Получение и характеристика рекомбинантного белка TUL4, потенциального компонента генно-инженерной субъединичной противотуляремийной вакцины тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Лящук, Александр Михайлович

• Лящук, Александр Михайлович
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лящук, Александр Михайлович

Список принятых сокращении.

Введение.

Глава I. Обзор литературы.

1. Краткая характеристика F. tularensis.

1.1. Распространение и эпидемиология.

1.2. Биологические свойства.

1.2.1. Классификация рода Francisella.

1.2.2. Морфология и культуральные свойства.

1.2.3. Биохимические свойства.

1.2.4. Основные факторы патогенности.

1.2.5. Основные антигенные детерминанты F. tularensis.

2. Профилактика туляремии.

2.1. Живые вакцины.

2.2. Инактивированные вакцины.

2.3. Рекомбинантные живые вакцины.

2.4. ДНК вакцины.

2.5. Субъединичные генно-инженерные вакцины.

3. Использование технологии химерных белков для создания субъединичных генно-инженерных вакцин.

3.1. Целлюлозосвязывающий домен.

3.2. Применение целлюлозы как иммуносорбента.

Глава II. Материалы и методы.

1. Материалы.

1.1. Бактериальные штаммы.

1.2. Плазмидные векторы.

1.3. Олигонуклеотиды.

1.4. Ферменты и другие реактивы.

1.5. Лабораторные животные.

2. Методы.

2.1. Выделение хромосомной ДНК.

2.2. Выделение и очистка аналитических количеств плазмидной

2.3. Выделение и очистка препаративных количеств плазмидной

2.4. Гидролиз ДНК специфическими эндонуклеазами.

2.5. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.

2.6. Препаративное разделение фрагментов ДНК и элюция их из геля.

2.7. Лигирование фрагментов ДНК.

2.8. Трансформация клеток Е. coli.

2.8.1. Подготовка компетентных клеток.

2.8.2. Электропорация.

2.9. Полимеразная цепная реакция.

2.10. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.11. Электрофорез белков в ПААГ-ДСН (PAGE - SDS)

2.12. Выращивание штамма-продуцента и индукция синтеза 45 рекомбинантных белков.

2.13. Определение локализации белков в лизатах штамма-продуцента.

2.14. Иммобилизация и выделение белков, содержащих целлюлозосвязывающий домен.

2.15. Иммунизация лабороторных животных.

2.16. Иммуноблоттинг.

Глава III. Результаты и обсуждение.

1. Создание бактериальных штаммов-продуцентов белка

TUL4 из F. tularensis.

1.1. Создание бактериального штамма-продуцента, обеспечивающего экспрессию и секрецию белка TUL4 в периплазму клеток Е. coli.

1.1.1. Клонирование гена белка TUL4.

1.1.1.1. Получение ПЦР фрагментов гена белка TUL4.

1.1.1.2. Клонирование гена белка TUL4 в векторе pGEM-T.

1.1.1.3. Секвенирование нуклеотидных последовательностей гена белка TUL4.

1.1.2. Создание экспрессионных векторов, содержащих ген белка TUL4.

1.1.3. Создание бактериальных продуцентов белка TUL4.

1.2. Создание бактериального штамма-продуцента, обеспечивающего экспрессию белка TUL4 в цитоплазме клеток Е. coli.

1.2.1. Создание экспрессионного вектора, содержащего ген зрелого белка TUL4.

1.2.2. Создание бактериального продуцента гена зрелого белка TUL4.

1.3. Создание бактериального штамма-продуцента, обеспечивающего экспрессию химерного белка TUL4-CBD в цитоплазме клеток Е. coli.

1.3.1. Создание экспрессионных векторов, содержащих ген белка TUL4 в составе химерной конструкции с целлюлозосвязывающим доменом.

1.3.2. Создание бактериальных продуцентов генов белков CBD-sp-TUL и TUL4-sp-CBD.

2. Оптимизация экспрессии химерных белков CBD-sp-TUL и TUL4-sp-CBD.

2.1. Оптимизация времени индукции.

2.2. Оптимизация индукции с помощью плазмиды pACYC-RIL.

2.3. Индукция белков CBD-sp-TUL и TUL4-sp-CBD в различных штаммах Е. coli.

3. Изучение локализации химерных белков CBD-sp-TUL4 и TUL4-sp-CBD в лизатах штамма Е. coli DH5a.

4. Выделение и очистка белков CBD-sp-TUL4 и

TUL4-sp-CBD.

4.1. Изучение связывания химерных белков CBD-sp-TUL и TUL4-sp-CBD с различными видами целлюлозы.

4.2. Выделение и очистка химерных белков CBD-sp-TUL и TUL4-sp-CBD.

5. Определение антигенных свойств белка TUL4-sp-CBD.

5.1. Получение кроличьих антисывороток к комплексу тиЬ4-эр-СВО-целлюлоза.

5.2. Исследование антигенных свойств.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и характеристика рекомбинантного белка TUL4, потенциального компонента генно-инженерной субъединичной противотуляремийной вакцины»

Актуальность проблемы. Туляремия является актуальной проблемой для здравоохранения в связи с широким распространением природных очагов в странах умеренного климатического пояса, а также возможной ролью возбудителя в качестве потенциального агента биотерроризма [16, 17, 110]. Для специфической профилактики туляремии в Российской

Федерации применяется живая вакцина (на основе Francisella tularensis 15 НИИЭГ) , использование которой позволило снизить заболеваемость этой инфекцией до спорадических случаев или небольших вспышек [92, 125, 17].

