Роль транскрипционного фактора Prep1 в регуляции глюконеогенеза в клетках печени тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Кулебякин, Константин Юрьевич

• Кулебякин, Константин Юрьевич
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Кулебякин, Константин Юрьевич

Оглавление

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Гомеостаз глюкозы в организме

1.2. Глюкостатическая функция печени

1.3. Глюконеогенез

1.4. Сигнальный каскад инсулина

1.5. FOXO1

1.6. Гомеобоксные белки TALE

1.7. Транскрипционный фактор Prep1

2. Материалы и методы

2.1. Получение клеточной линии HepG2, несущей нокаут гена Prep 1

2.2. Мышиная линия несущая селективный нокаут Prep1 в гепатоцитах

2.3. Выделение первичной культуры гепатоцитов мыши

2.4. Измерение продукции глюкозы

2.5. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле

2.6. Электрофорез по Лэммли

2.7. Вестерн блоттинг

2.8. Иммунохимическое окрашивание нитроцеллюлозных мембран после Вестерн-блоттинга

2.9. Получение и иммуногистохимическое окрашивание срезов печени

2.10. Иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов первичной культуры гепатоцитов

2.11. Анализ уровня экспрессии генов методом обратной транскрипции, совмещенной с ПЦР в реальном времени

2.12. Статистический анализ результатов

3. Результаты и их обсуждение

3.1. Получение и анализ клеточных линий HepG2, содержащих нокаут Prep!

3.2. Prepl не влияет на инсулиновый сигнальный каскад в клетках печени

3.3. Prep 1 снижает влияние инсулина на глюконеогенез в гепатоцитах

3.4. Prepl вовлечен в регуляцию экспрессии генов белков глюконеогенеза в печени

3.5. Prepl регулирует ядерную локализацию транскрипционного фактора FOXO1

3.6. Prepl регулирует активность сигнального каскада Wnt/бета-катенина

4. Заключение

5. Выводы

6. Список литературы

Список сокращений

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГбФаза - глюкозо-6-фосфатаза

ДСН - додецилсульфат натрия

ПЦР - поличеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль

СД2Т - сахарный диабет второго типа

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан

цАМФ - циклический аденозин-монофосфат

ЭБС - эмбриональная бычья сыворотка

ФЕП - фосфоенол-пируват

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Alb - сывороточный альбумин

Akt - протеинкиназа Б

DMEM - Среда Игла в модификации Дульбекко (Dulbecco's modified Eagle's medium) FOXO1 - forkhead box protein O1

HEPES - (4-(2-оксиэтил)1-пиперазин этансульфоновая кислота IKK - киназа ингибитора каппа Б

IRS-1 - Белок субстрат инсулинового рецептора (Insulin receptor substrate)

JNK - протеинкиназа c-Jun

LB - питательная среда Луриа-Бертани

PI3K - фосфоинозитид-3-киназа

TALE - семейство с удлинением на 3 аминокислоты (three amino acids loop extension) TBST - трис-солевой буфер с добавлением полисорбата 20 (Tween 20) WT - образцы дикого типа (wild type)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль транскрипционного фактора Prep1 в регуляции глюконеогенеза в клетках печени»

Введение

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности.

В развитых и развивающихся странах сахарный диабет второго типа (СД2Т) относится к основным социально-значимым заболеваниям [77]. Одной из причин данного заболевания является избыточная продукция глюкозы печенью (и, как следствие, гипергликемия), вызванная нарушением инсулиновой чувствительности. В физиологических условиях прием пищи и последующее повышение уровня сахара в плазме крови вызывают секрецию инсулина поджелудочной железой [98]. Действие инсулина приводит к усилению поглощения глюкозы тканями, а также к прекращению продукции глюкозы печенью. Таким образом, в крови поддерживается стабильный уровень глюкозы [99]. Развитие инсулинорезистентности ведет к потере печенью способности адаптироваться под текущие потребности метаболизма глюкозы и, как следствие, к неконтролируемой продукции глюкозы гепатоцитами. Механизмом, лежащим в основе хронической избыточной продукции глюкозы, является гиперэкспрессия основных ферментов глюконеогенеза - фосфоенолпируват-карбоксикиназы (ФЕП-карбоксикиназа) и глюкозо-6-фосфатазы (Г-6-фосфатаза) [37, 112].

За последнее время было найдено множество новых, ранее неизвестных белков-регуляторов инсулиновой чувствительности. К числу таких белков относится транскрипционный фактор Prepl. Этот белок принадлежит к семейству гомеобокс-содержащих транскрипционных факторов TALE, известных, в первую очередь, участием в контроле эмбрионального развития организма [35]. Тем не менее, в последнее время появляются новые данные о том, что Prep 1 может быть вовлечен в контроль инсулиновой чувствительности мышечной и жировой ткани [2, 23]. Эти данные позволяют рассматривать Prepl как новый регулятор инсулинового сигнального каскада и потенциальную мишень для контроля инсулиновой чувствительности в организме. В то же время пока нет однозначных данных о вовлеченности Prepl в контроль инсулиновой чувствительности в гепатоцитах. Кроме того, не установлен механизм этого влияния. Учитывая, что именно печень является основным органом, обеспечивающим поддержание гомеостаза глюкозы в организме, изучение роли и механизма участия Prepl в контроле инсулиновой

чувствительности гепатоцитов приобретает особую важность. В связи с этим целью данной работы является создание модели изучения функций транскрипционного фактора Prepl в гепатоцитах, а также установление молекулярного механизма участия Prep 1 в регуляции инсулиновой чувствительности клеток.

Цели и задачи работы.

Целью данной работы было выяснить возможное участие транскрипционного фактора Prepl в регуляции продукции глюкозы печенью. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Создать модель изучения функции Prep 1 в клетках печени.

2. Установить влияние Prepl на активность ключевых ферментов, ответственных за синтез глюкозы в печени.

3. Установить механизм участия Prepl в регуляции чувствительности гепатоцитов к инсулину.

Научная новизна

В ходе выполнения работы была создана новая модельная линия животных, несущих тканеспецифичный нокаут белка Prepl в клетках печени. Кроме того, были получены новые стабильные клеточные линии на основе клеток печени, несущие нокаут белка Prepl Используя эти две экспериментальные модели, мы впервые показали влияние транскрипционного фактора Prep1 на обмен глюкозы в печени, а

и u t-v

также установили возможный механизм этого действия. В частности, мы обнаружили, что Pep1 ослабляет действие инсулина на продукцию и высвобождение глюкозы гепатоцитами. При этом эффект Prepl реализуется не через регуляцию инсулинового сигнального каскада, а через контроль локализации и внутриклеточной стабильности мастер-регулятора фактора глюконеогенеза Foxol и экспрессии ряда участников сигнального каскада Wnt, таких как Wnt3 и Wnt6.

