Рецепторные белки стрептококков: Клонирование генов, характеристика и практ. использование белков, экспрессируемых в E. coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, доктор биологических наук Гупалова, Татьяна Витальевна

• Гупалова, Татьяна Витальевна
• доктор биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации доктор биологических наук Гупалова, Татьяна Витальевна

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

Список сокращений и условных обозначений

Введение

1. Литературный обзор

1.1. Общие сведения о стрептококках и их классификация

1.2. Стрептококки, как возбудители заболеваний человека

1.3. Факторы вирулентности стрептококков группы А

1.3.1. Факторы вирулентности, ассоциированные с клеточной стенкой

1.3 .2. Экстрацеллюлярные продукты

1.3.3. М белок

1.3.4. Семейство М подобных белков

1.4. Взаимодействие стрептококков с сывороточными белками человека

1.5. Иммуноглобулины: структура и функция

1.6. Альбумин: структура и функция

1.7. Бактериальные Бс-рецепторы, реагирующие с человека и млекопитающих

1.7.1. Стафилококковый белок А

1.7.2. Связывание стрептококковыми рецепторами 1§0 человека и млекопитающих

1.7.3. Стрептококковый белок О

1.8. Связывание сывороточного альбумина стрептококками групп А, С и в

1.9. Использование рецепторных белков стрептококка и необходимость создания их продуцентов

1.10. Актуальность тест-диагностических систем на основе рекомбинантных

белков

1.10.1. Протеинурия. Клиническое значение микроальбуминурии

1.10.2. Метод блоттинга

1.10.3. Иммуноферментный анализ

1.11. Заключение обзора

2. Материалы и методы

2.1. Бактерии, фаги, плазмиды

2.2. Культуральные среды и условия роста

2.3. Пассирование бактериофагов

2.4. Титрование бактериофагов

2.5. Выделение ДНК из лямбдоидных фагов

2.6. Выделение плазмидной ДНК из стрептококков

2.7. Выделение плазмидной ДНК из Е.соН

2.8. Выделение хромосомной ДНК из стрептококков

2.9. Рестрикция и лигирование ДНК

2.10. Трансформация стрептококков группы Н

2.11. Трансформация Е.соИ

2.12. Упаковка фаговой ДНК т укго

2.13. Ультразвуковая дезинтеграция стрептококков

2.14. Электрофорез ДНК

2.15. Элюция фрагментов ДНК из гелей

2.16. Гибридизация фаговых бляшек и бактериальных колоний

2.17. Гибридизационный анализ ДНК

2.18. Секвенирование ДНК

2.19. Методы лизиса клеток Е.соН для выделения рекомбинантных белков

2.20. Определение динамики синтеза 1§С- и ЧСА-связывающих рецепторных белков

2.21. Выделение и очистка рекомбинантных белков

2.22. Электрофорез белков

2.23. Электроперенос белков из полиакриламидного геля

2.24. Метод колоний-блотт

2.25. Метод конъюгирования пероксидазы хрена с белками

2.26. Радиоактивное мечение фрагментов ДНК

2.27. Иммунизация животных, получение антисывороток

2.28. Определение белка

2.29. Бактерицидный тест

2.30. Определение способности рецепторов связывать человеческий ^О

и альбумин

2.31. Определение количеств 1§0 или альбумина, которое может связать соответствующий рецепторный белок

2.32. Определение констант связывания

2.33.Определение взаимодействия рецепторных белков в и А с ^О, 1§М

и легкими цепями ^ человека

2.34. Определение молекулярного веса рецепторных белков

2.35. Получение альбумина из сыворотки крови

2.36. Получение из сыворотки крови

2.37.Проверка чистоты полученного препарата альбумина и идентификация полученных препаратов человеческого сывороточного альбумина

2.38. Приготовление аффинных колонок

2.39. Определение концентрации альбумина в моче методом блоттинга

2.40. Определение концентрации альбумина в моче методом конкурентного

связывания

3. Результаты и обсуждение

3.1. Клонирование гена М белка

3.1.1. Клонирование гена М белка 12 серотипа в плазмиде pVI 101

3.1.2. Клонирование гена М белка 48 серотипа в фаговом и плазмидном векторах

3.1.3. Получение антисывороток к рекомбинантным фаговым клонам и их

исследование в тестах по опсонизации

3 .2. Клонирование и экспрессия гена иммуноглобулинового

Fe- рецепторного белка

3.3. Клонирование и экспрессия гена G белка

3.3.1. Создание банка генов стрептококка группы G в фаговом векторе

3.3.2. Идентификация рекомбинантных фаговых клонов

3.3.3. Клонирование гена G белка в плазмидном векторе pUC 8

3.3.4. Клонирование 1.5 т.н.п фрагмента гена G белка в плазмидном

векторе р SP64

3.3.5. Клонирование части гена, ответственного за IgG-связывание

3.3.6. Клонирование части гена, ответственного за связывание альбумина

3.4. Выделение белков, кодируемых проклонированными частями гена

3.5. Определение динамики синтеза рецепторных белков

3.6. Очистка двуфункционального и монофункциональных белков

3. .7. Определение молекулярного веса белков

3.8. Характеристика связывающих свойств белков

3.8.1. IgG-связывающие белки

3.8.2. Альбумин-связывающий белок

3 .8.3. Определение количества IgG или альбумина, которое может

связать соответствующий рецепторный белок

3 .8.4. Взаимодействие G белка с IgG различных млекопитающих, с различными классами иммуноглобулинов и белками Бэнс-Джонса

3.8.5.Взаимодействие альбуминового рецептора с альбуминами

различных млекопитающих

3.8.6. Взаимодействие G белка и альбуминового рецептора с плазменными белками человека

3.8.7. Определение констант связывания

3.9. Стабильность препаратов рецепторных белков

3.10. Использование полученных белков в качестве лигандов для

аффинной хроматографии

3.10.1. Получение альбумина из сыворотки крови

3.10.2. Проверка чистоты полученного препарата альбумина

3.10.3. Выделение препарата IgG из сыворотки крови

3.11. Создание тест-систем для определения микроальбуминурии

3.12. Результаты клинической апробации метода

4. Заключение

5. Выводы

6. Благодарности

7. Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Рецепторные белки стрептококков: Клонирование генов, характеристика и практ. использование белков, экспрессируемых в E. coli»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Изучение патогенных стрептококков и вызываемых ими заболеваний продолжает оставаться одной из актуальных задач теоретической медицины и практического здравоохранения. Это объясняется весьма широким распространением стрептококкового носи-тельства и стрептококковых заболеваний практически во всех странах мира, как в форме первичных инфекций, так и их осложнений токсической, септической, аллергической и иммунологической природы.

Стрептококки разных серогрупп занимают лидирующее положение в инфекционной патологии, вызываемой бактериями. Они вызывают такие распространенные заболевания, как ангины, фарингиты, скарлатина, сепсис, стрептодермии, ревматическая лихорадка, ревматическое заболевание сердца, острый гломерулонефрит, менингит, хорея, а также гнойные поражения органов и тканей. Клиническое разнообразие форм стрептококковых заболеваний варьирует в зависимости от биологических особенностей возбудителя, условий формирования очага инфекции и состояния организма инфицированного хозяина. Распространенность перечисленных заболеваний в большинстве стран и связанная с ними хроническая патология и инвалидизация части населения представляют не только медицинский, но и экономический интерес.

В настоящее время накоплена значительная информация о структуре клеток стрептококка, о биологических свойствах их антигенов, токсинов и энзимов. Большое развитие получили исследования по идентификации клеточных компонентов данных микроорганизмов, по клинической и эпидемиологической иммунологии и иммунопатологии стрептококковых заболеваний. Однако наши знания относительно механизмов патогенности и вирулентности стрептококков нуждаются в дальнейшем накоплении и развитии, так как прогресс в понимании молекулярных основ их патогенности, безусловно, отстает по сравнению с большин-

ством других бактериальных систем. В связи с изложенным актуальность углубленного изучения стрептококков не может вызывать сомнений.

Как и в случае всех инфекционных заболеваний, патогенез стрептококковых инфекций является итогом взаимодействия биологических систем организма хозяина и микроба. К числу биологически активных веществ патогенных стрептококков в первую очередь следует отнести многие вещества белковой природы, секретируемые микробной клеткой или входящие в состав ее клеточной стенки.

Хорошо известно, что вирулентность стрептококков групп А, С и О коррелирует с их способностью продуцировать на поверхности ряд белков. Однако роль всех стрептококковых белков в патогенезе, не исключая таких хорошо известных белков, как М белок стрептококков групп А, С, и О до сих пор недостаточно' хорошо изучена. Более того, знания о стрептококках и механизмах их вирулентности, которые казались совсем недавно очевидными, сейчас подвергаются сомнению.

Еще совсем недавно считалось, что поверхностные фибриллы вирулентных штаммов стрептококков представлены исключительно М белком, однако в составе клеточной стенки уже сейчас обнаружены разнообразные структуры белков и ферментов. С самим же М белком, входящим в состав группы М подобных белков наиболее вероятно связана способность связывать фибриноген организма хозяина. При этом уменьшается диспозиция СЗЬ на бактериальной поверхности. Это свойство помогает стрептококку избежать фагоцитоза.

Кроме классического М белка большая группа белков, гомологичных по своей структуре М белкам, в частности, ^О-связывающие белки, относятся к семейству М подобных белков. Штаммы стрептококков группы А могут экспрессировать один, два или три М подобных белка, гены которых локализованы последовательно на стрептококковой хромосоме. На настоящий момент принято разделение всех штаммов СГА по характеру организации генетической области, прилежащей к етш, на два класса. Фенотипически эти классы

различаются по способности экспрессировать OF белок. OF" штаммы обычно имеют только один emm подобный ген, и для этих штаммов продукт этого гена имеет антифагоцитарные свойства. OF штаммы экспрессируют два или три M подобных белка и разделение антифагоцитарной функции между ними не всегда является легкой задачей.

Практически все исследования, связанные с клонированием генов M белков CFA, выполнены на OF" штаммах. В силу того, что OF+ и OF" штаммы стрептококка различаются по структуре клеточной стенки, антигенности M белка, по количеству emm подобных генов, очевидно, что данные, полученные для OF" штаммов, не могут быть автоматически распространены на группу OF" штаммов.

IgG Fc-евязывание известно не только для СГА, но и для стрептококков групп С и G. Большинство штаммов стрептококков групп С и G экспрессируют белок G - IgG-связывающий белок. Он связывает, в отличие от стафилококкового белка А, все подклассы человеческого IgG, IgG многих видов млекопитающих и человеческий альбумин. Роль IgG Fc-евязывающих рецепторных белков в патогенезе стрептококковых инфекций еще не очень понятна. Однако благодаря своей способности связывать плазменные белки человека, как Fc-рецепторные белки СГА, так и G белок, имеют большое прикладное значение.

Таким образом, помимо изучения структуры и функции конкретных генов, изучения их роли в патогенезе стрептококков той или иной группы, большую роль приобретает получение биологически активных белков, кодируемых данными генами, которые являются высоко актуальными для клиники и диагностики, для целей иммунологии, иммунохимии и биотехнологии.

Все выше сказанное определило цели и задачи настоящего исследования.

Целью настоящей работы явилось изучение разных типов рецепторных белков патогенных стрептококков, как относящихся к вирулентности штаммов разных серогрупп, так и актуальных для клинико-лабораторной практики и биотехнологии.

Для этого планировалось выполнить следующие задачи:

1. Осуществить клонирование генов двух поверхностных рецепторных белков, М белка и Fc-рецептора, стрептококка группы А, потенциально принимающих участие в реализации вирулентного фенотипа.

- осуществить клонирование гена М белка 12 серотипа в конъюгативной плазмиде pVI 101

- создать двурепликонные плазмидные векторы, позволяющие клонировать стрептококковые гены в E.coli и в стрептококке группы Н. С использованием такого рода векторов показать экспрессию гена М белка 12 серотипа в стрептококке группы Н.

- осуществить клонирование emm подобных генов, М белка и Fc-рецептора, стрептококка группы А М 48 OF+ штамма в фаговом и плазмидном векторах.

2. Осуществить клонирование гена G белка стрептококка группы G в фаговом и плазмидном векторах.

- осуществить клонирование гена, кодирующего двуфункциональный G белок, способный реагировать с IgG и с альбумином человека;

- осуществить клонирование фрагмента гена, кодирующего монофункциональный IgG- связывающий G белок;

- осуществить клонирование фрагмента гена, кодирующего монофункциональный белок, способный связывать сывороточный альбумин человека.

3. Создать высокоактивные штаммы-продуценты перечисленных рецепторных белков. Выделить и очистить рецепторные белки, охарактеризовать их физико-химические и специфические свойства.

4. Создать на основе рецепторных белков новые реагенты для аффинной хроматографии.

5. Создать на основе альбуминового рецептора диагностические тест-системы для определения концентрации альбумина в биологических жидкостях человека.

Научная новизна.

Научная новизна работы состоит в том, что:

1. Впервые проклонированы emm подобные гены, гены М белка и Fc-рецептора, стрептококка группы А М48 серотипа OF+ штамма в гетерологичной системе E.coli и показано, что проклонированный ген М белка кодирует антифагоцитарные детерминанты.

2. Создана группа двурепликонных плазмид, позволяющих клонировать стрептококковые гены в клетках E.coli и в стрептококке группы Н. С использованием такого рода векторов впервые показана экспрессия гена М белка 12 серотипа стрептококка группы А в стрептококке группы Н. Благодаря трансмиссибельности гибридных плазмид впервые осуществлен конъюгативный перенос гена М белка стрептококка группы А в стрептококк группы D и показана его экспрессия в стрептококке группы D.

3. Впервые осуществлено клонирование полноразмерного гена G белка, обладающего двумя функциональными активностями в гетерологичной системе E.coli, в результате чего получен и проанализирован G белок, оказавшийся слитым с ß-галактозидазой.

4. Впервые в нашей стране осуществлено клонирование отдельных фрагментов гена G белка в гетерологичной системе E.coli, в результате чего получены и проанализированы IgG-связывающий и альбумин-связывающий белки.

5. Впервые созданы штаммы-продуценты IgG-связывающего белка и альбуминового рецептора.

6 Впервые в нашей стране выделены высокоочищенные препараты альбумина и IgG человека аффинной хроматографией с использованием полученных рекомбинантных белков в качестве лигандов.

7. Впервые созданы диагностические тест-системы для определения концентрации альбумина в биологических жидкостях человека на основе рекомбинантного альбуминового рецептора.

Теоретическая ценность работы.

Работа носит теоретический характер. В части работы, посвященной изучению генов вирулентности стрептококков группы А осуществлено клонирование и анализ генов М подобных белков, М белка и Бс-рецептора, в фаговом и плазмидном векторах.

Это исследование является важным с теоретической точки зрения, так как оно касается генов, принадлежащих к ОБ позитивным штаммам стрептококков, которые пока недостаточно изучены. Детальное изучение различных поверхностных белков - потенциальных факторов патогенности и накопление сравнительных данных о генетических и биологических характеристиках различных поверхностных белков, выделенных из разных штаммов, поможет понять всю сложность действия факторов патогенности стрептококков. Анализ свойств различных поверхностных белков стрептококков в сопоставлении с вызываемыми ими заболеваниями должен помочь в определении путей, по которым бактерия атакует организм хозяина.

Практическая ценность.

Проведенные исследования позволили создать активные штаммы-продуценты связывающего белка и альбуминового рецепторного белка, актуальные для биотехнологии и клинико-лабораторной практики. Разработаны условия получения больших количеств ре-цепторных белков, которые могут быть использованы как лиганды в аффинной хроматографии. Получены два патента на изобретение: патент № 2056859 "Рекомбинантный ^О-связывающий О белок стрептококка группы С, зарегистрированный 27 марта 1996 г., патент № 2065746 "Рекомбинантный НБА-рецептор стрептококка группы в," зарегистрированный 27 августа 1996 г. Составлена и утверждена научно-техническая документация на

производство рекомбииантного G белка от 13 июня 1997 г. На основании использования альбумин-связывающего белка созданы два варианта тест-системы, позволяющие проводить раннюю диагностику диабетической нефропатии. Подготовлена документация для регистрации и сертифицирования в Государственном Научно-исследовательском Институте Стандартизации и Контроля медицинских и биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича им-муноферментной тест-системы для определения микроальбуминурии. Эффективность, высокая специфичность и чувствительность указанной тест-системы подтверждена положительными актами апробации из ряда практических клинических лабораторий различных регионов России. Получено положительное решение на изобретение "Способы определения альбумина в биологических жидкостях" от 19 ноября 1996 года.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Проклонированный ген М белка OF+ М 48 серотипа кодирует антифагоцитарные детерминанты, а соответствующий М белок содержит протективные эпитопы.

