Разработка компонентной базы на основе рекомбинантных А- и В-субъединиц рицина для создания тест-систем, антидотов и вакцин против отравлений рицином тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат химических наук Грачева, Мария Андреевна

• Грачева, Мария Андреевна
• кандидат химических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат химических наук Грачева, Мария Андреевна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Обзор литературы.

1.1. Характеристика рицина.

1.1.1. Рибосом-инактивирующие лектины.

1.1.2. Строение рицина и его действие на эукариотические клетки.

1.1.3. Биосинтез рицина.

1.1.4. Транспорт рицина в клетках млекопитающих.

1.1.5. Действие А-субъединицы рицина на рибосомы.

1.1.6. Иммунологические свойства рицина.

1.2. Профилактика излечение отравлений рицином.

1.2.1. Воздействие рицина на организм животных.

1.2.2. Разработка антидотов против рицина.

1.2.3. Разработка вакцин против отравлений рицином.

1.2.4. Разработка тест-систем для обнаружения рицина.

1.3. Применение субъединиц рицина в медицине.

1.3.1. Иммунотоксины.

1.3.2. Адьюванты для создания вакцин.47

1.4. Использование технологии создания химерных белков для получения рекомбинантных антигенов.

1.4.1. Аффинные домены и белки-носители.

1.4.2. Применение целлюлозы, как иммуносорбента.

ГЛАВА 2. Экспериментальная часть.

2.1. Материалы и реактивы.

2.1.1. Плазмидные векторы и олигонуклеотиды.

2.1.2. Бактериальные штаммы и среды.

2.1.3. Ферменты.

2.1.4. Сорбенты.

2.1.5. Другие реактивы.

2.1.6. Буферные растворы.

2.1.7. Лабораторные животные.

2.1.8. Оборудование.л.

2.2. Основные методики.

2.2.1. Выделение ДНК клещевины.7Г

2.2.2. Полимеразная цепная реакция.

2.2.3. Химико-ферментативный синтез.

2.2.4. Сайт-специфический мутагенез.

2.2.5. Гидролиз ДНК специфическими эндонуклеазами.

2.2.6. Фракционирование.фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.

2.2.7. Препаративное разделение фрагментов ДНК и их элюция из геля.

2.2.8. Лигирование фрагментов ДНК.

2.2.9. Выделение и очистка аналитического количества плазмидной ДНК.

2.2.10. Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК.

2.2.11. Определение нуклеотидных последовательностей плазмидных ДНК.76 . 2.2.12. Подготовка компетентных клеток Е. coli для трансформации плазмидной

ДНК электропорацией.

2.2.13. Трансформация клеток Е. coli.

2.2.14. Электрофорез белков в ПААГ-ДСН.

2.2.15. Выращивание штамма-продуцента и индукция синтеза рекомбинантных белков.

2.2.16. Определение растворимости белков.

2.2.17. Определение периплазматической локализации белков.

2.2.18. Выделение и очистка белков, содержащих ШБе-аффинную метку.

2.2.19. Выделение и очистка белков, содержащих CBD.

2.2.20. Иммунизация кроликов.

2.2.21. Непрямой ИФА.

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Получение рекомбинантных аутентичных RTA и RTB.

3.1.1. Клонирование нуклеотидной последовательности аутентичной RTA.

3.1.2. Клонирование нуклеотидной последовательности аутентичной RTB.

3.1.3. Экспрессия рекомбинантных генов аутентичных RTA и RTB в клетках Е. coli М15.

3.2. Получение рекомбинантной мутантной RTA.

3.2.1. Клонирование нуклеотиднойпоследовательности мутантной RTA.96'

3.2.2. Экспрессия рекомбинантного гена мутантной RTA в клетках Е. coli Ml

3.3. Получение химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD в цитоплазме Е. со Ii

3.3.1. Клонирование гибридных генов химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD.

3.3.2. Экспрессия гибридных генов химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD в клетках Е. coli Ml 5.

3.4. Получение химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR и исследование их иммуногенных и антигенных свойств.

3.4.1. Клонирование гибридных генов химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR.

3.4.2. Экспрессия гибридных генов химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR в клетках Е. coli Ml 5.108,

3.4.3. Выделение и очистка химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR.

3.4.4. Исследование иммуногенных и антигенных свойств химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR.

3.5. Получение химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD в периплазме Е. coli и исследование их иммуногенных и антигенных свойств.

3.5.1. Клонирование гибридных генов химерных белков SigRTAspCBD и SigRTBspCBD.

3.5.2. Экспрессия гибридных генов химерных белков SigRTAspCBD и SigRTBspCBD в Е. coli Ml 5.

3.5.3. Выделение и очистка химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD.

3.5.4. Исследование иммуногенных и антигенных свойств химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка компонентной базы на основе рекомбинантных А- и В-субъединиц рицина для создания тест-систем, антидотов и вакцин против отравлений рицином»

Актуальность проблемы. Рицин, токсин растительного происхождения из семян клещевины обыкновенной (Ricinus communis) (рис. 1), является одним из наиболее сильнодействующих токсинов [1]. Его содержание в семенах (касторовых бобах) составляет приблизительно 1-5%. С давних лет известно, что употребление всего двух бобов клещевины может оказаться смертельно опасным для человека.

А. Б.

Рис. 1. Клещевина обыкновенная (Ricinus communis): А. Растение с плодами. Б. Высохший плод (коробочка) и семена (касторовые бобы).

Клещевина обыкновенная представляет собой ценную сельскохозяйственную высокомасличную техническую культуру. В касторовых бобах содержится 48-55% касторового масла, которое отличается высоким содержанием трипшцеридов рицинолевой кислоты (80-85%) и используется в промышленности, медицине и косметологии. Побочным продуктом при производстве касторового масла является шрот клещевины, содержащий 37^40% питательного белка и входящий в компоненты кормов для сельскохозяйственных животных и рыб. Однако присутствие рицина в семенах клещевины осложняет производство касторового масла и шрота клещевины [2, 3, 4].

В руководстве работой и подготовке ее к защите принимал участие заведующий лабораторией биологически активных наноструктур ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН, к.б.н. В.Г. Лунин.

Обычно рицин удаляют из сырья острым паром [1]. Тем не менее, такая обработка не всегда полностью инактивирует токсин, что в дальнейшем может приводить к отравлению человека и сельскохозяйственных животных. Согласно ГОСТ 18102-95 (Масло касторовое медицинское. Технические условия) и ГОСТ 17290-71 (Шрот клещевинный кормовой. Технические условия), реакция.на рицин, в продукции должна отсутствовать.

Ввиду широкого распространения клещевины как сельскохозяйственной5 культуры и простой технологии выделения, рицин является легко доступным токсином. Из-за своей высокой токсичности и доступности он привлекает внимание военных специалистов в области химического оружия, начиная с 1-ой мировой войны. Технология выделения рицина из жмыха семян клещевины не требует сложного оборудования, и поэтому рицин доступен для производства даже в странах со слаборазвитой химической промышленностью. Разработаны эффективные технологии выделения и очистки рицина до кристаллического состояния.

По оценкам экспертов Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) летальная доза неочищенного рицина в аэрозольном состоянии находится на уровне ингаляционной дозы паров зарина, а очищенного - меньше чем летальная, доза вещества VX. Ему как поражающему агенту, был присвоен шифр «W» [5]. Летальные дозы токсина зависят от способа его попадания в организм животных и от вида животных. Наиболее опасной формой рицина является' аэрозоль. Минимальная летальная ингаляционная доза рицина для человека может составлять приблизительно 0,005 мг/кг [6, 7].

В 1978 году рицином был убит болгарский телеведущий Георгий Марков. Токсин был введен журналисту в бедро "уколом" зонтика, в котором была спрятана капсула с рицином. Смерть наступила через 3 дня [8]. В 2003 и 2004 годах рицин был обнаружен в Южной Каролине (США) в почтовом отделении, обслуживающем кабинет сенатора Билла Фриста, и внутри письма, адресованного в Белый Дом (США). Рицин был обнаружен на территории США у лиц, имеющих отношение к антиправительственным группировкам и связанных с террористическими организациями [1]. В начале 2003 года британская полиция арестовала группу террористов, часть которых прошла подготовку в Чечне. В подпольной лаборатории они наладили производство рицина, а между тем, один из задержанных работал на военной базе и имел доступ к приготовлению пищи солдат [9]. Очевидно, что растительный токсин рицин представляет серьезнейшую опасность из-за возможности его использования в качестве химического оружия, в частности, в террористических целях. Он может быть применен для отравления^ воздуха в закрытых вентиляционных системах, питьевой воды и запасов-продовольствия.