Теоретическая и практическая значимость

В ходе выполнения работы был описан ранее неизвестный механизм регуляции глюконеогенеза в печени. Установленная роль транскрипционного фактора Prep 1 в контроле инсулиновой чувствительности и обмена глюкозы в печени позволяет рассматривать его как потенциальную мишень для разработки новых подходов к терапии сахарного диабета 2 типа.

Работа выполнена при финансовой поддержке Гранта РНФ 14-35-00026 «Сахарный диабет 2 типа и метаболический синдром: выяснение молекулярных механизмов, ключевых сигнальных путей и транскрипционных факторов с целью определения биомишеней для новых лекарственных средств».

Методология и методы исследования

Путем скрещивания животных, несущих lox-P участки в гене Prepl, и трансгенных животных, экспрессирующих рекомбиназу Cre под промотором сывороточного альбумина, получены животные, несущие селективный нокаут гена Prep 1 в гепатоцитах. Для получения стабильных клеточных линий, несущих нокаут Prep1, были использованы ретровирусные векторы, содержащие конструкции, кодирующие shPHK, специфичные к мРНК гена Prep1. Для анализа продукции глюкозы гепатоцитами нами была использована двойная ферментная система, содержащая глюкозооксидазу и пероксидазу. Анализ уровня внутриклеточных мРНК проводился при помощи метода обратной транскрипции с последующим ПЦР в реальном времени. Для анализа внутриклеточного уровня белков нами были использованы методы иммуногистохимии иммуноцитофлуоресценции и вестерн блоттинга.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Установлено, что Prepl участвует в регуляции процесса глюконеогенеза в печени. Prepl ослабляет эффект инсулина на продукцию глюкозы гепатоцитами. При этом Prep 1 не влияет на активацию глюконеогенеза через сигнальный каскад цАМФ.

2. Prepl не влияет на активность и передачу сигнала через сигнальный каскад инсулинового рецептора.

3. Prep 1 контролирует внутриклеточную концентрацию и локализацию Foxo 1 -мастер-регулятора глюконеогенеза. Влияние Prepl на Foxol и последующая транскрипционная регуляция глюконеогенеза, возможно, осуществляются посредством сигнального каскада Wnt/ß-катенина.

Степень достоверности и апробация работы.

Научные положения и выводы, сформулированные автором в диссертации основаны на изучении достаточного объема экспериментального материала и применении современных методов для анализа полученных данных. Основные положения диссертации были опубликованы в рецензируемых российских и зарубежных научных журналах. Результаты диссертационной работы были представлены на III Национальном Конгрессе по Регенеративной Медицине. Результаты исследований были доложены и обсуждены на заседании кафедры биохимии и молекулярной медицины факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова; полученные результаты исследований включены в отчеты факультета фундаментальной медицины по гранту РНФ 14-35-00026 «Сахарный диабет 2 типа и метаболический синдром: выяснение молекулярных механизмов, ключевых сигнальных путей и транскрипционных факторов с целью определения биомишеней для новых лекарственных средств».

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ в российских и международных научных изданиях, из них: 3 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в список ВАК и 3 публикации в сборниках материалов научных конференций.

1. Обзор литературы

1.1. Гомеостаз глюкозы в организме

Гомеостаз - способность организма поддерживать постоянство своей внутренней среды - обеспечивается на клеточном уровне динамическим уравновешиванием процессов поступления и запасания в клетке веществ и энергии, а также выведения продуктов распада. Потоки веществ и энергии не всегда строго соответствуют потребностям организма и могут как существенно превышать их, так и быть значительно менее интенсивными, чем требуется. Соответственно этому организм способен менять интенсивность катаболических и анаболических процессов. В некоторых случаях (к примеру, при интенсивной деятельности или при голодании) организм может подвергать распаду свои собственные молекулы, такие как липиды и белки мышц, для поддержания процессов синтеза жизненно важных соединений, например, нуклеиновых кислот или глюкозы, постоянный приток которой необходим для нормальной жизнедеятельности мозга [1].

В многоклеточном организме энергетические потребности разных клеток, как правило, различаются, и определенная группа клеток может нуждаться в экстренном притоке энергии и питательных веществ (к примеру, при совершении мышечной работы с высокой нагрузкой или в случае стрессовой мобилизации организма). Cнабжение энергией нуждающихся тканей (в данном случае мозга и мышц), происходит за счет энергетических резервов печени и жировой ткани и строго регулируется нейрогуморальными механизмами. Таким образом, в конечном счете реализуется адаптация организма к меняющимся условиям окружающей среды.

1.2. Глюкостатическая функция печени.

Ключевым органом для обмена углеводов, обеспечивающим поддержание постоянного уровня глюкозы в кровотоке, является печень. От бесперебойного поддержания уровня глюкозы в крови критически зависит функционирование ряда тканей (нервная ткань [49], эритроциты [125], эндотелий [38]) В период голодания или при стрессе поступление глюкозы из гепатоцитов в кровоток способствует

обеспечению энергетических потребностей организма наряду с мобилизацией триацилглицеридов из жировой ткани [14]. Поэтому подстройка процессов синтеза, запасания и распада углеводов в гепатоцитах под текущие потребности организма строго контролируется как аллостерически, так и гормонально [78, 81].

В постабсорбтивный период уровень глюкозы в плазме крови снижается. Это приводит к активации а-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы, в результате чего а-клетки продуцируют и секретируют в системный кровоток гормон глюкагон [40]. Этот гормон активирует процессы распада гликогена и реакции глюконеогенеза, а также (посредством транскрипционной регуляции) способствует более интенсивному выходу глюкозы из гепатоцитов. Все эти эффекты обеспечивают поддержание достаточно высокого уровня глюкозы в плазме крови [52].

После приема пищи (в абсорбтивный период) происходит повышение уровня глюкозы в крови, что активирует сигнальный каскад сенсора глюкозы в |3-клетках островков Лангерганса в поджелудочной железе и в конечном счете стимулирует высвобождение этими клетками инсулина [98]. Связывание инсулина со своим рецептором на поверхности гепатоцитов подавляет в них продукцию и глюкозы, и ее высвобождение в кровоток. Одновременно с этим инсулиновый сигнальный каскад приводит к стимуляции катаболических превращений глюкозы и запасания энергии глюкозы в виде гликогена и триацилглицеридов [99]. Перейдем к более детальному рассмотрению реакций синтеза и распада глюкозы в клетках печени и регуляции этих процессов.

1.3. Глюконеогенез

В промежутках между приемами пищи (в постабсорбтивные периоды) гепатоциты поддерживают уровень глюкозы в крови за счет расщепления гликогена и высвобождения получившейся в результате глюкозы [22]. Печеночные запасы гликогена при этом истощаются в течение нескольких часов. В периоды более длительного голодания основную основную функцию по поддержанию уровня глюкозы в крови выполняет глюконеогенез. Глюконеогенез - процесс образования

глюкозы из неуглеводных предшественников (глицерол, пируват, лактат, углеродные скелеты некоторых аминокислот). Этот процесс является критическим для поддержания нормального функционирования организма при длительном голодании [97]. Субстраты глюконеогенеза поставляются в печень с кровотоком или синтезируются самими гепатоцитами (Рис. 1).

