Скрининг продуцентов гиполипидемических соединений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Чмель, Ярослава Валентиновна

• Чмель, Ярослава Валентиновна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Чмель, Ярослава Валентиновна

Введение.

Обзор литературы.

1. История открытия статинов.-.

2. Классификация статинов по химическому строению.

2.1. Механизм действия статинов.-.

2.2.Фармакодинамика статинов.-.-.

2.3.Фармакокинетика статинов.

2.4.Нелипидные эффекты статинов.-.

2.5.Побочные эффекты статинов.-.

2.6.Противопоказания к применению статинов.-.

3.Препараты, ингибирующие скваленсинтазу.-.

4.Препараты, ингибирующие этерификацию холестерина (ингибиторы АХАТ).

5.Препараты, регулирующие превращения холестерина в организме.

6. Препараты, ингибирующие абсорбцию холестерина.

7. Препараты, влияющие на белок переносящий эфиры холестерина (СЕРТ).

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Скрининг продуцентов гиполипидемических соединений»

Во всём мире ведётся широкий поиск природных препаратов, способных ингибировать синтез и регулировать метаболизм холестерина. Нарушение обмена холестерина в организме человека приводит к развитию дислипопротеидемий, что в свою очередь увеличивает риск возникновения атеросклероза. Атеросклероз лежит в основе многих сердечно-сосудистых заболеваний, характеризующихся высоким уровнем смертности; таких как ишемическая болезнь сердца (ИБС) и нарушение мозгового кровообращения. Эти заболевания являются наиболее частой причиной смертности в большинстве экономически развитых стран. Россия в этом плане не является исключением: ИБС и инсульты составили 85% смертности от сердечно-сосудистых заболеваний в 2002 году или 47,6% общей смертности в России. Эти эпидемиологические данные - свидетельство явного неблагополучия с профилактикой и лечением этого наиболее распространенного хронического неинфекционного заболевания в нашей стране. В настоящее время проблема атеросклероза - одна из ключевых в кардиологии, от ее решения зависят предупреждение и лечение инфаркта миокарда, инсульта, тромбозов и других заболеваний сердечно-сосудистой системы, приводящих к инвалидизации работоспособного населения и характеризующиеся высокой смертностью. В связи с этим Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) постоянно привлекает внимание мировой общественности и специалистов к необходимости расширения исследований в этой области. Критическая ситуация со здоровьем населения и в первую очередь необыкновенно высокая смертность от сердечно-сосудистых заболеваний требует адекватных безотлагательных решений. Резкому снижению развития атеросклероза способствуют специальные программы борьбы с атеросклерозом, разработанные и используемые в США и некоторых странах Западной Европы. Важной частью этих программ является использование и разработка новых гиполипидемических лекарственных веществ. В настоящее время проводятся исследования посвященные поиску принципиально новых классов гиполипидемических соединений, и изучается их воздействие на метаболизм липидов у трансгенных животных, лишенных генов отвечающих за липидный обмен. В 1976 году японские ученые Эндо и Курода после многолетнего интенсивного поиска микробных агентов, способных блокировать биосинтез холестерина in vitro выделили из грибной культуры Pénicillium citrinum препарат - мевастатин, а в 1979 году из экстрактов гриба Aspergillus terreus, а затем и Monascus ruber было выделено вещество монаколин К (ловастатин). В результате этих открытий началась эра статинов - эра препаратов, которые ингибировали ГМГ-Ко-А редуктазу (один из ключевых ферментов биосинтеза холестерина). На сегодняшний день это наиболее изученная и часто назначаемая группа гиполипидемических препаратов. В течение последних нескольких лет были проведены крупномасштабные многоцентровые рандомизированные исследования. Они позволили наглядно продемонстрировать высокую клиническую эффективность статинов у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями (ССЗ), однако были выявлены побочные эффекты статинов и установлены противопоказания к применению. Учитывая то, что гиполипидемические препараты должны применяться пациентами в течение всей жизни, необходим поиск таких соединений, которые помимо выраженного специфического действия должны быть удобными в применении, легко переносимыми пациентами и не обладать выраженным побочным действием.

Несмотря на прогресс в диагностике, лечении и профилактике сердечно-сосудистых заболеваний, они остаются наиболее частой причиной смертности в большинстве экономически развитых стран и в Российской Федерации. Гиполипидемическая терапия, а также поиск и создание гиполипидемических соединений рассматривается в настоящее время в качестве одной из основных задач здравоохранения. Представленные данные определили стратегию проводимого нами скрининга природных соединений с фармакологической активностью - отбор природных гиполипидемических соединений. Разработка эффективной системы скрининга является необходимым условием для отбора перспективных продуцентов биологически- активных соединений.

Традиционно отбор продуцентов гиполипидемических соединений проводился среди грибных культур, однако актиномицеты часто проявляют свойства продуцентов биологически-активных соединений. Ввиду слабого изучения этой группы микроорганизмов в качестве продуцентов гиполипидемических соединений и их явно большого потенциала в этой области, было решено провести поиск гиполипидемических соединений, как среди грибных культур, так и среди культур актиномицетов и бактерий.

Цель работы.

Целью данной работы были создание системы направленного поиска продуцентов гиполипидемических соединений и изучение воздействия отобранных соединений на метаболизм липидов в условиях in vitro и in vivo.

Для осуществления этой цели потребовалось решение следующих задач исследования:

1 .Разработать систему скрининга продуцентов гиполипидемических соединений среди микроорганизмов.

2. Провести скрининг продуцентов гиполипидемических соединений среди грибов, актиномицетов и бактерий, используя разработанную систему направленного поиска.

3.Изучение морфологических и физиологических особенностей отобранных культур.

4.Произвести наработку активных препаратов для изучения биологических и физико-химических свойств отобранных экстрактов.

Научная новизна результатов.