Рицин - гликопротеин, белковая часть молекулы которого построена из двух субъединиц - каталитической активной А-субъединицы (RTA, Ricinus Toxin А-chain) [10] и лектиновой связывающей В-субъединицы (RTB, Ricinus Toxin Вchain), соединенных одной дисульфидной связью [11]. RTA ответственна за

-f токсические свойства рицина, а RTB за его транспорт внутрь клетки. Благодаря своей токсической активности RTA нашла применение в создании иммунотоксинов (ИТ) - конъюгатов, состоящих из токсина и антитела и обладающих направленным действием, например в противоопухолевой терапии [11], терапии ВИЧ [12], а также для подавления иммунного ответа при трансплантации органов [13].

На сегодняшний день не существует препаратов для профилактики и лечения отравления рицином, в связи с чем, чрезвычайный интерес представляет создание антидотов и вакцин, а также разработка тест-систем для экспресс-индикации рицина в окружающей среде и в организме. Наиболее перспективными представляются антидоты, полученные на основе протективных антител к рицину, а также тест-системы, основанные на иммунохимических методах. Производство подобных антидотов, тест-систем и вакцин требует получения антигенов рицина.

Работа с нативным рицином для получения его антигенов крайне сложна ввиду его высокой токсичности. Следует отметить, что RTA, изолированная от RTB, находясь вне клетки нетоксична из-за неспособности проникать в клетку без RTB [14]. RTB, сама по себе, также нетоксична [15]. Кроме того, известно, что рекомбинантные RTA и RTB сохраняют многие эпитопы нативного рицина, в том числе и протективные [16, 17]. Поэтому перспективным подходом к получению антигенов рицина является создание рекомбинантных RTA и RTB. Для разработки ИТ также возможно использование рекомбинантных RTA, но для этой цели необходимо сохранение токсичности рекомбинантых RTA и снижение их имму ногенности.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось получение рекомбинантных антигенов RTA и RTB и исследование их иммуногенных и антигенных свойств. Работа выполнялась в рамках комплексного проекта Федерального агентства по науке и инновациям при Министерстве образования и науки РФ по теме: «Разработка технологий, методов и средств обеспечения-системы биологической безопасности и противодействия терроризму» (шифр «БТ

00.2.001») по договору №8-JI/05 от 04.05.2005 (ГК 02.467.11.6002 от 12.04.2005).

В соответствии с поставленной целью в процессе работы предстояло решить следующие основные задачи:

1. Клонирование и экспрессия в Е. coli нуклеотидных последовательностей, кодирующих как аутентичные RTA и RTB, так и их гибриды с белками-носителями;

2. Создание эффективных штаммов-продуцентов Е. coli рекомбинантных белков, содержащих RTA и RTB; I

3. Разработка технологии выделения и очистки рекомбинантных белков, содержащих RTA и RTB;

4. Исследование иммуногенных и антигенных свойств полученных белков.

Научная новизна. На основе идеологии создания многокомпонентных белков, развиваемой в исследовательских коллективах лабораторий биологически активных наноструктур ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН и молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, заведующим которых является к.б.н. В.Г. Лунин, были впервые спланированы и сконструированы рекомбинантные гибридные плазмидные ДНК Е. coli, позволяющие эффективно осуществлять в клетках Е. coli пггамма М15 индуцированный биосинтез химерных белков RTA-DHFR, RTB-DHFR и RTAspCBD, RTBspCBD, содержащих А- и В-субъединицы рицина и белки-носители (дигидрофолат редуктазу - DHFR и целлюлозосвязывающий домен -CBD). Впервые получены штаммы-продуценты данных белков. Разработана высокоэффективная схема выделения, очистки и иммобилизации рекомбинантных белков ЯТАзрСБШ, ЯТВврСВО на целлюлозном сорбенте, основанная на свойствах целлюлозосвязывающего домена и позволяющая получать препараты белков со степенью чистоты более 95%. Впервые получены в препаративных количествах высокоочищенные рекомбинантные белки ЯТА-ОНГЛ, ЯТВ-ОНТЫ и ЯТАврСВВ,

• ЯТВзрСВО, способные индуцировать у кроликов выработку высокого титра специфичных к нативному рицину антител.

Практическое значение работы. Полученные штаммы-продуценты рекомбинантных белков ЯТАэрСВО, ЯТВБрСВО и разработанный метод выделения, очистки и иммобилизации этих белков на целлюлозе, могут найти применение в области промышленной, биотехнологии при создании вакцинных препаратов для предотвращения отравлений рицином, тест-систем индикации рицина на основе иммунохимических методов, а также для получения антидотов к<, рицину на основе протективных антител. Целлюлозосвязывающий домен позволяет получать иммобилизованные препараты ЯТАзрСВО, ЯТВврСВО на целлюлозе. Белки, иммобилизованные на целлюлозном носителе, как показали данные предварительных испытаний, обладают большей стабильностью и существенно большей иммуногенностью по сравнению с раствором нативного белка [18]. Данные белки могут быть использованы для разработки нового поколения иммунологических диагностикумов, в том числе белковых биочипов, основанных на присоединении к подложке из целлюлозы данных рекомбинантных белков, а также для получения сорбентов на основе целлюлозы, для очистки противорициновых антител. В случае сохранения токсичности, связанной- с каталитической активностью ЯТА выщеплять аденин из 288 рРНК г эукариотических клеток, белок ЯТАврСВО может найти применение в качестве компонента ИТ для борьбы со злокачественными опухолями. Белок ЯТВврСВО. может бьггь использован в качестве адъюванта субъединичных генно-инженерных вакцин. 1

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Грачева, Мария Андреевна

выводы

1. Сконструированы экспрессионные плазмиды, содержащие гибридные гены химерных белков, состоящих из А- и В-субъединиц рицина и дигидрофолат редуктазы, обеспечивающие эффективную продукцию целевых белков как в водорастворимой форме, так и в форме телец включения в цитоплазме клеток Е. coli.

2. Сконструированы экспрессионные плазмиды, содержащие гибридные гены химерных белков, состоящих из А- и В-субъединиц рицина, целлюлозосвязывающего домена и N-концевой сигнальной последовательности, обеспечивающие эффективную продукцию целевых белков в водорастворимой форме в периплазме клеток Е. coli.

3. Разработана технологичная и высокоэффективная методика выделения, очистки и иммобилизации белков, состоящих из субъединиц рицина и целлюлозосвязывающего домена на целлюлозном сорбенте.

4. Изучены иммуногенные и антигенные свойства полученных белков. Показано, что они индуцируют выработку высокого титра специфических к нативному рицину антител.

5. Предложено использование белков с целлюлозосвязывающим доменом, как наиболее технологически и экономически выгодных, для создания тест-систем, вакцин и антидотов.

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю, акад. РАМН, д.б.н., проф. В.И. Швецу за умелое руководство и помощь в подготовке к защите данной работы. Автор выражает глубокую признательность заведующему лаборатории биологически активных наноструктур ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, к.б.н. В.Г. Лунину, идеалогически и экспериментально обосновавшего данную работу, за любезно предоставленную возможность выполнять работу в лаборатории биологически активных наноструктур, за помощь в ее выполнении и ежедневное умелое руководство. Автор выражает глубокую признательность сотрудникам лаборатории биологически активных наноструктур ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН: к.б.н. П.В. Попадьину, к.б.н. З.М. Галушкиной, к.б.н. H.H. Полетаевой, к.б.н. JI.B. Верховской, к.б.н. Н.В. Лавровой, а также В.В. Евстифееву за помощь в постановке экспериментов. Автор благодарит научных сотрудников Т.В. Тихонову и к.х.н. О.В. Сергиенко из лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН за участие в создании плазмиды pspCBD. Автор благодарит научных сотрудников лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН: к.х.н. О.В. Сергиенко, к.б.н. О.Л. Воронину, О.С. Колобову, Е.М. Рязанову, Д.В. Гришина, A.C. Семихина и всех остальных сотрудников за ценные рекомендации и советы, за неизменную доброжелательность, дружеское участие и поддержку при выполнении работы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Грачева, Мария Андреевна, 2008 год

1. Audi J., Belson M., Patel M., Schier J., Osterloh J. Ricin poisoning: a comprehensive review.// JAMA. -2005.-V. 294. -N. 18.-P. 2342-2351.