Рис.1. Схема процессов обмена глюкозы в гепатоцитах [1].

Предшественником глюкозы при глюконеогенезе является оксалоацетат, который синтезируется из пирувата в ходе реакции, катализируемой пируваткарбоксилазой, либо поставляется из цикла Кребса или образуется в процессе распада некоторых аминокислот (т.н. глюкогенных или глюкокетогенных аминокислот). Полученный оксалоацетат под действием фермента фосфоенолпируват-карбоксикиназы, или ФЕП-карбоксикиназы, превращается в фосфоенолпируват. ФЕП-карбоксикиназа является одним из ключевых ферментов глюконеогенеза. Лабораторные мыши, несущие генетический нокаут ФЕП-карбоксикиназы, погибают на третий день постнатального периода [105]. Линейные мыши, у которых нокаут ФЕП-карбоксикиназы произведен только в печени, после рождения сохраняют жизнеспособность, но страдают от стеатоза печени. Гепатоциты этих животных, будучи лишены способности конвертировать в глюкозу

лактат и продукты катаболизма аминокислот, избыточно накапливают в себе эти метаболиты, что приводит к поражению печени [15].

Активность ФЕП-карбоксикиназы в клетке в основном за счет изменения числа копий этого фермента. В первую очередь, это происходит за счет регуляции синтеза этого фермента под действием гормонов. Промотор гена ФЕП-карбоксикиназы содержит множество регуляторных элементов (например, чувствительных к действию инсулина, глюкокортикоидов, цАМФ) [127]. Помимо транскрипционной регуляции, ФЕП-карбоксикиназа подвергается протеасомальной деградации: в реакции, катализируемой ацетилтрансферазой р300, происходит мечениие ФЕП-карбоксикиназы убиквитином, после чего меченный белок направляется в протеасому [53].

Фосфоенолпируват претерпевает серию биохимических превращений, результатом которых является образование фруктозо-2,6-бисфосфата. Фруктозо-2,6-бисфосфатпод действием фруктозо-2,6-бисфосфатазы превращается во фруктозо-6-фосфат, который затем подвергается изомеризации с образованием глюкозо-6-фосфата. Последний транспортируется в ЭПР, где дефосфорилируется в реакции, катализируемой глюкозо-6-фосфатазой. Недостаточность глюкозо-6-фосфатазы приводит к развитию болезни Гирке - заболевания, для которого характерными симптомами являются гипогликемия, гипертриглицеридемия, стеатоз печени и лактацидоз [69]. Дефосфорилирование Г6Ф является скорость-лимитирующей реакцией для процессов глюконеогенеза и гликолиза. Поэтому активность глюкозо-6-фосфатазы, которая во многом определяет скорость прохождения реакций гликолиза и глюконеогенеза, также находится в клетке под строгим контролем. При этом, как и в случае с ФЕП-карбоксикиназой, активность глюкозо-6-фосфатазы регулируется посредством изменения уровня экспрессии этого фермента в результате связывания коактиваторов и гормон-чувствительных факторов транскрипции с промотором гена Г6Ф [46].

Реакции глюконеогенеза в гепатоцитах контролируются различными механизмами, которые можно условно разделить на регуляцию посредством посттрансляционных модификаций и транскрипционную регуляцию.

К посттрансляционным механизмам регуляции относятся изменение скорости реакции за счет изменения эффективной концентрации ее субстратов, а также механизмы регуляция активности ферментов за счет внесения посттрансляционных модификация в молекулу фермента или за счет связывания с аллостерическими регуляторами. Наличие посттрансляционных механизмов контроля позволяет быстро (десятки минут) подстроить метаболизм глюкозы под изменяющиеся потребности организма. Под претрансляционными механизмами подразумевается регуляция экспрессии генов ключевых (регуляторных) ферментов под воздействием транскрипционных факторов, которые, в свою очередь, контролируются гормональными сигналами. Претрансляционная регуляция требует для своего осуществления более длительных периодов времени (часы). Адаптация метаболизма гепатоцитов под энергетические потребности организма в тех или иных условиях регулируется с помощью каскадов внутриклеточной сигнализации, основными из которых являются инсулиновый сигнальный каскад и сигнальный каскад, запускаемый глюкагоном.

1.4. Сигнальный каскад инсулина

V

инсулин

Плазы атнч еская мембрана

Цитоплазма

Пролиферация и рост клеток.

подавление глюконеогенеза

Синтез гликогена

Синтез белков

Рис.2 Схема сигнального каскада инсулина.

На рис.2 представлена схема инсулинового сигнального каскада в клетках печени. Инсулин является пептидным гормоном, состоящим из 51 аминокислоты. В его структуре выделяют короткую А-цепь, состоящую из 21 аминокислоты и B-цепь, состоящую из 30 аминокислот, Две эти цепи соединяются дисульфидными связями [100]. Инсулин секретируется Р-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы в ответ на повышение уровня глюкозы в плазме крови [98]. Связываясь со своим рецептором на мембране клеток, инсулин запускает сигнальный каскад, ответственный за регуляцию клеточного метаболизма и пролиферации [80]. Основными физиологическими эффектами инсулина на клетки являются: усиление входа глюкозы в клетки в мышечной и жировой ткани за счет встраивания в плазматическую мембрану переносчика глюкозы GLUT4 [113], репрессия глюконеогенеза и высвобождения глюкозы в клетках печени [90], активация синтеза гликогена [108], жирных кислот [119] и белков [86].

Рецептор инсулина относится к группе рецепторных тирозиновых киназ, к подсемейству, включающему в себя также рецептор инсулиноподобного фактора роста и рецептор, связанный с инсулиновым рецептором [107]. Рецептор инсулина является крупным трансмембранным гликопротеином, состоящим из двух а-субъединиц, массой 135 кДа и двух Р-субъединиц массой 95 кДа, связанных дисульфидными связями и формирующими гетеротетрамерсо стехиометрией а2Р2 [117]. Обе субъединицы являются продуктами протеолитического расщепления прорецептора, синтезирующегося с гена, расположенного на 19 хромосоме [103]. Связывание инсулина с рецептором обеспечивается а-субъединицами, расположенными внеклеточно. Помимо участия в связывании инсулина, а-субъединицы ингибируют каталитическую активность Р-субъединиц в отсутствие инсулина. Связывание гормона с а-субъединицами приводит к изменению конформации рецептора, что ведет к восстановлению киназной активности Р-субъединиц и их последующему трансфосфорилированию [54].