2. Проклонированный ген IgG Fc-рецептора стрептококка М 48 в E.coli подтверждает наличие в OF+штаммах нескольких М подобных белков.

3. Создана группа двурепликонных плазмид, с помощью которых можно осуществлять клонирование генов стрептококков в клетках E.coli и в стрептококке группы Н. С использованием такого рода векторов показана экспрессия гена М белка 12 серотипа стрептококка группы А в стрептококках группы Н.

4. Проклонированные части гена G белка стрептококка группы G кодируют определенные функциональные белки, обладающие способностью связывать только IgG или альбумин.

5. G белок, способный связывать все четыре подкласса IgG человека и IgG большинства млекопитающих, в отличие от белка А, сможет заменить А белок в диагностических тест-системах, тем самым повышая их чувствительность.

6. Созданы высоко специфичные тест-системы для определения концентрации альбумина в биологических жидкостях на основе альбуминового рецептора.

Достоверность полученных результатов подтверждается высокой специфичностью использованных молекулярно-биологических методов исследования (ДНК-ДНК гибридизация, секвенирование ДНК, иммунологические методы анализа и т.д.), которые в совокупности позволяют однозначно трактовать полученные результаты.

Апробация работы.

Материалы диссертации опубликованы в 38 научных работах и многократно доложены и обсуждены на различных Российских и Международных конференциях и симпозиумах: II Международный конгресс по генетике стрептококков в США, Флорида, 1986; Всесоюзный симпозиум в Ленинграде "Стратегия возбудителя в организме хозяина", 1987; "Новые направления в биотехнологии", Пущино - на - Оке, 1992; XII Ленсфильдовский Международный симпозиум по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям, Санкт-Петербург, Россия, 1993; " Биотехнология, Санкт-Петербург-94", Санкт-Петербург, 1994; "Российский съезд специалистов по лабораторной диагностике", Москва, 1995; "Новые методы в микробиологии", Кошице, Словакия, 1995; III Нефрологический семинар, Санкт-Петербург, 1995; IY Нефрологический семинар, Санкт-Петербург, 1996; XIII Ленсфильдовский Международный симпозиум по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям, Париж, 1996; "Новые направления в биотехнологии", Международная конференция, Пущино - на - Оке, 1996, Y Нефрологический семинар, Санкт-Петербург, 1997; Результаты работы докладывались на заседаниях отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН.

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 251 странице, включающих введение, литературный обзор, материалы и методы, собственные исследования и их обсуждение, заключение, выводы и указатель литературы. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 51 рисунком. Список литературы содержит 386 источников, в том числе 12 отечественных.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Гупалова, Татьяна Витальевна

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Стрептококки разных серогрупп занимают лидирующее положение в инфекционной патологии бактериальной природы. Стрептококковая заболеваемость характеризуется сезонностью и циклическим течением. Ежегодно десятки миллионов людей страдают от стрептококковых заболеваний, которые имеют склонность к хронизации. Один и тот же вид микроорганизмов способен вызывать широкий спектр различных заболеваний. Вероятно, это происходит за счет вовлечения в процесс множества факторов патогенности стрептококка. На фоне изучения болезнетворных свойств и функций отдельных компонентов клеточной стенки микробов особую важность приобрели рецепторные белки клеточной стенки стрептококков групп А, В, С и О, способные связывать сывороточные белки млекопитающих. Подобного рода связывание рассматривается, как форма реализации разных патогенных признаков микроба, хотя механизмы соответствующих функций далеки еще от понимания.

Для того, чтобы понять молекулярные процессы, стоящие за этим взаимодействием, необходимо детальное исследование всех потенциальных факторов патогенности стрептококков и прежде всего поверхностных белков этих микроорганизмов, так как они первыми встречаются с белками млекопитающих. Патогенетические функции многих из них нуждаются в определении и дальнейшем изучении. Изучения генетики патогенных стрептококков до самого последнего времени практически не происходило. Основной причиной тому служила сложность осуществления основных генетических методик на стрептококках, которые использовались в классической генетике для других бактерий. Основными трудностями являются : ограниченность генетического обмена у стрептококков ( у патогенных стрептококков групп А, В, С и в отсутствует природная трансформация и Б+ зависимая конъюгация, не показана специфическая трансдукция), что длительное время тормозило изучение генома

этого микроба классическими методами; наличие генетических повторов в нуклеотидной последовательности генов, кодирующих многие поверхностные белки клеточной стенки, что приводит к их модификации за счет внутри- и межгенных рекомбинаций и к антигенной гетерогенности белков; генетический полиморфизм стрептококков по ряду признаков, что сопряжено с трудностями интерпретации данных, полученных на одном варианте стрептококка группы А в отношении других штаммов; наличие сходных форм биологической активности у стрептококковых белков, кодируемых разными генами.

Появление генно-инженерной методологии с возможностью осуществления клонирования генов и отдельного их изучения произвело переворот в исследованиях стрептококков. За достаточно короткий срок проклонировано значительное количество генов стрептококков групп А, С, и G (что отражено в обзоре литературы). Тем не менее информация о вкладе разных генов в формирование вирулентного фенотипа нуждается в серьезном расширении. Наиболее известным поверхностным белком является M белок, считающийся одним из ведущих факторов вирулентности стрептококков группы А, ответственный за способность стрептококков противостоять фагоцитозу. Кроме классического M белка большая группа белков, гомологичных по своей структуре M белкам, в частности Ig-связывающие белки, относятся к семейству M подобных белков. Штаммы стрептококков группы А экс-прессируют один, два или три M подобных белка [267], гены которых локализованы последовательно на стрептококковой хромосоме. Многие OF- штаммы содержат только ген, кодирующий M белок. Во всех OF+ штаммах mga регулон содержит три emm подобных гена: mrp, emm и enn [188] (рис.2), где центрально локализованный emm ген кодирует M белок. Ig-связывающие белки кодируются всеми тремя типами emm подобных генов. Большинство исследований, связанных с клонированием генов M белков стрептококков группы А, выполнено на OF- штаммах. Показанные выше отличия OF+ и OF- штаммов говорят о том, что получаемые данные на OF- штаммах, вряд ли могут быть автоматически перенесены на

группу 0Б+ штаммов. Отсюда вытекает необходимость специального изучения М подобных белков ОБ+ штаммов.

Помимо изучения структуры и функции конкретных генов большую роль приобретает получение чистых биологически активных белков, кодируемых данными генами, высоко актуальных для клиники и диагностики, для целей иммунологии, иммунохимии и биотехнологии.

В соответствии с вышеизложенным в данной диссертационной работе был поставлен ряд актуальных задач по клонированию генов факторов вирулентности стрептококков группы А ОР+ штамма - генов М белка и Рс-рецепторного белка - двух М подобных белков, клонированию генов альбумин- и иммуноглобулин-связывающих пептидов стрептококка группы О, созданию штаммов продуцентов этих белков, выделению и характеристике этих белков, их использованию в клинико-лабораторной диагностике и биотехнологии.

Первой задачей настоящей работы явилось клонирование гена М белка в плазмидном векторе. С этой целью была использована плазмида рУ1101 - спонтанный делеционный дериват плазмиды рЕЬ1. Как и исходная плазмида, рУ1 101 детерминирует резистентность к МЛС-антибиотикам, передается конъюгативноподобным процессом, как в пределах одной группы стрептококков, так и в межгрупповых скрещиваниях, и стабильно реплицируется с экспрессией МЛС-типа устойчивости в трансформантах СЬаШв 57. Плазмида рУ1 101 содержит один сайт для эндонуклеазы Есо!11, который был использован для получения гибрида этой плазмиды с плазмидой рРС 124. Цель подобного конструирования заключалась в получении гибридной плазмиды, способной реплицироваться в стрептококках, исследовании экспрессии М белка 12 серотипа в стрептококках и в изучении трансмиссибельности гибридной плазмиды.

Плазмиды рУ1 101 и рРС 124 были рестрицированы эндонуклеазой ЕсоЯ I и лигиро-ваны ДЕЖ-лигазой фага Т4. Лигированной смесью была проведена трансформация клеток

Е.соИ штамма НВ 101. Трансформанты генотипа Арк Етк, обозначенные рРСУ1, были проверены на экспрессию методом колоний блоттинга. В большей части рРСУ1 трансформантов М белок экспрессировался, что свидетельствовало о сохранности последовательности ДНК, кодирующей этот белок в гибридных плазмидах. Из М+ и М- трансформантов были выделены 16 плазмидных ДНК. Для исследования полученных плазмид на способность автономно реплицироваться в стрептококках они были апробированы в трансформации штаммов ОгаШв 57, ОБ 10.1. Из 16 использованных для трансформации плазмид, лишь три приводили к трансформации штамма СЬаШэ 57 и все 16 трансформировали штамм ОБ 10.1.

Встраивание Ешк гена в хромосому штамма ОБ 10.1 происходила, по-видимому, за счет гомологии ДНК штамма-реципиента с ДНК стрептококковых плазмид, содержащих ген Еш11. Етк Трансформанты штаммов СЬаШэ 57 и ОБ 10.1 были исследованы на экспрессию М белка. Экспрессия М белка была обнаружена только в трансформантах, содержащих плазмиды рРС\Т-1002 и рРСУ1-1004.

По числу исследованных признаков, детерминируемых гибридными ДНК, плазмиды были разделены на три группы (таблица 4). Плазмиды всех групп содержат маркеры анти-биотико-резистентности Ара Етк, плазмиды двух групп (первая и третья в таблице) содержат проклонированную последовательность гена М белка 12 серотипа и и одна группа плазмид (третья в таблице) не содержит репликатора для стрептококков.

Поскольку плазмида рУ1 101 является трансмиссибельной плазмидой, было интересно выяснить сохранилось ли это ее свойство в гибридных плазмидах. С этой целью была осуществлена попытка переноса плазмид рРСУ1-1002 и рРСУ1-1004 из трансформантов СЬаШв 57 в стрептококк серогруппы Б. В трансконъюгантах штамма Ш2-2 (группа Э) была обнаружена экспрессия М белка.

Таким образом, в результате клонирования гена М белка в плазмидном векторе рУ1 101, были созданы интегративные векторы, с использованием которых была впервые про-

демонстрирована экспрессия гена М белка 12 серотипа стрептококка группы А не только в штаммах E.coli, в которых первоначально был проклонирован этот ген, но и в клетках стрептококков групп Н и D. Учитывая высокую стабильность интегрируемых последовательностей ДНК при клонировании, использование интегративных векторов в биотехнологических целях представляется крайне перспективным.

Опыты по исследованию трансформантов группы Н (Challis 57), экспрессирующих М белок, в бактерицидном тесте показали, что синтезируемый в них белок не обладал антифагоцитарной активностью. Этот факт можно объяснить, вероятно тем, что проклонирован-ный в плазмиде ген М белка 12 типа, не является полноразмерным геном М белка, что было показано в работе Cleary.

Дальнейшим этапом работы явилась попытка проклонировать полноразмерный ген М белка. В соответствии с тем, что выше было сказано о важности изучения М подобных белков OF+ штаммов для клонирования гена М белка был выбран OF+ штамм стрептококка группы А.

Был создан банк хромосомных генов стрептококка группы А серотипа М 48 штамма 1/64 в Ecoli в векторе замещения бактериофага X L47.1. Идентификация рекомбинантных клонов, содержащих ген М белка, была проведена методом гибридизации in situ. В качестве зонда был использован радиоактивномеченый ген М белка 12 серотипа. Параллельно с гиб-ридизационным скринингом для идентификации рекомбинантных клонов, продуцирующих М белок, были использованы анти-рер сыворотки, которые перекрестно реагируют с М белками нескольких серотипов, включая М белок М 48. Из 1750 проанализированных клонов только три реагировали с анти-рер сыворотками и гибридизовались с радиоактивномеченым ДНК-зондом. Три отобранных фаговых клона были проверены в блоттинге на способность связывать фибриноген, меченный пероксидазой. Все клоны показали положительную реакцию.

Приведенные данные позволили предположить, что в этих рекомбинантных клонах содержится ген М белка 48 серотипа.

Было проведено картирование вставочного фрагмента гибридного фага 48 Б эндо-нуклеазой Hind III. Вставка хромосомной ДНК стрептококков гидролизовалась этой эндо-нуклеазой на 5 фрагментов, для которых были определены молекулярные размеры. Эксперименты по Саузерн гибридизации показали локализацию гена М белка в третьем Hind III фрагменте фага 48 Б.

На основании данных гибридизации была построена карта рекомбинантного фага 48 Б. ДНК фага 48 Б имеет два первых Hind III фрагмента лямдоидного происхождения. Третий фрагмент, в котором локализована последовательность гена М белка 48 серотипа, содержит область гомологии с Я L47.1, что указывает на его краевое расположение во вставочном Ваш HI-Sau ЗА фрагменте гибрида.

Далее было проведено клонирование фрагмента cl в векторной плазмиде E.coli PBR 322. Клоны E.coli, ДНК которых интенсивно гибридизовалась в дот-экспериментах, были проверены в иммуноблоттинге с анти-рер Ml сывороткой. Ряд клонов E.coli, содержащих гибридные плазмиды PBR 322 со вставками Hind III фрагментов ДНК фага 48 Б, положительно реагировали с анти-рер Ml сывороткой, причем ДНК этих же клонов наиболее интенсивно гибридизовалась с меченой ДНК фага 48 Б. Из одного клона была выделена ДНК, вставочный фрагмент которой был 6 т.н.п. То есть на основании этих данных было сделано заключение, что в гибридных плазмидах клонов E.coli удалось проклонировать фрагмент cl Hind III гидролизата ДНК фага 48 Б, содержащего ген М белка 48 серотипа.

Для проверки того, что полученные гибридные клоны продуцируют функционально полноценный М белок, были выполнены эксперименты по изучению специфического влияния экстрактов рекомбинантных клонов E.coli на опсонизирующую способность сыворотки анти-М 48. Стрептококки М 48 типа штамма 1/64 активно размножались в крови донора, не

содержащей соответствующих антител к белку М 48. Выживаемость клеток составила 170220 %. При добавлении сыворотки анти М 48 к стрептококковым клеткам последние опсо-низировались и фагоцитировались при экспозиции в крови использованного донора. Экстракты клонов Е coli с гибридными плазмидами, несущими вставки гена белка М 48, специфически удаляли анти-М 48-антитела, что приводило к росту (отсутствие фагоцитоза) стрептококков типа М 48 штамма 1/64. Выживаемость стрептококковых клеток в этом случае составляла 90-208 %. Экстракт контрольной культуры Ecoli (pBR 322) не удалял опсонизи-рующие антитела 48 типа, поэтому стрептококки не размножались, а полностью опсонизи-ровались и фагоцитировались при экспозиции в донорской крови. Эти данные указывают на то, что проклонированные фрагменты стрептококковой ДНК содержат достаточно информации для кодирования антифагоцитарных детерминант М белка.

Для подтверждения этой мысли важным оказалось то, что проклонированный ген М белка кодировал белок, который был иммуногенен для кроликов и вызывал образование антител, которые опсонизировали стрептококки М48 типа, то есть обладали протективным эффектом. Следовательно, проклонированный в фаге 48 Б ген М белка, кодировал белок, содержащий протективные эпитопы.