Была разработана и использована в практической работе система скрининга гиполипидемических соединений, состоящая из нескольких этапов:

1 .Скрининг с использованием клеток гепатомы Нер 02.

2.Скрининг с использованием в качестве тест - организма грибного штамма То1урос1асИит т/1аШт 106.

3.Скрининг с использование модели гиперлипидемии у кроликов.

Для проведения 2 этапа скрининга была разработана новая модельная тест - система отбора с использованием в качестве тест - организма грибного штамма Т. т/1аШт 106. Эта культура была отобрана в результате поиска чувствительных к ловастатину культур среди штаммов Коллекции культур микроорганизмов ГНЦА.

Были подобраны оптимальные условия для проведения экспериментов, а также проведено изучение влияния контрольного препарата — ловастатина на синтез стеролов у грибной культуры Т. т/1аШт.

Использование этой новой тест-системы скрининга позволило отобрать соединения, обладающие гиполипидемической активностью сравнимой, а для некоторых соединений превосходящей по активности контрольный препарат - ловастатин.

Проведен широкий поиск гиполипидемических соединений, в результате которого при изучении 702 штаммов почвенных актиномицетов, грибов и бактерий была выявлена способность почвенных микроорганизмов продуцировать гиполипидемические соединения. Причем этой способностью обладали не только мицелиальные грибы, но и культуры актиномицетов. В результате отобраны 9 продуцентов новых природных гиполипидемических соединений: 2 из которых относятся к мицелиальным грибам и 7 продуцентов являются актиномицетами.

Научно-практическая значимость работы.

Создана и использована в практической работе оригинальная и эффективная микробиологическая модель скрининга, с использованием грибного штамма Т. т/1аШт 106. Использование в качестве модельного организма грибной культуры было обусловлено тем, что грибные культуры, являясь эукариотами, имеют системы регуляции близкие к таковым для клеток животных и человека. Разработанная модель скрининга позволяла на уровне простых в исполнении микробиологических методов выявлять продуценты гиполипидемических соединений. Важной характеристикой разработанного метода были:

- высокая чувствительность метода,

- относительно короткие сроки проведения исследования,

- низкие экономические затраты ввиду отсутствия использования дорогостоящего оборудования и реактивов.

В настоящее время эта модельная система активно используется в работе лаборатории по изысканию продуцентов новых антибиотиков сектора коллекции культур ФГУП ГНЦА. Результаты работы имеют значение для проведения скрининга аналогичных соединений. Практическая значимость заключается в отборе новых перспективных продуцентов гиполипидемических соединений и оценке их эффективности для лечения атеросклероза.

Апробация работы.

Итоги научно-исследовательской работы, составляющие основу диссертации, были доложены на 2 Всероссийском Конгрессе по медицинской микологии (Москва 2004), 3 Международном Конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития». (Москва2005), на семинарах и межлабораторных конференциях ФГУП ГНЦА. Основные результаты работы была представлены на конкурсе молодых ученых, проходившем в рамках 3 Международного Конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития» Москва(2005), где работа была награждена дипломом за хорошую научно -исследовательскую работу. Публикации.

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ. Объем и структура работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 144 страницах, включают 43 таблицы, 1 схему, 63 рисунка и 11 фотографий. Список цитируемых источников включает 144 наименований отечественной и иностранной литературы.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Чмель, Ярослава Валентиновна

Выводы.

1. Разработана эффективная система скрининга продуцентов гиполипидемических соединений, включающая 3 этапа:

-1 этап. Отбор продуцентов гиполипидемических соединений с применением клеточной линии гепатоцитов Нер G2 ,

-2 этап. Отбор продуцентов гиполипидемических соединений с использованием новой высокоэффективной микробиологической модели, где в качестве тест - организма используется грибная культура Tolypocladium inflatum 106.

-3 этап. Изучение отобранных экстрактов в условиях in vivo с использованием модели гиперлипидемии у кроликов.

2. На первом этапе скрининга продуцентов гиполипидемических соединений среди 702 штаммов почвенных микроорганизмов были отобраны 117(16,6%) культур актиномицетов и мицелиальных грибов, для которых была установлена высокая способность подавлять синтез стеринов без влияния на синтез белка.

3. Разработанная микробиологическая модель скрининга позволила отобрать из 40 изученных 11 наиболее перспективных продуцентов и определить концентрационные зависимости применения данных экстрактов для экспериментов in vivo.

4. На 3 этапе скрининга в условиях эксперимента in vivo на модели гиперлипидемии у кроликов была подтверждена высокая гиполипидемическая активность для 9 из 11 исследованных экстрактов из культур.

5. Отобран перспективный грибной продуцент №16, мицелиальный экстракт из которого при исследовании в условиях in vivo не уступает, а в некотором отношении превосходит действие контрольного препарата ловастатина.

6. Впервые установлена гиполипидемическая активность для соединений олигомицинового ряда: олигофусцина и олигомицина F, выделенных из культур актиномицетов №17 и №31.

