Создание бактериального продуцента рекомбинантного человеческого Г-КСФ на базе технологии слитных белков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.12, кандидат биологических наук Скрыпник, Ксения Александровна

• Скрыпник, Ксения Александровна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Скрыпник, Ксения Александровна

Список сокращений

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Г-КСФ, молекулярная организация

2.2. Рецептор чГ-КСФ

2.3. Запуск сигнальных каскадов

2.4. Клиническое применение

2.5. Перспективы применения чГ-КСФ

2.6. Пути получения рекомбинантных белков

2.6.1. Рекомбинантные аналоги Г-КСФ

2.6.2. Экспрессия чужеродных генов в бактериях

3. Материалы и методы

3.1. Материалы

3.1.1. Бактериальные штаммы и плазмиды

3.1.2. Состав сред и условия культивирования 5 О

3.1.3. Система экспрессии и очистки белков IMPACT

3.1.4. Стандарты молекулярной массы белков и размеров 51 фрагментов ДНК

3.1.5. Клеточные линии

3.1.6. Стандарт чГ-КСФ

3.2. Методы

3.2.1. Выделение плазмидной ДНК

3.2.2. Приготовление компетентных клеток E.coli и их 53 трансформация

3.2.3. Сайт-специфический мутагенез методом полимеразной 54 цепной реакции

3.2.4. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК

3.2.5. Генно-инженерные манипуляции с ДНК

3.2.6. Выделение фрагментов из агарозного геля

3.2.7. Скрининг клонов

3.2.8. Индукция экспрессии Г-КСФ

3.2.9. Приготовление лизатов клеток

3.2.10. Электрофоретическое разделение белков в ПААГ

3.2.11. Вестерн-блоттинг

3.2.12. Иммуноферментный анализ

3.2.13. Концентрирование проб, содержащих белок

3.2.14. Очистка белка

3.2.15. Проверка биологической активности чГ-КСФ с 61 использованием клеток НЬ

Результаты

4.1. Сайт — специфический мутагенез гена чГ-КСФ с 63 использованием ПЦР

4.2. Вставка фрагмента чГ-КСФ в вектор рТУВ 11, отбор и 65 проверка клонов

4.3. Индукция экспрессии конструкции рТУВ11-ОС15 в 67 присутствии ИПТГ

4.4. Определение концентрации чГ-КСФ в составе 69 гибридного белка

4.5. Связывание гибридного белка с хитиновым сорбентом. 69 Индукция автопротеолитической активности в гибридном белке

4.6. Введение замен в последовательность чГ-КСФ с целью 70 индукции автопротеолитической активности интеина в составе гибридного белка. Индукция экспрессии гибридного белка

4.7. Очистка чГ-КСФ с помощью аффинной хроматографии

4.8. Проверка биологической активности in vitro

5. Обсуждение 76 Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Создание бактериального продуцента рекомбинантного человеческого Г-КСФ на базе технологии слитных белков»

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) — один из гемопоэтических факторов, играющих важную роль в организме. Этот цитокин способствует выживанию клеток-предшественников нейтрофильных гранулоцитов, стимулирует их деление, последующую дифференцировку и созревание, необходим он и для активации зрелых нейтрофилов (Morstyn and Burgess, 1988).

Обладая широким спектром активностей, чГ-КСФ применяется в онкологической практике для» лечения нейтропении, возникающей после проведения химио- и радиотерапии. Нейтропения характеризуется значительным снижением количества нейтрофилов, что ведет к резкому снижению иммунитета неспособности сопротивляться«внешним инфекциям. Введение препаратов, содержащих чГ-КСФ, позволяет восстановить уровень нейтрофилов, повысить иммунитет и избежать возникновения сопряженных инфекций.

В' последние годы было проведено множество исследований, показывающих, что чГ-КСФ-может быть использован не только при лечении онкологических заболеваний. Этот цитокин является- одним? из возможных препаратов для лечения ряда аутоиммунных и нейродегенеративных заболеваний, последствий инфаркта миокарда и инсульта.

Создание рекомбинантных аналогов природного человеческого Г-КСФ является одной из важных биотехнологических задач. При разработке рекомбинантных аналогов важно подобрать подходящую экспрессионную систему, позволяющую получать достаточные количества препарата и использовать систему очистки, обеспечивающую сохранение биологической активности целевого белка.

Существует несколько коммерческих рекомбинантных аналогов^ чГ-КСФ. Получение рекомбинантного белка осуществляется как в клетках эукариот, так и в прокариотических организмах. Наиболее доступной является экспрессия целевого белка в бактериальных клетках, в частности, в

Escherichia coli. Использование этого организма позволяет получать высокий уровень экспрессии при минимальных затратах.

