она

является основным и универсальным источником энергии для всего организма.

Большинство тканей и органов, таких как мозг, нуждаются в глюкозе постоянно.

Низкая концентрация глюкозы в крови (гипогликемия) может вызвать судороги,

потерю сознания и смерть. С другой стороны, хроническое высокое содержание

глюкозы в крови (гипергликемия) может привести к слепоте, почечной

недостаточности, сердечно-сосудистым заболеваниям и нейропатии. Поэтому

20

концентрация глюкозы в крови поддерживается в узких пределах с помощью гормонального регулирования процессов ее синтеза (глюконеогенез, гликогенолиз) и потребления (гликолиз), включая транспорт [37].

Одну из главных ролей в регуляции углеводного обмена организма играет гормон поджелудочной железы — инсулин. Выделяясь в кровяное русло, он через воротную вену сразу попадает в печень, где производит ряд значительных метаболических эффектов, включая ингибирование глюконеогенеза и гликогенолиза. Инсулин повышает скорость потребления глюкозы, прежде всего в поперечно-полосатых мышцах и жировой ткани за счет активации ее транспорта. Инсулин стимулирует также липогенез, ослабляя рилизинг свободных жирных кислот из триглицеридов в жировой и мышечной тканях. Инсулин уменьшает липолиз, повышается транспорт аминокислот в клетки, модулирует транскрипцию, тем самым стимулируя рост, синтез ДНК и клеточное деление.

Выше было отмечено, что в основе ИНЗСД лежат с одной стороны инсулинорезистентность, а с другой - нарушение секреции инсулина р-клетками поджелудочной железы. Таким образом, ИНЗСД можно рассматривать как следствие хронической дисфункции инсулиновой регуляции гомеостаза глюкозы. Для того чтобы понимать как тот или иной вид терапии ИНЗСД воздействует на гомеостаз глюкозы, необходимо представлять себе основные молекулярные механизмы секреции инсулина и опосредованной им регуляции метаболизма глюкозы. Поэтому далее, мы кратко рассмотрим некоторые молекулярно-биологические аспекты инсулиновой регуляции гомеостаза глюкозы и методов ее немедикаметнозной и медикаментозной модуляции, с точки зрения возможных

%-А Л и

молекулярных механизмов действия 4-гидроксиизолеицина.

2.3.2. Инсулин и его секреция р-клетками.

Инсулин представляет собой полипептидный анаболический гормон, образованный 51 аминокислотами.

Рисунок 1. Цитология островка Лангерганса. Красный цвет - (3-клетки (инсулин);

зеленый цвет-а-клетки (глюкагон); желтый цвет-у-клетки (сомастатин).

Воспроизводится по Rorsman, P., Br J Diabetes Vase Dis. 2005;5(4):187-191

Он секретируется в кровь р-клетками островков Лангерганса (сферические структуры диаметром 50 - 250 мкм, представляющие из себя скопления гормон-продуцирующих (эндокринных) клеток, преимущественно в хвосте поджелудочной железы, открытые в 1869 году немецким патологоанатомом Паулем Лангергансом и составляющие приблизительно 1-2 % массы поджелудочной железы (Рис. 1 ).

В среднем, поджелудочная железа содержит порядка 100 островков Лангерганса, каждый из которых содержит порядка 10 ' - 104 (3-клеток и 100 - 200 секреторных клеток других типов. Секреция инсулина минимальна при голодании, мышечной и нервной нагрузке, а также других формах стресса, когда возрастает потребность в использовании углеводов и жиров, и максимальна после приема пищи. Секреция инсулина контролируется изменениями концентраций циркулирующих в крови нутриентов (глюкозы, аминокислот, жирных кислот, гормонами желудочно-кишечного тракта, секретируемыми в нервно-гуморальную фазу сокоотделения (например, гастрин, секретин) и различными нейромедиаторами [38]. Перечисленные гормоны и медиаторы обуславливают так называемые энтероинсулярные стимулы секреции инсулина. Следует отметить,

что их значение второстепенно; то есть, главными стимулами служат "пищевые" стимулы.

Секрецию инсулина из ß-клеток в основном регулируется уровнем глюкозы в плазме крови и во многом определяется параметрами двух ключевых белков ß-клеток: транспортера глюкозы GLUT2, который имеет низкое сродство к глюкозе (К;1/ ~ 17 мМ) и глюкокиназы, сродство которой к глюкозе (Kw ~ 5 мМ) существенно ниже чем у гексогеназ из других тканей (КЛ/ ~ 0.01 мМ). Инсулин практически не секретируется, если концентрация глюкозы в крови меньше чем 3 мМ. При концентрации глюкозы в крови больше чем 5 мМ, происходит выброс инсулина и С-пептида[39]. Стимулирующий эффект длится столько, сколько времени концентрация глюкозы в плазме крови повышена. Секреция инсулина в ответ на глюкозу происходит в два этапа. Первый ответ начинается в течение нескольких минут после стимуляции. Эта "быстрая" фаза секреции связана с выбросом инсулина из небольшого числа "активированных" гранул находящихся непосредственно у клеточной мембраны. Второй этап секреции инсулина начинается через несколько минут после первого и секреция постепенно увеличивается до своего максимума в течение 30-40 мин. На этом, "медленном этапе" происходит мобилизация инсулиновых гранул, локализованных в клеточной цитоплазме [40].

Глюкоза транспортируются в ß-клетки островков Лангерганса с помощью GLUT2, фосфорилируется гексокиназой и вступает в гликолиз где окисляется до пирувата (Рис. 2). Скорость этого процесса лимитируется активностью глюкокиназы, а, следовательно (см. выше), концентрацией глюкозы в крови. Образовавшийся пируват поступает затем в митохондрии, где благодаря активностям пируватдегидрогеназы и пируваткарбоксилазы превращается соответственно в ацетил-КоА и оксалоацетат - субстраты ЦТК.