Заключение

В последние годы достигнут определенный успех в лечении гиперлипидемий и этот большой прогресс связан в первую очередь с тем, что при скрининге гиполипидемических соединений были найдены природные соединения - компактен и монаколин, отнесенные позднее к группе статинов. Завершенные контролируемые исследования с использованием статинов впервые показали возможность снижения не только сердечнососудистой, но и общей смертности (симвастатин, правастатин). В настоящее время во всем мире проводится широкий поиск препаратов, способных ингибировать синтез и регулировать метаболизм холестерина. Кроме того, проводятся работы по исследованию новых фармакологических подходов в лечении различных гиперлипидемий и атеросклероза. Исследование регуляции липидного обмена и поиск новых соединений для лечения нарушенй метаболизма липидов привело к открытию новых классов препаратов, влияющих на разные звенья липидного обмена: ингибиторы абсорбции холестерина, микросомального переносящего белка (МТТР) и ингибиторы белка, переносящего эфиры холестерина (СЕТР). Наибольшее число публикаций последних лет связано с описанием новых ингибиторов фермента АХАТ и ГМГ-коА-редуктазы. Все изученные в настоящий момент природные гиполипидемические соединения выделены из различных видов грибов. Однако известно, что актиномицеты и бактерии также являются продуцентами многих биологически-активных соединений. Ввиду слабого изучения этих групп микроорганизмов в качестве продуцентов гиполипидемических соединений и их явно большого потенциала в этой области, нами был проведен поиск гиполипидемических соединений, как среди грибных культур, так и среди культур актиномицетов и бактерий. Гиполипидемическая терапия, а также поиск и создание гиполипидемических соединений рассматривается в настоящее время в качестве одной из важнейших задач здравоохранения. Представленные данные определили стратегию проводимого нами скрининга - отбор продуцентов природных гиполипидемических соединений. Разработка эффективной системы скрининга является необходимым условием для отбора перспективных продуцентов биологически - активных соединений. Поэтому целью нашего исследования были - создание системы направленного поиска продуцентов гиполипидемических соединений и изучение воздействия отобранных соединений на метаболизм липидов в условиях in vitro и in vivo.

Экспериментальная часть.

Глава 1.Материалы и методы.

1Материалы и методы, использованные для культивирования микроорганизмов.

Поиск продуцентов гиполипидемических соединений проводили среди актиномицетов и грибов и бактерий, выделенных из почв различных регионов РФ в лаборатории изыскания продуцентов новых антибиотиков ГНЦА.

Навеску почвы в количестве 1 грамма вносили в 100 мл стерильной водопроводной воды. Тщательно перемешивали на круговой качалке при 220 об/мин в течении 15-20 минут. Высев полученной суспензии почвы проводили из разведений 10^-10"5. В расплавленную и остуженную до 40°С агаризованную среду Гаузе 1 и Райстрика разливали в чашки Петри. Чашки инкубировали 14-20 суток. Выросшие колонии переносили на скошенную в пробирках агаризованную среду Райстрика и Гаузе 1 и выращивали в течение 7-14 суток.

Актиномицеты выращивали и хранили на агаризованной среде Гаузе-1, содержащей: 0,5 г К2НРО4; 0,5 г N^04 X 7НгО; 0,5 г ЫаС1; 0,01 г БеЗС^Х НгО;1 г К>Юз;20 г крахмала и 20 г агар-агара на 1 литр воды, а также использовали крахмально-аммиачную, СР-1 с глюкозой, СР-1 с сахарозой, Чапека с глюкозой, Ваксмана, МПА, глюкозо-аспарогиновую, Гаузе-2, пептонно-дрожжевую, овсяную [124].

Грибные культуры выращивали и хранили на агаризованной среде Райстрика, содержащей 15 г глицерина; 15 г мелассы; 6 г пептона; 5 г ИаС1; 0,5 г КС1; 0,3 г КН2РО4; 0,15 г Ре804; 0,02 г Си304 и 20 г агар-агара на литр водопроводной воды; рН естественный; или солодовом агаре имеющем состав: 2 г солодового экстракта; 4 г дрожжевого экстракта;2 г агар-агара; водопроводной воды 1 литр; рН естественный.

Выращенные в течение 7-14 суток культуры хранили при 4 °С. Культуры актиномицетов выращивали при температуре 28 °С, микромицеты при 24 °С. Культуры, выращенные в пробирках на скошенном агаре, использовали в качестве посевного материала, высевая блоком в жидкую среду.

Культивирование актиномицетов осуществляли в колбах Эрленмейера объемом 750 мл с различными объемами (100,150 и 200 мл) питательной среды М-1 следующего состава:20 г гороховой муки; 21 г сахарозы; 8,5 г крахмала; 5 г ЫаЖ)з;5 г СаСОз; 5 г ЫаС1 на 1 литр водопроводной воды, рН естественный[125].

Время культивирования для культур актиномицетов обычно составляло - 120 часов(5 суток). Оптимальная температура культивирования для культур актиномицетов - 28° С. На подвесной качалке с круговым вращением и оборотами от 3,3с"1 до 4,3 с"'(180 оборотов в минуту).

Для грибных культур использовали среду А-9 [126], содержащую 20 г мелассы, 25 г соевой муки, 30 г глицерина, 5 г КН2РО4, 5 г NaCl на 1 литр водопроводной воды, рН естественный. Ферментацию грибных культур осуществляли в колбах Эрленмейера объемом 750 мл с объемом питательной среды 100 мл.

Оптимальная температура культивирования для грибных культур составляла 24° С. Продолжительность культивирования 6 и 14 суток. Культивирование проводили на подвесной качалке с круговым вращением и оборотами от 3,3с"1 до 4,3 с"1.

2. Методы химического выделения активных начал из биомассы продуцентов.

По окончании биосинтеза биомассу отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 минут. В дальнейшей работе использовали осадок мицелия. Мицелий заливали 5 объемами ацетона (по отношению к объему мицелия) и экстрагировали при перемешивании в течение 30 мин. Экстракцию повторяли дважды. Экстракт отделяли фильтрованием через бумажный фильтр. Ацетоновые экстракты объединяли и концентрировали на вакуум-выпарной установке (ИР-1) при температуре 45 °С до водного остатка. Водный остаток встряхивали в делительной воронке с равным объемом хлороформа и отделяли реэкстракт в хлороформе от водной фазы. Водную фазу отбрасывали, реэкстракт сушили безводным сульфатом натрия, фильтруя через бумажный фильтр. Растворитель удаляли в вакууме на вакуум-выпарной установке (ИР-1) при температуре 45 °С, затем сушили полученные осадки в вакуум-сушильном шкафу при температуре 45°С.