При цитоплазматической экспрессии в бактериях целевой белок может формировать тельца включения или присутствовать в растворимой форме. Получение растворимой формы предпочтительнее, так как позволяет избежать при очистке дополнительных этапов растворения и рефолдинга.

Существующие в настоящий момент рекомбинантные аналоги чГ-КСФ, полученные с использованием бактериальных продуцентов, экспрессируются в нерастворимой форме. Получение чГ-КСФ в растворимой форме позволило бы избежать дополнительных этапов, очистки и упростить процесс получения рекомбинантного аналога этого белка. .

В настоящий момент практически нет экспрессионных систем, которые позволяли бы получать чГ-КСФ в растворимой форме. Исследователи сталкиваются с терратогенным эффектом при продуцировании этого белка в организме различных трансгенных животных. Попытки экспрессировать чГ-КСФ в растворимой' форме в бактериальных клетках приводили к гибели клеток при достижении высокого- уровня процукции цитокина. Решением проблемы может являться- использование растворимого белка-партнера. Конструирование экспрессионного вектора, в состав которого будут входить последовательности как целевого гена, так и высокорастворимого партнера, и последующая экспрессия гибридного белка, сделает возможным «маскировку» чГ-КСФ в организме продуцента. Таким образом можно добиться высокого уровня продукции чГ-КСФ в растворимой форме с использованием лишь одного этапа очистки белка.

В данной работе отражены основные современные стратегии, применяющиеся при экспрессии рекомбинантных белков, в частности, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора. Представлены данные, касающиеся клинического применения этого цитокина, особое внимание уделено новым перспективным путям использования чГ-КСФ. В работе изложен новый подход, позволяющий обеспечивать экспрессию целевого белка в растворимой форме, исключая формирование телец включения.

Целью исследования была разработка и создание векторных конструкций, позволяющих, с помощью бактериальных продуцентов, получать чГ-КСФ в растворимой форме.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Подобрать экспрессионную систему, позволяющую обеспечивать «маскировку» Г-КСФ в составе продуцируемой в растворимой форме гибридной конструкции.

2. Модицифировать последовательность гена чГ-КСФ для бактериальной экспрессии с учетом частоты использования кодонов бактериальными продуцентами.

3. Разработать и создать векторные конструкции для бактериальной экспрессии чГ-КСФ.

4. Оптимизировать экспрессию гибридной конструкции, несущей в составе домен чГ-КСФ.

5. Очистить продуцируемый цитокин с помощью аффинной хроматографии.

6. Оценить биологическую активность полученного чГ-КСФ и сравнить с биологической активностью коммерческого аналога - Нейпогена.

2. Обзор литературы.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Скрыпник, Ксения Александровна

Выводы.

1. Последовательность гена чГ-КСФ была модифицирована для бактериальной экспрессии с учетом частоты использования кодонов бактериальными продуцентами.

2. Для «маскировки» чГ-КСФ при бактериальной экспрессии в растворимой форме в составе гибридного белка был выбран интеиновый домен.

3. Введение аминокислотных замен на Ы-конце последовательности чГ-КСФ с Ткг-Рго на А1а-А^ позволило существенно увеличить эффективность гидролиза связи между интеином и целевым белком. Совершенные замены не оказали влияния на биологическую активность цитокина.

• 4. На основе клеток В121(БЕЗ) создан штамм-продуцент, экспрессирующий гибридный белок. Белок экспрессируется в растворимой форме и несет в своем составе хитин-связывающий домен, интеин и чГ-КСФ. Уровень экспрессии составляет 7 мг/л.

5. Аффинная хроматография с использованием хитинового сорбента позволяет добиться одноэтапной очистки чГ-КСФ из состава гибридного белка.

6. Биологическая активность полученного цитокина соответствует ожидаемой и сопоставима с биологической активностью коммерческого аналога - Нейпогена. Она составляет 98% от биологической активности Нейпогена.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Скрыпник, Ксения Александровна, 2011 год

1. Абрамов М.Е., Жукова Л.Г. Современные аспекты профилактики нейтропении при химиотерапии солидных опухолей // Современная онкология. 2010. Т. 12. №1.С.75-81.

2. Белогурова М.Б. Клиническое использование гемопоэтических ростовых факторов // Практическая онкология. 2003. Т.4. №3. С.183-190.

3. Варлан Г. В., Петухова И.Н. Роль гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в профилактике и лечении фебрильной нейтропении // Сибирский онкологический журнал. 2009. Т.1. №31. С.56-63.