Данная вакцина, как всякая живая вакцина, не лишена определенных недостатков, важнейшими из которых являются введение человеку чужеродной генетической информации и длительное персистирование вакцинного штамма в организме вакцинированых. В настоящее время выявлено значительное сходство геномов вакцинного и дикого штаммов F. tularensis [96] . Поэтому применение живой вакцины для вакцинации людей не желательно, особенно в условиях нарастающей тенденции снижения уровня естественного иммунитета у населения.

Одним из перспективных направлений в области совершенствования и разработки эффективных способов защиты от туляремии является создание иммунопрофилактических препаратов нового поколения на основе протективных компонентов F. tularensis. Такими препаратами, например, могут быть субъединичные вакцины [31, 44, 28, 104]. Данные вакцины имеют ряд преимуществ, важнейшими из которых являются исключение возможности возникновения манифестной инфекции, слабая реактогенность и возможность получения стандартного препарата антигена. Вместе с тем, сложности в создании субъединичных вакцин связаны с недостаточными сведеньями о протективных антигенах F. tularensis и иммунных механизмах ответа макроорганизма.

Возбудитель туляремии является внутриклеточным патогеном и основная роль в формировании невосприимчивости к туляремии отводится Т-клеточному иммунитету. Основными Т-зависимыми антигенами туляремии являются компоненты внешней мембраны, среди которых наиболее изученным является белок TUL4[20, 138, 139] .

На основе данных антигенных компонентов в последние годы были получены перспективные вакцинные препараты - это рекомбинантный или очищенный белок TUL4, инкапсулированный в иммуностимулирующие комплексы (ISCOMs) [140, 68], липополисахарид-белковый комплекс наружных мембран

F. tularensis [93], препарат ОМ-«С», представляющий собой комплекс наружных мембран, выделенный из вакцинного штамма F. tularensis 15 [9].

В настоящее время спектр основных иммуногенов F. tularensis окончательно не определен, а вышеупомянутые препараты представляют собой сложную и, как следствие, заведомо трудно стандартизуемую смесь белков, липополисахаридов, жирных кислот и других компонентов клетки F. tularensis. Поэтому использование таких препаратов для вакцинации людей менее предпочтительно, по сравнению с препаратами индивидуальных белков, липополисахаридов или их смеси. Следует также отметить, что получение этих препаратов связано с необходимостью культивирования патогенных штаммов туляремии.

Получение стандартных белковых препаратов трудоемко, а многочисленные очистки приводят к снижению протективной активности.

Становится ясно, что для создания эффективных профилактических препаратов против туляремии необходим принципиально новый подход, направленный на получение стандартных рекомбинантных белков, обладающих высокой протективностью, в том числе, за счет использования соответствующих адъювантов или иммуносорбентов.

Цель работы. Получение и характеристика рекомбинантного белка TUL4 на основе технологии целлюлозосвязывающих доменов для генно-инженерных субъединичных противотуляремийных вакцинных препаратов.

В соответствии с поставленной целью в процессе выполнения диссертационной работы предстояло решить следующие основные задачи:

1. Клонирование гена белка TUL4, а также отдельных участков гена белка TUL4 в составе гибридных генов (белков);

2. Создание бактериальных продуцентов белка TUL4 и рекомбинантных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4;

3. Изучение локализации белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4 в лизатах клеток штамма-продуцента;

4. Разработка технологии очистки и получения препарата белка, пригодного для иммунизации;

5. Исследование антигенных свойств препарата белка TUL4.

Научная новизна. Впервые получен в препаративных количествах высокоочищенный рекомбинантный белок TUL4-sp-CBD, потенциальный компонент генно-инженерной субъединичной противотуляремийной вакцины.

Впервые для обеспечения синтеза белка TLJL4 в клетках Escherichia coli были сконструированы гибридные плазмиды, контролирующие синтез химерных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4. Данные химерные белки состоят из нуклеотидной последовательности зрелого белка TUL4, Gly-Ser спейсера и целлюлозосвязывающего домена из Anaerocellum thermophilum. Белки TUL4-sp-CBD и pCBD-sp-TUL4 отличаются N- и С-концевым расположением последовательности белка TUL4.

Впервые были получены эффективные бактериальные продуценты белка TUL4 в составе химерных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4 в клетках Е. coli штамма М15 (pREP4) и DH5a. Уровень экспрессии химерных белков составляет 30% от тотального.

На основе использования свойств целлюлозосвязывающего домена, входящего в состав химерных белков, была разработана эффективная схема очистки рекомбинантных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4 на целлюлозе. Степень чистоты препаратов составляла более 95%.

Препарат белка, содержащий комплекс TUL4-sp-CBD и целлюлозу индуцировал выработку антител к исследуемому белку у лабораторных животных. Специфичность антител подтверждена с помощью метода иммуноблоттинга.

