Участие тирозиновой протеинфосфатазы SHP-1 в передаче сигнала от рецептора инсулина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Кривцов, Андрей Владимирович

• Кривцов, Андрей Владимирович
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кривцов, Андрей Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. РОЛЬ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ ТИРОЗИНОВЫХ ОСТАТКОВ В КЛЕТОЧНОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ.

2. БЕЛКИ УЧАСТВУЮЩИЕ В СИГНАЛИЗАЦИИ ОТ РОСТОВЫХ ФАКТОРОВ.

2.1. Рецепторы ростовых факторов.

2.2. Рецепторы PDGF и EGF.

2.3. Рецептор инсулина.

2.3.2. Уникальность инсулиновой сигнализации.

2.4. Сигнальные белки, расположенные «ниже» рецептора инсулина. МАРкиназный путь.

2.4.1. SH2 домены или SH2 содержащие белки.

2.4.2. Адапторный белок She (Src Homology / Collagen).

2.4.3. Комплекс Grb2/SOS.

Активация MAP киназы.

2.5. Участие IRS-1 в инсулиновой сигнализации и путь Р13-киназы.

2.5.1. Идентификация IRS-белков.

2.5.2. IRS- белки координируют разветвленную и гибкую сигнальную систему.

2.5.3. Сигнальные белки, взаимодействующие с IRS-1.

2.6. Р13-киназа и роль IRS-1 в её активации. Р13-киназный путь.

2.7. тирозиновые протеинфосфатазы SHP-1 и SHP-2.

2.7.1. SHP-1 в гематопоэтических клетках.

2.7.2. SHP-1 и SHP-2 и Т-клеточная сигнализация.

2.8. IRS-1 активирует фосфатазу SHP-2.

2.9. ингибирование сигнализации через IRS-1.

2.10. Семейство белков SIRPa.

3. СИНТЕЗ ГЛИКОГЕНА И РОЛЬ ГЛИКОГЕНСИНТЕТАЗЫ В СИНТЕЗЕ ГЛИКОГЕНА.

3.1. Активация синтеза гликогена инсулином.

3.2. Судьба глюкозы в организме.

3.3. Стадии, определяющие скорость синтеза гликогена.

3.4. Механизм активации гликогенсинтетазы.

3.4.1. Дефосфорилирование гликогенсинтетазы приводит к ее активации.

3.4.2. Передача инсулинового сигнала на гликогенсинтетазу.

3.5. Инактивация инсулином киназы, фосфорилирующейГС.

3.6. Другие сигнальные пути, которые могут участвовать в регуляции ГС.

РЕЗЮМЕ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Реактивы и материалы для биохимических и молекулярно-биологических исследований.

2.1.2. Реактивы и материалы для клеточно-биологических исследований.

2.1.3. Реактивы и материалы для иммунохимических исследований.

2.2. экспрессионные плазмиды.

2.3. Праймеры и пептиды.

2.4. Клеточные линии.

2.5. Культивирование клеток.

2.6. Стимуляция клеток лигандами, обработка вортманнином, конканавалином и перванадатом, лизис клеток.

2.7. иммунопреципитация.

2.8. электрофорез в ПААГ в присутствие ДСН и.

2.9. иммуноблоттинг (вестерн блоттинг).

2.10. транзиторная гиперэкспрессия.

2.11. Стабильная гиперэкспрессия.

2.12. Определение активности фосфатидилинозитол-З ' киназы.

2.13. Измерение активности гликогенсинтетазы.

2.14. Измерение включения [3Н] тимидина в ДНК.

2.15. Определение пролиферации по включению МТТ.

2.16. Измерение транспорта [3Н]-глюкозы в клетку.

2.17. Измерение фосфатазной активности.

2.18. Мутагенез in vitro.

2.18.1. Получение одноцепочечной ДНК.

2.18.2. Отжиг праймеров и построение цепи ДНК, содержащей мутацию.

2.18.3. Лигирование цепи ДНК, содержащей мутацию.

2.19. Выделение плазмиднойДНК.

2.20. Определение нуклекотидной последовательности ДНК.