Белок субстрат инсулинового рецептора (IRS-1) был впервые описан в 1985 году как белок с кажущейся молекулярной массой в 185 кДа, фосфорилирующийся в ответ на активацию инсулинового рецептора [123]. Позднее было установлено, что молекулярная масса IRS-1 составляет 132 кДа, а изменение его подвижности

опосредуется обильным фосфорилированием по остаткам серина [111]. IRS играет ключевую роль в передаче сигнала и регуляции инсулинового сигнального каскада. Известно, что нокаут IRS-1 ведет к пре- и постнатальному нарушению развития, инсулиновой резистентности в тканях и нарушению толерантности к глюкозе [115]. В норме функционирование белка IRS-1 определяется его фосфорилированием. Данный белок содержит множественные участки фосфорилирования (Рис.3) как по остаткам тирозина (16 участков), так и по остаткам серина/треонина (более 30, на схеме не представлены) [122]. Фосфорилирование по остаткам серина и тирозина играет различную роль в функционировании данного белка и инсулинового каскада в целом. Так, хорошо известно, что фосфорилирование IRS под действием инсулинового рецептора по остатку тирозина Y608, а также дополнительно по остаткам Y460 и Y939 обеспечивает связывание 85-кДа регуляторной субъединицы фосфоинозитид-3 киназы (PI3K), что приводит к последующей активации этой киназы и передаче сигнала от рецептора инсулина в клетку [7].

Рис.3 Структура белка IRS-1, на схеме отражены участки фосфорилирования белка по остаткам тирозина. Черными стрелками указаны остатки тирозина, опосредующие связывание с 85-кДа регуляторной субъединицей фосфоинозитид-3 киназы [121] с изменениями.

С другой стороны, фосфорилирование белка IRS-1 по остаткам серина/треонина приводит к ингибированию инсулинового сигнального каскада [44]. Например, остаток серина S612 ответственен за ингибирование инсулиновой сигнализации под действием протеинкиназы С [32], а остаток серина S307 определяет ингибирование инсулинового сигнального каскада киназами JNK [96] и IKK [36].

Поскольку фосфорилирование критически важно для функционирования IRS-1, важным классом регуляторных ферментов для него являются фосфопротеин

фосфатазы. В современной литературе особое внимание уделяется таким фосфатазам, как тирозиновая фосфатаза PTP1B [31] и тирозиновая фосфатаза SHP-1 [29]. Известно, что обе эти фосфатазы являются негативными регуляторами инсулиновой сигнализации. Животные, нокаутные по генам этих фосфатаз, характеризуются более высокими уровнями фосфорилирования инсулинового рецептора и IRS-1 по остаткам тирозина, а также обладают повышенной инсулиновой чувствительностью.

Как было сказано выше, активированный IRS-1 способен взаимодействовать с регуляторной субъединицей фосфоинозитид-3 киназы. Фосфоинозитид-3 киназа представляет собой гетеродимер, состоящий из регуляторной субъединицы массой 85 кДа и каталитической субъединицы массой 100 кДа [20]. Этот фермент является критически важным для реализации клеточных эффектов инсулина. Показано, что ингибиторы фосфоинозитид-3 киназы подавляют большинство эффектов инсулина на метаболизм клеток [106]. Взаимодействие регуляторной субъединицы фосфоинозитид-3 киназы с остатками фосфотирозина в IRS-1 (в первую очередь с тирозином Y608 [94]) приводит к активации каталитического домена киназы и, как следствие, к увеличению внутриклеточной концентрации фосфатидилинозитол (3,4,5) трифосфата. Фосфатидилинозитол-трифосфат, в свою очередь, способен связываться с доменом плекстриновой гомологии (PH-домен) в сигнальных молекулах, регулируя их локализацию и активность [33]. В частности, таким образом происходит изменение локализации фосфоинозитид-зависимой киназы (PDK-1), опосредующее ее взаимодействие со своим субстратом протеинкиназой В[5].Активность данного сигнального каскада также может регулироваться посредством баланса синтеза и распада фосфатидилинозитол-трифосфата. Так, гиперэкспрессия фосфатазы SHIP2,расщепляющей фосфатидилинозитол-трифосфат, приводит к повышению чувствительности тканей к инсулину и увеличению активности инсулинового сигнального каскада [25].

Протеинкиназа В (PKB) или Akt, была впервые описана в 1987 году, как трансформирующий агент v-akt в составе мышиного ретровируса вируса AKT8 [110]. В той же работе был описан человечески гомолог гена v-akt - Aktl, который обнаруживался в клетках желудочной аденокарциномы. Основной всплеск интереса

к этой протеинкиназе произошел, когда в 1995 было описано, что она активируется в ответ на инсулин в нормальных клетках [58]. Сейчас уже хорошо установлено, что эта протеинкиназа определяет основные метаболические эффекты инсулина, такие как усиление захвата глюкозы [57], репрессия глюконеогенеза [76, 90], а также усиление синтеза гликогена [26, 27, 63], синтеза жирных кислот [120] и синтеза белка [116].

Akt представляет собой серин/треониновую протеинкиназу молекулярной массой 57 кДа. В ее структуре выделяют N-концевой домен плекстриновой гомологии (РН-домен), киназный домен, а также С-концевой гидрофобный мотив (Рис.4) [118].

При активации фосфоинозитид-3 киназы и увеличении концентрации фосфатидилинозитол-трифосфата происходит его взаимодействие с РН-доменом в составе Akt, что приводит к локализации протеинкиназы на плазматической мембране, а также к изменению ее конформации, что делает возможным взаимодействие с фосфоинозитид-зависимой протеинкиназой PDK-1 и фосфорилирование Akt по остатку треонина T308 [18]. Это фосфорилирование многократно повышает активность Akt, однако для достижения максимальной активации требуется дополнительное фосфорилирование данной протеинкиназы по остатку серина S473 [4], осуществляемое под действием киназы mTORC2 (mammalian target of rapamycin complex 2) [41].

Рис.4 Схема структуры протеинкиназы B.

Активная Akt транспортируется в ядро клетки [6], где она способна фосфорилировать транскрипционные факторы - мишени инсулиновой регуляции.

Ключевым транскрипционным фактором для реализации инсулин-зависимой репрессии глюконеогенеза является транскрипционный фактор FOXO1 [79].

1.5. FOXO1

FOXO1 является одним из представителей группы транскрипционных факторов FOXO, которые, в свою очередь, входят в семейство Forkhead. Особенность транскрипционных факторов этого семейства заключается в способности распознавать особые регуляторные последовательности в промоторных участках генома - т.н. элементы ответа на инсулин (IRE-insulin response elements) [30].

Все белки FOXO играют ключевую роль в регуляции поддержания жизнеспособности клеток и при ответе на стрессовые воздействия. В клетках млекопитающих, помимо FOXO1, имеются также транскрипционные факторы FOXO3, FOXO4, FOXO6 [19]. Все эти белки, за исключением специфичного для нейронов FOXO6 [50], обнаруживаются во множестве тканей [8] и имеют большое число общих генов-эффекторов, помимо своих уникальных транскрипционных мишеней. FOXO1 является одним из ключевых регуляторов инсулиновой чувствительности тканей и процессов глюконеогенеза. [70, 71, 79].