Практическое значение работы. Технология получения химерных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4, а также способ очистки и иммобилизации белков на целлюлозном сорбенте могут найти применение при создании профилактических препаратов против туляремии. Препарат, содержащий комплекс TUL4-sp-CBD-целлюлоза, может быть использован для диагностических целей или для изучения свойств белка TUL4.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на международной конференции «Молекулярная медицина и безопасность» 26-28 октября, 2004 г., г. Москва; на международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» 810 сентября, 2004 г., г. Новосибирск; на V молодежной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» 30 марта, 2005 г., г. Москва; на всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» 19-22 мая, 2005 г., г. Суздаль.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Лящук, Александр Михайлович

Выводы.

1. Сконструированы экспрессионные плазмиды, кодирующие аутентичные последовательности гена белка TUL4. Уровень экспрессии аутентичных генов белка TUL4 составляет менее 1% от общего белка Е. coli.

2. Созданы экспрессионные плазмиды, кодирующие химерные белки TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4, состоящие из нуклеотидной последовательности целлюлозосвязывающего домена из Anaerocellum thermophilum, Gly-Ser спейсера и последовательности зрелого белка TUL4. Подобраны условия индукции синтеза химерных белков. Уровень экспрессии белков составляет 30% от общего белка Е. coli.

3. Изучено состояние химерных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4 в цитоплазме клеток Е. coli штамма DH5a. Оба химерных белка экспрессируются в клетках штамма-продуцента в растворимой форме (растворимость составляет 90%).

4. На основе технологии получения химерных белков, включающих целлюлозосвязывающий домен, был разработан высокоэффективный метод очистки и иммобилизации химерного белка TUL4—sp-CBD на целлюлозном сорбенте. Получены препараты, содержащие комплекс тиь4-эр-СВВ-целлюлоза с концентрацией 3-4 мг белка на 1 мл сорбента.

5. Получены кроличьи антисыворотки к комплексу TUL4-sp-CBD-целлюлоза. Антигенные свойства химерного белка TUL4 показаны с помощью метода иммуноблоттинга.

6. Технология получения химерных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4, а также способ очистки и иммобилизации белков на целлюлозном сорбенте могут найти применение при создании профилактических препаратов против туляремии.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Лящук, Александр Михайлович, 2005 год

1. Батюк JI.JI., Бурый B.JI. Применение ПЦР как экспресс-метода индикации возбудителя туляремии. Здоровье населения и среда обитания. Инф. Бюлл. ФЦ ГСЭН МЗ РФ, 2003, №6, 123, с.22-25.

2. Васекина А.В., Ершов П.В., Решетова О.С., Тихонова Т.В., Лунин В.Г., Трофимова М.С., Бабаков А.В. Вакуолярный Ка+/Н+антипортер ячменя: идентификация и реакция на солевой стресс. 2005, Биохимия, 2005, том 70, вып. 1, с. 123 132.

3. Волков И.Ю., Лунина Н.А., Великодворская Г. А. Перспективы практического применения субстратсвязывающих модулей гликозолгидролаз (обзор). Прикладн. Биох. и мик. 2004, 40, №5, с. 499-504.

4. Воробьев А.А., Васильев Н.Н. Адьюванты (неспецифические стимуляторы иммуногенеза). М., 1969.

5. Гурвич А.Е. Количественное определение содержания антител при помощи белковых антигенов, фиксированных на бумаге. Биохимия 1957, Т. 22, вып. 6, с.1028.

6. Гурвич А.Е., Капнер Р.Б., Незлин Р. С. Выделение чистых антител при помощи фиксированных на целлюлозе антигенов и изучение их свойств. Биохимия, 1959, Т. 24, с.142.

7. Гурвич А.Е., Корукова А.А., Эльгорт Д. А. Усиление иммуногенности белков путем их присоединения к целлюлозной матрице, сб. Иммуномодуляторы, 1987, с.67-76.

8. Гуревич А.Е., Кузовлева О.Б., Туманова А.Е. Получение белково-целлюлозных комплексов (иммуносорбентов) в виде суспензий, способных присоединять большие количества антител. Биохимия Т. 26, вып. 5, 1961, с. 934-942.

9. Жемчугов В.Е, Дятлов И.А., Кутырев В.В., Волох О.А. Способ получения препарата для активной иммунизации против туляремии. Патент РФ, № заявки 2003102089/15, № публ. 2221591, 2004.

10. Ивашенцева Л.Н., Яшечкин Ю.И., Куличенко А.Н., Разработка ПЦР-тест системы для выявления возбудителя туляремии. Генодиагностика инфекционных заболеваний. М., 2002, с.275-277.

11. Кормилицина М.И., Барановский П. М., Ананова Е.В., Мещерякова И.С., Константинова Н.Д. Ассоциации франциселл синфузориями в эксперименте. В сб. Патогенные бактерии в сообществах, РАМН, Москва, 1994, с. 65-70.

12. Лехтцинд Е.В., Гурвич А.Е. Синтез высокоемкого иммуносорбента на основе суспензии целлюлозы. Бюл. экспер. биол. и мед., 1981, Т. 92, вып.7, с.68-70.

13. Лященко В.А., Воробьев А.А. Молекулярные основы иммуногенности. М., 1982.