< 5 mmol/1 Glue A

> 5.5 mmol/l Glucose g ' GIlUT-2

Рисунок 2. Ионный контроль секреции инсулина с помощью KATP каналов в зависимости от концентрации глюкозы в крови (воспроизведено с изменениями по http://www.medbio.info/Horn/Time%203-4/secretion of insulin and glucaeon.htm). А. При концентрации глюкозы < 5 мМ активность гексокиназы (glucokinase) низка и, как следствие, снижается внутриклеточное отношение АТФ/АДФ. АТФ-чувствительные калиевые каналы разблокированы и обеспечивают поляризацию мембраны, достаточную для блокировки работы потенциал-зависимых кальциевых каналов. Отсутствие кальция препятствует эффективному экзоцитозу инсулиновых гранул. Б. Концентрация глюкозы (> 5.5 мМ) достаточна для эффективной работы гексокиназы. Результатом роста отношения АТФ/АДФ является блокировка АТФ-чувствительных калиевых каналов и деполяризация мембраны. Кальций поступает в клетку и активирует секрецию инсулина.

Активация 1ДТК приводит к генерации восстановленных эквивалентов

(НАДН), окисление которых в электрон-транспортной цепи митоходрий приводит

к синтезу АТФ [41, 42]. Продукция АТФ приводит к возрастанию соотношения

АТФ /АДФ и, как следствие, закрытию АТФ-чувствительных калиевых каналов

(Катр). В результате происходит деполяризация плазматической мембраны,

которая вызывает открытие потенциал-зависимых Са" каналов. Это приводит к

притоку Са2~ в клетку, который вызывает экзоцитоз инсулиновых гранул [43].

Таким образом, зависимая от АТФ-чувствительных калиевых каналов глюкозо-

стимулиро ванная секреция инсулина происходит из-за уменьшения

электростатического отталкивания между отрицательно заряженными

поверхностями плазматической мембраны и мембран секреторных гранул [44].

Кроме этого, ионы Са2^ могут облегчать передвижение гранул внутри клеток, так

как влияют на функцию сократительных белков, содержащих актин и тубулин

(микротрубочек и микрофиламентов). Также ионы Са" связываются с

калмодулином, что активирует фермент аденилатциклазу, катализирующую

24

превращение АТФ в цАМФ. Циклический АМФ является важным физиологическим усилителем глюкозо-индуцированной секреции инсулина путем увеличения чувствительности [З-клеток к стимулирующему действию кальция и выступает посредником действия инкретиновых факторов, таких как СЬР-1 для высвобождения инсулина [45, 46].

глюкоза

Рисунок 3. Деполяризация мембраны р-клеток зависит от баланса активностей КАТР

и ^(воспроизведено с изменениями по http://www.medbio.info/Horn/Time%203-4/secretion of insulin and elucagon.htm). Мембрана, деполяризованная за смет блокировки АТФ-чувствительных калиевых каналов (КАТР), может быть реполяризована за счет работы потенциал-чувствительных калиевых каналов (Kv), а конечный результат будет определяться балансом между этими двумя процессами Активность Kv контролируется с помощью гормонов, действующих через G-белки, аденилатциклазу (АС), протеинкиназу А (РКА). Фосфорилирование канала Kv ингибирует транспорт ионов кали (К"). Kv также ингибируется НАДФН, который образуется в митохондриях в результате метаболизма глюкозы. Глюкагон-подобный пептид-1 (GLP-1), который стимулирует секрецию инсулина, действует также через Kv.

Позже, выяснилось, что мембрана, деполяризованная за счет блокировки КАтр, может быть реполяризована за счет работы потенциал-чувствительных калиевых каналов (Kv), а конечный результат будет определяться балансом между этими двумя процессами (Рис. 3) [47-49]. Регуляция активности Kv осуществляется за счет сигнальных каскадов опосредованных аденилатциклазой, цАМФ, и протеинкиназой А. Инициация регуляторных каскадов может происходить путем взаимодействия инкретинов (в частности GLP-1) со своими рецепторами [50].

Таким образом, согласно современным представлениям, основными мишенями для лекарственных средств, стимулирующих секрецию инсулина являются: 1) Кдтр-каналы: все перепараты, блокирующие транспорт калия и деполиризующие мембрану, будут способствовать секреции инсулина; 2) K.v-каналы: препараты, активирующие сигнальные каскады, результатом работы которых является фосфорилирование Кч-каналов, также будут являться инсулинотропными агентами; 3) соединения, метаболизм которых в (З-клетках приводит к увеличению индекса АТФ/АДФ, будут также способствовать секреции инсулина.

2.3.3. Инсулиновая регуляция гомеостаза глюкозы

Для предотвращения чрезмерного повышения концентрации глюкозы в

крови при пищеварении основное значение имеет потребление глюкозы печенью и мышцами, в меньшей мере - жировой тканью. Более половины всей глюкозы (60%), поступающей из кишечника в воротную вену, поглощается печенью. Около 1/3 этого количества откладывается в печени в форме гликогена, остальная часть превращается в жиры и окисляется, обеспечивая синтез АТФ. Ускорение этих процессов инициируется повышением инсулинглюкагонового индекса (отношение концентраций инсулина и глюкогона).

Другая часть глюкозы, поступающей из кишечника, попадает в общий кровоток. Большая часть этого количества поглощается мышцами и жировой тканью. Это обусловлено увеличением проницаемости мембран мышечных и жировых клеток для глюкозы под влиянием высокой концентрации инсулина. Глюкоза в мышцах откладывается в форме гликогена, а в жировых клетках превращается в жиры.

Остальная часть глюкозы общего кровотока поглощается другими клетками (Рис. 4) (цитировано по Биохимия: учеб. для вузов, под ред. Е.С. Северина., 2003. 779 с. ISBN 5-9231-0254).