2. Уланова P. Получение пищевой добавки из шрота клещевины. // Комбикорма. -2003.-№5.-С. 29.

3. Кормовые отравления сельскохозяйственных животных: Учебное пособие. 1-е изд. / Лимаренко А.А., Бажов Г.М., Бараников А.И. Санкт-Петербург: Лань, 2007. -С. 276-278.

4. Кононенко С.И. Повышение протеиновой питательности рационов растущих и откармливаемых свиней // Свиноферма. — 2007. -№3.-С. 14-16.

5. Антонов Н.С. Химическое оружие на рубеже двух столетий. М: Прогресс, 1994.-С. 108-111.

6. Doan L.G. Ricin: Mechanism of toxity, clinical manifestations, and vaccine development. // J. Toxicol. Clin. Toxicol. 2004. - V. 42. -N. 2. - P. 201-208.

7. Bradbeiry S.M., Dickers K.J., Rice P., Griffiths G.D., Vale J.A. Ricin poisoning. // Toxicol. Rev. 2003. - V. 22. -N. 1. - P. 65-70.

8. Crompton R., Gall D. Georgi Markov death in a pellet. // Med. Leg. J. - 1980. - V. 48.-N. 2.-P. 51-62.

9. Москалев E.B. Рицин в руках террористов и врачей. // Химия и жизнь XXI век. -2003. -№3,- С. 18-20.

10. Endo Y., Tsurugi К. RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain. Mechanism of action of the toxic lectin ricin on eukaryotic ribosomes. // J. Biol. Chem. 1987. - V. 262.-N. 17.-P. 8128-8130.

11. Olsnes S., Kozlov J.V. Ricin. // Toxicon. 2001 - V. 39. - N. 11. - P. 1723-1728.

12. Pincus S.H. Therapeutic potential of anti-HIV immunotoxins. // Antiviral Res. — 1996.-V. 33.-N. l.-P. 1-9.

13. О'Наге М., Roberts L.M., Thorpe Р.Е., Watson G.J., Prior В., Lord J.M. Expression of ricin A chain in Escherichia coli. IIFEBS Lett. 1987. - V. 216. - N. 1. - P. 73-78.

14. Roberts L.M., Lord J.M. Ribosome-inactivating proteins: entry into mammalian cells and intracellular routing. // Mini Rev. Med. Chem. 2004. - V. 4. - N. 5. - P. 505-512.

15. McGuinness C.R., Mantis N.J. Characterization of a novel high-affinity monoclonal immunoglobulin G antibody against the ricin В subunit. // Infect. Immun. 2006. - V. 74.-N. 6.-P. 3463-3470.

16. Волков И.Ю., Лунина H.A., Великодворская Г.А. Перспективы практического применения субстратсвязывающих модулей гликозолгидролаз // Прикладн. биох. мик. 2004. - Т.40. - № 5. - С. 499-504.

17. Stirpe F., Battelli M.G. Ribosome-inactivating proteins: progress and problems. // Cell Mol. Life Sci. 2006. - V. 63. -N.16. - P. 1850-1866.

18. Sweeney E.C., Tonevitsky A.G., Temiakov D.E., Agapov I.I., Saward S., Palmer R.A. Preliminary crystallographic characterization of ricin agglutinin. // Proteins. — 1997.-V. 28.-P. 586-589.

19. Olsnes S., Stirpe F., Sandvig K., Pihl A. Isolation and characterization of viscumin, a toxic lectin from Viscum album L. (mistletoe). // J. Biol. Chem. 1982. - V. 257. - P. 13263-13270.

20. Sweeney E.C., Tonevitsky A.G., Temiakov D.E., Agapov I.I., Saward S., Palmer R.A. Preliminary crystallographic characterization of ricin agglutinin. // Proteins. — 1997. V. 28. - P. 586-589.

21. Козлов Ю.В., Сударкина О.Ю., Курманова А. Г. Рибосом-инактивирующие лектины растений. // Мол. биол. 2006. - Т. 40. - № 4. - С. 711-723.

22. Montfort W., ViUafranca J.E., Monzingo A.F., Ernst S.R., Katzin В., Rutenber E., Xuong N.H., Hamlin R., Robertus J.D. The three-dimensional structure of ricin at 2.8 A. // J. Biol. Chem. 1987. - V. 262. - P. 5398-5403.

23. Rutenber E., Katzin В J., Ernst S., Collins E .J., Mlsna D., Ready M.P., Robertus J.D. Crystallographic refinement of ricin to 2.5 A. // Proteins. 1991. - V. 10. - N. 3. - P. 240-250.

24. Olsnes S., Pappenheimer A.M., Meren R. Lectins from Abrus precatorius and Ricinus communis. II. Hybrid toxins and their interaction with chain-specific antibodies. // J. Immunol. 1974. - V. 113. -N. 3. - P. 842-847.

25. Сокурова A.M. Особенности строения и фармакокинетика рицина. // Психофамакол. биол, наркол. 2007. - Т. 7. -№ 1. -С. 1484-1487.

26. Попова Е.Н. Взаимодействие рицина с клетками гибридом, секретирующих антитела против его каталитической субъединицы: Дис. . канд. биол. наук. М., 2004. -160 с.

27. Брандг Н.Н., Чикишев А.Ю., Сотников А.И. Савочкина Ю.А., Агапов И.И., Тоневицкий А.Г. Кирпичников М.П. Конформационные различия рицина и агглютинина рицина в растворе и кристалле. // Докл. АН 2001. - Т. 376. - № 5. -С.687-689.

28. Lewis M.S, Youle RJ. Ricin subunit association. Thermodynamics and the role of the disulfide bond in toxicity. // J. Biol. Chem. 1986. - Vol 261. - N. 25. P. 11571-11577.

29. Olsnes S., Pihl A. Different biological properties of the two constituent peptide chainse of ricin, a toxic protein inhibiting protein synthesis. // Biochemistry. 1973. - V. 12.-P. 3121-3126.

30. Katzin B.J., Collins E.J., Robertus J.D. Structure of ricin A-chain at 2.5 A. // Proteins.-1991.-V. 10.-P. 251-259.

31. Robertus J. D., Monzingo A. F. The structure of ribosome-inactivating proteins. // Mini Rev. Med. Chem. 2004. - V. 4. - P. 477-486.

32. Endo Y., Mitsui K., Motizuki M., Tsutugi K. The mechanism of action of ricin and related toxins on eukaryoutic ribosomes.// J. Biol. Chem. 1987. - V. 262. - P. 81288130.

33. Rutenber E., Robertus J.D. Structure of ricin B-chain at 2.5 A resolution. // Proteins. -1991. -V. 10.-P. 260-269.

34. Murzin A.G., Lesk A.M:, Chothia C. ^-Trefoil fold. Patterns of structure and sequence in the Kunitz inhibitors interlieukins-1 P and la and fibroblast growth factors. // J. Mol. Biol. 1992. --V. 223. - P. 531-543.

35. Sphyris N., Lord J.M., Wales R., Roberts L.M. Mutational analysis of the Ricinus lectin B-chains. Galactose-binding ability of the 2 gamma subdomain of Ricinus communis agglutinin B-chain.// J. Biol. Chem. 1995. - V. 27. - N. 35. - P. 20292202937.

36. Wales R., Richardson P.T., Roberts L.M:, Woodland H.R., Lord J.M. Mutational: analysis of the galactose binding ability of recombinant ricin B chain. // J. Biol.Chem: -1991.-V. 266. -N; 29.-P. 19172-19179:

37. Tregear J.W, Roberts L.M. The lectin gene family of Ricinus communis: cloning of a functional ricin gene and three lectin pseudogenes. // Plant Mol. Biol. 1992. - V. 18: -N. 3.-P. 515-525.

38. Lord J.M., Roberts L.M:, Robertus J.D. Ricin: structure, mode of action, and some current applications. // FASEB; J. 1994. - V. 8. - N. 2. - P. 201-208:

39. Youle R.J., Huang A.H. Protein bodies from the endosperm of castor bean: subfractionation, protein components, lectins, and changes during germination. // Plant Physiol. 1976. -V. 58: -N. 6. - P. 703-709.