Для микромицета №25 использовали другой способ выделения действующего начала, так как биологически активное вещество выделяли не из мицелия, а из культуральной жидкости.

По окончании биосинтеза культуральную жидкость пропускали через активированный уголь (5% от объема культуральной жидкости). Сорбцию проводили в течение 24 часов. Уголь и биомассу отделяли центрифугированием. Нативный раствор отбрасывали. Десорбцию активного вещества с угля осуществляли этиловым спиртом (50% от объема культуральной жидкости). Элюат упаривали досуха на вакуум-выпарной установке (ИР-1) при температуре 45 °С.

Для эксперимента на клеточной линии гепатоцитов Hep G2 использовали спиртовые экстракты мицелия; для этого полученную в результате культивирования биомассу осаждали центрифугированием 3000 об/мин в течение 20 минут, надосадочную жидкость отбрасывали, а к осадку приливали 3-х кратный избыток этанола(95%).Экстракцию проводили при постоянном перемешивании в течение 30 минут. При исследовании активности соединений, продуцируемых микроорганизмами, использовали разведение исходных спиртовых экстрактов 1:103. Для более подробного изучения использовали разведения 1*10 "2- 1*10 "5. Полученные экстракты объединяли и использовали сразу или хранили при -20 °С.

З.Методы изучения культурально-морфологических свойств продуцентов гиполипидемических соединений.

3.1. Культурально-морфологические признаки

Культурально-морфологические свойства продуцентов изучали в соответствии с принятыми методами используемыми при таксономии актиномицетов и грибов.

3.2.Микроморфологические исследования

Микроморфологический анализ культур осуществляли с помощью микроскопирования свежих препаратов в виде суспензии, а также микроскопированием роста штамма в тонком слое на стёклах (разные сутки роста) при использовании микроскопа МБИ-15 У 4.2. А. Осуществляли микроскопирование окрашенных метиленовой синью мазков при увеличении в 40-900 раз.

Исследовали характер роста и форму мицелия, конидиофоры, фиалиды и конидии. Ультраструктуру некоторых отобранных продуцентов изучали с помощью метода электронной микроскопии совместно со с.н.с. лаборатории электронной микроскопии МГУ им. М.ВЛомоносова О.В.Камзолкиной.

Споры и вид спороносцев исследовали методом сканирующей электронной микроскопии (микроскоп «Hitachi»(S-405 А)) при увеличении до 30000 раз. Для проведения электронной микроскопии использовали либо низкотемпературный метод, либо метод криофильной сушки. В случае каждого метода исследуемые штаммы культивировали на овсяном агаре или агаризованной среде Гаузе 1 для актиномицетов и солодовом агаре или агаре Райстрика для грибных культур. В газоне 14 суточной культуры вырезали блоки размером приблизительно 3x7 мм. В случае использования первого метода блоки замораживали жидким азотом. В случае второго метода. Блоки помещали в перфорированные пластиковые капсулы и фиксировали в 5% растворе глутаральдегида в течение 16 часов при температуре 4 °С. Образцы дегидратировали путём двукратного погружения на 10 минут в 2-этоксиэтанол. Криофильную сушку проводили с помощью аппарата CPD 030 (Balzers) с использованием жидкой углекислоты.

4. Материалы и методы изучения антимикробной активности отобранных экстрактов.

4.1. Определение антифунгальной активности.

Антифунгальную активность культуральных жидкостей и экстрактов из биомассы определяли методом диффузии в агар.

Споры Aspergillus niger 137а, выращенные на агаризованной среде Райстрика (в течение 18 часов при 37 °С), смывали с поверхности агара стерильной дистиллированной водой из расчета 10 мл на пробирку объемом 25 мл. Споровую суспензию разбивали стеклянными бусами(ё=8мм) в течение 15-30 мин на качалке со скоростью 3 с"1, фильтровали через ватный фильтр для освобождения от обрывков мицелия. Количество спор определяли подсчетом в камере Горяева. Оптимальный споровый титр, обеспечивающий получение равномерного газона тест-организма, составляет 106 спор/мл. Суспензию спор вносили в агаризованную среду Райстрика (расплавленную и остуженную до 40 °С) из расчета 1 мл на 100 мл среды.

Антифунгальную активность исследуемых образцов определяли, путем их нанесения в лунки или на диски. Действие изучаемых соединений оценивали, измеряя диаметр зон подавления роста тест-организма.

Оценка биологической активности отобранных препаратов осуществлялась по изменению антифунгальной активности контрольного препарата — ловастатина и изучаемых субстанций, а также ряда изучаемых компонентов, путем сравнения диаметра зон подавления роста Aspergillus niger 137 А с диаметром зон, полученных в опыте.

Исследование антидрожжевой активности отобранных соединений проводили с использованием тест-организма Candida albicans АТСС 885-653. Для этого использовали агаризованную среду Сабуро следующего состава: 10 г пептона ферментационного сухого;40 г глюкозы; 13 г агара микробиологического; воды дистиллированной 1000 мл, рН после стерилизации 5,6±0,2.

Тест-культуру Candida albicans АТСС 885-653, после 2-х суток инкубирования в жидкой питательной среде Сабуро с титром 1x109 КОЕ/мл (по стандарту мутности ГИСК им. JI.A. Тарасевича) разводили 1:1000 стерильным изотоническим раствором NaCl. Вносили по 1 мл взвеси тест-культуры в 100 мл расплавленной и охлажденной до 35- 40°С агаризованной среды Сабуро, перемешивали.

Агаризованную среду, содержащую тест-микроорганизм разливали в чашки Петри и оставляли до полного застывания при комнатной температуре. После застывания чашки Петри с тест-микроорганизмами подсушивали в течение 30 мин и делали на расстоянии 2830 мм от центра по окружности чашки шесть лунок диаметом 6 мм или накладывали диски, в лунки или на диски вносили исследуемые образцы. После внесения опытных образцов чашки инкубировали в термостате при 37 °С в течение 15 - 18 часов.