На основании вышеизложенного (результаты гибридизации, иммуноскрининга и тестов по опсонизации) было сделано заключение, что в рекомбинантном фаге 48 Б содержится полноценный структурный ген М белка 48 серотипа. Поскольку один и тот же OF+ штамм стрептококков группы А может экспрессировать помимо М белка другой М подобный белок, в частности IgG-связывающий белок, нам представилась возможность выявить в сконструированной библиотеке хромосомных генов стрептококка М 48 серотипа ген IgG Fc-рецептора, который часто близко сцеплен на хромосоме с геном М белка. Кроме того уже давно ряд авторов [3, 145, 379, 380] показал, что уникальные белки на поверхности определенных бактерий способны связываться с высокой аффинностью с Fc-частью иммуноглобу-

линов ряда млекопитающих и человека. При этом взаимодействии бактериальных Fc-рецепторов с детерминатами константного участка тяжелой цепи молекул Ig не влияет на способность антитела узнавать соответствующий антиген. Это свойство придает бактериальным рецепторам особую ценность при использовании их в качестве "метки" для количественного и качественного определения комплексов антиген-антитела. В настоящее время в большинстве исследований такого рода используется белок А стрептококка S aureus, обнаруженный на поверхности или секретируемый многими штаммами этого вида бактерий [100, 114, 235]. Важность белка А в качестве коммерчески доступного и широко применяемого в настоящее время иммунохимического реагента не вызывает сомнений, однако, существуют и некоторые ограничения его использования. Главное из них заключается в том, что белок А не способен связывать подкласс IgG 3 иммуноглобулинов человека.

Именно поэтому появился интерес к другим бактериальным Fc рецепторам, в частности, к Fc рецепторным белкам стрептококков группы А, способных связываться с иммуноглобулинами человека всех четырех подклассов.

Клонирование гена Fc-рецепторного белка стрептококка группы А М 48 типа способствовало бы, во-первых, подтверждению факта наличия у одного OF+ штамма двух или более emm подобных генов, во-вторых способствовало бы продолжению работ относительно роли IgG Fc-рецепторного феномена в развитии иммунопатологических процессов при заболеваниях стрептококковой этиологии, к настоящему времени еще четко не выявлена корреляция между экспрессией Fc рецепторного белка штаммами стрептококка группы А и выраженностью их патогенных свойств [53, 379], в третьих, помогло бы в разработке на основе Fc-рецепторного белка новых методов диагностики.

Перечисленные факты явились основанием для исследования генетического детерминирования феномена IgG Fc-рецепции.

В библиотеке хромосомных генов стрептококка М 48 серотипа были выявлены ре-комбинантные фаговые клоны, несущие генетические детерминанты FcR белка. При скрининге был использован человеческий IgG, меченный пероксидазой. Фрагменты одного из рекомбинантных фаговых клонов, а именно X 2-7 были субклонированы в E.coli в плазмид-ном векторе pBR 322. Путем клонирования неполного Hind III перевара ДНК фага X 2-7 в Hind III сайте векторной плазмиды была получена рекомбинантная плазмида р 22, экспрес-сирующая FcR-белок. Вставочный фрагмент хромосомной ДНК стрептококка в плазмиде р 22 размером около 5.0 т.н.п. был картирован с использованием ряда эндонуклеаз.

На основании сопоставления данных одиночных и двойных переваров ДНК р 22 построена физическая карта локализации сайтов гидролиза использованных эндонуклеаз во вставочном фрагменте хромосомной ДНК стрептококка. После построения рестрикционной карты плазмиды р 22 возникла необходимость более точного определения размера FcR гена и направления считывания. Hind III фрагменты 2.7 и 2.2 т.н. п. были проклонированы в pBR 322 и pUC 8 соответственно. Соответствующие им плазмиды не вызывали экспрессии FcR белка. Тогда как плазмида р 3101, содержащая только Bgl II фрагмент ( 2.7 т.н.п. ), сконструированная на основе pUC 8 и р 22, экспрессировала FcR белок. Уровень экспрессии в ре-комбинантном фаге X 2-7 и в E.coli HB 101, содержащей р 22 и р 3101, не менялся. Он не изменился и в E.coli с р 3101 и р 3102. Эти плазмиды отличались инверсией вставочного Bgl II фрагмента в pUC 9. В векторе pUC 8 был проклонирован 1.2 Pst I фрагмент из р 22. Плазмиды р 4101 ир4102, имеющие разные направления вставки в векторе, не отличались между собой по уровню экспрессии, общий же уровень экспрессии в этих случаях был ниже, чем при использовании плазмид р 3101 ир3102.

Для определения молекулярного веса FcR А48, экспрессируемого плазмидой р 22, был проведен вестерн-блотт анализ лизата культуры E.coli, содержащей р 22. В результате было обнаружено два фрагмента, более интенсивный из них имел молекулярный вес при-

мерно 41 kD, молекулярная масса второго составляла 38 kD. Оба эти фрагмента были проанализированы на способность связывать фибриноген. Ни один из них фибриноген не связывал.

Полученные результаты подтверждают, что ген, кодирующий FcR А48 белок из стрептококка группы A M 48 типа, может быть клонирован и экспрессирован в E.coli. Гибридизация с зондом, содержащим часть fer А76 гена, говорит в пользу гомологии между генами FcR белков из стрептококков разных серотипов. В то же время сравнение рестрикци-онных карт fer А76 и fer А48 генов и данных о молекулярных весах соответствующих им белков (46 kD для FcR А76) [145] и (41 kD для FcR А48) позволяют судить и о значительных отличиях в их структуре и нуклеотидной последовательности. В целом сравнительный анализ fer А76 и fer А48 генов позволяет судить об их частичной гомологии и о наличии существенных различий, являющихся результатом, вероятнее всего, межгенных рекомбинаций fer А и ешш генов.

Таким образом, в этой части работы было осуществлено клонирование и анализ генов M белка и M подобного белка в фаговом и плазмидных векторах. Это исследование является важным с теоретической точки зрения, поскольку оно касается изучения генов, принадлежащих к OF позитивным штаммам стрептококков, которые пока недостаточно изучены. Кроме того, эта работа имеет перспективы для дальнейших исследований. Было бы интересно выяснить истинное расположение генов M белка и Fc-рецептора в mga регулоне стрептококка серотипа M 48, а также осуществить определение нуклеотидной последовательности детерминант, обеспечивающих синтез протективных эпитопов на M или M подобном белке.

По своей избирательной способности связывать IgG только ограниченного числа млекопитающих, помимо человека, FcR А занимает исключительное положение в силу, по-видимому, уникальности стрептококков данной группы, поскольку, именно они являются

возбудителями большого числа нозологических форм, специфических в патологии человека. Это и определило необходимость исследований биологических свойств IgG FcR А с целью изучения их роли в патогенезе стрептококкового патологического процесса. Такие исследования ведутся сотрудниками Отдела молекулярной микробиологии.

Но как было показано IgG Fc-рецепторы стрептококков группы А могут иметь и большое прикладное значение.

Однако, Fc—рецептор III типа, так называемый G белок, стрептококков групп С и G, в отличие от Fc-рецепторов стрептококка группы А обладает большей аффинностью относительно IgG человека и, кроме того, он обладает более широким спектром связывания млекопитающих. Поэтому с целью получения более активного, обладающего большей аффинностью, IgG-связывающего рецептора, следующей задачей работы явилось клонирование полноразмерного гена G белка.

Помимо изучения структуры и функции конкретных генов, кодирующих поверхностные рецепторные белки, большую роль приобретает получение чистых, биологически активных продуктов для целей патогенетических исследований, для создания биотехнологических продуктов и расширения возможностей клинико-лабораторной диагностики.

Белок G - это молекула с уникальными связывающими свойствами. Присутствие на бактериальной клеточной стенке белка с раздельными специфическими сайтами для IgG и альбумина обуславливает значительный интерес к этому белку и с биологической и с прикладной точек зрения. Благодаря раздельно расположенным сайтам на молекуле G белка, альбумин-связывающая область и IgG Fc-связывающая часть белка могут быть разделены как химическими, так и генно-инженерными приемами. Низкий уровень и значительная гетерогенность экспрессии G белка стрептококка группы G осложняет их выделение обычными физико-химическими методами. В связи с этим наиболее прямым и эффективным решением задачи получения G белка могло бы быть клонирование соответствующего гена. Ре-

комбинантные бактериальные клоны, способные продуцировать большее количество генно-инженерного продукта, должны иметь особенно важное значение также в связи с тем, что способность продуцировать в белок стрептококками групп Сив может теряться при лабораторном пассировании, а продуцирующие эти белки, бактерии патогенны для человека.

В работе был проклонирован полноразмерный ген О белка с последующим субклонированием фрагментов гена, ответственных за альбумин- и ¡^-связывание с целью получения высокоочищенных белков с высокой аффинностью и специфичностью.

Для этого был сконструирован банк хромосомных генов стрептококка группы в штамма О 148, продуцирующего в белок в векторе замещения бактериофага ЕМВЬ-ЗА. Для анализа полученного банка генов был использован скрининг методом колоний-блоттинга с использованием меченного пероксидазой хрена, позволяющим проводить идентификацию рекомбинантных клонов по экспрессируемому продукту. В результате такого скрининга был отобран фаговый клон, дающий наибольшую экспрессию ^О-связывания. Из положительного клона была выделена ДНК и затем был проведен ряд последовательных этапов субклонирования, чтобы ограничить рамки гена в белка, отвечающего за связывание как

так и за связывание альбумина. Контроль функциональных активностей связывания и ЧСА проводились на каждом этапе клонирования. В результате был отобран клон в белка - Зв, обладающий обеими связывающими активностями. Размер фрагмента гена О белка, кодирующего двуфункциональный белок, составил 1.5 т.н.п.

При анализе структурной и рестрикционной карты гена О белка, оказалось, что этот фрагмент не кодирует сигнальную последовательность и соответствующую промоторную область. Исходя из этого факта, проклонированный 1.5 т.н.п. фрагмент должен кодировать белок, связывающий ^О, но не альбумин за счет существования регуляторных областей, включающих промотор и рибосомальные связывающие последовательности, функциональные в Е.соН. Один такой возможный промотор локализован на позициях 455-478 (130). По-

следовательность Хогнесса -35 (ТТГАЦА) идентична последовательности в E.coli, а возможная последовательность Прибноу (ТАГТАЦ) подобна соответствующей последовательности в E.coli (ТАТААТ) [130]. Положение обеих последовательностей разделяются 17 нук-леотидными парами, что характерно для промоторов E.coli (16-18 п.н.)

В нашем же случае 1.5 т.п.н. фрагмент кодировал G белок, связывающий как IgG, так и альбумин. Поэтому было сделано предположение, что проклонированный фрагмент кодирует слитый белок с ß-галактозидазой. Для доказательства этого было проведено клонирование 1.5 т.н.п. фрагмента в плазмидный вектор р SP64.

В результате клонирования, благодаря свойствам выбранного вектора, та же самая 1.5 т.п.н. вставка кодировала белок меньшего молекулярного веса, который связывал только IgG, но не связывал альбумин. Это явилось доказательством того, что полученный 65 kD белок, обладающий двумя функциональными активностями, является слитым белком с ß-галактозидазой.

Состыковка с ß-галактизидазой обычно приводит к повышению стабильности чужеродного белка в бактериальных клонах, поэтому во многих работах клонируемую ДНК соединяют в составе экспрессирующих векторов с фрагментом lac Z гена, содержащим промотор, участок связывания рибосом и триплеты нескольких первых аминокислот ß-галактозидазы E.coli, которые задают рамку трансляции клонированной кодирующей последовательности. При совпадении рамок трансляции ß-галактозидазы и клонированной ДНК в бактериальных клетках синтезируется целевой белок, но содержащий на N конце дополнительно несколько аминокислот ß-галактозидазы. При этом физико-химические и связывающие свойства белка могут сохраняться, как и произошло в нашем случае.

Дальнейшая работа была посвящена клонированию частей гена, ответственных за разные функциональные активности. В результате были проклонированы 0.7 т.н.п. фраг-

мент, кодирующий белок, связывающий только IgG и 0.64 т.н.п. фрагмент, ответственный за связывание альбумина. В результате ряда экспериментов были подобраны условия для извлечения IgG-связывающих и альбумин-связывающего рецепторных белков из клеток E.coli, условия максимального синтеза каждого рекомбинантного белка, проведена их очистка аффинной хроматографией. В ходе подбора условий культивирования для максимального выхода изучаемых белков оказалось, что для разных белков эти условия разные, что подтверждает значимость условий культивирования создаваемых рекомбинантных штаммов для достижения высокого уровня продукции чужеродного белка в бактериальной клетке. Все созданные рекомбинантные штаммы, продуцирующие IgG- и альбумин-связывающие рецепторы, согласно существующим критериям, являются штаммами продуцентами, причем самый большой выход белка из клеток E.coli был достигнут для монофункционального IgG-связывающего белка 7G. Препараты очищенных рецепторных белков были исследованы на способность связываться с иммуноглобулинами человека и с альбумином, определены константы связывания IgG-связывающих белков с IgG человека и альбуминового рецептора с альбумином человека. Результаты взаимодействия G белка и альбуминового рецептора с плазменными белками человека показали, что альбуминовый рецептор специфичен только лишь в отношении альбумина, тогда как IgG-связывающий белок связывает только IgG.

Было также показано, что монофункциональный и двуфункциональный белок G связывает все четыре подкласса IgG, в то время как А белок третий подкласс IgG не связывает, причем полученные данные позволяют заключить, что все препараты G белка связывают IgG 1, IgG 2, IgG 4 и поликлональный IgG более эффективно, чем белок А. Исследование способности G белка связывать, помимо IgG человека, IgG различных млекопитающих показало, что G белок обладает поливидовой активностью и с большей аффинностью связывает IgG кролика, козы, овцы, морской свинки, свиньи, лошади, собаки и не связывает только IgG кошки и птиц.

Как уже говорилось, белок А успешно используется в иммунохимии, в том числе и в иммуноферментном анализе. Белок А стабилен в растворимом и лиофилизированном состоянии, что позволило на его основе получить "универсальные" конъюгаты с пероксидазой и щелочной фосфатазой и использовать их аналогично меченым антивидовым (вторичным) антителам. Проведенные многочисленные исследования позволили сделать заключение, что конъюгат белка А может быть использован как заменитель антиглобулиновых антител во всех основных вариантах ИФА: при определении антител в прямых и непрямых тестах, индикации антигенов в иммуноблоттинге, при работе с растворимыми и фиксированными на клетках антигенами. Главным требованием для такой взаимозаменяемости явилось использование в тест-системе заведомо реагирующих с белком А иммуноглобулинов.

В исследованиях по изучению гуморального иммунного ответа в сероэпидемиологии и серодиагностике ИФА с меченым белком А способен давать хорошо воспроизводимые и сравниваемые результаты. В этой сфере исследований белок А обладает и рядом преимуществ перед мечеными антителами - меньшими значениями "фоновых" реакций, более высокой чувствительностью и большей экономичностью (на 1 стандартное исследование ИФА требуется не более 20 нг конъюгата). Однако белок А реагирует не со всеми подклассами 1§0 в одинаковой степени и не связывает третий подкласс 1^0 и, кроме того, его поливидовая активность ограничена, так как он активно связывает только кролика и свиньи. Использование О белка вместо А белка благодаря его явным преимуществам: связывание всех четырех подклассов человека с большей аффинностью и гораздо больших видов животных, позволит повысить чувствительность тест-систем.

Высокая специфичность полученных рецепторных белков позволила найти возможность использовать их в биотехнологии. Были созданы аффинные колонки. В качестве сорбента использовали сефарозу 4В. К ней присоединили как альбуминовый рецептор, так и монофункциональный О белок. Полученные препараты альбумина и 1§0, выделенные из

плазмы крови на аффинных колонках с соответствующим лигандом, показали высокую степень чистоты. Эти результаты доказали эффективность использования рецепторных белков в этом качестве. Все препараты рекомбинантных белков являются стабильными, могут храниться в растворах при 10° С в течение недели, в замороженном состоянии при -20° С и -70° С до 6 месяцев, могут быть легко лиофилизированы и в лиофилизированном состоянии храниться несколько лет.

Высокая степень специфического связывания альбуминового рецептора только с альбумином сыворотки крови человека позволили использовать его для создания тест-системы.

Как было отмечено, проблема диагностики микроальбуминурии в повседневной клинической практике в нашей стране до сих пор не решена. Были разработаны два варианта тест-системы для определения микроальбуминурии, используя метод блоттинга для скри-нингового обследования больных и метод гетерогенного конкурентного ИФА с заменой антител на альбуминовый рецептор.

Чувствительность тест-системы достигала 0.5 мкг/мл альбумина в моче, то есть созданная тест-система сможет выявлять количество альбумина в моче в пределах, включающих экскрецию альбумина в норме от 1 до 20 мкг/мл, и экскрецию альбумина в пределах микроальбуминурии в диапазоне 20-200 мкг/мл.