14. Мазепа А. В. и др. Применение полимеразной цепной реакции при обследовании природного очага туляремии. Актуальные аспкты природноочаговых болезней. Омск, 2001, с. 162-263.

15. Маниатис Т., Фрич Э., Сембрук Дж. Молекулярное клонирование. М., 1984.

16. Мещерякова И.С. Туляремия. Иммунология бактериальных инфекций: руководство для врачей. 1994. М.; Бишкек, РАН-АН Киргизии. Т. 1., С. 232.

17. Мещерякова И.С., Родионова И.В., Кормилицина М.И. Патогенные микроорганизмы рода Francisella. Матер. Научн. практ. Конф., посвящ. 100-летию образования противочум. службы России. Саратов, 1998, Т. 2, С. 84-85.

18. Мещерякова И.С. Современное состояние заболеваемости и профилактики туляремии в РФ. Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней. Сб. научн. тр. М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1998, вып 3, с. 209-212.

19. Мещерякова И.С. Таксономия, идентификация и иммунологическая диагностика возбудителя туляремии: Автрореф. дис. д-ра биол. Наук. М., 1990. 47с.

20. Оноприенко Н.Н. Сравнительная характеристика липополисахаридов бактерий рода Francisella. Диссертация. Ростов-на-Дону 2001, 141с.

21. Павлович Н.В., Цимболистова М.В., Маслова Н.Н. Быстрый метод оценки вирулентности Francisella tularensis in vitro. ЖМЭиИ, 2000, №2, С 17-20.

22. Поздеев O.K. Медицинская микробиология. М. : Геотар-мед. 2001, с.765.

23. Покровский В.И., Онищенко Г.Г., Черкасский Б.Л. Эволюция инфекционных процессов в России в XX веке. Руководство для врачей, Медицина, 2003.

24. Родионова И.В., Мещерякова И.С., Кормилицина М.И., Сравнительный анализ белковых антигенов Francisella. Мол. генетика, микробиолог, и вирусол., 1997, №3, С.11-15.

25. Рабинович M.JI. Кинетические аспекты действия карбогидраз (лизоцим и целлюлолитические ферменты). Дисс. канд. хим. наук. М.: Химический ф-т МГУ, 1977, 160с.

26. Рабинович M.J1., Мельник М.С. Прогресс в изучении целлюлолитических ферментов и механизм биодеградации высокоупорядоченных форм целлюлозы. Успехи биологической химии, т. 40, 2000, с. 205-266.

27. Романова JI.B., Мишанькин Б.Н., Праймеры для родоспецифического обнаружения Francisella tularensis в полимеразной рекции. Ж. микробиология. 1995, №5, с.77-80.

28. Ada G. Overview of vaccines. Mol Biotechnol. 1997 Oct;8(2):123-34. Review.

29. Anonymous. Tularemia, Kosovo. Wkly. Epidemiol. Rec. 2000.75:133-134.

30. Anthony, L. S. D., R. D. Burke, and F. E. Nano. Growth of Francisella spp. in rodent macrophages. Infect. Immun. 1991.59:3291-3296.

31. Arnon R, Ben-Yedidia T Old and new vaccine approaches. Int Immunopharmacol. 2003 Aug; 3(8):1195-204. Review.

32. Berdal, В.P., R. Mehl, N.K. Meidell, A.-M. Lorentzen-Styr, and 0. Scheel. Field investigations of tularemia in Norway. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. 13:191-195.

33. Boyce, J. M. Recent trends in the epidemiology of tularemia in the United States. J. Infect. Dis. 1975. 131:197199.

34. Burnette, W.N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radiodinated protein A.Anal. Biochem. 1981. 112:195-203.

35. Burke, D.S. Immunization against tularemia: analysis of the effectiveness of live Francisella tularensis vaccine in prevention of laboratoryacquired tularemia. J. Infect. Dis. 1977. 135:55-60.

36. Clayton M.A., Clayton J.M., Brown D.R., and Middlebrook, J. L. Protective vaccination with a recombinant fragment of Clostridium botulinum neuro-toxin serotype A expressed from a synthetic gene in Escherichia coli. Infect. Immun. 1995. 63, 2738-2742.

37. Coriell, L.L., E.O. King, and M.G. Smith. Studies on tularemia IV. Observations on tularemia in control and vaccinated monkeys. J. Immunol. 1948. 58:183-202.

38. Cowley SC, Gray CJ, Nano FE. Isolation and characterization of Francisella novicida mutants defective in lipopolysaccharide biosynthesis. FEMS Microbiol Lett. 2000 Jan 1;182(1):63-7.

39. Dertzbaugh MT. Genetically engineered vaccines: an overview. Plasmid. 1998; 39(2):100-13. Review.

40. Donnelly JJ, Friedman A, Martinez D, Montgomery DL, Shiver JW, Motzel SL, et al. Preclinical efficacy of a prototype DNA vaccine: enhanced protection against antigenic drift in influenza virus see comments. Nat Med 1995;1(6):583- 7.

41. Donnelly, J.J., Ulmer, J.В., Shiver, J.W., and Liu, M.A. DNA vaccines. Annu. Rev. Immunol. 2000. 15, 617- 648.

42. Dorofe'ev, K.A. Classification of the causative agent of tularemia. Symp. Res. Works Inst. Epidemiol. Mikrobiol. Chita. 1947. 1:170-180.