Аккумуляция

Синтез АТФ

Мозг

15гр *

Глюкоза в

8гр

»

пище

(Lictxt*)

Жировая ткань

(90 гр)

Гликоген

Мышцы

Гликоген

2;

Мышцы

Почки

Рисунок 4. Тканезависимое распределение потребленной глюкозы в организме человека

(Воспроизводится по http://www.medbio.info/Horn/Time%203-4/homeostasis_2.htm#The basics: Metabolic Effects)

2.3.3.1. Инеулинозависимая регуляция метаболизма глюкозы в печени.

Печень играет роль энергетического буфера организма, запасая или призводя

энергию в виде глюкозы за счет процессов: 1) синтеза и распада гликогена а также 2) гликолиза и глюконеогенеза. Переключение печени с производства глюкозы на ее запасание и наоборот, происходит с участием инсулина и глюкагона, при этом решающее значение имеет отношение концентрации инсулина в крови к концентрации глюкагона - "инсулинглюкагоновый индекс".

Переключение процессов синтеза и мобилизации гликогена происходит за счет регуляции активности двух ключевых ферментов его метаболизма: гликогенсинтазы и гликогенфосфорилазы (Рис. 5 А).

В период пищеварения преобладает влияние инсулина, так как инсулинглюкагоновый индекс в этом случае повышается. При этом, инсулин: 1) снижает уровень цАМФ в клетках, фосфорилируя (опосредованно через Ras-путь) и тем самым активируя протеинкиназу В (цАМФ-независимую). Протеинкиназа В, в свою очередь, фосфорилирует и активирует фосфодиэстеразу цАМФ -фермент, гидролизующий цАМФ с образованием АМФ (Рис. 5 Б); 2) активирует

(через ЯаБ-путь) фосфопротеинфосфатазу гранул гликогена, которая дефосфорилирует гликогенсинтазу и таким образом её активирует. Кроме того, фосфопротеинфосфатаза дефосфорилирует и, следовательно, инактивирует киназу фосфорилазы и гликогенфосфорилазу; 3) индуцирует синтез глюкокиназы, тем самым ускоряя фосфорилирование глюкозы в клетке. В совокупности, это приводит к тому, что инсулин одновременно активирует гликогенсинтазу и ингибирует гликогенфосфорилазу, переключая процесс мобилизации гликогена на его синтез.

Рисунок 5. А. Регуляция активности гликогенфосфорилазы и гликогенсинтазы. Кружками обозначены молекулы фермента: активные - чёрные, неактивные - белые. ФП-фосфатаза (ГР) - фосфопротеинфосфатаза гранул гликогена. Б. Влияние инсулина на активность гликогенсинтазы и киназы фосфорилазы. ФП-фосфатаза (ГР) - фосфопротеинфосфатаза гранул гликогена. ПК (ррЭОБб) - протеинкиназа, активируемая инсулином. (Воспроизведено по Биохимия: учеб. для вузов, под ред. Е.С. Северина., 2003.

Переключение печени с гликолиза на глюконеогенез и обратно также зависит от инсулинглюкагонового индекса и осуществляется за счет регуляции ферментов, катализирующих необратимые стадии гликолиза и глюконеогенеза, сочетание которых образуют "субстратные" циклы I, II, и III (Рис. 6)

Направление углеродного потока в первом субстратном цикле регулируется инсулином за счет индукции синтеза глюкокиназы. Поскольку глюкокиназа печени не ингибируется глюкозо-6-фосфатом (в отличие от гексокиназы мышц),

то основная часть глюкозо-6-фосфата в абсорбтивном периоде направляется на синтез гликогена и по гликолитическому пути.

Пищеварение

г ооойзнио

N

Т Инсупин>'тюкдгон

Глюкоза

^ч?«!«,""' (Глюмжими»]! 1

Гпкхозо-б-фосфат

г1

Г ток

1 Инсупим/ткжагон

фоефвг&м

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Киверо, Александр Дмитриевич

5. ВЫВОДЫ

1. В ходе работы был впервые идентифицирован и клонирован ген (ido), кодирующий Ь-изолейцин-4-гидроксилазу в геноме штамма Bacillus thuringiensis (2-е-2). Установлена аминокислотная последовательность, соответствующая процессированной активной форме IDO.

2. Проведена оптимизация экспрессии гена ido в составе плазмидного вектора в клетках Е. coli.

3. Впервые предложена и реализована схема модификации метаболизма Е. coli для эффективной биотрансформации L-изолейцина в 4-HIL на основе сопряжения клеточного роста и реакции гидроксилирования. Сконструирован штамм Е. coli 2А, способный после введения в него плазмиды pEL-IDO(Lys, 2-е-2) к эффективной биотрансформации L-изолейцина в 4-HIL.

4. Проведено перераспределение углеродных потоков от синтеза биомассы к ЦТК с целью более экономичной биотрансформации L-изолейцина в 4-H3L. Сконструирован и внедряется в производство штамм 2А tszwf,edd,eda [pEL-IDO(Lys, 2-е-2)], позволяющий, при поддержании коэффициента конверсии L-изолейцин/4-HIL на уровне 88%, уменьшить на 20% потребление глюкозы и снизить на 35% выход биомассы по сравнению со штаммом 2А [pEL-IDO(Lys, 2-е-2)].

5. Предложенная схема может быть использована для гидроксилирования других аминокислот при использовании соответствующих диоксигеназ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Киверо, Александр Дмитриевич, 2012 год

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Sauvaire, Y., et al., 4-Hydroxyisoleucine: a novel amino acid potentiator of

insulin secretion. Diabetes, 1998. 47(2): p. 206-10.

2. Jackson, J.E. and R. Bressler, Clinical pharmacology of sulphonylurea hypoglycaemic agents: part 1. Drugs, 1981. 22(3): p. 211-45.

3. Jackson, J.E. and R. Bressler, Clinical pharmacology of sulphonylurea hypoglycaemic agents: part 2. Drugs, 1981. 22(4): p. 295-320.

4. Jennings, A.M., et al., Islet cell antibodies and insulin autoantibodies in patients treated with oral hypoglycaemic agents. Diabet Med, 1989. 6(5): p. 434-9.