Разработанные тест-системы на основе альбуминового рецептора апробированы уже во многих клиниках Санкт-Петербурга. С помощью количественной тест-системы ведется определение микроальбуминурии у больных сахарным диабетом в процессе лечения, что является необходимым условием контроля течения болезни.

Данный метод позволяет выявлять микроальбуминурию у больных, у которых она не была выявлена при определении общего белка существующими методами, что отражено в таблице 13.

Два варианта тест-системы для определения микроальбуминурии при сахарном диабете можно использовать для проведения программы скрининга диабетической нефропатии. С помощью метода блоттинга можно очень быстро выявить среди больных сахарным диабетом группу риска развития диабетической нефропатии. Затем у выделенной группы больных с достоверной микроальбуминурией проводить количественные определения, которые необходимы на этапах проведения лечения микроальбуминурии для предотвращения прогресси-рования диабетичекой нефропатии.

5. ВЫВОДЫ

1. Осуществлено клонирование гена М белка 12 серотипа в конъюгативной плазмиде pVI 101. Создана группа двурепликонных плазмид, позволяющих клонировать гены стрептококков в клетках E.coli и в стрептококке группы Н.

Трансмиссибельность гибридных плазмид позволила осуществить конъюгативный перенос гена М белка стрептококка группы А в стрептококк группы D, в клетках которого показана экспрессия М белка.

2. Осуществлено клонирование гена М белка 48 серотипа OF позитивного штамма стрептококка группы А в фаговом и плазмидном векторах. Проклонированный в рекомби-нантном фаге, ген М белка 48 типа, кодирует антифагоцитарные детерминанты, а соответствующий экспрессирующийся М белок содержит протективные эпитопы.

3. Проведено клонирование второго emm подобного гена OF позитивного штамма М 48 типа стрептококка группы А - гена Fc-рецептора в системе E.coli, где показано наличие функционально активного белка. Построена физическая карта полученной рекомбинантной плазмиды, уточнены размеры гена Fc-рецептора переклонированием делеционных вариантов.

4. Осуществлено клонирование гена G белка стрептококка группы G в фаговом и плазмидном векторах. Путем клонирования 1,5 т.п.н. фрагмента гена, кодирующего полноразмерный белок G в вектор р SP64 доказано, что полученный белок является слитым белком с ß- галактозидазой и обладает двумя функциональными активностями.

5. Проведено клонирование отдельных фрагментов гена, ответственных за альбумин-и IgG-связывание в E.coli, где продемонстрировано наличие функционально активных белков.

6. Созданы штаммы-продуценты двуфункционального О белка, ^О-связывающего монофункционального в белка и альбумин-связывающего белка. Подобраны оптимальные условия для синтеза рекомбинантных белков и проведена их очистка аффинной хроматографией.

7. В результате аффинной хроматографии, лигандами для которой служили полученные рекомбинантные белки, как монофункциональный О белок, так и альбуминовый рецептор, выделены из плазмы человека препараты альбумина и ^О в высокоочищенном состоянии.

8. Впервые созданы высоко специфичные тест-системы для определения микроальбуминурии на основе альбуминового рецептора.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Гупалова, Татьяна Витальевна, 1998 год

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Анатолий С.А. Гиаулороновая капсула как один из факторов патогенности гемолитического стрептококка. Журнал микробиологии, 1977, 60, 3689-3696.

2. Беляков В.Д., Ходырев А.П., Тотолян A.A. Стрептококковая инфекция. М. Медицина, 1978, 294

3. Бурова Л.А., Тотолян A.A., Кристенсен П., Шален К. Иммуноглобулиновая Fc-рецеп-ция стрептококков и ее участие в постстрептококковых осложнениях. ЖМЭИ, 1984,10, 12-20.

4. Голубков В.И., Гупалова Т.В., Ионтова И.М., Колесниченко Т.Г., Суворов А.Н. Система для введения гетерологичных ДНК в хромосому стрептококков группы Н. Молекулю генет., микробиол., вирусол.,1985, 3, 30-34.

5. Голубков В.И., Гупалова Т.В., Нестерчук Л.Б., Суворов А.Н., Колениченко Т.Г. Клонирование гена М-белка в интегративных векторах. В кн.: "Стратегия возбудителя в организме хозяина", Л., 1987, 64-71.

6. Горбачев E.H., Вербов В.Н., Артюхов А.И. Влияние физико-химических факторов на чувствительность и специфичность иммуноферментного анализа. В кн. "Твердофазный иммуноферментный анализ", Л., 1988, 76-80.

7. Ионтова ИМ., Тотолян A.A. Серологические свойства стрептококковых липопротеиназ. Журн. микробиол., 1972, 3, 36-39.

8. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М., 1971,

9. Кульберг А.Я. Молекулярная иммунология, М. Высшая школа, 1985, 287 с.

10. Маниатис Т., Фрич Э., Самбрук Дж. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984.

11. Фримель Г. Иммунологические методы, пер. с нем., М. Медицина, 1987, 438-439.

12. Щелкунов С.Н. Конструирование гибридных молекул ДНК. Новосибирск, Наука, 1994.

13. Abrahmsen L., Moks T., Nilsson B., Hellman U., Uhlen M. Analysis of the secretion in the staphylococcal protein A gene. EMBO J., 1985, 4, 3901-3906.

14. Akerstrom B., Lindqvist A., Lindahl G., Binding properties of protein Arp, a bacterial IgA receptor. Mol. Immunol., 1991, 5, 393-400.

15. Akerstrom B., Lindahl G., Bjorck L., Lindqvist A. Protein Arp and protein H from group A streptococci: Ig binding and dimerization are regulated by temperature. J. Immunol. 1992, 148, 3238-3243.

16. Akerstrom B., Lindqist A., Vander Mallen V., Grubb A., Lindahl G., Vaerman J.P. Interaction between streptococcal protein Arp and different molecular forms of human immunoglobulin A. Mol. Immunol., 1994, 5, 393-400.

17. Akerstrom B ., Bjorck L., A Physicochemical study of protein G, a molecule with unique immunoglobulin G-binding properties. J. Biol. Chem., 1986, 261, 10240-10247.

18. Akerstrom B., Nielsen E., Bjorck L., Definition of the IgG- and the albumin-binding regions of streptococcal protein G . J. Biol. Chem., 1987, 262, 13388-13391.

19. Akerstrom B., Brodin T., Reis K., Bjorck L. Protein G - a power ful tool for binding and detection of monoclonal and polyclonal antibodies. J. Immunol., 1985, 135, 2589-2592.

20. Akesson P., Cooney J., Kishimoto f., Bjorck L. Protein H - a novel IgG binding bacterial proteins. Mol. Immunology, 1990, 27, 523-531.

21 Akesson P., Schmidt K-H., Cooney J., Bjorck L., Ml protein and protein H: IgGFc- and albumin-binding streptococcal surface proteins encoded by adjacent genes. Biochem.J., 1994,300,877886.

22. Armstrong G., Blevins A., Louria D.B., Henkel J.S., Moddy M.D., Sukany M. Group B, C and G streptococcal infections in a cancer hospital. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1970, 174, 511-522.

23. Alouf JE, Knoll H., Koller W., The family of mitogenic, shock- inducing and superantigenic toxins from staphylococci and streptococci. In Alouf J.E. and Freer J.H. ( eds.): Source of bacterial protein toxins. Academic. Press. San. Diego, 1991, 367-414.

24. Andresson L-O., Rehnstrom A., Eaker D.L., Studies on "nonspecific" binding, Eur. J. Biochemistry, 1971, 20, 371-380.

25. Barnham M., Thornton T.J., Lange K. Nephritis caused by Streptococcus zooepidemicus. Lancet, 1983, 1, 945-948.

26. Bajaj S.P., Castellino F.J. Activation of human plasminogen by equimolar levels of streptokinase. J. Biol. Chem., 1977, 25, 492-498.

27. Bateman AC., Ramsay A.D., Pallett A.P. Fatal infection associated with group C Streptococci. J. Clin. Pathol., 1993, 46, 965-967.

28. Berenguer J., Sampoedor J., Cercenado E., Baraia J., Rodiriguer-Creixems M., Bouza E. Group C Streptococcal bacterimia. Diag. Microbiol. Infect. Dis., 1992, 15, 151-155.

29. Berge A., Sjobring U. PAM, a novel plasminogen-binding protein from Streptococcus pyogenes. J.Biol. Chem., 1993, 268, 25417-25424.

30. Bessen D.E., Jones K.F., Fischetti V.A. Evidence for two distinct classes of streptococcal M protein and their relationship to rheumatic fever. J.Exp. Med., 1989, 169, 269-283.

31. Bessen D.E., Fischetti V.A. Differentiation between two biologically distinct classes of group A streptococci by limited substitutions of amino acids within the shared region of M protein like molecules. J. Exp. Med., 1990, 172, 1757-1764.

32. Bessen D.E., Fischetti V.A. Nucleotide sequence of two adjacent M or M like protein genes of group A streptococci: Different RNA transcript levels and identification of a unique immunoglobu-lin-A binding protein. Infect. Immun., 1992, 60, 124-135.

33. Bessen D.E., Hollingshead S.K. Allelic polymorphism of emm loci provides evidence for horizontal gene spread in group A streptococci. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1994, 91, 3280-3284.

34. Bessen D.E., Fischetti V. A. A human IgG receptor of group streptococci in associated with tissue site of infection and streptococcal class. J. Inf Dis. 1990, 161, 747-754.

35. Bisno A.L., Craven D.E., McCabel W.R. M proteins of group G streptococci isolated from bac-terimic human infection. Infect. Immun., 1986, 26, 1171-1176.

36. Bisno A.L., Campo R.E., Collins C.M. Pathogenic streptococci: present and future . Proceedings of the XII Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases. St-Petersburg, Russia, 225-227.

37. Bisno A.L. Alternate complement pathway activation by group A Streptococci role of M protein. Infect. Immun., 1979, 26, 1172-1176.

38. Birkholz S., Goroncy-Bermes P., Schonermark M., Hansch G.M., Opferkuch W. Intermediate filaments vimentin and desmin share epitopes with Ml protein of group A Streptococci. Zbl. Bact., 1990, 274, 183-194.

39. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant DNA. Nucl. Acid. Res., 1979, 7, 1513-1523.

40. Bjorck L., Kronvall G. Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-binding reagent. J. Immunol., 1984, 133, 969-974.

41. Bjorck L., Akerstrom B., Streptococcal protein G, in M.D.P. Boyle ( ed ), Bacterial immuno-globulin-binding proteins: microbiology, chemistry and biology. Academic Press Inc. San-Diego.,1990, 113-126.

42. Bjorck L., Kastern W., Lindahl G., Wideback K. Streptococcal protein G, expressed by streptococci or by E. coli, has separate binding sites for human albumin and IgG. Mol. Immunol., 1987, 24, 1113-1122.

43. Blanc D.L., Hassel E.P. Transformation of Streptococcus sanguis Challis by plasmid deoxyribonucleic acid from Streptococcus faecalis. J. Bacteriol., 1976, 128, 347-355.

44. Boitsov A.S., Golubcov V.I., Gupalova T.V., Iontova I.M., Zaizev E.N., Malke H., Totolian A. A. Inverted repeats on plasmids determining resistance to MLS antiobiotiks in group A streptococci. FEMS Microbiol. Left, 1979, 6, 11-14.

45. Boyle M.D.P., Reis K.J. Bacterial Fc receptors. Biotechnology, 1987, 5, 697-703.

46. Boyle M.D.P. The type I bacterial immunoglobulin-binding protein Staphylococcal protein A. In M.D.P. Boyle ( ed.) Bacterial immunoglobulin-binding proteins: microbiology, chemistry and biology. Academic. Press. Inc. San Diego, 17-28.

47. Braun M.A., Gerfach D., Hartwig J.H., Ozegowski F., Romagne F., Carrel S., Roller W., Fleischer B. Stimulation of human T cells by streptococcal "superantigen" erytrogenic toxins ( scarlet fever toxins ). J.Immunol., 1993, 150, 2457-2466.

48. Brockway W.J., Castellino F.J. A caracterization on native streptokinase and altered streptokinase isolated from human plasminogen activator complex. Biochem., 1974,13, 2063-2070.

49. Broder C.C., Lottenberg R., Von Mering G.O., Jonston K.N., Boyle M.D.P. Isolation of a pro-karyotic plasmin receptor. Relationship to plasminogen activator produced by the same microorganism. J.Biol. Chem., 1991, 266, 4922-4928.

50. Bronze M.S., Courtney H.S., Dale J.B. Epitopes of group A streptococcal M protein, that evoke cross-reactive local immune responses. J.Immunol., 1992, 149, 2729-2735.

51. Bronze M.S. Passive protection of mice against group A streptococcal pharyngeal infection by lipoteichoic acid. J.Infect. Dis., 1994, 169, 319-323.

52. Bryant A.E., Kehoe M.A., Stevens D. Streptococcal pyrogenic exotoxin and streptolysin O enhance polymorphonuclear leucocyte binding to gelatin matrixes. J.Infect. Dis., 1992, 166, 165-169.

53. Burova L.A., Ravdonicas L.E., Christensen P., Schalen C., Totolian A.A. The genetic control of virulence in group A streptococci. Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand., Sect B., 1983, 91, 6167.

54. Caparon M.G., Geist R.T., Perez-Casal J., Scott J R. Environmental regulation of virulence in group A streptococci: transcription of the gene encoding M protein is stimulated by carbon dioxide. J.Bacteriol., 1992, 174, 5693-5701.

55. Castellino F.T., Sodetz J.N., Brockway W.S., Siefring G.E. Streptokinase. Met. Enzymol., 1976, 45, 244-257.

56. Cedervall T., Akesson P., Stenberg L., Herrman A., Akerstrom B. Allosteric and temperature regulation of plasma protein binding by members of the streptococcal M protein family. J. Immunol., 1994, 151,2423-2427.

57. Chateau M., Bjorck L. Protein PAB, a mosaick albumin-binding bacterial protein representing the first contemporary example of module shuftling. J. Biol.Chem., 1994, 269,12147-12151

58. Chen C.C., Cleary P.P., Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes. J.Biol. Chem., 265, 3161-3167.

59. Chhatwal G.S., Valentin-Weigand P., Timmis K.N. Bacterial infection of wounds fibronectin mediated adherence of group A and group C streptococci to fibrin thrombi in vitro. Infect.Immun., 1990, 58, 3015-3019.

60. Chhatwal G., Muller G., Blobel H. Characterization of binding of human -macroglobulin to group G Streptococci. Infect.Immun., 47, 959-964.

61. Clarke R.B., Berrafati J.F., Janada J.M., Bottone E.J. Biotyping and exoenzyme profiling as an aid in the differentiation of human from bovine group G streptococci. Inter. J. Syst. Bacteriol., 1984, 20,706-710.

62. Christensen P., Oxellius V-A, A reaction between some streptococci and IgA myeloma proteins. Acta path, microbiol. scand. Sect.6, 1975, 83, 184-188.

63. Clarke L., Carbon J. A colony bank containing synthetic Col El hybrid plasmids representative of the entire E. coli genome. Cell., 1976, 9, 91-99.

64. Classon B.E.B., Svenson N.G., Gotthardsson L., Garden B. A foodborne outbreak of group streptococcal disease at a birhday party. Scand.J.Infect.Dis., 1992, 24, 577-586.

65. Claverus J.P., Louarn J.N., Sicard A.N. Cloning of streptococcal pneumonial DNA. Its use in pneumococcal transformation and in studies of mismatch repair. Gene, 1981, 13, 65-73.

66. Cleary P.P., Kaplan E L., Lindahl C., Skjold S. DNA fingerprinting of Streptococcus pyogenes areM type specific. J. Infect. Dis., 1988, 158, 1317-1323.

67. Cleary P.P., Peterson J., Chen C., Nelson C. Virulent human strains of group G streptococci express C 5a peptidase enzyme similar to that produced by group A streptococci. Infect. Immun., 1991,59, 2305-2310.

68. Cleary P.P., Jonson Z. Possible and function of M protein resistance to bacteriophage A25 and resistance to phagocytoses by human leycocytes Infect. Immunity, 1977, 16, 280-292.

69. Cleary P.P., La Penta D., Heath D., Haanes E. J., Chen C. A virulence regulation in Streptococcus pyogenes : In Dunny G.M., Cleary P.P., McCay( eds.), Genetics and molecular biology of streptococci and enterococci. American. Society for Microbiology. Washington D C., 147-151.