4. Ватутин Н.Т., Калинкина Н.В., Шевелек А.Н. Применение колониестимулирующих факторов при острых лейкозах // Гематология и трансфузиология. 2009. №1. С.15-21.

5. Подолъцева Э.И. Колониестимулирующие факторы в онкологии // Практическая онкология. 2001. №5. Т.1. С. 21- 24.

6. Птушкин В. В. Совершенствование методов поддерживающей терапии при проведении цитостатического лечения // Современная! онкология. 2002.№2. С.89-94.

7. Румянцев С.А., Владимирская Е.Б., Румянг{ев A.F. Механизмы Г-КСФ-индуцированной мобилизации гемопоэтических стволовых клеток // Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2003. Т.2. №4. С. 5-9.

8. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии. Спб.: Издательство-СПбГТУ, 2002". 552 с.

9. Bae CS., YangDS., Lee J., Park Y-P. Improved process for production of recombinant yeast-derived monomeric human G-CSF // Appi. Microbiol Biotechnol. 1999. V.52. P.338-344.

10. Bai X., Zhang C., Ruan D., He O., Hou L., Li H. Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (rhG-CSF) could be an effective adjuvant therapy for orthopedic implant-related infection (OIRI) // Medical Hypotheses. 2011. V. 76. P.703-705.

11. Chang Y-J., Huang X-J. Use of G-CSF-stimulated marrow in allogenic hematopoietic stem cell transplantation settings : a comprehensive review // Clin Transplant. 2011. V. 25. P. 13-23.

12. Chen Y-K., Jiang X-M., Gong J-P. Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor enhanced the resolution of venous thrombi // Journal of vascular surgery. 2008. V.47. No.5. 1058-1065.

13. Chopp M, Li Y. Treatment of neural injury with marrow stromal cells // Lancet Neurol. 2002 V. 1. No.2. P. 92-100.

14. Clark OA:, Lyman G., Castro AA., ClarkLG., Djulbegovic B. Colony stimulating factors for chemotherapy induced febrile neutropenia // Cochrane Database Syst Rev. 2003. V.3.CD003039.

15. Crawford J., Tomita DK., MazanetR., GlaspyJ., Ozer H. Reduction of oral mucositis by filgrastim (r-metHuG-CSF) in patients receiving chemotherapy // Cytokines Cell Mol Ther. 1999. V. 5. No.4.P. 187-93.

16. Cruciani M., Lipsky B., Mengoli C., de Lalla F. Are cranulocyte colony-stimulating factors beneficial in treating diabetic foot infections ? // Diabetes care. 2005. V. 28. No. 2. P. 454-460.

17. Doyle MV, Lee MT, Fong S. Comparison of the biological activities of human recombinant interleukin-2 (125) and native interleukin-2 // Journal of Biological Response Modifiers. 1985. V.4. P. 96-109.

18. Ellis SG., Penn MS:, Bolwell B, Garcia M. et al. Granulocute colonystimulating factor in patients withilargeracute myocardial infarction: results of a pilot dose-escalation randomized trial // American Heart Journal. 2006: V;*53.-No.6.e41. ;iL

19. Fernandez- Varon E., Villamayr L. Granulocyte and granulocyte macrophage colony-stimulating factors as therapy in human and veterinary medicine // The Veterinary Journal. 2007. V. 174. P. 33-41

20. AA.Gogarten P.J., Senejani A.G., Zhaxybayeva O., Olendzenski L., Hiliaro E. INTEINS: structure, function and: evolution // Annual review of Microbiology. 2002. V. 56. P. 263-287.

21. Golde D:, Cline M. Regulation of granulopoesis // N England J Med. 1974. V.291. No. 26. P.1388-1395.

22. Gregory A.D., Hogue L.A., Ferkol T. W., Link D. C. Regulation of systemic and* local neutrophil responses by G-CSF during pulmonary Pseudomonas aeruginosa infection // Blood. 2007. V. 109. No. 8. P:3235-3243.

23. Al.Harada M., Oin Y., Takano H., Minamino et al. G-CSF prevents cardiac remodelling after myocardial infarction by activating the Jak-Stat pathway in cardiomyocytes // Nature Medicine. 2005. V. 11. No. 3. P. 305-311.

24. Hill C.P., Osslund T.D., Eisenberg D. The structure of granulocyte colony-stimulating factor and its relationship to other growthfactors // Biochemistry. 1993. V.90. P.5167-5171.

25. Hoggartt J., Pelus-L.M. Many mechanisms-mediating mobilization: an alliterative review // Current opinion in hematology. 2011. V.I81 No.4.P,231-238.