5. Jette, L., et al., 4-Hydroxyisoleucine: a plant-derived treatment for metabolic syndrome. Curr Opin Investig Drugs, 2009. 10(4): p. 353-8.

6. Wang, Q., et al., A Practical Synthesis of (2S,3R,4S)-4-Hydroxyisoleucine, A Potent Insulinotropic a-Amino Acid from Fenugreek. European Journal of Organic Chemistry, 2002. 2002(5): p. 834-839.

7. Rolland-Fulcrand, V., et al., Chemoenzymatic Synthesis of Enantiomerically Pure (2S,3R,4S)-4-Hydroxyisoleucine, an Insulinotropic Amino Acid Isolatedfrom Fenugreek Seeds. European Journal of Organic Chemistry, 2004. 2004(4): p. 873877.

8. Oubré, A. Y., et al., From plant to patient: an ethnomedical approach to the identification of new drugs for the treatment ofNIDDM. Diabetologia, 1997. 40(5): p. 614-617.

9. Yang, W., et al., Prevalence of Diabetes among Men and Women in China. New England Journal of Medicine, 2010. 362(12): p. 1090-1101.

10. Diamond, J., Medicine: Diabetes in India. Nature, 2011. 469(7331): p. 478-479.

11. Shera, A.S., et al., Pakistan National Diabetes Survey: prevalence of glucose intolerance and associated factors in the Punjab Province of Pakistan. Prim Care Diabetes, 2010. 4(2): p. 79-83.

12. Cheng, M.H., Asia-Pacific faces diabetes challenge. Lancet, 2010. 375(9733): p. 2207-10.

13. Briers, B., et al., Hungry for money: the desire for caloric resources increases the desire for financial resources and vice versa? Psychol Sci, 2006. 17: p. 939 -943.

14. Lin, Y. and Z. Sun, Current views on type 2 diabetes. J Endocrinol, 2010. 204(1): p. 1-11.

15. Poulsen, P., et al., Heritability of type II (non-insulin-dependent) diabetes mellitus and abnormal glucose tolerance—a population-based twin study. Diabetologia, 1999. 42(2): p. 139-45.

16. Majithia, A.R. and J.C. Florez, Clinical translation of genetic predictors for type 2 diabetes. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes, 2009. 16(2): p. 100-6.

17. Bonnefond, A., P. Froguel, and M. Vaxillaire, The emerging genetics of type 2 diabetes. Trends Mol Med, 2010.16(9): p. 407-16.

18. Ridderstrale, M. and L. Groop, Genetic dissection of type 2 diabetes. Mol Cell Endocrinol, 2009. 297(1-2): p. 10-7.

19. Cockram, C.S., Diabetes mellitus: perspective from the Asia-Pacific region. Diabetes Res Clin Pract, 2000. 50 Suppl 2: p. S3-7.

20. Cockram, C.S., The epidemiology of diabetes mellitus in the Asia-Pacific region. Hong Kong Med J, 2000. 6(1): p. 43-52.

21. Reaven, G.M., Banting lecture 1988. Role of insulin resistance in human disease. Diabetes, 1988. 37(12): p. 1595-607.

22. Reaven, G.M., Role of insulin resistance in human disease (syndrome X): an expanded definition. AnnuRevMed, 1993. 44: p. 121-31.

23. Reaven, G.M., Banting Lecture 1988. Role of insulin resistance in human disease. 1988. Nutrition, 1997. 13(1): p. 65; discussion 64, 66.

24. Neel, J.V., Diabetes mellitus: a "thrifty" genotype rendered detrimental by "progress"? Am J Hum Genet, 1962.14: p. 353-62.

25. Neel, J.V., Thrifty genotype rendered detrimental by progress? Lancet, 1989. 2(8667): p. 839-40.

26. Neel, J.Y., Diabetes mellitus: a "thrifty" genotype rendered detrimental by "progress"? 1962. Bull World Health Organ, 1999. 77(8): p. 694-703; discussion 692-3.

27. Baschetti, R., Diabetes epidemic in newly westernized populations: is it due to thrifty genes or to genetically unknown foods? J R Soc Med, 1998. 91(12): p. 622-5.

28. Speakman, J.R., A nonadaptive scenario explaining the genetic predisposition to obesity: the "predation release" hypothesis. Cell Metab, 2007. 6(1): p. 5-12.

29. Hales, C.N. and D.J. Barker, Type 2 (non-insulin-dependent) diabetes mellitus: the thrifty phenotype hypothesis. Diabetologia, 1992. 35(7): p. 595-601.

30. Watve, M. and C. Yajnik, Evolutionary origins of insulin resistance: a behavioral switch hypothesis. BMC Evol Biol, 2007. 7(1): p. 61.

31. John P, O.D., Reward representations and reward-related learning in the human brain: insights from neuroimaging. Current Opinion in Neurobiology, 2004. 14(6): p. 769-776.

32. Briers, B., et al., Hungry for money: the desire for caloric resources increases the desire for financial resources and vice versa. Psychol Sci, 2006. 17(11): p. 93943.

33. Eriksson, J., J. Lindstrom, and J. Tuomilehto, Potential for the prevention of type 2 diabetes. Br Med Bull, 2001. 60: p. 183-99.

34. Tuomilehto, J. and S. Del Prato, Mealtime glucose regulation in type 2 diabetes. Int J Clin Pract, 2001. 55(6): p. 380-3.

35. Tuomilehto, J., et al., Prevention of type 2 diabetes mellitus by changes in lifestyle among subjects with impaired glucose tolerance. N Engl J Med, 2001. 344(18): p. 1343-50.

36. Valle, T.T., et al., [Type 2 diabetes can be prevented by life style changes]. Duodecim, 2001.117(15): p. 1517-8.

37. DeFronzo, R.A., Lilly lecture 1987. The triumvirate: beta-cell, muscle, liver. A

collusion responsible for NIDDM. Diabetes, 1988. 37(6): p. 667-87.