В качестве препарата сравнения при определении активности в отношении дрожжеподобных грибов был использован клотримазол ("Акрихин") применяемый в противогрибковой химиотерапии. Клотримазол использовали в концентрации 0,05 мкг/мл. Кроме того, в качестве контроля оставляли не обработанную антибиотиками суспензию тест-культуры для определения титра интактных клеток.

При определении антифунгальной активности масляные концентраты комплексных соединений разводили в спирте и вносили в лунки, вырезанные в агаре с тест-культурой в количестве I мкг, 10 мкг, 100 мкг. О величине МПК каждого исследуемого образца судили по диаметру зон подавления роста соответствующего тест-микроорганизма.

4.2. Определение антибактериальной активности.

Определение антибактериальной активности проводили в соответствии с методикой рекомендованной Государственной фармакопеей СССР [127]. Активность в отношении Staphylococcus aureus АТСС 29213, Bacillus subtilis АТСС 6633, Bacillus cereus Var mycoides luteus 537, исследуемых образцов определяли методом диффузии в агар.

Для этого в чашки Петри в качестве первого слоя разливали по 10 мл голодного агара (рН 7,0-7,2). В качестве второго слоя - 10 мл агаризованной среды МХА Мюллера-Хинтона(МХА), производства «Шзрап1аЬ»(Испания) следующего состава (в г\л): пептон казеиновый - 17,5; экстракт говядины - 300; крахмал - 1,5; агар - 17,0; вода,рН=7,4±0,2.

Для приготовления инокулята Staphylococcus aureus АТСС 29213 использовали 18-20 часовые культуры выросшие на готовой агаризованной среде МХА. Предварительно готовили суспензию культуры в стерильном изотоническом растворе до конечной концентрации 1x107 КОЕ/ мл по стандарту мутности ГИСК им. JI.A. Тарасевича. Стерильный тампон смачивали в суспензии тест-микроорганизма и наносили на поверхность чашки с питательной средой, равномерно распределяли по поверхности.

Для приготовления газона Bacillus subtilis АТСС 6633, брали 0,5 мл взвеси спор 1 х 108 спор/мл по стандарту мутности ГИСК им. JI.A. Тарасевича и разливали в чашки Петри по 10 мл в качестве второго слоя. При изучении чувствительности культуры инкубировали при 37 °С в течение 15-24 часов.

После застывания чашки Петри с тест-микроорганизмами подсушивали в течение 30 мин и делали на расстоянии 28-30 мм от центра по окружности чашки шесть лунок диаметом 6 мм или накладывали диски, в лунки или на диски вносили исследуемые образцы.

При определении антимикробной активности масляные концентраты комплексных соединений разводили в спирте и вносили в лунки, вырезанные в агаре с тест-культурой в количестве 1 мкг, 10 мкг, 100 мкг. О величине МПК каждого исследуемого образца судили по диаметру зон подавления роста соответствующего тест-микроорганизма.

5.Методы изучения гиполипидемической активности с использованием культуры клеток гепатоцитов Hep G2.

Изучение действия микробных метаболитов на синтез холестерина проводили с использованием культуры клеток Hep G2, для этого клетки Hep G2 культивировали в 75 см2 флаконах в минимальной среде Игла ("Flow"", Великобритания). К среде Игла добавляли 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 мкг/мл канамицина, 4 мМ L-глутамина при 37 °С в СОг-инкубаторе в атмосфере 95% воздуха и 5% СОг. Для постановки экспериментов клетки переносили в 24-луночные планшеты ("Flow", Великобритания) с плотностью 2x105 клеток на лунку и выращивали до достижения ими состояния субконфлуентного монослоя. Непосредственно перед внесением антибиотиков осуществляли кратковременную (1 час) инкубацию в бессывороточной среде. Дальнейшую инкубацию клеток проводили в среде Игла, содержащей 5 мкКи/мл 3Н -ацетата натрия (удельная активность 40,6 Ки/моль) в присутствии или в отсутствие тестируемых микробных метаболитов.

Исследуемые препараты вносили в виде спиртовых растворов одновременно с радиоактивным предшественником из расчета 2,5 мкл на 0,5 мл среды. Контрольным препаратом служил ловастатин (фирмы CBL, Индия). Продолжительность инкубации л составила 3 ч. После инкубации в течение 3 ч в СО -инкубаторе клетки дважды промывали холодным фосфатным буфером Дюльбекко следующего состава (в мМ): КС1 - 2,68, КН2РО4 -1,47, NaCl - 137,0, Na2HP04x7H20 - 0,06, рН 7,0. Липиды экстрагировали смесью гексан-изопропанол (3:2), после чего полученные растворы упаривали в атмосфере азота. Измерение радиоактивности проводили в диоксановом сцинтилляторе ЖС-8.

Цитотоксичность антибиотиков определяли окрашиванием клеток HepG2 0,5% раствором трипанового синего ("Flow", Великобритания), а также изучая воздействие препаратов на синтез белка. В последнем случае клетки HepG2 инкубировали с изучаемыми препаратами в течение 3-х часов в присутствии 5 мкКи/мл 3Н -ацетата натрия (удельная активность 40,6 Ки/моль). После отмывания клеток от не включившегося радиоактивного предшественника 0,1 М холодным фосфатным буфером (рН 7,0) их лизировали, добавляя 0,1 н. NaOH. Клеточный белок осаждали с помощью 10% ТХУ, дважды промывали и ресуспендировали в фосфатном буфере. Измерение радиоактивности проводили в диоксановом сцинтилляторе ЖС-8.

Достоверность различий определяли по ^критерию Стьюдента. Статистическую обработку результатов проводили по методу Стьюдента. Вычисляли среднее значение полученных величин и стандартное отклонение. Полученные данные являются результатом трех измерений. Каждое значение рассчитано, как среднее из 3 измерений.