40. Lamb F.I., Roberts L.M:, Lord J.M: Nucleotide sequence of cloned cDNA coding for preproricin. // Eur. J. Biochem. 1985. - V. 148. - N. 2. - P. 265-270.

41. Ferrini J.BI, Martin M:, Taupiac M.P., Beaumelle B. Expression of functional ricin B chain using the baculovirus system; // Eur. J. Biochem. 1995. - V. 233. - N. 3. - P. 772-773.

42. Lord J.M. Synthesis and intracellular transport of lectin and storage protein precursors in endosperm from castor bean. // Eur. J. Biochem: 1985. -V. 146: -N. 2. — P. 403-409.

43. Lord J.M. Precursors of ricin and Ricinns communis agglutinin. Glycosylation and processing during synthesis and intracellular transport. // Eur. J. Biochem. 1985. - V. 146.-N. 2.-P.411-416.

44. Kimura Y., Hase S., Kobayashi.Y., Kyogoku Y., Ikenaka Т., Funatsu G. Structures of sugar chains of ricin B. // J. Biochem.- 1988.- V. 103.-N. 6. P. 944-949.

45. Harley S.M., Beevers H. Ricin inhibition of in vitro protein synthesis by plant ribosomes. // Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 1982. - V. 79. -N. 19. - P. 5935-5938.

46. Richardson P.T., Westby M., Roberts L.M., Gould J.H., Colman A., Lord J.M; Recombinant proricin binds galactose but does not depurinate 28S ribosomal RNA. // FEBS lett. -1989. V 255. - P. 15-20.

47. Frigerio L., Vitale A., Lord J.M., Ceriotti A., Roberts L.M. Free ricin A chain, proricin, and native toxin have different cellular fates when expressed in tobacco protoplasts. //J. BioL Chem. 1998. - V. 273. -N. 23. -P. 14194^14199^

48. Barbieri L., Battelli M.G., Stirpe F. Ribosome-inactivating proteins from plants. // Biochim. Biophys Acta. 1993.- V, 1154:-N. 3-4.-P. 237-82: •

49. Lord J.M., Roberts L.M. Toxin entry: retrograde transport throught the secretory pathways. // J. Cell Biol. 1998. - V. 140. - N. 4. - P. 733-736.

50. Челнокова О.В. Конформационные изменения растительных токсинов в ходе внутриклеточного транспорта: Дис. канд. биол. наук. М., 2004. - 122 с.

51. Rodal S.K., Skretting G., Garred О., Vilhardt F., van Deurs В., Sandvig K. Extraction of cholesterol with methyl-beta-cyclodextrin perturbs formation of clathrin-coated endocytic vesicles. //Mol. Biol. Cell:- 1999:-V: 10.-N. 4.-P. 961-974.

52. Simpson J.C., Smith D.C., Roberts L.M., Lord J.M. Expression of mutant dynamin protects cells against diphtheria toxin but not against ricin. // Exp. Cell. Res. 1998. - V. 239.-N. 2.-P. 293-300.

53. Мойсенович M.M., Демина И.А., Агапов И.И. Рицин и вискумин связываются с разными участками клеточной мембраны. // ДАН. 2001. - Т. 379. - № 3. - С. 406410.

54. Cosson P., Letourneur F. Coatomer (COPI)-coated vesicles: role in intracellular transport and protein sorting. // Curr. Opin. Cell Biol. 1997. - V 9. - N. 4. - P. 484487.

55. Munro S., Pelham H.R. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. // Cell. 1987. - V. 48. - N. 5. - P. 899-907.

56. Wesche J., Rapak A., Olsnes S. Dependence of ricin toxicity on translocation of the toxin A-chain from the endoplasmic reticulum to the cytosol. // J. Biol. Chem. 1999. -V. 274. - N. 48. - P. 34443-34449.

57. Day P J., Owens S.R., Wesche J., Olsnes S., Roberts L.M., Lord J.M. An interaction between ricin and calreticulin that may have implications for toxin trafficking. // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. - N. 10. - P. 7202-7208.

58. Johnson. A.E., van Waes M.A. The translocon: a dynamic gateway at the ER membrane. // Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 1999. - V. 15. - P. 799-842.

59. Ellgaard L., Molinari M., Helenius A. Setting the standards: quality control in the secretory pathway. // Science. 1999. - V. 286. -N. 5446. - P. 1882-1888.

60. Simpson J.C., Roberts L.M., Römisch К., Davey J., Wolf D.H., Lord J.M. Ricin A chain utilises the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter the cytosol of yeast. // FEBS Lett. 1999. - V. 459. - N. 1. - P. 80-84.

61. Тоневицкий А.Г., Мириманова H.B., Бушуева Т.JI. Структурные и функциональные особенности термически обработанной связывающей субъединицы растительного токсина рицина. //Мол. биол. -1991.-Т. 25. -Вып. 2. -С. 451-461.

62. Spooner R.A., Watson P.D., Marsden C.J., Smith D.C., Moore K.A., Cook J.P., Lord J.M., Roberts L.M. Protein disulphide-isomerase reduces ricin to its A and В chains in the endoplasmic reticulum. // Biochem. J. 2004. - V. 383. - P. 285-293.

63. Day P.J., Pinheiro T.J., Roberts L.M., Lord J.M. Binding of ricin A-chain to negatively charged phospholipid vesicles leads to protein structural changes and destabilizes the lipid bilayer. // Biochemistry. 2002. - V. 41. - N. 8. - P. 2836-2843.

64. Argent R.H., Parrott A.M., Day P.J., Roberts L.M., Stockley P.G., Lord J.M., Radford S.E. Ribosome-mediated folding of partially unfolded ricin A-chain. // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. -N. 13. - P. 9263-9269.

65. Попова E.H. Взаимодействие рицина с клетками гибридом, секретирующих антитела против его каталитической субъединицы: Дис. . канд. биол. наук. М., 2004.-160 с.

66. Ogasawara T., Sawasaki T., Morishita R, Ozawa A., Madin K., Endo Y. A new class of enzyme acting on damaged ribosomes: ribosomal RNA apurinic site specific lyase found in wheat germ. // EMBO J. 1999. - V. 18. - N. 22. - P. 6522-6531.

67. Robertus J. D., Monzingo A. F. The structure of ribosome-inactivating proteins. // Mini Rev. Med. Chem. 2004. - V. 4. - P. 477^86.

68. Olsnes S., Fernandez-Puentes C., Carrasco L., Vazquez D. Ribosome inactivation by the toxic lectins abrin and ricin. Kinetics of the enzymic activity of the toxin A-chains. // Eur. J. Biochem. 1975.- V. 60. - P. 281-288.

69. Eiklid K., Olsnes S., Pihl A. Entry of lethal doses of abrin, ricin and modeccin into the cytosol ofHeLa cells. // Exp. Cell Res. 1980. - V. 12. -N. 2. - P. 321-326.

70. Hartley M.R, Legname G., Osborn R., Chen Z., Lord J.M. Single-chain ribosometinactivating proteins from plants depurinate Escherichia coli 23 S ribosomal RNA. // FEBS Lett. 1991. -V. 290. - P. 65-68.

71. Moazed D., Robertson J.M., Noller H.F. Interaction of elongation factors EF-G and EF-Tu with a conserved loop in 23S RNA. // Nature. 1988. - V. 334. - P. 362-364.

72. Glück A., Endo Y., Wool I.G. Ribosomal RNA identity elements for ricin A-chain recognition and catalysis. Analysis with tetraloop mutants. // J. Mol. Biol. 1992 - V. 226. - N. 2. - P. 411-424.

73. Glück A., Endo Y., Wool I.G. The ribosomal RNA identity elements for ricin and for alpha-sarcin: mutations in the putative CG pair that closes a GAGA tetraloop. // Nucleic Acids Res. 1994. -V. 22. -N. 3. - P. 321-324.

74. Endo Y., Glück A., Wool I.G. Ribosomal RNA identity elements for ricin A-chain recognition and catalysis. // J. Mol. Biol. 1991. - V. 221. - N. 1. - P. 193-207.

75. Larsson S.L., Sloma M.S., Nygard O. Conformational changes in" the structure of domains II and V of 28S rRNA in ribosomes treated with the translational inhibitors ricin or alpha-sarcin. // Biochim. Biophys. Acta. 200. - V. 1577. - P. 53-62.