Физиологическая роль транскрипционного фактора FOXO1 была детально изучена с использованием различных модельных линий животных. Так, было показано, что экспрессия конститутивно активной формы этого транскрипционного фактора приводит к развитию у экспериментальных мышей гипергликемии, а также к печеночной инсулиновой резистентности и повышению уровня экспрессии гена глюкозо-6-фосфатазы в гепатоцитах [70, 75]. При селективном нокауте гена FOXO1 в печени, также, как и при экспрессии конститутивно неактивной формы FOXO 1 в ней, у животных наблюдается понижение уровня глюкозы в крови, а также сниженная экспрессия генов глюкозо-6-фосфатазы и ФЕП-карбоксикиназы [71]. У мышей, несущих генетический нокаут по FOXO1, нарушен ангиогенез, что приводит к гибели этих животных во время эмбрионального развития [43]. Этот феномен может объясняться влиянием процессов гликолиза и глюконеогенеза на дифференцировку и прорастание сосудистого эндотелия, которое было установлено

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Кулебякин, Константин Юрьевич, 2017 год

6. Список литературы

1. Кулебякин К.Ю. [и др.]. Механизмы транскрипционного контроля обмена глюкозы в печени // Сахарный Диабет. 2016. № 3 (19). C. 190-198.

2. Пеньков Д.Н. [и др.]. Транскрипционный контроль экспрессии инсулинчувствительного переносчика глюкозы Glut4 в клетках жировой ткани // Доклады Академии наук. 2016. № 5 (467). C. 612-616.

3. Abiola M. [и др.]. Activation of Wnt/beta-catenin signaling increases insulin sensitivity through a reciprocal regulation of Wnt10b and SREBP-lc in skeletal muscle cells. // PloS one. 2009. № 12 (4). C. e8509.

4. Alessi D.R. [и др.]. Mechanism of activation of protein kinase B by insulin and IGF-1. // The EMBO journal. 1996. № 23 (15). C. 6541-51.

5. Alessi D.R. [и др.]. 3-Phosphoinositide-dependent protein kinase-1 (PDK1): structural and functional homology with the Drosophila DSTPK61 kinase. // Current biology: CB. 1997. № 10 (7). C. 776-89.

6. Andjelkovic M. [и др.]. Role of translocation in the activation and function of protein kinase B. // The Journal of biological chemistry. 1997. № 50 (272). C. 31515-24.

7. Backer J.M. [и др.]. Phosphatidylinositol 3'-kinase is activated by association with IRS-1 during insulin stimulation. // The EMBO journal. 1992. № 9 (11). C. 3469-79.

8. Barthel A., Schmoll D., Unterman T.G. FoxO proteins in insulin action and metabolism. // Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 2005. № 4 (16). C. 1839.

9. Berthelsen J. [и др.]. Prep1, a novel functional partner of Pbx proteins. // The EMBO journal. 1998. № 5 (17). C. 1423-33.

10. Berthelsen J. [и др.]. The novel homeoprotein Prep1 modulates Pbx-Hox protein cooperativity. // The EMBO journal. 1998. № 5 (17). C. 1434-45.

11. Bertolino E. [и др.]. A novel homeobox protein which recognizes a TGT core and functionally interferes with a retinoid-responsive motif. // The Journal of biological chemistry. 1995. № 52 (270). C. 31178-88.

12. Bock K. De [h gp.]. Role of PFKFB3-driven glycolysis in vessel sprouting. // Cell. 2013. № 3 (154). C. 651-63.

13. Boustead J.N. [h gp.]. Identification and characterization of a cDNA and the gene encoding the mouse ubiquitously expressed glucose-6-phosphatase catalytic subunit-related protein. // Journal of molecular endocrinology. 2004. № 1 (32). C. 33-53.

14. Brooks B.J., Arch J.R., Newsholme E.A. Effect of some hormones on the rate of the triacylglycerol/fatty-acid substrate cycle in adipose tissue of the mouse in vivo. // Bioscience reports. 1983. № 3 (3). C. 263-7.

15. Burgess S.C. [h gp.]. Impaired tricarboxylic acid cycle activity in mouse livers lacking cytosolic phosphoenolpyruvate carboxykinase. // The Journal of biological chemistry. 2004. № 47 (279). C. 48941-9.

16. Burglin T.R. Analysis of TALE superclass homeobox genes (MEIS, PBC, KNOX, Iroquois, TGIF) reveals a novel domain conserved between plants and animals. // Nucleic acids research. 1997. № 21 (25). C. 4173-80.

17. Burglin T.R., Ruvkun G. New motif in PBX genes. // Nature genetics. 1992. № 5 (1). C. 319-20.

18. Calleja V. [h gp.]. Intramolecular and intermolecular interactions of protein kinase B define its activation in vivo. // PLoS biology. 2007. № 4 (5). C. e95.

19. Calnan D.R., Brunet A. The FoxO code. // Oncogene. 2008. № 16 (27). C. 2276-88.

20. Cantley L.C. [h gp.]. Oncogenes and signal transduction. // Cell. 1991. № 2 (64). C. 281-302.

21. Chen H. [h gp.]. Cloning of a novel homeobox-containing gene, PKNOX1, and mapping to human chromosome 21q22.3. // Genomics. 1997. № 2 (41). C. 193-200.

22. Cherrington A.D. Banting Lecture 1997. Control of glucose uptake and release by the liver in vivo. // Diabetes. 1999. № 5 (48). C. 1198-214.

23. Ciccarelli M. [h gp.]. Glucose-induced expression of the homeotic transcription factor Prep1 is associated with histone post-translational modifications in skeletal muscle. // Diabetologia. 2016. № 1 (59). C. 176-86.

24. Cichy S.B. [h gp.]. Protein kinase B/Akt mediates effects of insulin on hepatic insulin-like growth factor-binding protein-1 gene expression through a conserved insulin response sequence. // The Journal of biological chemistry. 1998. № 11 (273). C. 6482-7.

25. Clément S. [h gp.]. The lipid phosphatase SHIP2 controls insulin sensitivity. // Nature. 2001. № 6816 (409). C. 92-7.

26. Cross D.A. [h gp.]. The inhibition of glycogen synthase kinase-3 by insulin or insulin-like growth factor 1 in the rat skeletal muscle cell line L6 is blocked by wortmannin, but not by rapamycin: evidence that wortmannin blocks activation of the mitogen-activated protein kin // The Biochemical journal. 1994. № 1994 (303 ( Pt 1). C. 21-6.

27. Cross D.A. [h gp.]. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by insulin mediated by protein kinase B. // Nature. 1995. № 6559 (378). C. 785-9.

28. Daitoku H. [h gp.]. Silent information regulator 2 potentiates Foxol-mediated transcription through its deacetylase activity. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2004. № 27 (101). C. 10042-7.

29. Dubois M.-J. [h gp.]. The SHP-1 protein tyrosine phosphatase negatively modulates glucose homeostasis. // Nature medicine. 2006. № 5 (12). C. 549-56.