43. Dreisbach VC, Cowley S, Elkin KL. Purified lipopolysaccharide from Francisella tularensis live vaccine strain (LVS) induses protective immunity against LVS infection that requires В cells and gamma interferin. Infect Immun 2000, 68:1988-1996.

44. Eigelsbach, H.T., and C.M. Downs. Prophylactic effectiveness of live and killed tularemia vaccines. I. Production of vaccine and evaluation in the white mouse and guinea pig. J. Immunol. 1961. 87:415-425.

45. Eigelsbach, H.T., and V.G. McGann. Genus Francisella Dorofe'ev 1947, 176AL. In N. R. Krieg and J. G. Holt (ed.), Bergey's manual of systematic bacteriology, vol. 1. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Md 1984. p. 394-399.

46. Einhauer A, Schuster M, Wasserbauer E, Jungbauer A Expression and purification of homogenous proteins in Saccharomyces cerevisiae based on ubiquitin-FLAG fusion. Protein Expr Purif. 2002. 24:497-504.

47. Ellis Jill, Petra C.F. Oyston, Michael Green, and Richard W. Titball Tularemia CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Oct. 2002, Vol. 15, No. 4, p. 631-646.

48. Evan GI, Lewis GK, Ramsay G, Bishop JM. Isolation of monoclonal antibodies specific for human c-myc proto-oncogene product. Mol Cell Biol. 1985. 5:3610-3616.

49. Fairweather, N.F., Chatfield, S.N., Makoff, A.J., Strugnell, R.A., Bester, J., Maskell, D.J., Dougan, G., Oral vaccination of mice against tetanus by use of a live attenuated Salmonella carrier. Infect. Immun. 1990. 58, 13231326.

50. Forsman, M., E.W. Henningson, E. Larsson, T. Johansson, and G. Sandstrom. Francisella tularensis does not manifest virulence in viable but nonculturable state. FEMS Microbiol. Ecol. 2000. 31:217-224.

51. Foshay, L. A comparative study of the treatment of tularemia with immune serum, hyperimmune serum and streptomycin. Am. J. Med. 1946. 1:190-188.

52. Foshay, L. Tularemia. Annu. Rev. Microbiol. 1950. 4:313330.

53. Foshay, L. , W.H. Hesselbrock, H.J. Wittenberg, and A. H. Rodenberg. Vaccine prophylaxis against tularemia in man. Am. J. Public Health 1942. 32:1131-1145.

54. Francis, E. Microscopic changes of tularemia in the tick Dermacentor andersoni and the bedbug Cimex lectularius. Public Health Rep. 1927. 42:2763-2772.

55. Freudl, R. , Maclntyre, S., Degen, M. , Henning, U. , Cell surface exposure of the outer membrane protein OmpA of Escherichia coli K-12. J. Mol. Biol. 1986. 188, 491-494.

56. Fridhandler L, Berk JE, Wong D. Affinity characteristics of amylase-binding substance(s) prepared from macroamylase complexes. Clin Chem. 1974;20(1):22-5.

57. Fulop, M., P. Mastroeni, M. Green, and R. W. Titball. Role of antibody to lipopolysaccharide in protection against low-and high-virulence strains of F. tularensis. Vaccine. 2001.19:4465-447250.

58. Germanier, R., Furer, E., Isolation and characterization of GalE mutant Ty21a of Salmonella typhi: a candidate strain for a live, oral typhoid vaccine. J. Infect. Dis. 1975. 131, 553-558.

59. Gilligan, P. H. Pseudomonas and Burkholderia, In P. R. Murray, E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover, and R. H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology Press, Washington, D.C. 1995. p. 509-519.

60. Golovliov I., Ericsson M. , Akerblom L., Sandstrom G. , Tarnvik A., Sjostedt A. Adjuvanticity of ISCOMs incorporating a T cell-reactive lipoprotein of the facultative intracellular pathogen Francisella tularensis. Vaccine, 1995, V. 13 (3), P. 261-267.

61. Gurycova, D. Analysis of the incidence and routes of transmission of tularemia in Slovakia. Epidemiol. Mikrobiol. Immunol. 1997. 46:67-72.

62. Gurycova, D. First isolation of Francisella tularensis subsp. Tularensis in Europe. Eur. J. Epidemiol. 1998. 14:797802.

63. Gurvich A.E., Drizlikh G.I. Use of Antibodies on an Insoluble Support for Specific Detection of Radioactive Antigens. Nature. 1964. Aug. 8. V. 203 P. 648-649.

64. Helvaci, S., Gedikoglu S., Akalin H., and Oral H.B. Tularemia in Bursa, Turkey: 205 cases in ten years. Eur. J. Epidemiol. 2000. 16:271-276.

65. Hermanowska-Szpakowicz, Т., and S. A. Pancewicz. The presence of antibodies against Francisella tularensis among inhabitants of North-Eastern Poland. Przegl. Epidemiol. 1996. 50:55-59.

66. Holm S.E., A. Tarnvik, and G. Sandstrom. Antigenic composition of a vaccine strain of Francisella tularensis. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 1980. 61:136-144.