70. Cleary P.P., Retnoningrum D. Group A streptococci immunoglobulin-binding proteins: adhesins, molecular mimicry or sensory proteins? Trends Microbiol., 2, 131-136.

71. Cleary P.P., Jones S., Spenier J., Simpson W., Robbins J. Phase variation and M protein expression in Streptococcus pyogenes : Abstracts of the second ASN Conf. on Streptococcal Genetics., 1986, 14.

72. Cleary P.P., Johnson D., Wannamaker L.V. Genetic variation in the M antigen of group A streptococci. J.Infect.Disease, 1979, 140, 747-754.

73. Clevel D.B., Yagi Y., Dunny G.N., Shultz S.K. Characterization of three plasmid deoxyribonucleic acid molecules in a strain of Streptococcus faecalis : identification of a plasmid determining erythromycin resistance. J. Bacterid., 1974, 117, 285-289.

74. Close T.J., Christmann J.L., Rodriquez R.L. M13 bacteriophage and pUC plasmids containing DNA inserts but still capable of b-galactesidase- a complementation. Gene, 1983, 23,131-136.

75. Collins C.M., Kimura A., Bisno A.L. Group G streptococcal M protein exibits structural features analogus to those of class 1M protein of group A streptococci. Infect Immun., 1992, 60 3689-3696.

76. Colman G., Tanna A., Efstration A., Gaworzewska E.T. The serotypes of Streptococcus pyogenes present in Britain during 1980-1990 and their association with disease. J. Med. Microbiol., 1993, 39, 165-178.

77. Colman G., Efstration A., Marrison D. Streptococci and related organisms. Identification Methods in Applied and Environmental Microbiology, 1992, 221-449.

78. Courtney H.S., Hundstein C., Dale J.B., Bronze M.S., Beachey E.N., Hasty D.L. Lipoteichoic acid M protein : dual adhesions of group A streptococci. Microbiol. Pathog., 1992, 12,199-208.

79. Courtney H.S., Li Y, Dale J.B., Hasty D.L. Cloning sequencing and expression of a fibronec-tin\fibrinogen binding protein from group A streptococci. Infect. Immun., 1994, 62 3937-3946.

80. Cunniff H., Bump C.M. Extra-respiratory non-group D isolates of streptococci. Am.J.Med.Technol., 1976, 42, 195-200.

81. Cunningham M.W., McCormack J.M., Fenderson P.G., Beachey E.H., Dale J.B. Human and murine antibodies crossreaktive with streptococcal M protein and myosine recognize the sequence gly-lys-gln in M protein. J.Immunol. 1989, 143,2677-2683.

82. Cunningham M.W., Krisher K., Graves D.C. Murine monoclonal antibodies reactive with human heart and group A streptococcal pharyngeal infection by lipoteichoic acid. J.Infect.Dis., 1994, 169, 319-323.

83. Dale J.B., Beachey E.H. Sequence of myosine-cross reactive epitopes of streptococcal M protein. J.Exp. Med., 1986, 164, 1785-1790.

84. Dale J.B., Beachey E.H. Unique and protective epitopes among different serotypes of group A streptococcal M proteins defined with hybridome antibodies. Infect. Immun., 1984, 46, 267-269.

85. Dale J.B., Chiang E. Y., Lederer J.W. Recombinant tetravalent group A streptococcal M protein vaccine. J.Immunol., 1993, 151 2188-2194.

86. Dagert M., Ehrlich S.D. Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells. Gene, 1979, 6, 23-28.

87. De Angelis P.L., Papaconstautinai J., Weigel P.H. Isolation of a Streptococcus pyogenes gene locus that directs hyaluronate biosynthesis in acapsular mutants acid in heterologus bacteria. J.Biol.Chem., 1993, 268, 14568-14571.

88. Deisenhofer J., Jones J.A., Huber R., Sjodahl J., Sjoquist J. Chrystallization, crystal structure analysis and atomic model of the complex formed by a human Fc fragment and fragment B of protein A from Staphilococcus aureus. Hoppel-Sayler s inZ. Physiol. Chem., 1978, 395, 975-985.

89. Devriese L.A., Hommer J., Kilper-Balz R., Schleifer K.H. Streptococcus canis sp. nov: a species of group G streptococci from animals. Inter. J. Syst. Bacteriol., 1986, 12, 422-425.

90. Dougherty B.A., Van de Rijn T. Molecular characterization of a locus required for hyaluronic acid, capsule production in group A streptococci. J.Exp. Med., 1992, 175, 1291-1299.

91. Dukamel R.C., Schur PH., Brendel K. pH gradient elution of human IgGl, IgG2 and IgG4 from protein A sepharose J.Immunol., 1989, 122, 1468-1472.

92. Dunna R.L., Wienberg AN., Medrek T.F., Kunz L.J. Streptococcal infections. Medicine, 1969, 48, 87-127.

93. Dutra J.S., Chhatwal G.S., Blobel H. Binding of aggregated b2-microglobulin to streptococci of serological group A, B, C and G. In "Bacteria and the host" ( eds.) Rye. M., Frank J. Avicenus Czechoslovak Medical Press., Praque, 107-109.

94. Edelman G. Antibody structure and molecular immunity. Science, 1973, 830-840.

95. Efstration A. Outbreaks of human infections caused by pyogenic streptococci of Lancefield group C and G. J. Med. Microbiol., 1989, 29, 207-219.

96. Efstration A., Teare E.L., McGhie D., Colman G. The presence of M proteins in outbreaks strains of Streptococcus equisimilis T- type 204. J.Infect., 1989, 19, 105-111.

97. Ellen R.P., Gibbon R.J. M protein-associated adherence of Streptococcus pyogenes to epithelia surface : prerequisine for virulence. Infect. Immun., 1972, 5, 826-830.

98. Elliasson M. Streptococcal protein G. Structure and function. Thesis Royal Institute of Technology, Stockholm, 1990.

99. Elliasson M., Olsson A., Palmkrautz E., Wiberg K., Inganas M., Guss B., Lindberg M., Uhlen M. Chimeric IgG binding receptors engineered from staphylococcal protein A and streptococcal protein G. J. Biol. Chem., 1988, 263, 4323-4327.

100. Endresen C. The binding to protein A of immunoglobulin G and of Fab and Fc fragments. Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. C, 1979, 87, 185-189.

101. Engvall E., Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry, 1971, 8, 871-874.

102. Ericson D. Agglutination of streptococcus mutants by low molecular weigt salivary component effect ofb2microglobulin. Infect. Immun., 1984, 46, 526-531.

103. Erntell N., Myhre E.B., Kronvall G. Non-immune F ( ab1^ - and Fc-mediated interaction of mammilian immunoglobulins with S. aureus and group C and G streptococci. Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. B, 1986, 94, 377-385.

104. Erntell M., Myhre E., Sjobring U., Bjorck L. Streptococcal G protein has affinity for both Fab and Fc fragments of human IgG. Mol.Immunol., 1988, 25, 121-126.

105. Fahnestock SR., Alexander P., Fipula D., Nagle J. Structure and evolution of the streptococcal genes encoding protein G. In M.D.P. Boyle ( ed.) Bacterial immunoglobulin-binding proteins : microbiology, chemistry and biology. Academic Press. Inc. San. Diego, 1990, 133-148.

106. Falkenberg C., Bjorck L , Akerstrom B. Localization of the binding site for streptococcal protein G on human serum albumin. Identification of a 5,5-kilodalton protein G binding albumin fragment. Biochem., 1992, 31, 1451-1457.

107. Faulmann E.L., Boyle M.D.P. Type Ila and lib immunoglobulin-binding proteins associated with group A streptococci. In Bacterial immunoglobulin binding Proteins. Boyle M.D.P., New York: Acadfinic Press., 1, 69-81.

108. Fischetti V.A. Streptococcal M protein : Molecular design and biological behavior. Clin. Microbiol. Rev., 1989, 2, 285-314.

109. Fischetti V.A., Jones K.F., Hollingshead I.R., Scott I.R. Structure, Function and Genetics of Streptococcal M protein. Reviews of infections diseases., 1988, 2, 285-314.

110. Fischetti V.A., Jones K.F., Scott I.R. Size variation of the M protein in group A streptococci. J.Exp. Med., 1985, 161, 1384-1401.

111. Fischetti V.A., Jones K.E., Manjula B.N., Scott I.R. Streptococcal M protein expressed in Es-chericia Coli. Localization, purification and comparison with Streptococcal derived M protein. J.Exp. Med., 1984, 159, 1083-1095.

112. Fletcher B.T., TomarR.N. Streptokinase. Met. Enzymol., 1970, 19, 807-829.

113. Flingold D.S., Wienberg A.N., Medrek T.F., Kunz L.J. Extra-respiratory streptococcal infections. Importance of various serological groups. N. Engl. J. Med., 1966, 275, 356-361.

114. Forsgren A., Sjoquist J. Protein A from Staphylococcus aureus. l.Pseudoimmune reaction with human -globulin. J.Immunol., 1966, 97, 822-827.

115. Fraser Ch.A.M. Immune response of quinea pigs to opacity factor of group A streptococci. In : Basic concepts of streptococci and streptococcal diseases. ( eds. Christensen P.) Reedbooks Ltd. England, 1982, 173-174.

116. Frick J.M., Kerstrom P., Cooney J. Protein H, surface protein of Streptococcus pyogenes with separate binding sites for IgG and albumin. Mol. Microbiol., 1994,12, 143-151.

117. Friquet B., Chffotte A.F., Djavadi-Chaniancel L , Goldberg M.E. J.Immunol. Meth., 1985, 77, 305-319.

118. Frithz E., Heden L.O., Lindahl G. Extensive sequence homology between IgA receptor and M proteins in Streptococcus pyogenes. Mol. Microbiol., 1988, 3,1111-1119.

119. Galan J., Timoney J. Cloning and expression in Escherichia coli M protein gene of Streptococcus equi; Abstracts II ASM Conf. on Streptococcal Genetics, USA, Florida, 1986, 16.

120. Gaustad P. Genetic transformation in Streptococcus sanquis. Acta Pathol. Microbiol. Immunol Scand. Sect. B., 1983,91, 193-200.

121. Golubkov V.l., Gupalova T V., Iontova I.M., Kolesnichenko T.G., Suvorov A.N., Totolian A.A. Insertion of phage L 47.1 DuN into the Streptococcus sanquis chromosomal DNA : the use in molecular cloning expirement. Proc. IX I nt. Symp. on Streptococci and Streptpococcal Diseases., ed Y.Kimura., 238-239.

122. Gomi H., Hozumi T., Hattori C., Tagawa C,. Kishimonto F., Bjorck L. The gene sequence and some properties of protein H. A novel IgG binding protein. J.Immunol., 1990, 144, 4046-4052.

123. Goroney-Bermes P., Dale JB., Beachy E.H., Opferkuch W. Monoclonal antibody to human renal glomeruli cross-reacts with streptococcal M protein. Infect. Immun., 1987, 55, 2416-2419.

124. Goshorn S.C., Schlievert P.M. Nucleotide sequence of streptococcal pyrogenic exotoxin type C. Infect. Immun., 1988, 56, 2518-2520.

125. Goward C.R., Murphy J.P., Atkinson T., Barstow D.A. Exspression and purification of a truncated recombinant streptococcal Protein G. Biochem., 1990, 267, 171-177.

126. Graun J.W., Gray B.M., Griffith F.M., Desmuke W.E. Acute glomerulonephritis following group G streptococci infection. J.Infect. Dis., 1987, 156, 411-412.

127. Graunt P.N., Seal D.V. Group G streptococcal infections. J.Infect., 1987, 15, 5-20.

128. Griffith F. The serological classification of Streptococcus pyogenes. J.Hyg. ( Camb.), 1934, 34, 542-585.

129. Gronenborn A.M., Clore G.M. Identification of the contact surface of a streptococcal protein G domain complexed with a human Fc fragment. J.Mol. Biol., 1993, 233, 331-335.

130. Guss B., Eliasson M., Olsson A., Uhlen M., Frej A.K., Jornvall H., Flock J., Lindberg M. Structure of the IgG binding regions of streptococcal protein G. EMBO J., 1986, 5, 1567-1575.

131. Guss B., Lindberg M., Uhlen M. The gene for staphylococcal protein A. In M.D.P. Boyle ( ed.), Bacterial immunoglobulin-binding proteins: microbiology, chemistry and biology. Academic. Press.,Inc., San Diego, 1990, 29-39.

132. Haanes E.J., Cleary P.P. Identification of divergent M protein gene and an M protein-related gene family in Streptococcus pyogenes serotype 48. J.Bacteriol., 1989, 171, 6397-6408.

133. Haanes E.J., Heath D.G., Cleary P.P. Architecture of the vir regulons of group A streptococci parallels opacity factor phenotype and M protein class. J.Bacteriol., 1992, 174,4967-4980.

134. Haanes-Fritz E., Robbins I.C., Cleary P.P. Comparison of genes encoding group A streptococcal M protein types L and L2, conservation of 5 and upstream sequences. Abstr. II ASM Conf. on Streptococcal Genetics, USA - Florida, 22.

135. Hackett S.P., Stevens D.L. Stretococcal toxic shock syndrome synthesis of tumor necrosis factor and interleukin-1 by monocytes stimulated with pyrogenic exotoxin A and streptolysin O. J.Infect. Dis., 1992, 165, 879-885.

136. Hallas G. The production of pyrogenic exotoxins by group A streptococci. J.Hyg. ( Camb.), 1985, 95, 47-57.

137. Handman E., Jarvis H.M. Nitrocellulose-based assays for the detection of glycolipids and other antigens: mechanism of binding to Nitrocellulose. J.Immunol. Met., 1985, 83, 113-123.

138. Hanski E., Caparon M.G. Protein F, a fibronectin-binding, is an adhesin of the group A streptococcus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 6172-6176.

139. Hanski E., Horwitz P. A., Caparon M.G. Expression of protein Fl, the fibronectin-binding protein of Streptococcus pyogenes IRS4 in heterologous streptococcal and enterococcal strains promotes their adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun, 1992, 60, 5119-5125.

140. Hasty D.L., Ofek J., Cartney H.S., Doyle R.J. Multiple adhesins of streptococci. Infect. Immun., 1992, 60, 2147-2152.

141. Hauser A.R., Schlievert P.M. Nucleotide sequence of the streptococcal pyrogenic exotoxins type B gene and relationship between the toxin and the streptococcal proteinase precursor. J. Bacte-riol., 1990, 171, 4536-4542.

142. Hauser A.R., Stevens D.L., Kaplan E.L., Schilevert P.M. Molecular analysis of pyrogenic exotoxins from Streptococcus pyogenes isolates associated with toxic shock syndrome. J. Clin. Microbiol., 1991, 29, 1562-1567.

143. Heath D.G., Boyle M.D.P., Cleary P.P. Isolated DNA repeat region from fcrA76, the Fc-binding protein gene from an M-type 76 strain of group A streptococci, encodes a protein with Fc-binding activity. Mol. Microbiol., 1990, 4, 2071-2079.

144. Heath D.G., Cleary P.P. Fc-receptor and M -protein genes of group A streptococci are products of gene duplication. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 4741-4745.

145. Heath D.G., Cleary P.P. Cloning and expression of the gene for an immunoglobulin G Fc-receptor protein from a group A streptococcus. Infect. Immun., 1987, 55, 1233-1238.

146. Heden L.O., Fritz E., Lindahl G. Molecular characterization of an IgA receptor from group B streptococci: sequence of the gene, identification of a proline-rich region with unique structure and isolation ofN-terminal fragments with IgA binding capacity. Eur. J.Immunol., 1991, 21, 1481-1490.

147. Heden L.O., Lindahl G. Conserved and variable regions in protein Arp, the IgA receptor of Streptococcus pyogenes. J.Gen. Microbiol., 1993, 139, 2067-2074.

148. Hill H.B., Caldwell G.G., Wilson E., Hager D., Zuimmerman R.A. Epidemic of pharingits due to streptococci of Lancefield group G. Lancet., 1969, 371-374.

149. Hill H.B., Bohnsack J.F., Morris E.Z., Augustin N.H., Parker C.J., Cleary P.P., Wu J.T. Group B streptococci inhibit the chemotactic activity on the fifth component. J.Immunol., 1988, 141, 35513556.