За 100% брали уровень включения радиоактивных предшественников в клетки контрольных лунок, содержащих 0,5% этанола. б.Материалы и методы, использованные при разработке микробиологической модели скрининга продуцентов гиполипидемических соединений.

При создании модели скрининга продуцентов гиполипидемических соединений в качестве контрольного препарата с доказанным клинически гиполипидемическим действием использовали субстанцию ловастатина.

В результате специальных исследований был отобран высокочувствительный штамм То1урос1асИит \njlatum 106 , который использовали в качестве тест-организма при определении гиполипидемической активности культуральных жидкостей и других исследуемых субстратов. Т. /п/1аШт 106 выращивали на агаризованной среде Райстрика. Для изучения влияния ловастатина на синтез эргостерола у отобранного штамма тест-культуры Т. '\nflatum 106, культуру растили в погруженных условиях в жидкой питательной среде А-9. Способ культивирования в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл (объем среды составлял 50 мл) на качалках в условиях сильного перемешивания(180 об/мин) и слабого перемешивания (50 об/мин) при температуре 24°С.

Методика постановки экспериментов по определению гиполипидемической активности отобранных экстрактов с использованием микробиологической модели.

Для приготовления посевного материала в колбу Эрленмейера объемом 750 мл с 50 мл жидкой питательной среды А-9 вносили агаровый блок с культурой Т. \nflatum 106, выращенной на скошенном агаре Райстрика в течение 14 суток при 24 °С. Вегетативный посевной мицелий культивировали в течение 48 часов при 24 °С на качалках при 180 об/мин (3,6 с"1). Ферментацию проводили в той же среде и при тех же условиях, что и при подготовке посевного материала. Объем посевного материала составлял 5% от объема питательной среды в колбе.

В момент засева ферментационной среды в колбы вносили ловастатин в концентрации от 10"6 до 1 мкг/мл (2,5x10"9 до 0,0025 моль/л).

Для изучения влияния на синтез стеролов отобранных препаратов-сырцов, экспериментальные образцы (первичные экстракты и отдельные фракции) вносили в момент засева ферментационной среды. При изучении влияния отобранных соединений на синтез стеролов исследовали концентрации в диапазоне от 1 до 1*10-7 мкг/мл среды.

Контролем служила культуральная жидкость Т. inflatum 106, без каких либо добавок. Культивировали опытные колбы при температуре 24°С на качалках при 50 и 180 об/мин. Через 2 суток роста определяли количество эргостерола в клетках тест-культуры и выражали в мкг/мг сухой биомассы [128]. В качестве стандарта использовали эргостерол любезно предоставленный профессором Н.А.Благосклоновым (Государственный научно исследовательский институт витаминов).

По окончании культивирования из опытной колбы отбирали 2 пробы по 10 мл — для определения биомассы по весу сухого мицелия и для определения содержания эргостерола в мицелии. Биомассу отделяли центрифугированием в режиме 2000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость отбрасывали.

Для определения количества биомассы мицелий сушили в заранее взвешенных пробирках до постоянного веса при температуре 100-110 °С в течение 4-7 часов.

Для определения содержания эргостерола, влажную биомассу из 10 мл культуральной жидкости, отделенную от жидкости подвергали щелочному гидролизу. Для этого 1 мл спиртового раствора 1N КОН приливали к содержимому пробирки и выдерживали в течение 1 часа на масляной бане при температуре 80 °С[129]. По окончании гидролиза в пробирки вносили 5 мл петролейного эфира и в течение 1 часа проводили экстрагирование. Содержание эргостерола в полученном экстракте определяли спектрофотометрически на спектрофотометре СФ - 46 при длине волны 282 нм, что соответствует максимуму поглощения эргостерола [130].

Качественную и количественную оценку образования эргостерола проводили методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках Silufol UV 254 , в системе растворителей гексан - ацетон 2:1. На пластинку наносили гидролизованный экстракт опытного образца и контрольный препарат эргостерола. После хроматографирования экспериментальных образцов наличие эргостерола определяли по Rf в сравнении с контролем. Для количественного определения эргостерола в экспериментальных образцах предварительно проводили построение калибровочной кривой со стандартным препаратом эргостерола, используя спектрофотометрический метод. Для определения эргостерола в опытных образцах и в стандарте, зону с хроматографической пластинки, соответствующую Rf эргостерола вырезали и кусочки пластинки элюировали в этиловом спирте в течение 30 минут и определяли экстинкцию при 282 нм на спектрофотометре СФ - 46.

Расчет количественного содержания эргостерола проводили по формуле: Е* 160

С=- , где X

Е - экстинкция при 282 нм, в единицах оптической плотности.

160 - коэффициент пересчета при экстракции в 5 мл петролейного эфира,

X — вес сухого мицелия (мг)

С - кол-во эргостерола (мкг/мг сухого веса мицелия)

Статистическую обработку результатов проводили по методу Стьюдента. Вычисляли среднее значение полученных величин и стандартное отклонение. Процент подавления синтеза эргостерола рассчитывали, принимая контрольный уровень (без препаратов) за 100 %.

7.Методы изучения гиполипидемической активности отобранных экстрактов в экспериментах in vivo на кроликах.

Изучение гиполипидемической активности отобранных экстрактов в условиях in vivo (на модели гиперлипидемии у кроликов) проводили совместно с сотрудниками ФГУП ГНЦА Долговой Г.В. и Померанцевой Т.Я.