67. Hood AM: Virulence factors of Francisella tularensis. J Hyg (London) 1977, 79:47-60.

68. Hornick R.B., and H.T. Eigelsbach. Aerogenic immunization of man with live tularemia vaccine. Bacteriol. Rev. 1966. 30:532-538.

69. Hubalek, Z., W. Sixl, and J. Halouzka. Francisella tularensis in Dermacentor reticulatus ticks from the Czech Republic and Austria. Wien. Klin.Wochenschr. 1998. 110:909910.

70. Ilan L. , Oded S. Cellulose-binding domains Biotechnological applications. Biotechnology Advances. 2002.20:191-213.

71. Johansson A, Forsman M, Sjostedt A. The development of tools for diagnosis of tularemia and typing of Francisella tularensis. APMIS. 2004. Nov-Dec;112(11-12):898-907.

72. Johnson K., Charles, I., Dougan, G., Pickard, D., O'Gaora, P., Costa, G., Ali, Т., Miller, I., Hormaeche, C., The role of a stress-response protein in Salmonella typhimurium virulence. Mol. Microbiol. 1991. 5, 401-407.

73. Jungbauer A, Hahn R. Engineering protein A affinity * chromatography. Curr Opin Drug Discov Devel. 2004.1. Mar;7(2):248-56.

74. Junhui, Z., Y. Ruifu, L. Jianchun, Z. Songle, C. Meiling, C. Fengxiang, and C. Hong. Detection of Francisella tularensis by the polymerase chain reaction. J. Med. Microbiol. 1996. 45:477-482.

75. Kadull P.J., Reames H.R., Coriell L.L., and Foshay L. Studies on tularemia. V. Immunization of man. J. Immunol. 1950. 65:425-435.

76. Kadzhaev K.V. Kormilitsina M.I. Demidova T.N. et al. Detection of Francisella tularensis in the samples of different origin by polymerase chain reaction. Ibid. 2000. P. 23.

77. Karpeisky MY, Senchenko VN, Dianova MV, Kanevsky V. Formation and properties of S-protein complex with S-peptidecontaining fusion protein. FEBS Lett. 1994. 339:209212.

78. Keefe AD, Wilson DS, Seelig B, Szostak JW One-step purification of recombinant proteins using a nanomolar-affinity streptavidin-binding peptide, the SBP-Tag. Protein Expr Purif. 2001. 23:440-446.

79. Khatenever, L. M. The allergic diagnosis, specificprophylaxis and vaccine therapy of tularemia. In E. B. 4 Balsky, I. Kochergin G., and Porin V. V. (ed.), Microbiologyand epidemiology. Medical Publications Ltd,, London, United Kingdom. 1943. p. 62-79.

80. Khlebnikov V.S., Golovliov I.R., Kulevatsky D.P., Tokhtamysheva N.V, Averin S.F., Zhemchugov V.E., lipopolysaccharide-protein complex (LPS-17 kDa protein) as chemical tularemia vaccines. FEMS Immunol Med Microbiol. 1996. Mar;13(3):227-233.

81. Kumar S, Epstein JE, Richie TL, Nkrumah FK, Soisson L, Carucci DJ, et al. A multiple effort to develop DNA vaccines against falciparum malaria. Trends Parasitol 2002;18(3 ) :129-35.

82. Kuwajima, G. , Asaka, J.-I., Fujiwara, Т., Nakano, K., Kondoh, E., Presentation of an antigenic determinant from hen egg-white lysozyme on the flagellar filament of Escherichia coli. Bio:Technology. 1988.6, 1080-1083.

83. Larsson P., Chain P., Forsman M. , Lindler LE, Andersson SGE, et all. The Francisella Tularensis SCHU S4 genom project. Abstract. Fourth international conference on tularemia. 15-18 September 2003. City of Bath.United Kingdom.

84. Lauriano CM, Barker JR, Nano FE, Arulanandam BP, Klose KE. Allelic exchange in Francisella tularensis using PCR products. FEMS Microbiol Lett. 2003 Dec 12; 229(2):195-202.

85. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.i,

86. Leslie DL, Cox J, Lee M, Titball RW. Analysis of a-cloned Francisella tularensis outer membrane protein gene and expression in attenuated Salmonella typhimurium. Microbiol Lett. 1993 Aug 1;111(2-3)s 331-5.

87. Liljeqvist S, Stahl S. Production of recombinant subunit vaccines: protein immunogens, live delivery systems and nucleic acid vaccines. J Biotechnol. 1999 Jul 30;73(1):1-33. Review.

88. Marmur J. Electrophoresis DNA on a agarose gel // J. Molec. Biol. 1961. №3. P.208-218.

89. Melcher U. The purification of beta-galactosidase-specific polysomes by affinity chromatography. Anal Biochem. 1975 Apr;64(2):461-5.

90. McCoy, G. W. , and Chapin C. W. . Further observations on a plaguelike disease of rodents with a preliminary note on the causative agent, Bacterium tularense. J. Infect. Dis. 1912. 0:61-72.

91. McCormick M, Berg J. Purification and S-Tag detection of CBD fusion proteins. In Novations. 1997. 7:12-15.

92. Morrison, D. C., and J. L. Ryan. Bacterial endotoxins andhost immune responses. Adv. Immunol. 1979. 28:293-450. ' 110) Morner, T. The ecology of tularemia. Rev. Sci. Tech. Off.1.t. Epiz. 1992. 11:1123-1130.