150. Hill M.J., Wannamaker L.W. The serum opacity reaction of Streptococcus pyogenes, general properties of the streptococcal factor and of the reaction in aged serum. J. Hyg. (Camb.), 1968, 66, 37-44.

151. Holm B., Murray K. Packing recombinant DNA molecules into bacteriophage particles in vitro. PNAS, USA, 1977, 74, 3259-3263.. Holm B., Murray K. Packing recombinant DNA molecules into bacteriophage particles in vitro. PNAS, USA, 1977, 74, 3259-3263.

152. Holm S.E. Hypothesis of the phatogenesis of post-streptococcal glomerulonephritis based on recent clinical and expiremental research. Zbl. Bact. Hyg., 1990, 274, 325-332.

153. Holm S.F., Ferretti J.S., Simon D., Jonston K.H. Deletion of streptokinase gene eliminates the nephritogenic capacity of a type 49 strain. Zbl. Bact., 1992a, 22, 261-263.

154. Holm S.E., Norbby A., Bergholm A.M., Norgren M. Aspects of pathogenesis of serious group A streptococcal infections in Sweden. J.Infect. Dis., 1992b, 166, 31-37.

155. Holm S.E., Bergholm A.M., Johnston K.H. A Streptococcal plasminogen activator in the focus of infection and in the kidneys during the initial phase of experimental streptococcal glomerulonephritis. APMIS, 1988, 96, 1097-1108.

156. Hollingshead S.K., Fischetti V.A., Scott JR. Complete nucleotide sequence of type 6 M protein of the group A Streptococcus: repetitive structure and membrane anchor. J.Biol. Chem., 1986, 261, 1677-1686.

157. Hollingshead S.K., Readdy T.L., Yung D.L., Bessen D.E. Structural heterogeneity of the erara gene cluster in group A streptococci. Mol. Microbiol., 1993, 8, 707-717.

158. Hollingshead S.K., Arnold J., Readdy T.L., Bessen D.E. Molecular evolution of a multigene family in group A streptococci. Mol. Biol. Evol., 1994, 11, 208-219.

159. Hommer C., Shulman S T. Clinical Aspects of acute rheumatic fever. J. Rheumatol., 1991, 18, 2-13.

160. Hong K., Komurazaki Y, Kobayshi M., Ishikawa H., Ingue K. Purification and characterization of M3 protein expressed of the surface of group A streptococcus type 3 strain C203. FEMS. Immunol. Med. Microbiol., 1995, 12, 73-78.

161. Horstmann R.D., Sievertsen H.J., Leippe M., Fischetti V.A. Role of fibrinogen in complement inhibition by streptococcal M protein. Infect.Immun., 1992, 60, 5036-5041.

162. Horstmann R.D., Sievertsen H.J., Knobloch J., Fischetti V.A. Antiphagocytic activity of streptococcal M protein: Selective binding of complement control protein factor H. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 1657-1661.

163. Hrynlewick W., Lipinski B., Jeljoczeu V.J. Nature of the interaction between M protein of Streptococcus pyogenes and fibrinogen. J.Infect. Dis., 1977, 125, 626-630.

164. Huang T.T., Malke H., Ferretti J.S. The streptokinase gene of group A streptococci: cloning, expression in Eschericia coli and sequence analysis. Mol. Microbiol., 1989a, 3, 197-205.

165. Husmann L.K., Scott JR., Lindahl G., Stenberg L. Expression of protein Arp, a member of the M protein family, is not sufficient to inhibit phagocytosis of Streptococcus pyogenes. Infect.Immun., 1995, 63, 345-348.

166. Iwasaki M., Jgarashi H., Hmuma Y., Yutsudo T. Cloning, characterization and overexpression of Streptococcus pyogenes gene encoding a new type of mitogenic factor., FEBS Lett., 1993, 331, 187-192.

167. Jacks-Weis J., Kim Y., Cleary P.P. Restriction deposition of C3 on M" group A streptococci: correlation with resistance to phagocytosis. J.Immunol., 1982,128, 1897-1902.

168. Jackson K.W., Malke H., Gerlach D., Ferretti J.J., Tang J. Active streptokinase from the cloned gene in Streptococcus sanguis is without the carboxy-terminal 32 residues. Biochem., 1986, 25, 108114.

169. Jeppson H., Frithz E., Heden L.O. Duplication of DNA sequence homologous to genes for immunoglobulin receptors and M proteins in Streptococcus pyogenes. FEMS Microbiol. Lett., 1992, 92, 139-146.

170. Jensen K. Anormally occurring staphylococcus antibody in human serum. Acta pathol. micro-biol., 1958, 44, 421-428.

171. Jones K.F., Khan S.A., Erikson B.W., Hollingahead S.K., Scott JR., Fischetti V.A. Immunochemical localization and amino acid sequences of cross-reactive epitopes within the group A streptococcal M6 protein. J.Exp. Med., 1986, 164, 1226-1289.

172. Jones K.F., Manjula B.N., Johnston K.N., Hoolingshead S.K., Scott J.R., Fischetti V.A. Location of variable epitopes among the multiple serotypes of streptococcal M protein. J.Exp.Med., 1985, 161,623-631.

173. Johnson D R., KaplanE.L. A review of the correlation of T-agglutination pattern and M-protein typing and opacity factor production in the identification of group A streptococci. J.Med.Microbiol., 1993, 38,311-315.

174. Johnson D R., Stevens P.M. Group streptococcal phage T12 carries the structural gene for py-rogenic exotoxin type A. Mol.Gen.Genet., 1984, 194, 52-56.

175. Johnson D R., Gautsch J.W., Sportsman J.R., Elder J.F. Improved technique utilizing nonfat dry milk for analysis of proteins and nucleic acids transferred to nitrocellulose. Gene., 1984, 1, 3-8.

176. Johnson D.R., Stevens D.L., Kaplan E.L. Epidemiologic analysis of group A streptococcal serotypes associated with severe systemic infections rheumatic fever or uncomplicated pharyngits. I.Infect.Dis., 1992, 166, 374-382.

177. Johnston K.H., Zabriskie J.B. Purification and partial characterization of the nephritis strain associated protein from Streptococcus pyogenes, group A. J.Exp.Med., 1986, 163, 697-712.

178. Johnston K.N., Chaiban J.E., Wheeler R.C. Analysis of the variable domain of the streptokinase gene from streptococci associated with post streptococcal glomerulonephritis. Zbl. Bact., 1992a, 22, 339-342.

179. Johnston K.N., Wheeler K.C., Gallinia C.F. Polymorphism of the internal variable domain of group A streptokinase and possible relation to post-streptococcal glomerulonephritis. Abstract In: programm and abstract of 92 annual melting of the American Society for Microbiology (New Orleans), Washington, 1992b, 266.

180. Johansson P.J.H., Malone E.C., Williams R.C., Retnoningrum D.S., Cleary P.P. Streptococcus pyogenes Ml2 protein shous selective binding to some human IgG3 myeloma proteins. In-fect.Immun,, 1994, 40, 3559-3563.

181. Kantor F. Fibrinogen precipitation by streptococcal M protein. 1 Identification of the reactants, and stoichiometry of the reaction. J.Exp.Med., 1965, 121, 849-859.

182. Kapur V., Topouzis S., Majesky M.W. Aconserved Streptococcus pyogenes extracellular cysteine protease cleaves human fibronectin and degrades vitronectin. Microbiol. Phatogen., 1993a, 15, 327-346.

183. Kapur V., Maffei J.T., Greer R.S., Li L.L., AdamsG.J., MusserJ.M. Vaccination with streptococcal extracellular cysteine protease protects mice against challenge with heterologous group A streptococci. Microbiol. Pathogen., 1994, 16, 443-450.

184. Kapur V., Majesky M.W., Li L.L., Black R.A.,Musser J.M. Cleavage of interleikin lb precusor to produce active IL-Ib by a conserved extracellular cysteine protease from Streptococcus pyogenes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993b, 90, 7676-7680.

185. Katerov V.E., Schalen C., Totolian A.A. Sequencing of genes within the regulon of Streptococcus pyogenes type Ml 5 - an opacity factor positive serotype with low opasity factor expression. Mol. Gen. Genetic., 1994, 18, 525-530.

186. Kato K., Lian L.Y., Barsukov I.L., Derrick J.P., Kim H., Tanaka R. Model for the complex between protein G and an antibody Fc fragment in solution. Faculty pharm. Sciences, 1995, 3, 79-85.

187. Kaufhold A., Podbielski A., Jonson D.R., Kaplan E L., Lutticken R. M protein gene typing of Streptococcus pyogenes by nonradioactively labeled oligonucleotide probes. J. Clin. Microbiol., 1992, 30, 2391-2397.

188. Kehoe M.A. Cell-wall associated proteins in Gram-positive bacteria. New. Comp. Biochem., 1994, 27,217-261.

189. Kehoe M.A., Poirier T.P., Beachey E.A., Timmus K.M. Cloning and genetic analysis of serotype 5M protein determinant of group A streptococci: evidence for multiple copies of the M5 determinants in the Streptococcus pyogenes genome. Infect. Immun., 1985, 48, 191-197.

190. Kehoe M.A. New aspects of Streptococcus pyogenes pathogenicity. Rev. Med. Microbiol., 1991,2, 147-152.

191. Kehoe M.A., Miller L., Poirier T. Genetics of type 5M protein from group A streptococci: Abstr. II ASM Conf. on Streptococcal Genetics USA, Florida, 1986,14.

192. Kill K.S., Cunningham M.W., Barnet L A. Cloning and sequence analysis of a gene encoding a 67 kilodalton myosin-cross reactive antigen of Streptococcus pyogenes reveals its similarity with class II major histocompatibility antigens. Infect. Immun., 1994, 62 2440-2449.

193. Kohler K.W. Streptococcal toxic shock syndrome. Zbl.Bact., 1990, 272, 257-264.

194. Kohler K.W., Wicken O. Relationship between haptoglobin and Streptococcus pyogenes T4 antigens. Nature(London), 1978,271, 373-376.

195. Kraus W., Seyer J.M., Beachy E.H. Vimentin-cross-reactive epitope of type 12 streptococcal M protein. Infect. Immun., 1989, 57, 2457-2461.

196. Kragh-Hansen H. Molecular aspects of ligand binding of serum albumin. Pharmocol. Rev., 1981,33, 1753-1758.

197. Kragh-Hansen H. Location of long chain fatty acid binding sites of bovine serum albumin by affinity labelling. Biochem.J., 1985, 225, 629-638.

198. Kronvall G. A surface component on group A, C and G streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin G. J.Immunol., 1973, 111, 1401-1406.

199. Kronvall G., Myhre E., Bjorck L., Berggard J. Binding of aggregated human beta-2-microglobulin to surface protein structure in group A, C and G streptococci. Infect. Immun., 1978, 22, 136-142.

200. Kronvall G., Simmous A., Myhre E.B., Johnson S. Specific absorbtion of human serum albumin, immunoglobulin A and immunoglobulin G with selected strains of group A and G streptococci. Infect. Immun., 1979, 25, 1-10.

201. Kronvall G., Bjorck L., Myhre E., Wannamaker L. Binding of aggregated beta-2-microglobulin, IgG, IgA and fibrinogen to group A, C, G streptococci with special references to streptococcal M protein. In: Parker M.T. (ED.): Pathogenic Streptococci. ReedbooksLtd., 1979b, 74-75.

202. Kyhse-Andersen J. Elektroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid tranfer of proteins from polyacrilamid to nitrocellulose. J.Biochem. Biophys. Met., 1984, 10, 203-209.

203. Kuusela P., Ulberg M., Saksela O, Kronvall G. Tissue type plasminogen activator-mediated activation of plasminogen on the surface of group A, C and G streptococci. Infect. Immun., 1992, 60, 196-201.

204. Kuusela P., Fibronectin binds to Staphylococcus aureus. Nature (London), 1978, 271, 273-276.

205. Laemmli U.K. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature.(London)., 1970, 227, 680-686.

206. Kuszewski J., Clore G.M., Gronenborn A M. Fast folding of a prototypic polypeptides: the immunoglobulin binding domain of streptococcal protein G. Ppotein Sci, 1994, 3, 1945-1952.

207. Lancefield R.C. The antigenic complex of Streptococcus haemolyticus. ¡.Demonstration of a type-specific substance in exstracts of Streptococcus haemolyticus. J.Exp. Med., 1928,47, 91-103.

208. Lancefield R.C. A serological differentiation of human and other groups of hemolytic streptococci. J.Exp. Med., 1933, 57, 571-595.

209. Lancefield R.C. Current knowledge of type-specific M antigens of group A streptococci. J.Immunol., 1962, 89, 307-313.

210. Lancefield R. Differentiation of group A streptococci with a common R antigen into three serological types, with special reference to the bactercidal test. J.Exp. Med., 1957, 106, 525-535.

211. Langley K.E., Vllarejo M.R., Fowler A.V. Molecular basis of beta- galactosidase alfa-complementation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1975, 72 1354-1257.

212. Langone J. Protein A of Staphylococcus aureus and related immunoglobulin receptors produced by streptococci and pneumococci. Adv. Immunol., 1982, 32, 157-252.

213. Lee B.R., Park S.K., Kim H.J., Bjun S.M. Site-specific alteration of Gly 24 in streptokinase: its effect of plasminogen activation. Biochem. Biophys. Communations., 1989, 165, 1085-1090.

214. Lee S.M., Essig N.Z., Lee T.K. Process development for the recovery and purification of recombinant protein G. J.Biotechn., 1992, 26, 213-219.

215. Lindahl G. Cell surface proteins of a group A streptococcus type M4: The IgA receptor and a receptor related to M proteins are coded for by closely linced genes. Mol. Gen. Genet., 1989, 216, 372-379.

216. Lindahl G., Stenberg. Binding of IgA and /or IgG is common property among clinical isolates of group A streptococci. Epidemiol. Infect., 1990, 105, 87-93.

217. Lindahl G., Akerstrom B. Receptor for IgA in group A streptococci: cloning of the gene and characterization of the protein, expressed in Eschericia coli. Mol. Microbiol., 1989, 3, 239-247.

218. Lottenberg R., Minmin-Wenz D., Boyle M.D.P. Capturing host plasmin(ogen): a common mechanism for invasive pathogen? Trends Microbiol., 1994, 20, 20-24.

219. Lottenberg R., Broder C., Boyle M.D.P. Identification of a specific receptor for plasmin on a group A streptococcus. Infect. Immun., 1987, 55, 1914-1928.

220. Lowry O.H., Rosenbraugh N.J., Ferr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent. J.Mol. Biol., 1957, 193, 265-273.

221. Lufkvist T., Sjoquist J. Chemical and serological analysis of antigen preparation from Streptococcus aureus. Acta. Pathol. Microb. Scand., 1962, 56, 295-304.

222. Magge J.T., Hindmarch J.M ., Typing of Streptococcus pyogenes by pyrolysis mass spectrometry. J.Med. Microbiology., 1991, 35, 304-306.

223. Malke H. Polymorphism of the streptokinase gene. Implication for the pathogenesis of post streptococcal glomerulonephritis. Zbl. Bact., 1993, 278, 246-257.

224. Malke H., Roe B., Ferretti J. Nucleotide sequence of the streptokinase gene from Streptococcus equilimilis H46 A. Gene, 1985, 34, 357-362.

225. Marrach P., Kappler J.W. The staphylococcal enterotoxins and their relatives. Science, 1990, 248, 705-711.

226. Maxted W.R., Widdowson J.P., Frazer C AM., Ball L.C., Basselt D.C.J. The use of serum opacity reaction in the typing of group A streptococci. J. Med. Microbiol., 1973, 6, 83-90.

227. Maxted W.R., Widdowson J.P. Protein antigens of group A streptococci. In. Streptococci and Streptococcal diseases (eds. Wannamaker L.W, Natson J.M.), Academic. Press., New-Jork, London, 1972, 251-266.

228. Maxted W.R., Widdowson J.F. Antibody to streptococcal opacity factor in human sera. J. Hyg.(Camb.), 1973, 71, 35-42.

229. McLandsborouah L.A., Cleary P.P. Insertional inactivation of VIR R in Streptococcus pyogenes M49 demonstrates that VIR R functions as a positive regulator of Sep A, FcRA, OF and M protein. FEMS Microbiol. Lett., 1995, 128, 45-51.