Работу проводили в виварии ФГУП ГНЦА на кроликах породы шиншилла. Животных получали из питомника ОПХ «Монихино» и содержали на стандартном рационе вивария. Для испытаний было отобрано 6 кроликов с исходной массой тела 2,1 ± 0,12 кг. Для создания модели гиперлипидемии использовали кроликов, так как именно у этих животных ввиду их травоядного рациона (обычно не содержащего животных жиров) можно быстро вызвать нарушение липидного обмена путем введения в рацион холестерина или других липидов. Кроликам ежедневно в течение 57 дней вводили внутрь холестерин (содержание основного компонента составляло 95%), в дозе 300 мг/кг в 2 мл 2 % крахмального геля. На 14-ый, 30-ый и 48 день этого периода в сыворотке крови животных определяли содержание общего холестерина(ОХ), триглицеридов(ТГ) и холестерин липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП) с использованием коммерческих наборов для определения. Концентрацию общего холестерина определяли энзиматическим колориметрическим методом с применением набора реактивов фирмы «Ольвекс Диагностикум» (кат. № 013.012). Концентрацию триглицеридов в сыворотке определяли энзиматическим колориметрическим методом с применением набора реактивов фирмы «Витал Диагностике СПб» (кат. № 017.022), а концентрацию ЛПВП в сыворотке крови с применением набора реактивов фирмы Pointe Scientific, 1пс.(кат№ Р803-Н7507-01) США.

Содержание холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС ЛНП) определялось по формуле Фридвальда[131]:

ХС ЛНП = ОХС - ХС ЛВП - ТГ/5 (мг/дл) где ОХС - концентрация общего холестерина,

ХС ЛВП - концентрация холестерина липопротеинов высокой плотности, ТГ - концентрация триглицеридов, уровень которых не превышал 4.5 ммоль/л. Сыворотку крови кроликов использовали сразу или хранили в морозильнике при температуре -18 °С. Динамику липидных показателей сыворотки крови кроликов определяли с использованием автоматического анализатора (Spekol 221, ГДР). Концентрации были измерены с использованием спектроскопического метода при длине волны: Я,=540 нм - для определения концентрации триглицеридов, Я,=505 нм - для определения концентрации общего холестерина, Я,=500 нм - для определения концентрации ЛПВП.

На 57 день после начала введения холестерина кроликам, после того как липидные показатели стабилизировались, проводили эксперимент по изучению влияния ловастатина. За 18 часов до опыта у животных отбирали корм, оставляя свободный доступ к воде. Утром животным вводили однократно внутрь ловастатин в дозе 4 мг/кг в 2 мл 2% крахмального геля (эта доза при пересчете по поверхности тела эквивалентна максимальной суточной дозе препарата для человека). Отбор венозной крови проводили до введения испытуемого препарата и через 0,5; 1, 1,5; 2, 3 и 5 часов после его введения. В сыворотке крови определяли содержание общего холестерина, триглицеридов и ЛПВП.

В тех же условиях проводили оценку влияния новых препаратов на уровень холестерина в крови кроликов. За 18 часов до опыта у животных отбирали корм, оставляя свободный доступ к воде. Утром животным вводили однократно внутрь ловастатин в дозе 4 мг/кг в 2 мл 2% крахмального геля, а также опытные экстракты, показавшие выраженный эффект в модельных экспериментах in vitro.

Опытные экстракты представляли собой сырцы, количество которых определяли из сопоставления их концентраций, вызывающих снижение синтеза эргостерола в культуре Т. inßatum 106, и концентраций ловастатина, вызывающих в этой же модели снижение синтеза эргостерола с последующим пересчетом на действующую у кроликов дозу ловастатина. Разведения испытуемых препаратов готовили с использованием этилового спирта (95%), так как они проявляли себя как гидрофобные вещества.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Чмель, Ярослава Валентиновна, 2005 год

1. Endo A., Kuroda M., Tanzawa K. et al. Competitive inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzyme A reductase by ML-236 and ML-236B, fungal metabolites having hypocholesterolemic activity.//FEBS. Lett.-1976.-72- pp. 323-326.

2. Endo A., Kuroda M„ Tsujita Y. et al. ML-236A, ML-236B and ML-236C, new inhibitors ofcholesterogenesis produced by P.citrinum.ll J. Antibiot.-1976.- vol. 29.- n.12.- pp. 1346-1348.

3. Brown A.G., Smale T.C., King T.J. et al. Crystal and molecular structure of compactin, a newantifungal metabolite from Penicillium brevicompactum.ilJ. Chem. Soc. Perkin Trans. 1976.-pp. 1163-1170.

4. Brown M.S., Faust J.R., Goldstein J.L. et al. Induction of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme

5. A reductase activity in human fibroblasts incubated with compactin (ML-236B), a competitive inhibitor of the reductase.//J. Biol. Chem.- 1978.- vol. 253-n. 4- pp. 1121-1128.

6. Brown M.S., Dana S.E., Goldstein J.L. et al. Regulation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase activity in cultured human fibroblasts.//J. Biol. Chem. 1974. - vol. 249-n.3- pp. 789-796.

7. Endo A., Hasumi K, Yamada A. et al. The synthesis of compactin (ML-236B) and monacolin Kin fungi.//J. Antibiot. 1986.- vol. 39- n.l 1- pp. 1609-1610.

8. Gunde-Cimerman N., Plemenitas A., Cimerman A. et al. Pleurotus fungi produce mevinolin, aninhibitor of HMG-CoA-reductase.//FEMS Microbiol. Lett. 1993.- 113- 3- n.l- pp.333-337.

9. Kuroda M., Endo A. et al. Inhibition of in vitro cholesterol synthesis by fatty acids./VBiochim.

10. Biophys. Acta. 1977- 486-pp. 70-81.

11. Greenspan M.D., Yudkovitz J.B., Alberts A.W. et al. Mevinolic acid biosynthesis by Aspergillusterreus and its relationship to fatty acid biosynthesis.//J. Bacteriol. 1985.- 162- 2- pp. 704-707

12. Endo A., Kuroda M. et al. Monacolin K, a new hypocholesterolemic agent produced by a Monascus species.//J. Antibiot. 1979.- vol.32- pp. 852-854.