76. Osborn R.W., Hartley M.R. Dual effects of ricin A chain on protein synthesis in rabbit reticulocyte lysate. Inhibition of initiation and translocation. // Eur. J. Biochem. -1990.-V. 193.-P. 401-407.

77. Correll C.C., Munishkin A., Chan Y.L., Ren Z., Wool I.G., Steitz T.A. Crystal structure of the ribosomal RNA domain essential for binding elongation factors. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. N. 23. - P. 13436-13441.

78. Correll C.C., Wool I.G., Munishkin A. The two faces of the Escherichia coli 23 S rRNA sarcin/ricin domain: the structure at 1.11 A resolution. // J Mol Biol. 1999. — V. 292.-N. 2.-P. 275-87.

79. Ban N., Nissen P., Hansen J., Moore P.B., Steitz T.A. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. // Science. 2000. - V. 289. - N. 5481.-P. 905-920.

80. Endo Y., Tsurugi K. The RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain. The characteristics of the enzymatic activity of ricin A-chain with ribosomes and with rRNA*. // J Biol Chem. 1988. - V. 263. -N. 18. P. 8735-8739.

81. Nicolas E., Beggs J.M., Taraschi T.F. Gelonin is an unusual DNA glycosylase that removes adenine from single-stranded DNA, normal base pairs and mismatches. // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. - N. 40. - P. 31399-31406.

82. Roncuzzi L., Gasperi-Campani A. DNA-nuclease activity of the single-chain ribosome-inactivating proteins dianthin 30, saporin 6 and gelonin. // FEBS Lett. 1996. -V. 392.-N. l.-P. 16-20.

83. Rajamohan F., Venkatachalam Т.К., Irvin J.D., Uckun F.M. Pokeweed antiviral protein isoforms PAP-I, РАР-П, and PAP-III depurinate RNA of human immunodeficiency virus (HIV)-1. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. - V. 260. -N.2.-P. 453—458.

84. Щелкунов C.H. Противовирусные вакцины: от Дженнера до наших дней. // Сорос, образ, жур. Биол. 1998. - №7. - С. 43-50.

85. Chanh Т.С., Romanowski M.J., Hewetson J.F. Monoclonal antibody prophylaxis against the in vivo toxicity of ricin in mice. // Immunol. Invest. 1993. - V. 22. - N. 1. — P. 63-72.

86. Hewetson J.F., Rivera V.R., Creasia D.A., Lemley P.V., Rippy M.K., Poli M.A. Protection of mice from inhaled ricin by vaccination with ricin or by passive treatment with heterologous antibody. // Vaccine. 1993. - V. 11. - P. 743-746.

87. Foxwell B.M., Detre S.I., Donovan T.A., Thorpe P.E. The use of anti-ricin antibodies to protect mice intoxicated with ricin. // Toxicology. 1985. - V. 34. - N. 1. - P. 79-88:

88. Griffiths G.Di, Lindsay C.D., Allenby A.C., Bailey S.C., Scawin J.W., Rice P., Upshall D.G. Protection against inhalation toxicity of ricin and abrin by immunisation. // Hum. Exp Toxicol. 1995. -V. 14. -N. 2. - P. 155-164.

89. GodaltA., Fodstad O., Pihl A. Antibody formation against the cytotoxic proteins abrin and ricin in humans and mice. // Int. J. Cancer. 1983. - V. 32. — N. 4. - P. 515521.

90. Houston L.L. Protection of mice from ricin poisoning by treatment with antibodies directed against ricin. // J. Toxicol. Clin. Toxicol. 1982. - V. 19. - N. 4. - P. 385-389.

91. Lemley P.V., Amanatides P., Wright D.C. Identification and characterization of amonoclonal antibody that neutralizes ricin toxicity in vitro and in vivo. // Hybridoma. i1994.-V. 13.-N.5.-P.41-7-421. .

92. Hewetson J.F., Rivera* V.R., Creasia D.A., Lemley P.V., Rippy M:K., Poli M.A. Protection of mice from inhaled ricin by vaccination with ricin or by passive treatment with heterologous antibody. // Vaccine. 1993. - V. 11. - P. 743-746.

93. Kende M., Yan C., Hewetson J., Frick M.A., Rill W.L., Tammariello R. Oral immunization of mice with ricin toxoid vaccine encapsulated in polymeric microspheres against aerosol challenge. // Vaccine. 2002. - V. 20. - N. 11-12. - P. 1681-1691.

94. Thrush G.R., Lark L.R., Clinchy B.C., Vitetta E.S. Immunotoxins: an update. // Ann. Rev. Immunol. 1996. - V. 14. - P. 49-71.

95. Lebeda F.J., Olson M.A. Prediction of a conserved, neutralizing epitope in ribosome-inactivating proteins. // Int. J. Biol. Macromol. 1999. - V. 24. - N. 1. - P. 1926. ,

96. Maddaloni M., Cooke C., Wilkinson R., Stout A.V., Eng L., Pincus S.H. Immunological characteristics associated withsthe protective efficacy of antibodies to ricin. // J. Immunol. -2004. -V. 172. -N. 10. P. 6221-6228.

97. Mantis N.J., McGuinness C.R., Sonuyi O., Edwards G., Farrant S.A. Immunoglobulin A antibodies against ricin A and В subunits protect epithelial cells from ricin intoxication. //Infect. Immun. -2006. V. 74. -N. 6. - P. 3455-3462.

98. McGuinness C.R., Mantis NJ. Characterization of a novel high-affinity monoclonal immunoglobulin G antibody against the ricin В subunit. // Infect. Immun. 2006. - V. 74.-N. 6. -P. 3463-3470.

99. Тоневицкий А.Г., Топтыгин А.Ю., Агапов И.И., Рахманова В.А., Шамшиев А.Т., Алексеев Ю.О., Пфюллер У., Франкел А. Получение биологически активной рекомбинантной В-субъединицы рицина. // Мол. биол. 1995. — Т. 29. - № 2. - С. 398-406.

100. Bigalke Н., Rummel A. Medical aspects of toxin weapons. // Toxicology. 2005. -V. 214.-P. 210-220.

101. Challoner K.R., McCarron M.M. Castor bean intoxication. // Ann. Emerg. Med. -1990.-V. 19.-N. 10.-P. 1177-1183.

102. Fodstad О., Olsnes S., Pihl A. Toxicity, distribution and elimination of the cancerostatic lectins abrin and ricin after parenteral injection into mice. // Br. J. Cancer. -1976. V. 34. - N. 4. - P. 418-425.

103. Fodstad O., Johannessen J.V., Schjerven L., Pihl A. Toxicity of abrin and ricin in mice and dogs. // J. Toxicol. Environ. Health. 1979. - V. 5. -N. 6. - P. 1073-1084.

104. Верескунов A.M. Фармакологическая и токсикологическая характеристика действия рицина: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Санкт-Петербург, 2005. 24 с.

105. Roy С.J., Hale М., Hartings J.M., Pitt L., Duniho S. Impact of inhalation exposure modality and particle size on the respiratory deposition of ricin in BALB/c mice. // Inhal. Toxicol. -2003. -V. 15. -N. 6. -P: 619-638.

106. Burnett J.C., Henchal E.A., Schmaljohn A.L., Bavari S. The evolving field of biodefence: therapeutic developments and diagnostics. // Nat. Rev. Drug Discov. — 2005. -V. 4. N. 4. - P. 281-97.

107. Pappenheimer A.M.J., Uchida Т., Harper A.A. An immunological study of the diphtheria toxin molecule. // Immunochemistry. 1972. - V. 9. -N. 9. P. 891-906.

108. Yamaizumi M., Uchida Т., Okada Y., Furusawa M. Neutralization of diphtheria toxin in living cells by microinjection of antifiragment A contained within resealed erythrocyte ghosts. // Cell. 1978. - V. 13. - N. 2. P. 227-232.

109. Zucker D.R., Murphy J.R. Monoclonal antibody analysis of diphtheria toxin-I. Localization of epitopes and neutralization of cytotoxicity. // Mol. Immunol. 1984. - V. 21.-N. 9.-P. 785-793.