93. Nano F.E. Identification of a heat-modifiable protein of Francisella tularensis and molecular cloning of the encoding gene. Microb Pathog. 1988 Aug;5(2):109-19.

94. Olsufjev, N. G., and I. S. Meshcheryakova. Subspecific taxonomy of Francisella tularensis McCoy and Chapin 1912. Int. J. Syst. Bacteriol. 1983. 33: 872-874.

95. Ohara, Y., T. Sato, H. Fujita, T. Ueno, and M. Homma. Clinical manifestations of tularemia in Japan — analysis of 1355 cases observed between 1924 and 1987. Infection. 1991.19:14-17.

96. Owen, C. R. Genus Francisella, . In R. EBuchanan and N. E. Gibbons (ed.), Bergey's manual of determinative bacteriology. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Md. 1974. p. 283-285

97. Pallesen, L., Poulsen, L.K., Christiansen, G., Klemm, P., Chimeric FimH adhesin of type 1 fimbriae: a bacterial surface display system for heterologous sequences. Microbiology 141, 1995. 2839-2848.

98. Pavlov, V. M., A. N. Mokrievich, and K. Volkovoy. Cryptic plasmid pFNLlO from Francisella novicida-like F6168: the base of plasmid vectors for Francisella tularensis. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. 13:253-256.

99. Pavlovich, N. V., N. I. Shimaniuk, and B. N. Mishan'kin. Neuraminidase activity in representatives of the genus Francisella. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 1992. 910:8-10.

100. Pollitzer, R. History and incidence of tularemia in the Soviet Union. A review. The Institute of Contemporary Russian Studies, Fordham University, New York, N.Y. 1967.

101. Prior, R. G., L. Klasson, P. Larsson, K. Williams, L. Lindler, A. Sjostedt, T. Svensson, I. Tamas, B. W. Wren, P. C.

102. F. Oyston, S. G. E. Andersson, and R. W. Titball. Preliminaryanalysis and annotation of the partial genome sequence of ' Francisella tularensis strain Schu 4. J. Appl. Microbiol.2001. 91:1-7.

103. Rabinovich M.L. // Materials of Soviet-Finland Seminar on Bioconversion of Plant Raw Materials byMicroorganisms. Institute of Biochemistry and Physiology of. Microorganisms. Pushchino. 1984. P.31-48.

104. Robinson HL. DNA vaccines: basic mechanism and immune responses. Int J Mol Med 1999;4(5):549- 55.

105. Rufissmann, H., Shams, H., Poblete, F. , Fu, Y., Gala^n, J.E., Donis, R.O., Delivery of epitopes by the Salmonella type III secretion system for vaccine development. Science 281, 1998. 565-568.

106. Sandstrom, G. The tularemia vaccine. J. Chem. Tech. Biotech. 1994. 59: 315-320.

107. Sandstrom, G., and A. Tarnvik. Immunospecif ic T-lymphocyte stimulation by membrane proteins from Francisella tularensis. J. Clin. Microbiol. 1987. 25:641-644.

108. Saslaw, S., H. T. Eigelsbach, J. A. Prior, H. E. Wilson, and S. Carhart. Tularemia vaccine study. II. Respiratory challenge. Arch. Intern. Med. 1961. 107:702-714.

109. Saslaw, S., H. T. Eigelsbach, H. E. Wilson, J. A. Prior, and S. Carhart. Tularemia vaccine study. I. Intracutaneous challenge. Arch. Intern. Med. 1961. 107:689-701.

110. Sassenfeld HM, Brewer SJ. A polypeptide fusion designed for purification of recombinant proteins. Bio/Technology. 1984. 2:76-81.

111. Scheich C, Sievert V, Bussow K. An automated method for high-throughput protein purification applied to a comparisonof His-tag and GST-tag affinity chromatography. BMC Biotechnol. 2003 Jul 28;3(1):12.

112. Schmidt TGM, Koepke J, Frank R, Skerra A. Molecular interaction between the Strep-tag affinity peptide and its cognate target, Streptavidin. J Mol Biol. 1996. 255:753-766.

113. Schmidt TGM, Skerra A. The random peptide libraryassisted engineering of a C-terminal affinity peptide, useful for the detection and purification of a functional Ig Fv fragment. Protein Eng. 1993. 6:109-122.

114. Sjostedt, A., A. Tarnvik, and G. Sandstrom. Francisella tularensis: host-parasite interaction. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. 13:181-184.

115. Sjostedt, A., Sandstrom G., and Tfirnvik A. Several membrane polypeptides of the live vaccine strain Francisella tularensis LVS stimulate T cells from naturally infected individuals. J. Clin. Microbiol. 1990.28:43-48.

116. Sjostedt A., Kuoppa K., Johansson Т., Sandstrom G. The 17 kDa lipoprotein and encoding gene of F. tularensis LVS are conserved in strains of F. tularensis. Microb Pathog., 1992, V. 13(3), P. 243-249.