2.20.1. Щелочная денатурация ДНК.

2.20.2. Отжиг праймера.

2.20.3. Сиквенсная реакция.

2.21. Ферментативное дегликозилирование белков.

2.22. Мечение клеток [3Н] глюкозаминомивыделенииеГФИ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Сравнительная характеристика связывания SHP-1 и SHP-2 с рецепторами факторов роста, EGF, PDGF и инсулина.

3.1.1. Связывание SHP-1 и SHP-2 с рецептором EGF.

3.1.2. Связывание SHP-1 и SHP-2 с рецептором PDGF.

3.1.3. Связывание SHP-1 и SHP-2 с рецептором инсулина.

3.2. Связывание SHP-1 с субстратом рецептора инсулина - IRS-1.

3.2.1. Связывание SHP-1 и SHP-2 с IRS-1 в клетках BHK-IR.

3.2.2. Связывание эндогенных SHP-1 с IRS-1 в клетках IM9.

3.2.3. Картирование SH2 домена SHP-1, участвующего в связывании с IRS-1.

3.2.4. Взаимодействие IRS-1 с SHP-1 в клетках Rati.

3.2.4.1. Дефосфорилирование IRS-1 фосфатазой SHP-1 в клетках Rati.

3.2.4.2. Сравнительная характеристика IRS-1- зависимой активации Р13-киназы в клетках Rati, экспрессирующих каталитически активную и не активную SHP-1.

3.3. Влияние стабильной экспрессии SHP-1 на биологические ответы клеток Rati, вызванные инсулином.

3.3.1. Активация гликогенсинтетазы.

3.3.2. Синтез ДНК.

3.3.3. Клеточная пролиферация.

3.3.4. Регуляция инсулин-зависимой активации фосфолипазы С, специфичной в отношении ГФИ в клетках Rati.

3.3.4.1. Инсулин стимулирует расщепление ГФИ в Rati клетках.

3.3.4.2. Инсулин активирует ГФИ специфичную фосфолипазу С.

3.3.4.3. Инсулин-зависимая активация ГФИ специфичной фосфолипазы С чувствительна к вортманнину.

3.4. белок SIRPa - субстрат фосфатазы SHP-1.

3.4.1. Предпосылки к изучению взаимодействия SHP-1 с SIRPa.

3.4.2. Связывание SHP-1 с SIRPa.

3.4.3. Активация SHP-1 фосфопептидами SIRPa.

3.4.6. SIRPa как субстрат для SHP-1.

3.4.6.1. Изучение взаимодействия SH0P-1 и SIRPa с помощью синтетических пептидов SIRPa.

3.4.6.2. Картирование SH2 домена SHP-1, опосредующего связывание с SIRPa.

3.5. Структурные и функциональные свойства нового субстрата фосфатазы SUP-1 -белка SIRPa.

3.5.1. Кросс-сшивка SIRPa с помощью антител не вызывает его тирозиновое фосфорилирование.

3.5.2. SIRPa образует устойчивые кластеры.

3.5.3. Влияние SIRPa на метаболические эффекты инсулина.

3.5.3.1. Транспорт глюкозы.

3.5.3.2. Активация гликогенсинтетазы.

3.6. Контроль уровня фосфорилирования SHP-1.

3.6.1. SHP-1 обладает способностью к аутодефосфорилированию.

3.6.2. Димеризация SHP-1.

3.6.3. Поиск адаптора, на котором могут образовываться димеры SHP-1.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

1. Взаимодействие SHP-1 и SHP-2 с рецепторами факторов роста.

2. Аутодефосфорилирование SHP-1 как процесс, контролирующий уровень шрозинового фосфорилирования этой фосфатазы.

3. Участие фосфатазы SHP-1 в регуляции уровня тирозинового фосфорилирования IRS-1.

3.1. Участие инозитолфосфогликана в инсулиновой сигнализации.

4. Влияние стабильной экспрессии SHP-1 на митогенные эффекты инсулина.