30. Durham S.K. [h gp.]. FKHR binds the insulin response element in the insulin-like growth factor binding protein-1 promoter. // Endocrinology. 1999. № 7 (140). C. 31403146.

31. Elchebly M. [h gp.]. Increased insulin sensitivity and obesity resistance in mice lacking the protein tyrosine phosphatase-1B gene. // Science (New York, N.Y.). 1999. № 5407 (283). C. 1544-8.

32. Fea K. De, Roth R.A. Protein kinase C modulation of insulin receptor substrate-1 tyrosine phosphorylation requires serine 612. // Biochemistry. 1997. № 42 (36). C. 12939-47.

33. Ferguson K.M. [h gp.]. Structural basis for discrimination of 3-phosphoinositides by pleckstrin homology domains. // Molecular cell. 2000. № 2 (6). C. 373-84.

34. Fernandez-Diaz L.C. [h gp.]. The absence of Prep1 causes p53-dependent apoptosis

of mouse pluripotent epiblast cells. // Development (Cambridge, England). 2010. № 20 (137). C. 3393-403.

35. Ferretti E. [h gp.]. Hypomorphic mutation of the TALE gene Prep1 (pKnox1) causes a major reduction of Pbx and Meis proteins and a pleiotropic embryonic phenotype. // Molecular and cellular biology. 2006. № 15 (26). C. 5650-62.

36. Gao Z. [h gp.]. Serine phosphorylation of insulin receptor substrate 1 by inhibitor kappa B kinase complex. // The Journal of biological chemistry. 2002. № 50 (277). C. 48115-21.

37. Gardner L.B., Liu Z., Barrett E.J. The role of glucose-6-phosphatase in the action of insulin on hepatic glucose production in the rat. // Diabetes. 1993. № 11 (42). C. 161420.

38. Goveia J., Stapor P., Carmeliet P. Principles of targeting endothelial cell metabolism to treat angiogenesis and endothelial cell dysfunction in disease // EMBO Molecular Medicine. 2014. № 9 (6). C. 1105-1120.

39. Green M.R., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual / M.R. Green, J. Sambrook, 2012.

40. Gromada J., Franklin I., Wollheim C.B. Alpha-cells of the endocrine pancreas: 35 years of research but the enigma remains. // Endocrine reviews. 2007. № 1 (28). C. 84116.

41. Hers I., Vincent E.E., Tavare J.M. Akt signalling in health and disease. // Cellular signalling. 2011. № 10 (23). C. 1515-27.

42. Hori Y.S. [h gp.]. Regulation of FOXOs and p53 by SIRT1 modulators under oxidative stress. // PloS one. 2013. № 9 (8). C. e73875.

43. Hosaka T. [h gp.]. Disruption of forkhead transcription factor (FOXO) family members in mice reveals their functional diversification. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2004. № 9 (101). C. 2975-80.

44. Hotamisligil G.S. [h gp.]. IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance. // Science (New York, N.Y.). 1996. № 5249 (271). C. 665-8.

45. Huang H., Tindall D.J. Dynamic FoxO transcription factors. // Journal of cell science. 2007. № Pt 15 (120). C. 2479-87.

46. Hutton J.C., O'Brien R.M. Glucose-6-phosphatase catalytic subunit gene family. // The Journal of biological chemistry. 2009. № 43 (284). C. 29241-5.

47. Iotti G. [h gp.]. Homeodomain transcription factor and tumor suppressor Prep1 is required to maintain genomic stability. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2011. № 29 (108). C. E314-22.

48. Iotti G. [h gp.]. Reduction of Prep1 levels affects differentiation of normal and malignant B cells and accelerates Myc driven lymphomagenesis. // PloS one. 2012. № 10 (7). C. e48353.

49. Ivanov A.I. [h gp.]. Glycolysis and oxidative phosphorylation in neurons and astrocytes during network activity in hippocampal slices. // Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 2014. № 3 (34). C. 397-407.

50. Jacobs F.M.J. [h gp.]. FoxO6, a novel member of the FoxO class of transcription factors with distinct shuttling dynamics. // The Journal of biological chemistry. 2003. № 38 (278). C. 35959-67.

51. Jho E. [h gp.]. Wnt/beta-catenin/Tcf signaling induces the transcription of Axin2, a negative regulator of the signaling pathway // Molecular and cellular biology. 2002. № 4 (22). C. 1172-83.

52. Jiang G., Zhang B.B. Glucagon and regulation of glucose metabolism. // American journal of physiology. Endocrinology and metabolism. 2003. № 4 (284). C. E671-8.

53. Jiang W. [h gp.]. Acetylation regulates gluconeogenesis by promoting PEPCK1 degradation via recruiting the UBR5 ubiquitin ligase. // Molecular cell. 2011. № 1 (43). C. 33-44.

54. Kahn C.R. [h gp.]. Direct demonstration that receptor crosslinking or aggregation is important in insulin action. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1978. № 9 (75). C. 4209-13.

55. Kanazawa A. [h gp.]. Association of the gene encoding wingless-type mammary

tumor virus integration-site family member 5B (WNT5B) with type 2 diabetes. // American journal of human genetics. 2004. № 5 (75). C. 832-43.

56. Knoepfler P.S. [h gp.]. Meisl and pKnoxl bind DNA cooperatively with Pbxl utilizing an interaction surface disrupted in oncoprotein E2a-Pbx1. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1997. № 26 (94). C. 14553-8.

57. Kohn A.D. [h gp.]. Expression of a constitutively active Akt Ser/Thr kinase in 3T3-L1 adipocytes stimulates glucose uptake and glucose transporter 4 translocation. // The Journal of biological chemistry. 1996. № 49 (271). C. 31372-8.

58. Kohn a D., Kovacina K.S., Roth R. a Insulin stimulates the kinase activity of RAC-PK, a pleckstrin homology domain containing ser/thr kinase. // The EMBO journal. 1995. № 17 (14). C. 4288-95.

59. Laemmli U.K. (1970): Cleavage of Structural Proteins during Assembly of Head of Bacteriophages // Nature. 1970. (227). C. 680-685.

60. Laurent A. [h gp.]. ChlP-Seq and RNA-Seq analyses identify components of the Wnt and Fgf signaling pathways as Prep1 target genes in mouse embryonic stem cells. // PloS one. 2015. № 4 (10). C. e0122518.

61. Lee J.-M. [h gp.]. AMPK-dependent repression of hepatic gluconeogenesis via disruption of CREB.CRTC2 complex by orphan nuclear receptor small heterodimer partner. // The Journal of biological chemistry. 2010. № 42 (285). C. 32182-91.

62. Li W.-C., Ralphs K.L., Tosh D. Isolation and Culture of Adult Mouse Hepatocytes // Methods in Molecular Biology. 2010. № 4 (633). C. 197-206.

63. Li X. [h gp.]. Akt/PKB regulates hepatic metabolism by directly inhibiting PGC-1alpha transcription coactivator. // Nature. 2007. № 7147 (447). C. 1012-6.