230. Messing J., Gronenborn B., Muller-Hill B., Hofschneider P.H. Filamentous coli phage M13 as a cloning vehicle. Insertion of a Hindll fragment of the lac regulatory region in M13 replicative form in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74, 3642-3646.

231. Miller L., Gray L., Beachy E., Kehoe M. Antigenic variation among group A streptococcal M proteins. Nucleotide sequence of the serotype 5M protein gene and its relationship with genes encoding types 6 and 24 M protein. J.Biol. Chem., 1988, 263, 5668-5673.

232. Miorner H., Myhre E., Bjorck L., Kronvall G. Effect of specific binding of human albumin, fibrinogen and immunoglobulins G on surface characteristic of bacterial strains as revealed by partition expirements in polymere phase systems. Infect. Immun., 1980, 29, 879-885.

233. Montoya A., Castell J.V. Long-tern storage of peroxidase-labeled immunoglobulins for use in enzyme immunoassay. J.Immunol. Methods., 1987, 99, 13-20.

234. Moks T., Abrahmsen L., Nilsson B., Hellman U., Sjoqvist J., Uhlen M. Staphylococcal protein A consists of five IgG-binding domains. Eur. J. Biochem., 1986, 156, 637-643.

235. Myhre E.B., Kronvall G. Heterogenity on nonimmune immunoglobulin Fc reactivity among Gram-positive cocci: Description of three major types of receptors for human immunoglobulin G. Infect. Immun., 1977, 17, 475-482.

236. Myhre E.B., Kuusela P. Binding of human fibronectin to group A, C and G streptococci. Infect. Immun., 1983, 40, 29-34.

237. Myhre E.B., Kronvall E.B. Demonstration of specific binding sites for human albumin in group C and G streptococci. Infect.Immun., 1980, 27, 6-14.

238. Myhre E.B., Kronvall G. Immunoglobulin binding to group A, C and G streptococci. In Parker M. (ed.), Pathogenic streptococci. Reedbooks Ltd., Surrey, 1979, 76-78.

239. Myhre E.B., Kronvall G. Immunoglobulin specificities of defined types of streptococci Ig receptors. In: Basic concepts of streptococci and streptococcal diseases. S.Holm and P. Christensen (eds.), Reedbooks., Ltd., Surrey, 1981, 209-210.

240. Myhre E.B. Nonimmune binding of immunoglobulin G to Gram-positive cocci. Description of different types of immunoglobulin receptors with defined specificities for mammalian IgG subclasses. Thesis, Lund, 1981, 127.

241. Natvig J., Kunkel H. Human immunoglobulins: classes, subclasses, genetic variation and idio-types. Adv. Immunol., 1973, 16, 1-59.

242. Nicholas W.C., Steele C. Occurrence of groupable beta-hemolytic streptococci study among school children in Bismarck N.D. J.Am. Med. Assoc., 1962, 182, 197-205.

243. Nillson B., Abrahmsen L., Uhlen M. Immobilization and purification of enzymes with stafilo-coccal protein A gene fusion vectors. EMBO J., 1985a, 4, 1075-1080.

244. Niiison B., Moks T., Jansson B., Abrahmsen L., Elmblad A., Holmgren E., Henrichson C., Jones A T., Uhlen M. A syynthetic IgG -binding domain based on staphylococcal protein A. Prot. Eng.,1987, 1, 17-113.

245. Nohlgard C., BjorklundA., Hammar H. Group G streptococcal infections on dermatological ward. Act Derm. Vnereol. Stockholm, 1992, 72, 172-176.

246. Norby-Teglund A. The role of superantigens in the pathogenesis of group A streptococcal infections. Umea University Medical Dissertations, Sweden, 1994.

247. Nygren P. A., Eliasson M., Abrahmsen L., Uhlen M. Analysis and use of the serum albumin domains of streptococcal protein G. J. of Molec. Recognition, 1988, 1, 69-74.

248. O^onnor S.D., Cleary P.P. Localization of the streptococcal C5a peptidase to the surface of group A streptococci. Infect. Immun., 1986, 53, 432-434.

249. O^onnor S.D., Darip D., Fraley K., Nelson C.M., Kaplan E.L., Cleary P.P. The human antibody response to streptococcal C5a peptidase. J.Infect. Dis., 1991,163, 109-116.

250. Ohga S., Okada K., Mitsui K., Aoki T., Ueda K. Outbreaks of group A beta-hemolytic streptococcal pharyngitis in childern: correlation of serotype T4 with scarlet fever. Scand. J.Infect. Dis., 1992, 24, 599-605.

251. Okada N., Pentlan A.P., Falk P., Caparon M.G. M protein and protein F act as important determinants of cell-surface tropism of Streptococcus pyogenes in skin tissue. J.Clin. Invest., 1994, 94, 956-977.

252. Olsson A., Eliasson M., Guss B., Niisson B., Heliman U., Lindberg M., Uhlen M. Structure and evolution on the repetitive gene encoding streptococcal protein G. J.Eur. Chem., 1987, 168, 319324.

253. O'Toole P., Stenberg L., Rissler M., Lindahl G. Two major classes in the M protein family in group A streptococci. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Microbiology, 1992, 89, 8, 8661-8665.

254. Otten R.A., Raeder R., Heath D.G., Lottenberg R, Cleary P.P., Boyle M.D.P. Identification of two type Iia IgG-binding proteins expressed by a single group A Streptococcus. J.Immunol., 1992, 148, 3174-3182.

255. Oukuni H., Todome Y., Suziki H., Mizuse M., Kotani. N. Immunological studies and complete amino acid sequence of the streptokinase from Streptococcus pyogenes (group A) M type 12 strain A347. Infect. Immun., 1992, 60, 278-283.

256. Pack T.D., Podbielski A., Boyle M.D.P. Identification of an amino acid signature sequence predictive of protein G - inhibitable IgG3-binding activity in group A streptococcal IgG binding proteins. Gene, 1996, 24, 65-70.

257. Pancholi V., Fischetti V.A. A major surface protein on group A streptococci is a glyceral de-hyde-B phosphate dehydrogenase with multiple binding activity. J.Exp. Med., 1992, 176, 415-426.

258. Pancholi V., Fischetti V.A. Glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase on the surface on group A streptococci is also an ADP-ribosylating enzyme. Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1993, 90, 8154-8158.

259. Parker M.T., Ball L.C. Streptococci and aerococci associated with systematic infections in man. J.Med. Microbiol., 1976, 9, 275-309.

260. Parkash K., Dutta S. Application of serum opacity factor in subtyping of group A streptococci and identification of new M types. Indian J.Med. Res.(A), 1991, 93, 222-224.

261. Peterson P.K., Schmeling D., Cleary P.P., Wilkinson B.J, Kim Y., Quie G. Inhibition of alternative complement pathway by group A streptococcal M protein. J.Inf. Dis., 1979, 139, 575-587.

262. Peters T. Jr.: Serum albumin. Adv. Protein Chem., 1985, 37, 161-245.

263. Philips G.N., Flicker P.F., Cohen C., Manjula B.N., Fischetti V.A. Streptococcal M protein: alpha-helical coiled coil structure and arrangement on the cell surface. Proc. Natl. Acad., Sci, USA, 1981, 78, 4689-4693.

264. Podbielski A., Kuhnemund O., Lutticken R. Identification of group A type 1 streptococcal M protein gene by a non-radioactive oligonucleotide detection method. Med. Microbiol. Immunol., 1990, 179, 255-262.

265. Podbielski A., Flosdorff A., Weber-Heynemann J. The group A streptococcal VIR R 49 controls expression of four regulon genes. Infect. Immun., 1995, 63, 9-20.

266. Podbielski A., Mignon M., Weber-Heynemann J., Schnitzler N., Lutticken R., Kaufhold A. Pathogenic streptococci: present and future Proceedings of the XII Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases. St-Petersburg, Russia, 1994, 234-236.

267. Podbielski A. Three different types of organization of the VIR regulon in group A streptococci. Mol. Gen. Genet., 1993, 237, 287-300.

268. Podbielski A., Hawlitzky J., Pack T.D., Flosdorf A., Boyle M.D.P. Astreptococcal Enn protein potentially resulting from intergenomic recombination exibits atypical immunoglobulin binding characteristic. Mol. Microbiol., 1994, 12, 725-736.

269. Poirier T P., Kehoe M.S., Shaw C.E., Dale J.B., Beachey E.H. Surface expression of the type M5 protein of Streptococcus pyogenes in Streptococcus sanguis: Abstr. II ASM Conf. on Streptococcal Genetics USA, Florida, 1986, 22.

270. Poirer TP, Kehoe M.A., Whitnack E., Dockter M.E., Beachey E.H. Fibrinogen binding and resistance to phagocytosis of Streptococcus sanguis expressing cloned M protein of Streptococcus pyogenes. Infect. Immun., 1989, 57, 29-35.

271. Poirier TP., Kehoe M.A., Dale J.B., Beachey E.H. Expression of protective and cardiac tissue cross-reactive epitopes of type 5 streptococcal M protein in Eschericia coli. Infect. Immun., 1985, 48, 198-203.

272. Poljak R. Three-dimensional structure, function and genetic control of immunoglobulins. Nature, 1975, 256, 373-376.

273. Poon-King R, Bannan J., Viteri A., Cu G., Zabriskie J.B. Identification of an extracellular plasmin binding protein from nephrito genie streptococci. J.Exp., Med., 1993, 178, 751-763.

274. Pruksakorn S., Galbraith A.,Houghten R.A., Good M.F. Conserved T and B cell epitopes on the M protein of group A streptococci. Induction of bactericidal antibodies. J.Immunol., 1992, 149, 2729-2735.

275. Pruksakorn S., Currie B., Brandt R. Towards a vaccine for reheumatic fever: identification of conserved target epitope on M protein of group A streptococci. Lancet, 1994, 344, 639-642.

276. Raeder R., Boyle M.D.P. Comparison and human receptors expresses on bovine and human group G streptococci. Infect. Immun., 1991, 56, 609-616.

277. Raeder R, Otten R.A., Chamberlin L., Boyle M.D.P. Functional and serological analysis of type II immunoglobulin Gbinding proteins expressed by pathogenic group A streptococci. J.Clin. Microbiol., 1992, 30, 3074--3081.

278. Raeder R, Otten R., Boyle M.D.P. Comparison of albumin receptors expressed on bovine and human group G streptococci. Infect. Immun., 1991, 59, 609-616.

279. Raeder R., Boyle M.D.P. Association between expression of immunoglobulin G binding proteins by group streptococci and virulence in a mouse skin infection model. Infect. Immun., 1993a, 63, 1378-1384.

280. Raeder R., Boyle M.D.P. Association of type immunoglobulin G-binding protein expression and survival of group A streptococci in human blood. Infect. Immun., 1993b, 61, 3696-3702.

281. Reed W.P., Metzier C., Albright G. Streptococcal adherence to Langerhands cells. A possible step, in the pathogenesis of streptococcal pharyngits. Clin. Immunol, and Immunopathol., 1994, 70, 28-31.

282. Reed G.L., Kussie P., Parhami-Sern B. A functional analysis of the antigenicity of streptokinase using monoclonal antibody mapping and recombinant streptokinase fragments. J.Immonol., 1993, 150, 4407-4415.

283. Reed R.G. Location of long chain fatty acid binding sites of bovine serum albumin by affinity labelling. J. Biol. Chem., 1986, 261, 15619-15624.

284. Reid H.F.M., Bassed D.C.J., Poon-King T., Read S.F. Group G streptococci in healthy school children and patients with glomerulo nephritis in Trinidad. J.Hyg. Camb., 1985, 94, 61-68.

285. Reis K.J., Ayoub E., Boyle M.D.P. Streptococcall Fc receptors. 1.Isolation and partial characterization of the receptor from a group C streptococcus. J.Immunol., 1984, 132, 3091-3097.

286. Reis K.J., Siden J., Boyle M.D.P. Selective colony blotting to expand bacterial surface receptors: applications to receptors for rat immunoglobulins. Biotechniques, 1988,6, 130-136.

287. Reis K.J., Hansen F., Bjorck L. Extraction and characterization of IgG Fc receptors from group C and G streptococci. Molec. Immunol., 1986, 23, 425-431.

288. Reis K. J., Ayoub E.M., Boyle M.D.P. A rapid method for the isolation and characterization of a homoheneous population of streptococcal Fc receptors. J. Microbiol. Methods, 1985, 4,45-48.

289. Reis K.J., Ayoub E.M., Boyle M.D.P. Streptococcal Fc receptors. II.Comparison of the reactivity of a receptor from a group C streptococcus with staphilococcal protein A. J.Immunol., 1984, 132, 3098-3102.

290. Reis K. J., Boyle M.D.P., Ayoub E.M. Identification of distinct Fc receptor molecules on streptococci and staphylococci. J.Clin. Lab. Immunol., 1983, 13, 75-80.

291. Reis K.J., Salpeter J., Boyle M.D.P. Type IV bacterial immunoglobulin binding proteins. In Boyle M.D.P. (ed.), Bacterial immunoglobulin binding protein. Academic Press. Inc., San Diego. Calif.,1990, 1, 149-154.

292. Reis K.J., von Mering GO., Karis M.A., Faulmann E.L., Lottenberg R., Boyle M.D.P. Enzyme-labeled type III bacterial Fc receptors- a versatile tracer for immunoassay. J.Immunol. Methods, 1988, 107, 273-280.

293. Relf H.F.M., Martin D.R., Sriprakash K.S. Identification of sequence typing among the nonty-peable group A streptococci. J.Clin. Microbiol., 1992, 30, 3190-3194.

294. Reichard W., Gulkbe K., Schmidt K.H. M3 protein with close seguence homology to M12 protein binds fibrinogen, albumin, fibronectin, but not to any subclass of IgG-localization of binding regions. Dev. Biol. Stand., 1995, 85, 179-182.

295. Retnoningrum D.S., Cleary P.P. M12 protein from Streptococcus pyogenes is a receptor for immunoglobulin G3 and human albumin. Infect.Immun., 1994, 62, 2387-2394.

296. Retnoningrum D.S., Podbielski A M Cleary P.P. Type M12 protein from Streptococcus pyogenes is a receptor for IgG3. J.Immunol., 1993, 150, 2332-2340.

297. Rigby P.W.J., Diecmann M., Rhodes C., Berg P. Labeling deoxyribonucleic acid to high specific activity in vitro by nick translation with DNA polymerase. J.Mol. Biol., 1977, 113, 236-251.

298. Rodriguez P., Fuentes D., Munoz F., Kivero D., Orta D., Alburqueque S., Perez S., Basada V., Hernera L. The streptokinase domain responsible for plasminogen binding. Fibrinolysis, 1994, 8, 276-285.

299. Ronjac J.V., Robbins R.S., Fischetti V.A. DNA sequence of the serum opacity factor of group A streptococci. Identification of a fibronectin binding repeat domain. Infect. Immun., 1995, 63, 622631.

300. Sauer-Erikson A.E., Kleywegt G.J., UhlenM., Jones T.A. Crystal structure of C2 fragment of streptococcal protein G in complex with the Fc domain of human IgG. Structure, 1995, 3, 265-278.

301. Sanger F, Coulson A.R., Barell B.G., Smith A.S.N., Roe B.A. Cloning in single-standed bacteriophage as an aid to rapid D.NA sequencing. J.Mol. Biol., 1980, 143, 161-178.

302. Scatchard G. The attractions of proteins for small molecules and ions. Ann. N Y Acad. Sci, 1949, 51, 666-672.

303. Schalen C., Christensen P., Grubb A.M., Samuelsson G., Svensson ML. Demonstration of separate regions for human IgA and IgG in group A streptococci type 4. Acta Path. Microbiol. Scand. Sect C, 1980, 88, 77-82.

304. Schalen C, Truedsson L., Christensen K., Christensen P. Blocking of antibody complement-dependent effector functions by streptococcal IgG Fc receptor and staphylococcal protein A. Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. B., 1985,93, 395-400.

305. Schalen C., Christensen P., Grubb R.: Lancefield extract of group A streptococci type 15 acts like an anti-human IgG with restricted specificity. Acta Path. Microbiol. Sect. C, 1978, 86, 41-43.

306. Schilvert P.M., Bettin K.M., Watson D.W., Production of pyrogenic exotoxin by groups of streptococci: asociation with group A. Infect. Dis., 1979, 140, 676-681.