5. Структурные и функциональные свойства нового субстрата фосфатазы SHP-1 -белка SIRPa.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Участие тирозиновой протеинфосфатазы SHP-1 в передаче сигнала от рецептора инсулина»

Процессы роста, дифференцировки, выживания, метаболизма и смерти клеток регулируются фосфорилированием и дефосфорилированием сигнальных белков по специфическим тирозиновым остаткам [Ullrich and Schiessinger, 1990]. Фосфорилирование тирозиновых остатков осуществляется тирозиновыми протеинкиназами, а их дефосфори-лирование катализируется тирозиновыми протеинфосфатами. Все рецепторы факторов роста обладают тирозин-протеинкиназной активностью. При взаимодействии ростовых факторов с их рецепторами на клеточной поверхности происходит аутофосфорилирование рецепторных тирозиновых протеинкиназ, выражающееся в их каталитической активации, что приводит к фосфорилированию многих внутриклеточных субстратов этих рецепторов. Считается, что терминация внутриклеточной сигнализации происходит при участии тирозиновых протеин-фосфатаз. В то же время последние данные свидетельствуют о том, что тирозиновые протеинфосфатазы могут не только подавлять сигнализацию, но также и усиливать её [Stein-Gerlach et al., 1998].

Инсулин оказывает множественное воздействие на клетку. С одной стороны он регулирует метаболизм глюкозы в организме [Lawrence and Roach, 1997]. В то же время являясь, фактором роста, он активно воздействует на пролиферацию и дифференцировку клеток [Roth and Cassell, 1983]. Кроме того, инсулин является вазодилятирующим агентом, влияющим на тонус сосудов [Cleland et al., 1998]. Связывание инсулина со своим рецептором (IR) на поверх-ности клеток активирует тирозин-протеинкиназный домен рецептора, что выражается в аутофосфорилировании ß-субъединицы рецептора с последующим связыванием и фосфорилированием внутриклеточных мишиней инсулинового рецептора, -субстрата-1 инсулинового рецептора (IRS-1) и адапторного белка гомологичного src и коллагену (She). Эти два докинг-белка в фосфорилированном по тирозиновым остаткам состоянии связывают множество сигнальных белков, содержащих SH2 домены, образуя муль-тисубъединичные сигнальные комплексы модулирующие передачу сигнала внутри клетки.

Регуляция инсулиновой сигнализации требует участия тирозиновых протеинфосфатаз. К настоящему времени клонированы две тирозиновые протеин-фосфатазы, содержащие SH2 домены (SHP-1 и SHP-2), позволяющие этим фосфатазам связываться с фосфорилиро-ванным инсулиновым рецептором и его субстратами. Выяснение роли этих фосфатаз в инсулиновой сигнализации может помочь понять механизмы инсулиновой сигнализации, которая до сих пор остается одним из белых пятен молекулярной биологии клетки.

Нарушение обмена глюкозы в организме приводит к серьезному заболеванию -сахарному диабету. При инсулин-независимом сахарном диабете нет нарушений в секреции инсулина в кровь, но при этом инсулин не регулирует метаболизм глюкозы. Это может быть вызвано нарушением процесса передачи сигнала от рецептора инсулина в клетку. С другой стороны, нарушения в инсулиновой сигнализации могут приводить к другим, трагичным для организма, последствиям. Инсулин является фактором роста и контролирует пролиферацию и дифференцировку жировых клеток [Roth and Cassell, 1983; Smith et al., 1997]. Известно, что нарушения механизмов контроля роста клеток, выражаются в безудержной пролиферации клеток, что приводит к появлению злокачественных новообразований [Daughaday and Deuel, 1991]. Выяснение конкретных участников путей сигнализации факторов роств может помочь в создании специфических ингибиторов неконтролируемого роста клеток для терапии раковых образований, а также регуляторов клеточного роста и метаболизма. В частности, понимание механизмов процессов активации инсулином транспорта глюкозы в клетку и синтеза гликогена может помочь в борьбе с таким заболеванием, как инсулин-независимый сахарный диабет.