26. Hoglund M. Glycosylated and*, non-glycosylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (rhG-CSF)--what is the difference? // Medical oncology. 1998. Vol. 15. No. 4. P. 229^233.

27. Jeong K.J., Lee S.Y. Secretory production of human granulocyte colony-stimulating factor in Escherichia coli II Protein expression and purification. 2001. V. 23. P.311-318.

28. Kaufman R.J. Overview of vector design for mammalian-gene expression // ' Molecular biotechnology. 2000: V. 16: P. 151- 160:

29. Kaufmann SH, Karp JE, Jones RJ, Miller GB, Schneider E, Zwelling LA, Cowan K, Wendel K, Burke PJ. Topoisomerase II levels and drug sensitivity in adult acute myelogenous leukemia // Blood. 1994. V.83. No.2. P.517-530.

30. Kim M.O., Kim S.H., Lee S.R., Kim K.S., Min K.S., Lee H.T., Kim S.J., Ryoo ZIY. Transgene expression of biological active recombinant human granulocyte-colony stimulating factor (hG-CSF) into mouse urine // Life Sciences. 2006. V.78.P. 1003-1009.

31. Kim J., Lee S., Jeon B., Jang W., Moon C., Kim S. Protection of spermatogenesis against gamma ray-induced damage by granulocyte colony-stimulating factor in mice // Andrologia. 2009. V.43. P. 87-93.

32. Kirsch F., Kruger C., Schneider A. The receptor for granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) is expressed in radial glia during development of the nervous system // BMC Dev Biol, 2008. V.8.P.32.

33. Komine-Kobayashi M, Zhang N, Liu M, Tanaka R, Hara H, Osaka

34. A, Mochizuki H, Mizuno Y, Urabe T. Neuroprotective effect of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in transient focal ischemia of mice // J Cereb Blood FlowMetab. 2006i V. 26. No.3. P:402-413.

35. Kuritzkes DR. Neutropenia, neutrophil dysfunction; and bacterial'infection in patients with human immunodeficiency virus disease: the role of granulocyte colony-stimulating factor // Clinical infection disease. 2000. V.30. P. 256-260.

36. Lasnik M.A., Porekar V.G., Stale A. Human granulocyte colony stimulating' factor (hG-CSF) expressed by methylotrophic yeast Pichia pastoris // Eur O Physiol. 2001. V. 442. Suppl.l. R.184-186.

37. Lee S-T., Chu K, Jung K-H., Ko S-Y., Kim E-H., Sinn D-L, Lee Y-S., Lo E.H., Kim M., Roh J-K Granulocyte colony-stimulating factor enhances angiogenesis after focal cerebral1 ischemia // Brain research. 2005: V. 1058. P.120-128. X ■

38. Liu F., YangH., Wesselschmidt R., Kornaga T., LinkD.C. Impaired production and increasedapoptosis of neutrophils in G-CSF-receptor-deficient mice // Immunity. 1996. V. 5. P. 491-501'.

39. Makrides S.C., Strategies for achieving4 high level expression of genes in Escherichia coli //Microbiological reviews. 1996.V.60. No.3.P.512-538.

40. Marino J., Furmento' V. A., Zotta E., Roguin L.P. Peritumoral administration of granulocyte colony-stimulating factor induces an apoptotic response on a murine mammary adenocarcinoma // Cancer biology and therapy. 2009. V. 8.No. 18. P. 1737-1743.

41. Martin S.J., Bradley J.G., Cotter T.G. HL-60 cells induced to differentiate towards neutrophils subsequently die via apoptosis // Clin. Exp. Immunol. 1990. V. 79. P. 448-453.

42. Molineux G., Pegfilgrastim: using pegilation technology to improve neutropenia support in cancer patients // Anti-Cancer Drugs.2003.V.14.No.4.P.259-265.

43. Mortsyn G., Burgess A. W. Hemopoietic growth factors: a review // Cancer research. 1988. V. 48. P. 5624-5637.

44. Nicola N.A. Murine granulocyte colony-stimulating factor: actions on normal and leukemic cells // Behring Inst Mitt. 1988.V.83.P.207-215.

45. SS.Nicola N.A., MetcalfD., Matsumoto M: Purificationof a factor inducing differentiation in murine myelomonocytic leukemia cells. Identification as granulocyte colony-stimulating factor // J Biol Chem. 1983. V. 258. No. 14. P. 9017-9023.