110. Lemley P.V., Wright D.C. Mice are actively immunized after passive monoclonal antibody prophylaxis and ricin toxin challenge. // Immunology. 1992. — V. 76. - N. 3. — P. 511-513.

111. Dertzbaugh M.T., Rossi C.A., Paddle B.M., Hale M., Poretski M., Alderton M.R. Monoclonal antibodies to ricin: in vitro inhibition of toxicity and utility as diagnostic reagents. // Hybridoma (Larchmt). 2005. - V. 24. -N. 5. - P. 236-243.

112. Guo J.W., Shen B.F., Feng J.N., Sun Y.X., Yu M., Hu M.R. A novel neutralizing monoclonal antibody against cell-binding polypeptide of ricin. // Hybridoma (Larchmt). — 2005. V. 24. - N. 5. P. 263-266.

113. Poli M.A., Rivera V.R., Pitt M.L., Vogel P. Aerosolized specific antibody protects mice from lung injury associated with aerosolized ricin exposure. // Toxicon. 1996. —

114. V. 34. -N. 9. -N. 1037-1044.

115. Vogel P., Rivera V.R., Pitt M.L., Poll M.A. Comparison of the pulmonary distribution and efficacy of antibodies given to mice by intratracheal instillation or aerosol inhalation. //Lab. Anim. Sci. 1996 . - V. 46. -N. 5. -N. 516-523.

116. Rainey G.J., Young J.A. Antitoxins: novel strategies to target agents of bioterrorism. // Nat. Rev. Microbiol. 2004. - V. 2. - N. 9. - P. 721-726.

117. Griffiths G.D., Phillips G.J., Bailey S.C. Comparison of the quality of protection elicited by toxoid and peptide liposomal vaccine formulations against ricin as assessed by markers of inflammation. // Vaccine. 1999. - V. 17. - P. 2562-2568.

118. Marsden C.J., Smith D.C., Roberts L.M., Lord J.M. Ricin: current understanding and prospects for an antiricin vaccine. // Expert. Rev. Vaccines. 2005. - V. 4. - N. 2. -P. 229-37.

119. Piatak M., Lane J.A., Laird W., Bjorn M.J., Wang A., Williams M. Expression of soluble and fully functional ricin A chain in Escherichia coli is temperature-sensitive. // J. Biol. Chem. 1988. -V. 263. -N. 10. - P. 4837-4843.

120. Griffiths G.D., Bailey S.C., Hambrook J.L., Keyte M.P. Local and systemic responses against ricin toxin promoted by toxoid or peptide vaccines alone or in liposomal formulations. // Vaccine. 1998. - V. 16. - N. 5. - P. 530-535.

121. Yoder J.M., Aslam R.U., Mantis NJ. Evidence for widespread epithelial damage and coincident production of monocyte chemotactic protein 1 in a murine model of intestinal ricin intoxication. // Infect. Immun. 2007. - V. 75. - N. 4. - P. 1745-1750.

122. Mantis NJ. Vaccines against the category B toxins, staphylococcal enterotoxin B, epsilon toxin and ricin. // Adv. drug deliv. rev. 2005. - V. 57. - P. 1424-1439.

123. Ready M.P., Kim Y., Robertus J.D. Site-directed mutagenesis of ricin A-chain and implications for the mechanism of action. // Proteins. 1991. - V. 10. - N. 3. - P. 270278.

124. Roberts L.M., Tregear J.W, Lord J.M. Molecular cloning of ricin. // Targeted Diagn. Ther. 1992. - V. 7. - P. 81-97.

125. Smallshaw J.E., Firan A., Fulmer J.R., Ruback S.L., Ghetie V., Vitetta E.S. A novel recombinant vaccine which protects mice against ricin intoxication. // Vaccine. 2002. -V. 20. -N. 27-28. - P. 3422-3427.

126. Monzingo A.F., Robertus J.D. X-ray analysis of substrate analogs in the ricin A-chain active site. // J. Mo.l Biol. 1992. - V. 227. - N. 4. - P. 1136-1145.

127. Kim Y., Mlsna D., Monzingo A.F., Ready M.P., Frankel A., Robertus J.D. Structure of a ricin mutant showing rescue of activity by a noncatalytic residue. // Biochemistry. -1992.-V. 31.-N. 12.-P. 3294-3296.

128. Day P.J., Pinheiro T.J., Roberts L.M., Lord J.M. Binding of ricin A-chain to negatively charged phospholipid vesicles leads to protein structural changes and destabilizes the lipid bilayer. // Biochemistry. 2002. - V. 41. - N. 8. - P. 2836-2843.

129. Schlossman D., Withers D., Welsh P., Alexander A., Robertus J., Frankel A. Role of glutamic acid 177 of the ricin toxin A chain in enzymatic inactivation of ribosomes. // Mol. Cell. Biol. 1989. -V. 9. -N. 11. - P. 5012-5021.

130. Olson M.A., Carra J.H., Roxas-Dunkan V., Wannemacher R.W., Smith L.A., Millard C.B. Finding a new vaccine in the ricin protein fold. // Protein Eng. Des. Sel. — V. 4.-P. 391-397.

131. Chaddock J.A., Roberts L.M. Mutagenesis and kinetic analysis of the active site Glul77 of ricin A-chain. // Protein Eng. 1993. - V. 6. - N. 4. - P. 425-431.

132. Marsden C.J., Knight S„ Smith D.C., Day P.J., Roberts L.M., Phillips G.J., Lord J.M. Insertional mutagenesis of ricin A chain: a novel route to an anti-ricin vaccine. // Vaccine. 2004. - V. 22. - N. 21-22. - P. 2800-2805.

133. McHugh C.A., Tammariello R.F., Millard C.B., Carra J.H. Improved stability of a protein vaccine through elimination of a partially unfolded state. // Protein Sci. 2004. -V. 13.-N. 10.-P. 2736-2743.

134. Smallshaw J.E., Richardson J.A., Pincus S., Schindler J., Vitetta E.S. Preclinical toxicity and efficacy testing of RiVax, a recombinant protein vaccine against ricin. // Vaccine. -2005. -V. 23. -N. 39. P. 4775^784.

135. Vitetta E.S., Smallshaw J.E., Coleman E., Jafri H., Foster C., Munford R., Schindler J. A pilot clinical trial of a recombinant ricin vaccine in normal humans. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2006. -V. 103. -N. 7. P. 2268-2273.

136. Smallshaw J.E., Richardson J.A., Vitetta E.S. RiVax, a recombinant ricin subunit vaccine, protects mice against ricin delivered by gavage or aerosol. // Vaccine. — 2007. — V. 25. -N. 42. P. 7459-7469.

137. Измерение концентраций вредных веществ в воздухе рабочей зоны: Сб. метод, указаний МУК 4.1.100-96-МУК 4.1.197-96. / Официальное издание, М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 1998. Вып. 29. — 429 с.

138. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир, 2000. - С. 527г536.

139. Griffiths G.D., Newman H.V., Gee D.J. Immunocytochemical detection of ricin. П. Further studies using the immunoperoxidase method. // Histochem. J. 1986. — V. 18. -N. 4.-P. 189-195.

140. Leith A.G., Griffiths G.D., Green M.A. Quantification of ricin toxin using a highly sensitive avidin/biotin enzyme-linked immunosorbent assay. // J. Forensic Sci. Soc -1988 V. 28 - N. 4 - P. 227-236.

141. Shyu R.H., Shyu H.F., Liu H.W., Tang S.S. Colloidal gold-based immunochromatographic assay for detection of ricin. // Toxicon. 2002 . — V. 40. — N. 3. -P. 255-258.

142. Market profile: handheld assays for biodefense. // Instrument Business Outlook. -2006. http://www.allbusiness.eom/instrument-business-outlook/l 176843-1 .html

143. Fulton R.E., Thompson H.G. Fluorogenic hand-held immunoassay for the identification of ricin: rapid analyte measurement platform. // J. Immunoassay Immunochem. 2007. - V. 28. - N. 3. - P. 227-241.

144. Cloneya L.P., Spiller L.J., Fong W.K., Harris J.E., Harris P.C. RAMP®: High accuracy from immunochromatographic assays by the use of internal control ratios. // Clinical Chemistry. 2003. - V. 49. - P. 1775-1777.

145. McCoig C., Van Dyke G., Chou C.S., Picker L.J., Ramilo O., Vitetta E.S. An anti-CD45RO immunotoxin eliminates T cells latently infected with HTV-1 in vitro. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - N. 20. - P. 11482-11485.