Целью нашего исследования было выяснение роли фосфатазы SHP-1 в сигнализации рецепторов факторов роста в негематопоэтических клетках. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнение характера связывания тирозиновых протеинфосфатаз -1 и -2, содержащих SH2 домены (SHP-1 и SHP-2) с рецепторами инсулина, эпидермального фактора роста и фактора роста из тромбоцитов. Выяснить возможность дефосфорилирования этих рецепторов фосфатазой SHP-1.

2. Выявить потенциальные субстраты фосфатазы SHP-1, участвующие в передаче сигнала в клетку от инсулинового рецептора и изучить возможность регуляции их биологической функции этим ферментом.

3. Выяснить особенности регуляции уровня фосфорилирования фосфатазы SHP-1

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Кривцов, Андрей Владимирович

выводы

1. Тирозиновые протеинфосфатазы -1 и -2 содержащие SH2 домены (SHP-1 и SHP-2) взаимодействуют с активированными рецепторами эпидермального фактора роста (EGF) и фактора роста из тромбоцитов (PDGF). С рецептором инсулина взаимодействует только фосфатаза SHP-2, и не взаимодействует фосфатаза SHP-1. Связывание фосфатаз с активированными рецепторами не приводит к их дефосфорилированию.

2. Фосфатаза SHP-1 обладает способностью аутодефосфорилировать тирозиновые остатки по межмолекулярному механизму. Этот механизм требует образование комплекса SHP-1—SHP-1. Для образования этого комплекса требуются «активные» SH2 домены фосфатазы. Этот комплекс может образовываться на белках-посредниках ррЮО и рр120.

3. Фосфатаза SHP-1 участвует в инсулиновой сигнализации, взаимодействуя с субстратом 1 инсулинового рецептора (IRS-1). Это взаимодействие осуществляется через N-концевой SH2 домен фосфатазы и приводит к дефосфорилированию фосфотирозинов, являющихся участками связывания регуляторной субъединицы фосфатидилинозитол-3' киназы.

4. Стабильная экспрессия фосфатазы SHP-1 в клетках Rati приводит к подавлению инсулин- зависимой активации гликогенсинтетазы, не влияя на инсулин- зависимую пролиферацию клеток. Напротив, стабильная экспрессия каталитически неактивной формы фосфатазы SHP-1 приводит к подавлению инсулин- зависимой пролиферации, но не влияет не активацию гликогенсинтетазы. Этот эффект связан с гиперфосфорилированием клеточного белка ppllO, который в норме дефосфорилируется эндогенными фосфатазами.

5. Показано, что рр 110 является белком SIRPa, известным как негативный регулятор митогенных эффектов факторов роста. Белок SIRPa взаимодействует с N- концевым SH2 доменом SHP-1 посредством своих тирозиновых остатков Y451 и Y495. Взаимодействие с SIRPa приводит к его дефосфорилированию. Синтетические фосфопептиды, повторяющие последовательность SIRPa, активируют каталитическую активность SHP-1.

6. Белок SIRPa обладает способностью к гомофильному взаимодействию.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю искреннюю признательность моему научному руководителю Михаилу Юрьевичу Меньшикову за помощь в работе и подготовке этой диссертации, и Всеволоду Арсеньевичу Ткачуку за поддержку и внимательное отношение, а также поименованным ниже сотрудникам лабораторий Молекулярной Эндокринологии Российского Кардиологического Научного Комплекса и департамента Молекулярной Биологии Института Биохимии Макс-Планковского общества где была выполнена часть настоящей работы и другим сотрудникам и зарубежным коллегам, оказавшим помощь в работе, обсуждениях и написании данного труда.

Арефьева Т. Boehrmer F.

Бочков В.Н. Lankenau А.

Герасимовская Е. Lammers R.

Данилкович А. Niler 0.

Имянитов Е. Sures I.

Фрезе К. Stien-Gerlach M.

Харитоненков А. Ullrich A.

Чебуркин Ю.