98

38. MacDonald, M.J., et al., Perspective: emerging evidence for signaling roles of mitochondrial anaplerotic products in insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2005. 288(1): p. El-15.

39. Gerich, J.E., Control of glycaemia. Baillieres Clin Endocrinol Metab, 1993. 7(3): p. 551-86.

40. Straub, S.G. and G.W. Sharp, Hypothesis: one rate-limiting step controls the magnitude of both phases ofglucose-stimulated insulin secretion. Am J Physiol Cell Physiol, 2004. 287(3): p. C565-71.

41. Matschinsky, F.M., Glucokinase as glucose sensor and metabolic signal generator in pancreatic beta-cells and hepatocytes. Diabetes, 1990. 39(6): p. 647-52.

42. MacDonald, M.J., et al., Pyruvate dehydrogenase and pyruvate carboxylase. Sites of pretranslational regulation by glucose of glucose-induced insulin release in pancreatic islets. J Biol Chem, 1991. 266(33): p. 22392-7.

43. Malaisse, W.J., et al., Regulation of calcium fluxes and their regulatory roles in pancreatic islets. Ann N Y Acad Sci, 1978. 307: p. 562-82.

44. Ashcroft, F.M., D.E. Harrison, and S.J. Ashcroft, Glucose induces closure of single potassium channels in isolated rat pancreatic beta-cells. Nature, 1984. 312(5993): p. 446-8.

45. Prentki, M., et al., Cyclic AMP raises cytosolic Ca2+ and promotes Ca2+ influx in a clonal pancreatic beta-cell line (HIT T-15). FEBS Lett, 1987. 220(1): p. 1037.

46. Prentki, M. and F.M. Matschinsky, Ca2+, cAMP, andphospholipid-derived messengers in coupling mechanisms of insulin secretion. Physiol Rev, 1987. 67(4): p. 1185-248.

47. Gembal, M., P. Gilon, and J.C. Henquin, Evidence that glucose can control insulin release independently from its action on ATP-sensitive K+ channels in mouse B cells. J Clin Invest, 1992. 89(4): p. 1288-95.

48. Miki, T., et al., Defective insulin secretion and enhanced insulin action in KATP channel-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(18): p. 10402-6.

49. Remedi, M.S., et al., Hyperinsulinism in mice with heterozygous loss ofK(ATP) channels. Diabetologia, 2006. 49(10): p. 2368-78.

50. MacDonald, P.E. and M.B. Wheeler, Voltage-dependent K(+) channels in pancreatic beta cells: role, regulation and potential as therapeutic targets. Diabetologia, 2003. 46(8): p. 1046-62.

51. Obici, S., et al., Hypothalamic insulin signaling is requiredfor inhibition of glucose production. Nat Med, 2002. 8(12): p. 1376-1382.

52. Margolis, R.U. and N. Altszuler, Insulin in the cerebrospinal fluid. Nature, 1967. 215(5108): p. 1375-6.

53. Folli, F., et al., Insulin receptor substrate-1 (IRS-1) distribution in the rat central nervous system. J Neurosci, 1994. 14(11 Pt 1): p. 6412-22.

54. Pocai, A., et al., Hypothalamic K(ATP) channels control hepatic glucose production. Nature, 2005. 434(7036): p. 1026-31.

55. Inoue, H., et al., Role of hepatic STAT3 in brain-insulin action on hepatic glucose production. Cell Metab, 2006. 3(4): p. 267-75.

56. Kandror, K.V. and P.F. Pilch, Compartmentalization of protein traffic in insulinsensitive cells. Am J Physiol, 1996. 271(1 Pt 1): p. El-14.

57. Taniguchi, C.M., B. Emanuelli, and C.R. Kahn, Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action. Nat Rev Mol Cell Biol, 2006. 7(2): p. 8596.

58. Agati, J.M., D. Yeagley, and P.G. Quinn, Assessment of the roles of mitogen-activatedprotein kinase, phosphatidylinositol 3-kinase, protein kinase B, and protein kinase C in insulin inhibition of cAMP-inducedphosphoenolpyruvate carboxykinase gene transcription. J Biol Chem, 1998. 273(30): p. 18751-9.

59. Storz, P. and A. Toker, 3'-phosphoinositide-dependent kinase-1 (.PDK-1) in PI 3-kinase signaling. Front Biosci, 2002. 7: p. d886-902.

60. Barthel, A. and D. Schmoll, Novel concepts in insulin regulation of hepatic gluconeogenesis. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2003. 285(4): p. E685-92.

61. DeFronzo, R.A., et al., The effect of insulin on the disposal of intravenous glucose. Results from indirect calorimetry and hepatic and femoral venous catheterization. Diabetes, 1981. 30(12): p. 1000-7.

62. Sato, Y., et al., Physical exercise improves glucose metabolism in lifestyle-related diseases. Exp Biol Med (Maywood), 2003. 228(10): p. 1208-12.

63. Henriksen, E .J., Invited review: Effects of acute exercise and exercise training on insulin resistance. J Appl Physiol, 2002. 93(2): p. 788-96.

64. Holloszy, J.O. and H.T. Narahara, Studies of tissue permeability. X. Changes in permeability to 3-methylglucose associated with contraction of isolated frog muscle. J Biol Chem, 1965. 240(9): p. 3493-500.

65. Ivy, J.L. and C.H. Kuo, Regulation of GLUT4 protein and glycogen synthase during muscle glycogen synthesis after exercise. Acta Physiol Scand, 1998. 162(3): p. 295-304.

66. Neufer, P.D. and G.L. Dohm, Exercise induces a transient increase in transcription of the GLUT-4 gene in skeletal muscle. Am J Physiol, 1993. 265(6 Pt 1): p. C1597-603.

67. Folli, F., et al., Insulin stimulation of phosphatidylinositol 3-kinase activity and association with insulin receptor substrate I in liver and muscle of the intact rat. J Biol Chem, 1992. 267(31): p. 22171-7.