146. Kreitman RJ. Immunotoxins in cancer therapy. // Curr. Opin. Immunol. 1999. -11.-N.5.-P. 570-578.

147. Frankel A.E., Neville D.M., Bugge T.A., Kreitman RJ., Leppla S.H. Immunotoxin therapy of hematologic malignancies. // Semin. Oncol. 2003. - V. 30. - N. 4. - P. 545557.

148. Frankel A.E., Kreitman R J. CLL immunotoxins. // Leuk. Res. 2005. - V. 29. - N. 9. -P. 985-986.

149. Jain R.K. Delivery of* molecular and cellular, medicine to solid tumors. // Microcirculation. 1997. - V. 4'. - N. 1. - P. 1-23.

150. Тоневицкий A.F., Демина И.А., Агапов И.И. Цитотоксическая активность конъюгатов человеческого трансферрина и А-субъединиц растительных токсинов in vivo и in vitro. II ДАН. 2000. - Т. 374. - № 4: - С. 557-560.

151. Winter G., Harris W.J. Humanized antibodies'. // Immunol. Today. 1993. — V. 14'. -N. 6:-P. 243-246.

152. Laske D.W., Youle R.J., Oldfield E.H. Tumor regression with regional distribution of the targeted toxin TF-CRM107 in patients witbmalignant brain tumors. // Nat. Med. -1997. -V. 3. -N. 12.-P: 1362-1368.

153. Engert- A., Sausville E.A., Vitetta E. The emerging role of ricin A-chain immunotoxins in leukemia and lymphoma. // Curr. Top. Microbiol: Immunol. 1998. — V. 234:-P. 13-33.

154. Zhan J., Chen Y., Wang K., Zheng S. Expression of ricin A chain and ricin A chain-KDEL in Escherichia coli. II Protein Expr. Purif. 2004. - V. 34. - N. 2. - P. 197-201.

155. Choi N.W., Estes M.K., Langridge W.H: Ricin toxin B1 subunit enhancement of rotavirus NSP4'immunogenicity in mice. // Viral Immunol. — 2006. V. 19. - N. Г. - P. 54-63.

156. Beaumelle В., Taupiac M.P., Lord J.M., Roberts L.M. Ricin A chain can transport unfolded«dihydrofolate reductase into the cytosol. // J. Biol. Chem. 1997. —V. 272. — N. 35.-P. 22097-22102.

157. Terpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. - V. 60. -N.5.-P. 523-533.

158. Глик Б., Пастернак Д. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. -М.: Мир, 2002.-589 с.

159. Scheich С., Sievert V., Bussow К. An automated method for high-throughput protein- purification applied to« a comparison' of His-tag and GST-tag affinity-chromatography. // BMC Biotechnol; 2003. - V. 3. - N. 1. - P. 12.

160. Hochuli E., Dobeli H., Schacher A. New metal chelate adsorbent selective for, proteins and peptides containing neighbouring histidine residues. // J. Chromatogr. -1987.-V. 411.-P. 177-184.

161. Blanar M.A., Rutter W.J. Interaction cloning: identification of a helix-loop-helix zipper protein that interacts with c-Fos. // Science. 1992. - V. 256. - N. 5059. - P. 1014—1018.

162. Schmidt T.G.M., Koepke J., Frank R., Skerra A. Molecular interaction between the Strep-tag affinity peptide and its cognate target, streptavidin. // J. Mol. Biol. 1996. — V. 255.-P. 753-766.

163. Keefe A.D., Wilson D.S., Seelig Br, Szostak J.W. One-step purification of recombinant proteins using a nanomolar-affinity streptavidin-binding peptide, the SBP-Tag. // Protein Expr. Purif. 2001. - V. 23. - P. 440-446.

164. Evan G.I., Lewis G.K., Ramsay G., Bishop J.M. Isolation of monoclonal antibodies specific for human c-myc proto-oncogene product. // Mol. Cell: Biol. 1985. - V. 5. - P. 3610-3616.

165. Karpeisky M.Y., Senchenko V.N., Dianova.M.V., Kanevsky V. Formation and properties ofiS-protein complex with S-peptidecontaining fusion protein. // FEBS Lett. — 1994. V. 339. - P. 209-212.

166. McCormick M., Berg J. Purification and S-Tag detection'of CBD fusion proteins. // Innovations. 1997. - V. 7. -P: 12-15.

167. Zheng C.-F., Simcox T., XuL., Vaillancourt P. A new. expression vector for high level protein production,1 one step purification and direct isotopic labeling of calmodulin-binding peptide fusion proteins. // Gene. 1997. -V. 186. - P. 55-60:

168. Stofko-Hahn R.E., Carr D.W., Scott J.D. A single step purification for recombinant proteins. // FEBS Lett. 1992. - V. 302. - P. 274-278«

169. Xu Z., Bae W., Mulchandani A., Mehra R.Kt, Chen W. Heavy metal removal by novel CBD-EC20 sorbents immobilized on cellulose: //Biomacromolecules. -2002 . — V.3.-N.3.-P. 462-465.

170. Nock S, Spudich JA, Wagner P. Reversible, site-specific immobilization of polyarginine-tagged fusion proteins on mica surfaces. // FEBS Lett. 1997. -V. 414. — N. 2.-P. 233-238.

171. The QIAexpressionist. A handbook for high-level expressionist and purification of 6xHis-tagged proteins. QIAGEN: -2003. 128 p.

172. Hopp T.P:, Pricket K.S., Price V.L., Libbi R.T., March C.J., Ceretti D.P., Urdal D.L., Conlon P.J. A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification. // Biotechnology. 1988. - V. 6. - P. 1204-1210. \

173. Einhauer A., Schuster M., Wasserbauer E., Jungbauer A. Expression and purification of homogenous proteins in Saccharomyces cerevisiae based on ubiquitin-FLAG fusion. // Protein. Expr. Purif. 2002. - V. 24. - P. 497-504.

174. Voss S., Skerra A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. // Protein Eng. 1997. - V. 10. - N. 8. - P. 975-982.

175. Skerra A., Schmidt T,G. Use of the Strep-Tag and streptavidin for detection and purification of recombinant proteins. // Methods Enzymol. 2000. - V. 326. - P. 271— 304.

176. Munro S., Pelham H.R. An Hsp70-like protein in the ER: identity with the 78 kd glucose-regulated protein and immunoglobulin heavy chain binding protein. // Cell. -1986. V. 46. - N. 2. - P. 291-300.

177. Kipriyanov S.M., Kupriyanova O.A., Little M., Moldenhauer G. Rapid detection of recombinant antibody fragments directed against cell-surface antigens by flow cytometry. // J. Immunol. Methods. 1996. - V. 196. - N. 1. - P. 51-62.

178. Schiöth H.B., Kuusinen A., Muceniece R., Szardenings M., Keinänen K., Wikberg J.E. Expression of functional melanocortin 1 receptors in insect cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. - V. 221 - N. 3. - P. 807-814.

179. Dreher M.L., Gherardi E., Skerra A., Milstein C. Colony assays for antibody fragments expressed in bacteria. // J. Immunol. Methods. 1991. - V. 139. - N. 2. - P. 197-205.

180. Karpeisky M.Y., Senchenko V.N., Dianova M.V., Kanevsky V.Y. Fonnation and properties of S-protein complex with S-peptide-containing fusion protein. // FEBS Lett. — 1994.-V. 339.-N. 3.-P. 209-212.

181. Head J.F. A better grip on calmodulin. II Curr. Biol. 1992. - V. 2. - N. 11. - P. 609-611.

182. Zheng C.F., Simcox Т., Xu L., Vaillancourt P. A new expression vector for. high level protein production, one step purification and direct isotopic labeling of calmodulin-binding peptide fusion proteins. //Gene. — 1997.-V. 186.-N. l.-P. 55-60.

183. Рабинович M.JL, Мельник M.C. Прогресс в изучении целлюлолитических ферментов и механизм биодеградации высокоупорядоченных форм целлюлозы. // Успехи биол. химии. 2000. - Т. 40. - С. 205—266.

184. Rabinovich M.L.: Materials of Soviet-Finland Seminar on Bioconversion of Plant Raw Materials by Microorganisms. Pushchino: Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, 1984. - P. 31-48.