Хочу выразить искреннюю благодарность фондам и организациям, финансовую поддержку данным исследованиям:

Соросовской образовательной программе, грант А-98-1739, 1998 г. Мах Planck Geselshaft, грант 1995-1997 гг. DAAD, грант 325-phi-cus, 1995-1996 гг.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ: анализируя многие данные об участии фосфатаз SHP-1 и SHP-2 в клеточной сигнализации, можно сделать вывод, что ни SHP-1, ни SHP-2 не могут только усиливать или подавлять сигнализацию. Конкретная роль каждой фосфатазы зависит от нескольких параметров, одними из которых являются: конкретный сигнальный путь и концентрации этих ферментов. Были продемонстрированы случаи, в которых SHP-2 может как усиливать, так и подавлять сигнализацию. Мы продемонстрировали, что с одной стороны каталитическая активность SHP-1 подавляет инсулин-зависимую активацию гликогенсинтетазы, тем самым SHP-1 выступает в качестве негативного регулятора сигнализации. С другой стороны каталитическая активность SHP-1 требуется для индукции инсулином синтеза ДНК, тем самым SHP-1 выступает в качеве положительного регулятора эффектов инсулина на клетку. Обобщая можно сказать, что в инсулиновой сигнализации SHP-1 выступает как регулятор митогенной / метоболической состовляющих, сдвигая равновесие в сторону митогенной составляющей.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кривцов, Андрей Владимирович, 1999 год

1. Abraham RT, Wiederrecht GJ. (1996) Immunopharmacology of rapamycin. Annu Rev Immunol; 14:483-510

2. Alessi DR, Andjelkovic M, Caudwell B, Cron P, Morrice N, Cohen P, Hemmings BA. (1996) Mechanism of activation of protein kinase B by insulin and IGF-1. EMBO J; 15(23):6541-51

3. Alonso MD, Lomako J, Lomako WM, Whelan WJ. (1995) A new look at the biogenesis of glycogen. FASEB J; 9(12): 1126-37

4. Anderson NG, Mailer JL, Tonks NK, Sturgill TW. (1990) Requirement for integration of signals from two distinct phosphorylation pathways for activation of MAP kinase. Nature; 343(6259):651-3

5. Ando A, Yonezawa K, Gout I, Nakata T, Ueda H, Hara K, Kitamura Y, Noda Y, Takenawa T, Hirokawa N, et al. (1994) A complex of GRB2-dynamin binds to tyrosine-phosphorylated insulin receptor substrate-1 after insulin treatment. EMBO J; 13(13):3033-8

6. Antonetti DA, Algenstaedt P, Kahn CR. (1996) Insulin receptor substrate 1 binds two novel splice variants of the regulatory subunit of phosphatidylinositol 3-kinase in muscle and brain. Mol Cell Biol; 16(5):2195-203

7. Araki E, Lipes MA, Patti ME, Bruning JC, Haag B 3rd, Johnson RS, Kahn CR. (1994) Alternative pathway of insulin signalling in mice with targeted disruption of the IRS-1 gene. Nature; 372(6502): 186-190

8. Argetsinger LS, Norstedt G, Billestrup N, White MF, Carter-Su C. (1996) Growth hormone, interferon-gamma, and leukemia inhibitory factor utilize insulin receptor substrate-2 in intracellular signaling. J Biol Chem; 271 (46):29415-21

9. Arrandale JM, Gore-Willse A, Rocks S, Ren JM, Zhu J, Davis A, Livingston JN, Rabin DU. (1996) Insulin signaling in mice expressing reduced levels of Syp. J Biol Chem; 271(35): 21353-8

10. Avila M.A., Clemente R., Varela-Nieto I. (1992) A phosphatidylinositol-linkage-deficient T-cell mutant contains insulin-sensitive glycosyl-phosphatidylinositol Biochem. J., 282:681-686

11. Backer JM, Shoelson SE, Weiss MA, Hua QX, Cheatham RB, Haring E, Cahill DC, White MF. (1992c) The insulin receptor juxtamembrane region contains two independent tyrosine/beta-turn internalization signals. J Cell Biol; 118(4):831-9

12. Baron AD, Brechtel G, Wallace P, Edelman SV. (1988) Rates and tissue sites of non-insulin-and insulin-mediated glucose uptake in humans. Am J Physiol; 255(6 Pt l):E769-7416