64. Liu H. [h gp.]. Wnt signaling regulates hepatic metabolism. // Science signaling. 2011. № 158 (4). C. ra6.

65. Longobardi E. [h gp.]. Prep1 (pKnox1)-deficiency leads to spontaneous tumor development in mice and accelerates EmuMyc lymphomagenesis: a tumor suppressor role for Prep1. // Molecular oncology. 2010. № 2 (4). C. 126-34.

66. Longobardi E. [h gp.]. Biochemistry of the tale transcription factors PREP, MEIS, and PBX in vertebrates. // Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 2014. № 1 (243). C. 59-75.

67. Lu M. [h gp.]. Insulin regulates liver metabolism in vivo in the absence of hepatic Akt and Foxo1. // Nature medicine. 2012. № 3 (18). C. 388-95.

68. MacDonald B.T., Tamai K., He X. Wnt/beta-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases. // Developmental cell. 2009. № 1 (17). C. 9-26.

69. Marcolongo P. [h gp.]. Multiple roles of glucose-6-phosphatases in pathophysiology: state of the art and future trends. // Biochimica et biophysica acta. 2013. № 3 (1830). C. 2608-18.

70. Matsumoto M. [h gp.]. Dual role of transcription factor FoxO1 in controlling hepatic insulin sensitivity and lipid metabolism. // The Journal of clinical investigation. 2006. № 9 (116). C. 2464-72.

71. Matsumoto M. [h gp.]. Impaired regulation of hepatic glucose production in mice lacking the forkhead transcription factor Foxo1 in liver. // Cell metabolism. 2007. № 3 (6). C. 208-16.

72. Matsuzaki H. [h gp.]. Insulin-induced phosphorylation of FKHR (Foxo1) targets to proteasomal degradation. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2003. № 20 (100). C. 11285-90.

73. McCrea P.D., Turck C.W., Gumbiner B. A homolog of the armadillo protein in Drosophila (plakoglobin) associated with E-cadherin. // Science (New York, N.Y.). 1991. № 5036 (254). C. 1359-61.

74. Mukherjee K., Burglin T.R. Comprehensive analysis of animal TALE homeobox genes: new conserved motifs and cases of accelerated evolution. // Journal of molecular evolution. 2007. № 2 (65). C. 137-53.

75. Nakae J. [h gp.]. Regulation of insulin action and pancreatic beta-cell function by mutated alleles of the gene encoding forkhead transcription factor Foxo1. // Nature genetics. 2002. № 2 (32). C. 245-53.

76. Nakae J., Park B.C., Accili D. Insulin stimulates phosphorylation of the forkhead

transcription factor FKHR on serine 253 through a Wortmannin-sensitive pathway. // The Journal of biological chemistry. 1999. № 23 (274). C. 15982-5.

77. NCD Risk Factor Collaboration (NCD-RisC) Worldwide trends in diabetes since 1980: a pooled analysis of 751 population-based studies with 4.4 million participants. // Lancet (London, England). 2016. № 10027 (387). C. 1513-30.

78. Nordlie R.C., Foster J.D., Lange A.J. Regulation of glucose production by the liver. // Annual review of nutrition. 1999. (19). C. 379-406.

79. O-Sullivan I. [h gp.]. FoxO1 integrates direct and indirect effects of insulin on hepatic glucose production and glucose utilization. // Nature communications. 2015. № May (6). C. 7079.

80. Olivares-Reyes J.A., Arellano-Plancarte A., Castillo-Hernandez J.R. Angiotensin II and the development of insulin resistance: implications for diabetes. // Molecular and cellular endocrinology. 2009. № 2 (302). C. 128-39.

81. Oosterveer M.H., Schoonjans K. Hepatic glucose sensing and integrative pathways in the liver. // Cellular and molecular life sciences : CMLS. 2014. № 8 (71). C. 1453-67.

82. Oriente F. [h gp.]. Prep1 deficiency induces protection from diabetes and increased insulin sensitivity through a p160-mediated mechanism. // Molecular and cellular biology. 2008. № 18 (28). C. 5634-45.

83. Oriente F. [h gp.]. Prep1 controls insulin glucoregulatory function in liver by transcriptional targeting of SHP1 tyrosine phosphatase // Diabetes. 2011. № 1 (60). C. 138-147.

84. Oriente F. [h gp.]. PREP1 deficiency downregulates hepatic lipogenesis and attenuates steatohepatitis in mice. // Diabetologia. 2013. № 12 (56). C. 2713-22.

85. Paddison P.J. [h gp.]. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. // Genes & development. 2002. № 8 (16). C. 948-58.

86. Pause A. [h gp.]. Insulin-dependent stimulation of protein synthesis by phosphorylation of a regulator of 5'-cap function // Nature. 1994. № 6500 (371). C. 762767.

87. Penkov D. [h gp.]. Involvement of Prep1 in the alphabeta T-cell receptor T-lymphocytic potential of hematopoietic precursors. // Molecular and cellular biology. 2005. № 24 (25). C. 10768-81.

88. Petersen C.P., Reddien P.W. Wnt signaling and the polarity of the primary body axis. // Cell. 2009. № 6 (139). C. 1056-68.

89. Postic C. [h gp.]. Dual roles for glucokinase in glucose homeostasis as determined by liver and pancreatic beta cell-specific gene knock-outs using Cre recombinase. // The Journal of biological chemistry. 1999. № 1 (274). C. 305-15.

90. Puigserver P. [h gp.]. Insulin-regulated hepatic gluconeogenesis through FOXO1-PGC-1alpha interaction. // Nature. 2003. № 6939 (423). C. 550-5.

91. Rena G. [h gp.]. Roles of the forkhead in rhabdomyosarcoma (FKHR) phosphorylation sites in regulating 14-3-3 binding, transactivation and nuclear targetting. // The Biochemical journal. 2001. № Pt 3 (354). C. 605-12.

92. Rena G. [h gp.]. Two novel phosphorylation sites on FKHR that are critical for its nuclear exclusion. // The EMBO journal. 2002. № 9 (21). C. 2263-71.

93. Rivera L.B., Bergers G. Angiogenesis. Targeting vascular sprouts. // Science (New York, N.Y.). 2014. № 6191 (344). C. 1449-50.

94. Rocchi S. [h gp.]. Identification by mutation of the tyrosine residues in the insulin receptor substrate-1 affecting association with the tyrosine phosphatase 2C and phosphatidylinositol 3-kinase. // Endocrinology. 1995. № 12 (136). C. 5291-7.

95. Rosa P. Di [h gp.]. The homeodomain transcription factor Prep1 (pKnox1) is required for hematopoietic stem and progenitor cell activity. // Developmental biology. 2007. № 2 (311). C. 324-34.

96. Rui L. [h gp.]. Insulin/IGF-1 and TNF-alpha stimulate phosphorylation of IRS-1 at inhibitory Ser307 via distinct pathways. // The Journal of clinical investigation. 2001. № 2 (107). C. 181-9.