68. Kraegen, E.W., et al., In vivo insulin resistance in individual peripheral tissues of the high fat fed rat: assessment by euglycaemic clamp plus deoxyglucose administration. Diabetologia, 1986. 29(3): p. 192-8.

69. Kahn, B.B. and O. Pedersen, Suppression of GLUT4 expression in skeletal muscle of rats that are obese from high fat feeding but not from high carbohydrate feeding or genetic obesity. Endocrinology, 1993. 132(1): p. 13-22.

70. Kahn, B.B., Dietary regulation of glucose transporter gene expression: tissue specific effects in adipose cells and muscle. J Nutr, 1994. 124(8 Suppl): p. 1289S-1295S.

71. Cerf, M.E., High fat diet modulation of glucose sensing in the beta-cell. Med Sci Monit, 2007. 13(1): p. RA12-7.

72. Philipson, L.H. and D.F. Steiner, Pas de deux or more: the sulfonylurea receptor and K+ channels. Science, 1995. 268(5209): p. 372-3.

73. Mitrakou, A., et al., Role of reduced suppression of glucose production and diminished early insulin release in impaired glucose tolerance. N Engl J Med, 1992. 326(1): p. 22-9.

74. Virally, M., et al., Type 2 diabetes mellitus: epidemiology, pathophysiology, unmet needs and therapeutical perspectives. Diabetes Metab, 2007. 33(4): p. 23144.

75. Morral, N., Novel targets and therapeutic strategies for type 2 diabetes. Trends Endocrinol Metab, 2003.14(4): p. 169-75.

76. DeFronzo, R.A., Pharmacologic therapy for type 2 diabetes mellitus. Ann Intern Med, 1999.131(4): p. 281-303.

77. Hoist, J.J., The physiology of glucagon-like peptide 1. Physiol Rev, 2007. 87(4): p. 1409-39.

78. Vilsboll, T. and J.J. Hoist, Incretins, insulin secretion and Type 2 diabetes mellitus. Diabetologia, 2004. 47(3): p. 357-66.

79. Wajchenberg, B.L., beta-cell failure in diabetes and preservation by clinical treatment. Endocr Rev, 2007. 28(2): p. 187-218.

80. Toft-Nielsen, M.B., S. Madsbad, and J.J. Hoist, Continuous subcutaneous infusion of glucagon-like peptide 1 lowers plasma glucose and reduces appetite in type 2 diabetic patients. Diabetes Care, 1999. 22(7): p. 1137-43.

81. Zander, M., et al., Effect of 6-week course of glucagon-like peptide 1 on glycaemic control, insulin sensitivity, and beta-cell function in type 2 diabetes: a

parallel-group study. Lancet, 2002. 359(9309): p. 824-30.

102

82. Van Gaal, L.F., S.W. Gutkin, and M.A. Nauck, Exploiting the antidiabetic properties of incretins to treat type 2 diabetes mellitus: glucagon-like peptide 1 receptor agonists or insulin for patients with inadequate glycemic control? Eur J Endocrinol, 2008. 158(6): p. 773-84.

83. Farilla, L., et al., Glucagon-like peptide-1 promotes islet cell growth and inhibits apoptosis in Zucker diabetic rats. Endocrinology, 2002. 143(11): p. 4397-408.

84. Perfetti, R., et al., Glucagon-like peptide-1 induces cell proliferation and pancreatic-duodenum homeobox-1 expression and increases endocrine cell mass in the pancreas of old, glucose-intolerant rats. Endocrinology, 2000. 141(12): p. 4600-5.

85. Drucker, D.J. and M.A. Nauck, The incretin system: glucagon-like peptide-1 receptor agonists and dipeptidylpeptidase-4 inhibitors in type 2 diabetes. Lancet, 2006. 368(9548): p. 1696-705.

86. Gautier, J.F., et al., Biological actions of the incretins GIP and GLP-1 and therapeutic perspectives in patients with type 2 diabetes. Diabetes Metab, 2005. 31(3 Pt 1): p. 233-42.

87. Eng, J., et al., Isolation and characterization of exendin-4, an exendin-3 analogue, from Heloderma suspectum venom. Further evidence for an exendin receptor on dispersed acini from guinea pig pancreas. J Biol Chem, 1992. 267(11): p. 7402-5.

88. Nielsen, L.L. and A.D. Baron, Pharmacology of exenatide (synthetic exendin-4) for the treatment of type 2 diabetes. Curr Opin Investig Drugs, 2003. 4(4): p. 4015.

89. Thorens, B., et al., Cloning and functional expression of the human islet GLP-1 receptor. Demonstration that exendin-4 is an agonist and exendin-(9-39) an antagonist of the receptor. Diabetes, 1993. 42(11): p. 1678-82.

90. Kim, W. and J.M. Egan, The role of incretins in glucose homeostasis and diabetes treatment. Pharmacol Rev, 2008. 60(4): p. 470-512.

91. Kolterman, O.G., et al., Pharmacokinetics, pharmacodynamics, and safety of exenatide in patients with type 2 diabetes mellitus. Am J Health Syst Pharm, 2005. 62(2): p. 173-81.

92. Briones, M. and M. Bajaj, Exenatide: a GLP-1 receptor agonist as novel therapy for Type 2 diabetes mellitus. Expert Opin Pharmacother, 2006. 7(8): p. 1055-64.

93. Iltz, J.L., et al., Exenatide: an incretin mimetic for the treatment of type 2 diabetes mellitus. Clin Ther, 2006. 28(5): p. 652-65.

94. Lam, S. and S. See, Exenatide: a novel incretin mimetic agent for treating type 2 diabetes mellitus. Cardiol Rev, 2006. 14(4): p. 205-11.

95. Nicolucci, A. and M.C. Rossi, Incretin-based therapies: a new potential treatment approach to overcome clinical inertia in type 2 diabetes. Acta Biomed, 2008. 79(3): p. 184-91.