117. Sjostedt A., Sandstrom G. , Tarnvik A., Jaurin B. Nucleotide sequence and T cell epitopes of a membrane protein of Francisella tularensis. J Immunol., 1990, V. 145(1), P. 311-317.

118. Sjostedt A., Sandstrom G. , Tarnvik A. Humoral and cell-mediated immunity in mice to a 17-kilodalton lipoprotein of Francisella tularensis expressed by Salmonella typhimurium. Infect. Immun., 1992, V. 60(7), P. 2855-2862.

119. Sjostedt A., Sandstrom G. , Tarnvik A., Jaurin B. Molecular cloning and expression of a T-cell stimulating membrane protein of Francisella tularensis. Microb. Pathog., 1989, V. 6 (6), P. 403-414.

120. Sorokin, V. M. , N. V. Pavlovich, and L. A. Prozorova. Francisella tularensis resistance to bactericidal action of normal human serum. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. 13:249-252.

121. Stewart, S. J. Tularemia: association with hunting and farming. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. 13:197-199.

122. Stofko-Hahn RE, Carr DW, Scott JD. A single step purification for recombinant proteins. FEBS Lett. 1992.302:274-278.

123. Studier, F. W. , Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W., Fuerst, T. R. , Niles, E. G. , and Moss, B. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of genes. Methods: Enzymol. Companion Methods 185, 1990. p.60-89.

124. Tarnvik, A. Nature of protective immunity to Francisella tularensis. Rev. Infect. Dis. 1989. 11:440-451.

125. Tarnvik, A., M. Ericsson, I. Golovliov, G. Sandstrom, and A. Sjostedt. Orchestration of the protective immune response to intracellular bacteria: Francisella tularensis as a model organism. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. 13:221-225.

126. Tarnvik, A., G. Sandstrom, and A. Sjostedt. Epidemiological analysis of tularemia in Sweden, 1931-1993. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. 13:201-204.

127. Terpe К. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. Review. 2003. 60:523-533.

128. Tigertt, W. D. Soviet viable Pasteurella tularensis vaccines: a review of selected articles. Bacteriol. Rev. 1962. 26:354-373.

129. Tomme P, Boraston A, McLean B, Kormos J, Creagh AL, Sturch K, Gilkes NR, Haynes CA, Warren RA, Kilburn DG. Characterization and affinity applications of cellulose-binding domains. J Chromatogr B. 1998. 715:283-296.

130. Tough, D. F., S. Sun, and J. Sprent. T cell stimulation in vivo by lipopolysaccharide (LPS). J. Exp. Med. 1997. 185:2089-2094.

131. Van Die I., Wauben M., Van Megen I., Bergmans H., Riegman N. , Hoekstra W., Pouwels P., Enger-Valk В., Genetic manipulation of major P-fimbrial subunits and consequences for formation of fimbriae. J. Bacteriol. 1988. 170, 5870-5876.

132. Watanabe T, Ito Y, Yamada T, Hashimoto M, Sekine S, Tanaka H. The role of the C-terminal domain and type III domains of chitinase Al from bacillus circulans WL-12 in chitin degradation. J Bacteriol. 1994. 176:4465-4472.

133. Wilson, G. S., and A. A. Miles. Brucella tularensis, In Topley and Wilson's principles of bacteriology and immunity. The Williams and Wilkins Co., Baltimore. Md. 1964. p. 10131014

134. Wenger, J. D. , D. G. Hollis, R. E. Weaver, C. N. Baker, G. R. Brown, D. J. Brenner, and С. V. Broome. Infection caused by Francisella philomiragia (formerly Yersinia philomiragia).

135. A newly recognised human pathogen.Ann. Intern. Med. 1989. 110:888-892.

136. Westphal 0, Luderitz O, Keiderling W. Effects of bacterial toxins; biochemical analysis of inflammation. Zentralbl bakteriol parasitenkd infektionskr' hyg. 1952 jun;158(3-5):152-60.

137. Wu, J.Y., Newton, S., Judd, A., Stocker, В., Robinson, W.S., Expression of immunogenic epitopes of hepatitis В surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989. p.4726-4730.

138. Xu Z, Bae W, Mulchandani A, Mehra RK, Chen W Heavy metal removal by novel CBD-EC20 sorbents immobilized on cellulose. Biomacromolecules. 2002. 3:462-465.

139. Zheng C-F, Simcox T, Xu L, Vaillancourt P. A new expression vector for high level protein production, one step purification and direct isotopic labeling of calmodulin-binding peptide fusion proteins. Gene 1997.186:55-60

140. Автор выражает огромную благодарность за неоценимую помощь в выполнении работы своим научным руководителям: Ирине Сергеевне Мещеряковой и Владимиру Глебовичу Лунину.

141. Отдельное спасибо: Кормилициной М.И., Родионовой И.В., Шмарову М.М., Народицкому Б.С., Карягиной-Жулиной А. С., Лавровой Н.В., Галушкиной З.М., Сергиенко О.В.,

142. Рязановой Е.М., Ворониной О.Л, Тихоновой Т.В., Ванюшевой О.В., Шилову И.А. и коллективам лаборатории генетической регуляции биохимических процессов, лаборатории молекулярной биотехнологии и лаборатории туляремии.

143. Также автор сердечно благодарит своих друзей и родных за оказанную поддержку и помощь.