97. Rui L. Energy metabolism in the liver // Comprehensive Physiology. 2014. № 1 (4). C. 177-197.

98. Rutter G.A. [h gp.]. Pancreatic P-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion. // The Biochemical journal. 2015. № 2 (466). C. 203-18.

99. Saltiel A.R., Kahn C.R. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism. // Nature. 2001. № 6865 (414). C. 799-806.

100. Sanger F. Chemistry of insulin; determination of the structure of insulin opens the way to greater understanding of life processes. // Science (New York, N.Y.). 1959. № 3359 (129). C. 1340-4.

101. Sauer B. Functional expression of the cre-lox site-specific recombination system in the yeast Saccharomyces cerevisiae. // Molecular and cellular biology. 1987. № 6 (7). C. 2087-96.

102. Schmoll D. [h gp.]. Regulation of glucose-6-phosphatase gene expression by protein kinase Ba and the Forkhead transcription factor FKHR: Evidence for insulin response unit-dependent and -independent effects of insulin on promoter activity // Journal of Biological Chemistry. 2000. № 46 (275). C. 36324-36333.

103. Seino S., Seino M., Bell G.I. Human insulin-receptor gene. // Diabetes. 1990. № 2 (39). C. 129-33.

104. Sharabi K. [h gp.]. Molecular pathophysiology of hepatic glucose production. // Molecular aspects of medicine. 2015. № 4 (46). C. 21-33.

105. She P. [h gp.]. Phosphoenolpyruvate carboxykinase is necessary for the integration of hepatic energy metabolism. // Molecular and cellular biology. 2000. № 17 (20). C. 6508-17.

106. Shepherd P.R., Nave B.T., Siddle K. Insulin stimulation of glycogen synthesis and glycogen synthase activity is blocked by wortmannin and rapamycin in 3T3-L1 adipocytes: evidence for the involvement of phosphoinositide 3-kinase and p70 ribosomal protein-S6 kinase. // The Biochemical journal. 1995. (305 ( Pt 1). C. 25-8.

107. Shier P., Watt V.M. Primary structure of a putative receptor for a ligand of the insulin family. // The Journal of biological chemistry. 1989. № 25 (264). C. 14605-8.

108. Shulman R.G., Bloch G., Rothman D.L. In vivo regulation of muscle glycogen synthase and the control of glycogen synthesis. // Proceedings of the National Academy

of Sciences of the United States of America. 1995. № 19 (92). C. 8535-42.

109. Smith P.K. [h gp.]. Measurement of protein using bicinchoninic acid. // Analytical biochemistry. 1985. № 1 (150). C. 76-85.

110. Staal S.P. Molecular cloning of the akt oncogene and its human homologues AKT1 and AKT2: amplification of AKT1 in a primary human gastric adenocarcinoma. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1987. № 14 (84). C. 5034-7.

111. Sun X.J. [h gp.]. Structure of the insulin receptor substrate IRS-1 defines a unique signal transduction protein. // Nature. 1991. № 6330 (352). C. 73-7.

112. Sun Y. [h gp.]. Phosphoenolpyruvate carboxykinase overexpression selectively attenuates insulin signaling and hepatic insulin sensitivity in transgenic mice // Journal of Biological Chemistry. 2002. № 26 (277). C. 23301-23307.

113. Suzuki K., Kono T. Evidence that insulin causes translocation of glucose transport activity to the plasma membrane from an intracellular storage site. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1980. № 5 (77). C. 2542-5.

114. Swift S. [h gp.]. Rapid production of retroviruses for efficient gene delivery to mammalian cells using 293T cell-based systems. // Current protocols in immunology. 2001. (Chapter 10). C. Unit 10.17C.

115. Tamemoto H. [h gp.]. Insulin resistance and growth retardation in mice lacking insulin receptor substrate-1. // Nature. 1994. № 6502 (372). C. 182-6.

116. Ueki K. [h gp.]. Potential role of protein kinase B in insulin-induced glucose transport, glycogen synthesis, and protein synthesis. // The Journal of biological chemistry. 1998. № 9 (273). C. 5315-22.

117. Ullrich A. [h gp.]. Human insulin receptor and its relationship to the tyrosine kinase family of oncogenes. // Nature. 1985. № 6005 (313). C. 756-61.

118. Vanhaesebroeck B., Alessi D.R. The PI3K-PDK1 connection: more than just a road to PKB. // The Biochemical journal. 2000. (346 Pt 3). C. 561-76.

119. Viscarra J.A. [h gp.]. Transcriptional activation of lipogenesis by insulin requires phosphorylation of MED17 by CK2. // Science signaling. 2017. № 467 (10). C. 1-12.

120. Wang D., Sul H.S. Insulin stimulation of the fatty acid synthase promoter is mediated by the phosphatidylinositol 3-kinase pathway. Involvement of protein kinase B/Akt. // The Journal of biological chemistry. 1998. № 39 (273). C. 25420-6.

121. White M.F. The IRS-signalling system: a network of docking proteins that mediate insulin action. // Molecular and cellular biochemistry. 1998. № 1-2 (182). C. 3-11.

122. White M.F., Kahn C.R. The insulin signaling system. // The Journal of biological chemistry. 1994. № 1 (269). C. 1-4.

123. White M.F., Maron R., Kahn C.R. Insulin rapidly stimulates tyrosine phosphorylation of a Mr-185,000 protein in intact cells. // Nature. 1985. № 6042 (318). C. 183-6.

124. White M.F., Takayama S., Kahn C.R. Differences in the sites of phosphorylation of the insulin receptor in vivo and in vitro. // The Journal of biological chemistry. 1985. № 16 (260). C. 9470-8.

125. Wijk R. van The energy-less red blood cell is lost: erythrocyte enzyme abnormalities of glycolysis // Blood. 2005. № 13 (106). C. 4034-4042.

126. Wisniewski J.R. [h gp.]. In-depth quantitative analysis and comparison of the human hepatocyte and hepatoma cell line HepG2 proteomes. // Journal of proteomics. 2016. (136). C. 234-47.

127. Yang J. [h gp.]. Aspects of the control of phosphoenolpyruvate carboxykinase gene transcription. // The Journal of biological chemistry. 2009. № 40 (284). C. 27031-5.

128. Yin H.L., Janmey P.A. Phosphoinositide regulation of the actin cytoskeleton. // Annual review of physiology. 2003. № 1 (65). C. 761-89.

129. Zhang W. [h gp.]. FoxO1 regulates multiple metabolic pathways in the liver effects on gluconeogenic, glycolytic, and lipogenic gene expression // Journal of Biological Chemistry. 2006. № 15 (281). C. 10105-10117.

130. Zhao X. [h gp.]. Multiple elements regulate nuclear/cytoplasmic shuttling of

FOXO1: characterization of phosphorylation- and 14-3-3-dependent and -independent mechanisms. // The Biochemical journal. 2004. № Pt 3 (378). C. 839-49.