96. Ahmed, M., E. Grapengiesser, and B. Hellman, Amino acid transformation of oscillatory Ca2+ signals in mouse pancreatic beta-cells. J Endocrinol, 1999. 160(2): p. 191-5.

97. DeFronzo, R.A., Pathogenesis of type 2 (non-insulin dependent) diabetes mellitus: a balanced overview. Diabetologia, 1992. 35(4): p. 389-97.

98. DeFronzo, R.A., R.C. Bonadonna, and E. Ferrannini, Pathogenesis ofNIDDM. A balanced overview. Diabetes Care, 1992. 15(3): p. 318-68.

99. Bailey, C.J. and R.C. Turner, Metformin. N Engl J Med, 1996. 334(9): p. 574-9.

100. Wollen, N. and C.J. Bailey, Inhibition of hepatic gluconeogenesis by metformin. Synergism with insulin. Biochem Pharmacol, 1988. 37(22): p. 4353-8.

101. Johnson, A.B., et al., The impact of metformin therapy on hepatic glucose production and skeletal muscle glycogen synthase activity in overweight type II diabetic patients. Metabolism, 1993. 42(9): p. 1217-22.

102. Stumvoll, M., et al., Metabolic effects of metformin in non-insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med, 1995. 333(9): p. 550-4.

103. Radziuk, J., et al., Effects of metformin on lactate uptake and gluconeogenesis in the perfused rat liver. Diabetes, 1997. 46(9): p. 1406-13.

104. He, L., et al., Metformin and insulin suppress hepatic gluconeogenesis through phosphorylation of CREB binding protein. Cell, 2009.137(4): p. 635-46.

105. Modi, P., Diabetes beyond insulin: review of new drugs for treatment of diabetes mellitus. Curr Drug Discov Technol, 2007. 4(1): p. 39-47.

106. Florkowski, C.M., Management of co-existing diabetes mellitus and dyslipidemia: defining the role of thiazolidinediones. Am J Cardiovasc Drugs, 2002. 2(1): p. 15-21.

107. Noble, J., M.O. Baerlocher, and J. Silverberg, Management of type 2 diabetes mellitus. Role of thiazolidinediones. Can Fam Physician, 2005. 51: p. 683-7.

108. Diani, A.R., et al., Pioglitazone preserves pancreatic islet structure and insulin secretory function in three murine models of type 2 diabetes. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2004. 286(1): p. El 16-22.

109. Zeender, E., et al., Pioglitazone and sodium salicylate protect human beta-cells against apoptosis and impairedfunction induced by glucose and interleukin-lbeta. J Clin Endocrinol Metab, 2004. 89(10): p. 5059-66.

110. Peraldi, P., M. Xu, and B.M. Spiegelman, Thiazolidinediones block tumor necrosis factor-alpha-induced inhibition of insulin signaling. J Clin Invest, 1997. 100(7): p. 1863-9.

111. Aljabri, K., S.E. Kozak, and D.M. Thompson, Addition of pioglitazone or bedtime insulin to maximal doses of sulfonylurea and metformin in type 2 diabetes patients with poor glucose control: a prospective, randomized trial. Am J Med, 2004.116(4): p. 230-5.

112. Roden, M., et al., Non-insulin-like action of sodium orthovanadate in the isolated perfused liver of fed, non-diabetic rats. Diabetologia, 1993. 36(7): p. 602-7.

113. Brichard, S.M., W. Okitolonda, and J.C. Henquin, Long term improvement of glucose homeostasis by vanadate treatment in diabetic rats. Endocrinology, 1988.123(4): p. 2048-53.

114. Domingo, J.L., et al., Improvement of glucose homeostasis by oral vanadyl or vanadate treatment in diabetic rats is accompanied by negative side effects. Pharmacol Toxicol, 1991. 68(4): p. 249-53.

115. Srivastava, A.K., Anti-diabetic and toxic effects of vanadium compounds. Molecular and Cellular Biochemistry, 2000. 206(1): p. 177-182.

116. Yadav, U.C., K. Moorthy, and N.Z. Baquer, Effects of sodium-orthovanadate and Trigonella foenum-graecum seeds on hepatic and renal lipogenic enzymes and lipid profile during alloxan diabetes. J Biosci, 2004. 29(1): p. 81-91.

117. Ezaki, O., The insulin-like effects of selenate in rat adipocytes. J Biol Chem, 1990. 265(2): p. 1124-8.

118. Shisheva, A., D. Gefel, and Y. Shechter, Insulinlike effects of zinc ion in vitro and in vivo. Preferential effects on desensitized adipocytes and induction of normoglycemia in streptozocin-induced rats. Diabetes, 1992. 41(8): p. 982-8.

119. Baquer, N.Z., et al., The modifying effect of manganese on the enzymic profiles and pathways of carbohydrate metabolism in rat liver and adipose tissue during development. Biochem Biophys Res Commun, 1975. 62(3): p. 634-641.

120. Fowden, L., H.M. Pratt, and A. Smith, 4-Hydroxyisoleucine from seed of Trigonella foenum-graecum. Phytochemistry, 1973. 12(7): p. 1707-1711.

121. Alcock, N.W., et al., Stereochemistry of the 4-hydroxyisoleucine from Trigonella foenum-graecum. Phytochemistry, 1989. 28(7): p. 6.

122. Broca, C., et al., Insulinotropic agent ID-1101 (4-hydroxyisoleucine) activates insulin signaling in rat. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2004. 287(3): p. E463-71.

123. Broca, C., et al., 4-Hydroxyisoleucine: experimental evidence of its insulinotropic and antidiabetic properties. Am J Physiol, 1999. 277(4 Pt 1): p. E617-23.

124. Broca, C., et al., 4-Hydroxyisoleucine: effects of synthetic and natural analogues on insulin secretion. Eur J Pharmacol, 2000. 390(3): p. 339-45.

125. Haeri, M.R., et al., The effect offenugreek 4-hydroxyisoleucine on liver function biomarkers and glucose in diabetic and fructose-fed rats. Phytother Res, 2009. 23(1): p. 61-4.