185. Рабинович M.JL Кинетические аспекты действия карбогидраз (лизоцим и целлюлолитические ферменты): Дис. . канд. хим. наук. М., 1977. — С. 16.

186. Levy I., Shoseyov О. Cellulose-binding domains: biotechnological applications. // Biotechnol. Adv. -2002. -V. 20. -N. 3-4. P. 191-213.

187. Xu Z., Bae W., Mulchandani A., Mehra R.K., Chen W. Heavy metal removal by novel CBD-EC20 sorbents immobilized on cellulose. // Biomacromolecules. 2002 . -V. 3.-N. 3.-P. 462-465.

188. Watanabe Т., Ito Y., Yamada Т., Hashimoto M., Sekine S., Tanaka H. The roles of the C-terminal domain and type III domains of chitinase A1 from Bacillus circulans WL-12 inchitindegradation.//J.Bacterid.- 1994.-V. 176.-N. 15.-P.4465-4472.

189. Szweda P., Pladzyk R., Kotlowski R., Kur J. Cloning, expression, and purification of the Staphylococcus simulans lysostaphin using the intein-chitin-binding domain (CBD) system. // Protein Expr. Purif. 2001. - V. 22. -N. 3. - P. 467-471.

190. Smith D.B., Johnson K.S. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. // Gene. 1988. - V. 67. — N. 1. - P. 31—40.

191. Duplay P., Hofiiung M. Two regions of mature periplasmic maltose-binding protein of Escherichia coli involved in secretion. // J. Bacteriol. 1988. - V. 170. - N. 10. - P. 4445-4450.

192. Sachdev D., Chirgwin J.M. Properties of soluble fusions between mammalian aspartic proteinases and bacterial maltose-binding protein. // J. Protein Chem. 1999. -V. 18.-N. l.-P. 127-136.

193. Davis G.D., Elisee C., Newham D.M., Harrison R.G. New fusion protein systems designed to give soluble expression in Escherichia coli. //Biotechnol. Bioeng. 1999. -V. 65.-N. 4-N. 382-388.

194. LaVallie E.R., Lu Z., Diblasio-Smith E.A., Collins-Racie L.A., McCoy J.M. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. II Methods Enzymol. Bacteriol. 2000. - V. 326. - P. 322-340.

195. Jungbauer A., Hahn R. Engineering protein A affinity chromatography. // Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2004. - V. 7. - N. 2. - P. 248-256.

196. Goward C.R., Murphy J.P., Atkinson Т., Barstow D.A. Expression and purification of a truncated recombinant streptococcal protein G. // Biochem. J. 1990. - V. 267. - N. l.-N. 171-177.

197. Воробьев A.A., Васильев H.H. Адьюваиты (неспецифические стимуляторы иммуногенеза). М.: Мед. книга, 1969 206 с.

198. Лященко В.А., Воробьев А.А. Молекулярные основы иммуногенности. — М.: Медицина, 1982-271 с.

199. Гурвич А.Е., Капнер Р.Б., Незлин Р.С. Выделение чистых антител при помощи фиксированных на целлюлозе антигенов и изучение их свойств. // Биохимия. -1959.-Т. 24.-С. 142.

200. Гурвич А.Е. Количественное определение содержания антител при помощи белковых антигенов, фиксированных на бумаге. // Биохимия. 1957. - Т. 22. - Вып. 6. - С. 1028. '

201. Gurvich А.Е., Drizlikh G.L Use of antibodies on an insoluble support for specific detection of radioactive antigens. //Nature. 1964. - V. 203. - P. 648-649.

202. Лехтцинд E.B., Гурвич A.E. Синтез высокоемкого иммуносорбента на основе суспензии целлюлозы. // Бюл. экспер. биол. и мед. — 1981. — Т. 92. — Вып. 7. — Р. 6870.

203. Wang W., Malcolm В.А. Two-stage PCR protocol allowing introduction of multiple mutations, deletions and insertions using QuikChange Site-Directed Mutagenesis. // Biotechniques. 1999. - V. 26. - N. 4. - P. 680-682.

204. Маниатис Т., Фрич Э., Сембрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М: Мир, 1984. - 479 с.

205. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. //Nature. 1970. - V. 227. -N. 5259. -680-682.

206. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. // Anal. Biochem. -1976. -V. 72.-P. 248-254.

207. Hailing K.C., Hailing A.C., Murray E.E., Ladin B.F., Houston L.L., Weaver R.F. Genomic cloning and characterization of a ricin gene from Ricinus communis. // Nucleic Acids Res. 1985.-V. 13.-N. 22.-P. 8019-8033.

208. Hussain K., Bowler C., Roberts L.M., Lord J.M. Expression of ricin В chain in Escherichia coli. И FEBS Lett. 1989. - V. 244. -N. 2. - P. 383-387.

209. Richardson P.T., Hussain K., Woodland H.R., Lord J.M., Roberts L.M. The effects of N-glycosylation on the lectin activity of recombinant ricin В chain. II Carbohydr. Res. 1991.-V. 213.-P. 19-25.

210. Hussain K., Bowler C., Roberts L.M., Lord J.M. Expression of ricin В chain in Escherichia coli. И FEBS Lett. 1989. - V. 244. -N. 2. - P. 383-387.

211. Wales R., Gorham H.C., Hussain K., Roberts L.M., Lord J.M. Ricin В chain fragments expressed in Escherichia coli are able to bind free galactose in contrast to the full length polypeptide. // Glycoconj. J. 1994. - V. 11. - N. 4. - P. 274-281.

212. Гурвич A.E., Корукова A.A., Эльгорт Д.А. Усиление иммуногенности белков путем их присоединения к целлюлозной матрице. // сб. Иммуномодуляторы. -1987. -С.67-76.

213. Лящук A.M. Получение и характеристика рекомбинантного белка TUL4, потенциального компонента генно-инженерной субъединичной противотуляремийной вакцины: Автореф. дис. . канд. биол. наук. М., 2005. 19 с.

214. Васекина А.В., Ершов П.В., Решетова О.С., Тихонова Т.В., Лунин В.Г., Трофимова М.С., Бабаков А.В. Вакуолярный №+/Н+антийортер ячменя: идентификация и реакция на солевой стресс. // Биохимия. 2005. - Т. 70. - № 1. -С. 123-132

215. Wang S.T., Ни M.R., Guo J.W., Feng J.N., Shen B.F. Fusion expression and purification of recombinant ricin A-chain. // Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. -2005.- V.21.-N.2.-P. 137-140.

216. Bardwell J.C. Building bridges: disulphide bond formation in the cell. II Mol. Microbiol. 1994. -V. 14. -N. 2. - P. 199-205.

217. Rudolph R., Lilie H. In vitro folding of inclusion body proteins. // FASEB J. 1996. -V. 10.-N. l.-P. 49-56.

218. Blight M.A., Holland I.B. Heterologous protein secretion and the versatile Escherichia coli haemolysin translocator. // Trends Biotechnol. 1994. - V. 12. - N. 11. -P. 450-455.

219. Jennings M.P., Beacham I.R. Analysis of the Escherichia coli. gene encoding L-asparaginase II, ¿z«sB, and its regulation by cyclic AMP receptor and FNR proteins. //

220. J. Bacterid. 1990. - V. 172.-N.3.-P: 1491-1498.

221. Tan S., Wu W., Liu J., Kong Y., Pu Y., Yuan R. Efficient expression and secretion of recombinant hirudin III in E. coli using the L-asparaginase II signal sequence. // Protein Expr. Purif. 2002. - V. 25. - N. 3. - P. 430-436.

222. Гурвич A.E., Кузовлева О.Б., Туманова A.E. Получение белково-целлюлозных комплексов (иммуносорбентов) в виде суспензий, способных присоединять большие количества антител. // Биохимия. — 1961. Т. 26. - Вып. 5. - С. 934-942.

223. Ada G. Overview of vaccines. // Mol. Biotechnol. 1997. - V. 8. -N. 2. - P. 123134.

224. Dertzbaugh M.T. Genetically engineered vaccines: an overview. // Plasmid. 1998. - V. 39.-N. 2.-P. 100-113.

225. Liljeqvist S., Stahl S. Production of recombinant subunit vaccines: proteinimmunogens, live delivery systems and nucleic acid vaccines. // J. Biotechnol — V. 73. —40.48.1. N. l.-P. 1-33.