46. Perler F.B., Olsen G.J:, Adam E. Compilation and- analysis of intein sequences,// Nucleic Acids Research: 1997. V. 25: No. 6.P. 1087-1093.

47. Roberts A. W. G-CSF: a key regulator of neutrophil production, but that's not all! // Growth factors; 2005. V. 23;No. 1 P;33-41.

48. Sachs L. The molecular control of blood cell development // Science. 1987.P. 1374-1379. :

49. Schabitz WR, Kbllmar R, SchwahingerMf Juettlen E^Bardutzky J-Scholzke MN, Sommer C, Sch wab S. Neuroprotective effect of granulocyte colony-stimulating factor after focal;cerebral,ischemia // Stroke. 2003. V.34. No.3.P. 745-51. '

50. Shimoda K, Okamura S., Harada N., Kondo S., Okamura T., Niho Y. Identification of a functional' receptor for granulocyte colony-stimulated factor on platelets // J.Clin. Invest., 1993. V.91. P.1310-1313.

51. Simons JP, McClenaghan M, Clark A J. Alteration of the quality of milk by expression of sheep beta-lactoglobulin in transgenic mice // Nature. 1987 Vol.328. No.6130.P.530-532.

52. Solaroglu I., Cahill J., Tsubokawa T., Beskonakli E., Zhang Ji Granulocyte colony-stimulating factor protects the brain against experimental stroke via inhibition of apoptosis and inflammation // Neurological research. 2009. V.31!. P. 167-172.

53. Takano H., Komuro I. G-CSF therapy for acute myocardial infarction: studies of animal experiments give valuable hints to clinical trials // International'Journal of Cardiology. 2009. V.135. P.l 15-116.

54. Takano H., Ueda K, Hasegawa H., Komuro I. G-CSF therapy for acute myocardial infarction // Trends in pharmacological sciences. 2007. V. 28. No. 10: P. 512-517.

55. Tanaka H., Tanaka Y., Shinagawa K, Yamagishi Y., Ohtaki K, Asano K. Three types of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor have equivalent biological activities in monkeys // Cytokine. 1997.V.9.No.5.P.360-369.

56. VanzA., Renard G., Palma M., Chies J.M., Dalmora S.L., Basso L.A., Santos D.S. Human granulocyte colony stimulating factor: cloning, overexpression, purification and characterization // Microbial cell factories. 2008. V. 7.No. 13.

57. WangL, Rudert WA, Loutaev I, Roginskaya V, Corey SJ. Repression of c-Cbl leads to enhanced G-CSF Jak-STAT signaling without increased cell proliferation // Oncogene. 2002. V. 21. P. 5346-5355.

58. Watari K., Asano S., Shirafuji N., Kodo H., Ozawa K., Takaku F., Kamachi S. Serum granulocyte colony-stimulating factor level in healthy volunteers and patients with various disorders as estimated by enzyme immunoassay//Blood, 1989. V. 73.P.117-122.

59. Weintraub M. Thrombolysis (tissue plasminogen* activator) in stroke: a medicolegal quagmire // Stroke. 2006. V.37.P.1917-1922.

60. Willis F., Pettengell R. Pegfilgrastim // Expert Opin Biol Ther.2002.V.2.No.8.P.985-992.

61. Yamaguchi T., Yamaguchi T., Kogi M, Yamamoto Y., Hayakawa T. Bioassay of human granulocyte colony-stimulating factor using human promyelocytic HL-60 cells // Biol. Pharm Bull. 1997. V. 20. No. 9. P. 943947.

62. Yamamoto A., Iwata A., Saito T., Watanabe F., Ueda S. Expression and purification of canine granulocyte colony-stimulating factor // Veterinary immunology and immunopathology. 2009. V.130. P.221-225.

63. Yamamoto A., Fujino M., Tsuchiya T., Iwata A. Recombinant canine granulocyte colony-stimulating factor accelerates recovery from cyclophosphamide-induced neutropenia in dogs // Veterinary immunology and immunopathology. 2011. V. 142. P. 271-275.

64. Yu C-R., MahdiR., Ebong S., VisticaB., GeryL, Egwuagu CE. Suppressor of cytokine signaling 3 regulates proliferation and activation of T-helper cells // The journal of biological chemistry. 2003. V.278. No.32. P.29752-29759.

65. Zavala F., Abad S., Ezine S., Taupine V., Masson A. Bach J-F. G-CSF therapy of ongoing experimental allergic encephalomyelitis via chemokine-and cytokine-based immune deviation // 2002. V. 168. P. 2011-2019.

66. Zheng W, Flavell RA. The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells // Cell. 1997. V. 89. P.587-596.