126. Sergent, D., et al., Synthesis ofhydantoin analogues of (2S,3R,4S)-4-hydroxyisoleucine with insulinotropicproperties. Bioorg Med Chem Lett, 2008. 18(15): p. 4332-5.

127. Kodera, T., et al., A novel l-isoleucine hydroxylating enzyme, l-isoleucine dioxygenase from Bacillus thuringiensis, produces (2S,3R,4S)-4-hydroxyisoleucine. Biochem Biophys Res Commun, 2009. 390(3): p. 506-10.

128. Katashkina Zh, I., et al., [Tuning of expression level of the genes of interest located in the bacterial chromosome]. Mol Biol (Mosk), 2005. 39(5): p. 823-31.

129. Datsenko, K.A. and B.L. Wanner, One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sei USA, 2000. 97(12): p. 6640-5.

130. Szyperski, T., et al., Support of 1H NMR assignments in proteins by biosynthetically directedfractional 13C-labeling. J Biomol NMR, 1992. 2(4): p. 323-34.

131. Cavanagh, J., Protein NMR spectroscopy : principles and practice. 2. ed. 2007, Burlington, MA: Elsevier Academic Press, xxv, 885 s.

132. Shaka, A.J., P.B. Barker, and R. Freeman, Computer-optimized decoupling scheme for wideband applications and low-level operation. Journal of Magnetic Resonance (1969), 1985. 64(3): p. 547-552.

133. Bartels, C., et al., The program XEASYfor computer-supported NMR spectral analysis of biological macromolecules. JBiomol NMR, 1995. 6(1): p. 1-10.

134. Szyperski, T., Biosynthetically directedfractional 13C-labeling of proteinogenic amino acids. An efficient analytical tool to investigate intermediary metabolism. Eur J Biochem, 1995. 232(2): p. 433-48.

135. Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis, Molecular cloning: A laboratory manual 1-3. 2.ed. ed. 1989, Cold Spring Harbor,N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Forsk.pag.

136. Peredelchuk, M.Y. and G.N. Bennett, A method for construction of E. coli strains with multiple DNA insertions in the chromosome. Gene, 1997. 187(2): p. 231-8.

137. Haldimann, A. andB.L. Wanner, Conditional-replication, integration, excision, and retrieval plasmid-host systems for gene structure-function studies of bacteria. J Bacterid, 2001.183(21): p. 6384-93.

138. Govorun, V.M., et al., Comparative analysis ofproteome maps of Helicobacter pylori clinical isolates. Biochemistry (Mosc), 2003. 68(1): p. 42-9.

139. Cohen, S.A. and D.P. Michaud, Synthesis of a Fluorescent Derivatizing Reagent, 6-Aminoquinolyl-N-Hydroxysuccinimidyl Carbamate, and Its Application for the Analysis of Hydrolysate Amino Acids via High-Performance Liquid Chromatography. Anal Biochem, 1993. 211(2): p. 279-287.

140. Ogawa, J., et al., Synthesis of 4-hydroxyisoleucine by the aldolase-transaminase coupling reaction and basic characterization of the aldolase from Arthrobacter simplex AKU626. Biosci Biotechnol Biochem, 2007. 71(7): p. 1607-15.

141. Smirnov, S.V., et al., A novel strategy for enzymatic synthesis of 4-hydroxyisoleucine: identification of an enzyme possessing HMKP (4-hydroxy-3-methyl-2-keto-pentanoate) aldolase activity. FEMS Microbiol Lett, 2007. 273(1): p. 70-7.

142. Haefele, C., C. Bonfils, and Y. Sauvaire, Characterization of a dioxygenase from Trigonella foenum-graecum involved in 4-hydroxyisoleucine biosynthesis. Phytochemistry, 1997. 44(4): p. 563-6.

143. Hausinger, R.P., Fell/alpha-ketoglutarate-dependent hydroxylases and related enzymes. Crit Rev Biochem Mol Biol, 2004. 39(1): p. 21-68.

144. Shibasaki, T., et al., Microbial proline 4-hydroxylase screening and gene cloning. Appl Environ Microbiol, 1999. 65(9): p. 4028-31.

145. Shibasaki, T., H. Mori, and A. Ozaki, Enzymatic production of trans-4-hydroxy-L-proline by regio- and stereospecific hydroxylation of L-proline. Biosci Biotechnol Biochem, 2000. 64(4): p. 746-50.

146. Samsonova, N.N., et al., Identification of Escherichia coli K12 YdcW protein as a gamma-aminobutyraldehyde dehydrogenase. FEBS Lett, 2005. 579(19): p. 410712.

147. Lane, C.S., Mass spectrometry-basedproteomics in the life sciences. Cellular and Molecular Life Sciences, 2005. 62(7): p. 848-869.

148. Creaghan, I.T. and J.R. Guest, Succinate dehydrogenase-dependent nutritional requirement for succinate in mutants of Escherichia coli K12. J Gen Microbiol, 1978.107(1): p. 1-13.

149. Wolfe, A.J., The acetate switch. Microbiol Mol Biol Rev, 2005. 69(1): p. 12-50.

150. Adams, M.D., et al., Nucleotide sequence and genetic characterization reveal six essential genes for the LIV-I and LS transport systems of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry, 1990. 265(20): p. 11436-11443.

151. Stucky, K., et al., Cloning and characterization ofbrnQ, a gene encoding a low-affinity, branched-chain amino acid carrier in Lactobacillus delbruckii subsp. lactis DSM7290. Mol Gen Genet, 1995. 249(6): p. 682-90.

152. Tauch, A., et al., Isoleucine uptake in Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 is directed by the brnQ gene product. Arch Microbiol, 1998.169(4): p. 303-12.

153. Sauer, U., et al., The soluble and membrane-bound transhydrogenases UdhA and PntAB have divergent functions in NADPH metabolism of Escherichia coli. J Biol Chem, 2004. 279(8): p. 6613-9.