307. Scott J R., Guenthner P C., Malone L.M., Fischetti V.A. Conversion of a M" group A streptococcus to M^ by transfer of a plasmid containing a M6 gene. J.Exp. Med., 1986, 164, 1641-1651.

308. Scott J R., Pulliam W.M., Hollingsheed S.K., Fischetti V.A. Relationship of M protein genes in group A streptococci. PNAS USA, 1985, 82, 1822-1826.

309. Scott JR., Hollingsheed S.K., Fischetti V.A. Structural and genetic relationships of the family of M protein molecules of group A streptococcus: Abstr. II ASM Conf. on Streptococcal Genetics USA, Florida, 1986, 14.

310. Scott J R., Fischetti V.A. Expression on streptococcal M protein in Escherichia coli. Sci, 1983, 221, 758-760.

310 a. Scott JR., Cleary P.P, Caparon M.G., Podbelski A., Neu name for the positive regulator of the protein of the group A Streptococcus, Mol. Microbiol., 1997, 17, 799.

311. Schnitzler N., Haase G., Bussing A., Kaufhold A., Beyhs P., Podbielski A. Measuring resistance to phagocytes of group A and G streptococci. Med. Microbiol. Immunol., 1995, 184,17-22.

312. Schnitzler N., Podbielski A., Baumgarten G., Mignon M., Kaufhold A. M and M-like polymorphism in human group G streptococci. J.Clin. Microbiol., 1995, 33, 356-363.

313. Schnitzler N., Haase G., Bussing A., Podbielski A. Measuring resistance to phagocytosis of group A and G streptococci: comparison of direct bactericidal assay and flow cytometry. Med. Microbiol. Immunol., 1995, 184, 17-22

314. Schroder A., Nardella F., Mannik M., Svensson M.-L., Christensen P. Interaction between streptococcal IgG Fc receptors and human and rabbit IgG domains. Immunology, 1986, 57, 305309.

315. Seppala H., He Q, Osterblad K., Huovinen P., Typing of group A streptococci by random amplified polymorphic DNA analysis. J.Clin. Microbiol., 1994a, 32, 1945-1948.

316. Sepalla H., Vnopio-Varkila J., Osterblad M., Jahkola M., Rummukainen M., Holm S.E., Huovinen P. Evaluation of methods for epidemiologic typing of group A streptococci. J.Infect. Dis., 1994b, 169, 519-525.

317. Schmidt K.H., Wadstrom T. A secreted receptor related to Ml protein of Streptococcus pyogenes binds to fibrinogen, IgG and albumin. Zbl. Bact., 1990, 273, 216-228.

318. Schmidt K.H., Kuhnemund O., Koler W. A screening of streptococci freshly isolated from human and animal sources for binding of human IgG. Zbl. Bact. Hyg., 1987, 265, 420-429.

319. Simpson W.J., Robbinson J.C., Cleary P.P. Evidence for group A related M protein genes in human but not animal-associated group G spreptococcal pathogens. Microbiol, Pathog., 1987, 3, 339-350.

320. Simpson W.J., Cleary P.P. Corregulation of type 12M protein and streptococcal C5a peptidase genes in group A streptococci: evidence for a virulence regulion controlled by the VIR R locus. J.Bacteriol., 1990, 172, 696-700.

321. Simpson W.J., Cleary P.P. Genetic analysis of phagocytic resistant group G streptococci, using an M12 protein coding sequence as probe. Abstr. II ASM Conf. on Streptococcal Genetics USA, Florida, 1986, 22.

322. Simpson W.A., Ofek J., Beachy F.H. Fatty acid binding sites of serum albumin as membrane receptor analogs for streptococcal lipoteichoic acid. Infect. Immun., 1980, 29, 119-122.

323. Simpson W.A., Musser J.M., Cleary P.P. Evidence consistent with gorizontal transfer of the gene (emml2) encoding serotype Ml2 protein between group A and group G pathogenic streptococci. Infect. Immun., 1992, 60, 1890-1893.

324. Sjobring U., Bjorck L., Kastern W. Proteins G genes: structure and distribution of IgG-binding and albumin-binding domains. Mol. Microbiol., 1989, 3, 319-327.

325. Sjobring U., Bjorck L., Kastern W. Streptococcal protein G: gene structure and protein binding properties. J. Biol. Chem., 1991, 266, 399-405.

326. Sjobring U. Isolation and molecular characterization of a novel albumin-binding protein from group G streptococci. Infect. Immun., 1992, 60, 3601-3608.

327. Sjobring U., Falkenberg C., Nielsen E., Akerstrom B., Bjorck L. Isolation and characterization of a 14-kDa albumin-binding fragment of streptococcal protein G. J.Immun., 1988, 140,1595-1599.

328. Sjobring U., Trojnar J., Grubb A., Akerstrom B., Bjorck L. Ig-binding bacterial proteins also bind proteinase inhibitors. J. Immunol., 1989, 143, 2948-2954.

329. Skjold A.S., Wannamaker L.W. Method for typing group A type 49 streptococci. J.Clin. Microbiol., 1976, 4, 232-238.

330. Sjodahl J. Repetitive sequences in protein A from Stafilococcus aureus. Arrangement of five regions within the protein , four being highly homologous and Fc-binding. Eur. J. Biochem., 1977, 73,343-351.

331. Southern E.M. Detection of specific sequence among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J.Mol. Biol., 1975, 89, 503-517.

332. Spanier J.G., Jones S.J.C., Cleary P.P. Small DNA deletions creating avirulence in Streptococcus pyogenes. Sci., 1984, 225, 935-938.

333. Stenberg L., O'Toole P., Lindahl G. Many group A streptococcal strains express two different immunoglobulin binding proteins, encoded by closely linked genes: characterization of the proteins expressed by four strains of different M types. Mol. Microbiol., 1992, 6, 1185-1194.

334. Stenberg L., O'Toole P., Mestecky J., Lindahl G. Molecular characterization of protein Sir, a streptococcal cell surface protein, that binds both immunoglobulin A and immunoglobulin G. J.Biol. Chem, 1994, 269, 13458-13464.

335. Stenberg L. Genetics and Biochemistry of group A streptococcal cell surface proteins, with special reference to immunoglobulin A-binding proteins. Doctoral Thesis, Lund University, 1994. 326. Stollerman G.N. Short analytical review: rheumatogenic streptococci and autoimmunity. Clin. Immunol. Immunopathol., 1991, 61, 131-142.

337. Stone G.C., Sjobring U., Bjorck L., Sjoquist J., Barber C. V., Nardella F A. The binding site for streptococcal proteinG is the C gamma2-C gamma3 interface region IgG and is related to the sites that binds staphylococcal protein A and human rheumatoid factors. J.Immunol., 1989, 143, 565-570.

338. Talkington D.F., Schwartz B., Black C.M., Todd J.K., Elliott J., Breiman R.F., Facklam R.R. Association of phenotypic and genotypic characteristic of invasive Streptococcus pyogenes isolates with clinical components of streptococcal toxic shock syndrome. Infect. Immun., 1993, 61, 33693374.

339. Tagg JR., Bannister L.V. Finger printing beta-hemolytic streptococci by their production of and sensivity to bacteriocin-like inhibitors. J.Med. Microbiol., 1979,12, 397-411.

340. Talay S R., Valentin-Weigand P., Jerlstrom P.G., Timmis K.N., Chhatwal G.S Fibronectin-binding protein of Streptococcus pyogenes: sequence of the binding domain involved in adherence of streptococci to epithelial cells. Infect. Immun., 1993 , 61, 3837-3844.

341. Talay S R., Grammel M P., Chhatwal G.S. Structure of a group C streptococcal protein that binds to fibrinogen, albumin and immunoglobulin G via overlapping modules. Biochemical J., 1996, 315, 577-582.

342. Tewdors W., Kronvall G. Distribution of presumptive pathogenicity factors among beta-hemolytic streptococci isolated from Ethiopia. APMIS, 1993, 101, 295-305.

343. Thern A., Stenberg L., Dahlback B., Lindahl G. Immunoglobulin-binding surface proteins of Streptococcus pyogenes also bind human C4b-binding protein (C4BP), a regulatory component of the complement system. J.Immunol., 1994, 152, 2342-2349.

344. Tillet W.S., Edwards L.B., Graner R.L. Fibrinolytic activity of hemolytic streptococci development of resistance of fibrinolysis following acute hemolytic streptococcus infection. J.Clin. Invest., 1934, 13,47-51.

345. Top F.H.I.,Wannamaker L.W. The serum opacity reaction of Streptococcus pyogenes. Frequency of production of streptococcal lipoproteinase by strains of different serological types and relation ship to M protein production. J.Hyg. (Camb ), 1968a, 66, 49-55.

346. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from poly acril amide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 4350-4354.

347. Tylewska S.K., Fischetti V.A., Gibbon R.J. Binding selectivity of Streptococcus pyogenes and M protein to epithelial cells differs from that of lipoteichoic acid. Curr. Microbiol., 1988, 16, 209216.

348. Vanheyningen T., Frogg G., Yatls D., Hansi E., Caparon M. Adherence and fibronectin binding are envirommentally regulated in the group A streptococci. Mol. Microbiol., 1993, 9, 1213-1222.

349. Van Oss C.J. Phagocytosis: an overview. Meth. Enzymol., 1986, 132, 3-5.

350. Van Weemen B.K., Schuure A H. Immunoassay using antigen-enzyme conjugates. PEBS Letten, 1971, 15, 232-236.

351. Viberti G C , Mogensen C.E., Passo P., Bilous R., Mangill R. St. Vincent. Declaration, 1994, 515-525.

352. Vickers B., Beachy E. Cloning and expression of streptococcal M protein in Escherichia coli. Plasm., 1984, 11, 192-193.

353. Villarreal H, Fischetti V.A., Van de Rijn J., Zabriskie J.B. The occurrence of a protein in the extracellular products of streptococcal isolated from patients with acute glomerulo-nephritis. J.Exp. Med., 1979, 149, 459-472.

354. Vogt A., Mertz A., Batsford S., Rodrigdex B., Garcia P. Cationic antigens in poststreptococcal glomerulonephritis. Clin. Nephritol., 1983, 20 271-279.

355. Wagner B., Schmidt K.H., Wagner K.H. Immunoelectron microscopic localization of T proteins in the cell wall of Streptococcus pyogenes. Zbl. Bact. Hyg., 1979.

356. Wagner B., Schmidt K.H., Wagner M., Kohler W. Albumin bound to the surface of M protein positive streptococci increased their phagocytosis by human polymorphonuclear leucocytes in the absence of complement and bactericidal antibodies. Zbl. Bact. Hyg., 1986, 261, 432-446.

357. Walter R, Siegel M., Malke H. Nucleotide sequence of the streptokinase gene from a Streptococcus pyogenes type 1 strain. Nucl. Acids Res., 1989,17, 1261-1265.

358. Wang J R., Stinson M.N. Streptococcal M6 protein binds to fructose-contaning glycoprotein on cultured human epithelial cells. Infect. Immun., 1994, 94, 956-977.

359. Weeks C.R., Ferretti J.J. Nucleotide sequence of the type A streptococcal exotoxin gene from Streptococcus pyogenes bacteriophage T12. Infect. Immun., 1986, 52, 144-150.

360. Welpty J.K., Fowier A., Zabin L. Beta-galactozidase alpha complementation. J.Biol. Chem., 1981, 256, 6804-6810.

361. Wessels M R., Goldberg J.B., Moses A.E., Dicesare T.J. Effect on virulence of mutations in a locus essential for hyaluronic acid capsule expression in group A streptococci. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1991, 88, 8317-8321.

362. Wexler D.E., Cleary P.P. Human neutrophil chemotactic response to group A streptococci: bacteria-mediated interference with complement-derived chemotactic factors Infect. Immun., 1986, 53, 432-434.

363. Whatmore A.W., Kehoe M. Horizontal gene transfer in the evolution of group A streptococcal emm-like genes: gene mosaics and variation in VIR regulons. Mol. Microbiol., 1994, 11, 363-374.

364. Whatmore A.M., Kapur V., Sullivan D.J., Musser J.M., Kehoe M.A. Noncongruent relationships between variation in emm gene sequence and the population genetic structure of group streptococci. Mol. Microbiol.., 1994, 14, 619-631.

365. Whatmore AM., Kapur V., Musser J.M., Sullivan D.J., Kehoe M.A. Variation in emm-like gene sequence in the context of the population genetic structure of group A streptococci. Dev. Biol. Stand., 1995, 85, 159-162.

366. Whitnack E., Bisno A.L., Beachy E.H. Hyoluronate capsule prevente attachment of group A streptococci to mouse peritoneal macrophages. Infect. Immun., 1981, 31, 985-989.

367. Whitnack E., Beachy E.H., Antiopsonic activity of fibrinogen bound to protein M on the surface of group A streptococci. J.Clin., Inverst., 1982, 69, 1042-1045.

368. Whitnack E., Beachy E.H., Biochemical and biological properties of the binding of human fibrinogen to M protein in group A streptococci. J. Bacteriol., 1985, 164, 350-358.

369. Wideback K., Havlicek J., Kronvall G. Demonstration of a receptor for mouse and human serum albumin in Streptococcus pyogenes. Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. Sect, B., 1983, 91, 373-382.

370. Wideback K., Kronvall G. Surface receptors for serum albumin in group C and G streptococci show three different types of albumin specificity. Infect. Immun., 1982, 38, 1154-1163.

371. Wideback K., Kronvall G. Isolation of a specific albumin receptor from a group G streptococcal strain. Acta Pathol. Microbiol. Immonol. Scand. Sect.B, 1987, 95, 203-210.

372. Wideback K., Seal U., Kronvall G. Receptor in group C and G streptococci detects albumin structures present in mammalian species. Infect. Infect., 1982, 36, 469-475.

373. Widdowson J.P., Maxted W.R., Grant D.L. The production of opacity factor by group A streptococci and its relatiohship with the presence of M antigen. J.Gen. Microbiol., 1970, 61, 343353.

374. Wigley D.B. The third IgG binding domain from streptococcal protein G. An analysis by x-ray crystallography of the structure alone and in a complex with Fab. J.Mol. Biol., 1994, 243, 906-918.

375. Winkelhake J. Immunoglobulin structure and effector functions. Immunochemistry, 1978, 15, 695-714.

376. Winters B.D., Ramasubbi N., Stinson M.W. Isolation and characterization of a Streptococcus pyogenes protein that binds to basic laminae of human caridac muscle. Infect. Immun., 1993, 61, 3259-3264.

377. Woof J.M., Burton D.R. The nature of the interaction of bacterial Fc receptors and IgG. In Boyle M.D.P. (ed.), Bacterial immunoglobulinbinding proteins: microbiology, chemistry and biology. Academic Press., Inc., San Diego, 305-316.

378. Yalow R.S., Besson S.A. Assay of plasma insulin in human subjects by immonological methods. Nature, 1959, 184, 1648-1649.

379. Yarnall M., Boyle M.D.P. Isolation and partial characterization of a type II Fc receptor from a group A streptococcus. Mol. Cell. Biochem., 1986, 70, 66-69.

380. Yarnall M., Boyle M.D.P. Isolation and characterization of type Ha and type lib Fc receptors from a group A streptococcus. Scand. J. Immunol., 1986,24, 549-557.

381. Yoshizawa N., Oshima S., Ssgel J., Shimizu J., Treser G. Role of a streptococcal antigen in the pathogenesis of acute poststreptococcal glomerulonephritis. J.Immunol., 1992,148, 3110-3116.

382. Yu C.E., Ferretti J.J. Frequency of the erytrogenic toxin B and C genes (spe B and spe C) among clinical isolates of group A streptococci. Infect. Immun., 1991, 59, 211-215.

383. Yu C. E., Ferretty J.J. Molecular epidemiologic analysis of the type A streptococcal exotoxin gene (spe A) in clinical Streptococcus pyogenes strains. Infect. Immun., 1989, 57, 3715-3719.

384. Uhlen M., Guss B., Nilsson B., Gatenbeck S.M, Philipson L., Lindberg M. Complete sequence of the staphylococcal gene encoding protein A. J.Biol. Chem., 1984, 259, 1695-1702.

385. Ulberg M., Kronvall G, Wiman B. New receptor for human plasminogen on gram positive cocci. APMIS, 1989, 97, 996-1022.

386. Ulberg M., Karlsson G., Miman B., Kronvall G. Two types of receptors for human plasminogen of group G streptococci. APMIS, 1992, 100, 21-28.