13. Endo A., Hasumi K, Negishi S., et al. Monacolins J and L, new inhibitors of cholesterol biosynthesis produced by Monascus ruber.Hi. Antibiot. 1985.- vol.38- (3)- pp. 420-422.

14. Endo A., Komagata D„ Shimada H. O. et al Monacolin M, a new inhibitor of cholesterol biosynthesis.//J. Antibiot. 1986. - 39- (12)- pp. 1670-1674.

15. Komagata D., Shimoda H., Murakawa Sh. et al. Biosynthesis of monacolins: conversion of monacolin L to J by a monooxygenase of Monascus ruber.!/J. Antibiot. 1989- vol.42-(3) - pp. 407-412.

16. Endo A., Hasumi K., Yamada A. et ah The synthesis of compactin (ML-236B) and monacolin К in fungi.//J. Antibiot. 1986. - vol. 39- (11)- pp. 1609-1610.

17. Sacks F.M., Tonkin A.M., ShepardJ. et ah Prospecting Pravastatin Pooling Project Investigators Group. Effect of pravastatin on coronary disease events in subgroups defined by coronary risk factors.//Circulation.- 2000.- 102-pp. 1893-1900.

18. Stein E., Kreisberg R., Miller V. et ah Effects of simvastatin and cholestyramine in familial and nonfamilial hypercholesterolemia. Multicenter Group I.//Arch. Intern. Med. 1990.-150 pp. 341-345.

19. Hagen E„ Istad H., Ose L. et ah Fluvastatin efficacy and tolerability in comparison and in combination with cholestyramine.//Eur. J. Clin. Pharmacol. 1994.- 46- pp. 445—449.

20. McClellan K. Cerivastatin.//Drugs. 1998. - vol. 55- pp.415-422.

21. Keech A. Three-year follow-up of the Oxford Cholesterol Study: assessment of the efficacy and safety of simvastatin in preparation for a large mortality study .//Eur. Heart. J. 1994.- 15- pp. 255—69.

22. Rosenson R.S. Rosuvastatin: a new inhibitor of HMG-coA reductase for the treatment of dyslipidemia.//Expert. Rev. Cardiovasc .Ther. -2003.-Nov;l(4)- pp. 495-505.

23. Metabolic fate of pitavastatin, a new inhibitor of HMG-CoA reductase: human UDP-glucuronosyltransferase enzymes involved in lactonization. //Xenobiotica. 1 January 2003.-vol.33 -n. 1-pp. 27-41.

24. Оганов P. Г., Марцевич С. Ю. Лекарственная терапия сердечно-сосудистых заболеваний: данные доказательной медицины и реальная клиническая практика// Российский кардиологический журнал. — 2001.- №4 С. 8-11

25. Оганов Р.Г., Ахмеджанов Н.М. Аторвастатин новый ингибитор ГМГ -КоА- редуктазы для лечения атеросклероза и гиперлипидемий// Кардиология. 2000. - №7 - С.62 -67.

26. Rosensen R.S., Tangney С.С., Casey L.C., et ah Inhibition of pro-inflammatory cytocine production by pravastatin.//Lancet. 1999. - vol. 353 - pp.983-984

27. Оганов P.Г., Перова H.B., и соавт. Современные подходы к диагностике и коррекции дислипопротеидемий//Кардиология. 1989. - N 10 - С. 15-22

28. Rifkind В.М. High-density lipoprotein cholesterol and coronary artery disease: survey of the evidence.//Am. J. Cardiol. 1990. - 66 - pp.3 A—6A.

29. Brown G., Albers J.J., Fisher L.D. et ah Regression of coronary artery disease as a result of intensive Iipidlowering therapy in men with high levels of apolipoprotein N.//Engl. J.Med. -1990.-n. 323-pp. 1289- 1298.

30. Cholesterol, diastolic blood pressure, and stroke: 13 000 strokes in 450 000 people in 45 prospective cohorts. Prospective studies collaboration.//Lancet. — 1995. -n. 346 pp.1647-1653.

31. Лякишев А.А., Кухарчук В.В., Титов В.Н. и соавт. Оценка гиполипидемических эффектов ловастатина при первичной гиперхолестеринемии. Многоцентровое исследование//Кардиология. 1993. - №11 - С. 48- 54.

32. Jones P. et al. Comparative dose efficacy study of atorvastatin, simvastatin, pravastatin, and fluvastatin in patients with hypercholesterolemia (CURVES Study).//Am. J. Cardiol. 1998. -n.81 - pp.582 -587.

33. Wierzbicki A.S. et al. Comparison of therapy with simvastatin 80 mg and atorvastatin 80 mg in patients with familial hypercholesterolaemia.//Int. J. Clin. Pract. 1999. - 53 -pp.609-611.

34. Pitt В., Furberg C., McGovern M. et al. Reduction in cardiovascular events during treatment with pravastatin: pooled analysis from coronary and carotid atherosclerosis triaI.//Eur. Heart. J. 1994.-15-pp.487.

35. Downs J.R., Clerfield M.,Weis S. et al. Primary prevention of acute coronary events with lovastatin in men and women with average cholesterol level. Results of AFCAPS/TexCAPS.//JAMA. 1998. - n. 279-pp. 1615- 1622.

36. Shepard J., Cobbe S.M., Ford I. et al. WOSCOPS (West Of Scotland COronary Prevention Study)//Am. J. Cardiol. 1995. - n. 76 - pp. 485-491.

37. Sacks F.M., Pfeffer M.A., Moye L.A. et al. CARE (Cholesterol And Recurrent Events)//Circulation. 1999. -n.99 - pp. 216-223.

38. LIPID (Long-term Intervention with Pravastatin in Ischemic Disease)//Am. J. Cardiol. 1995. -n.76 - pp. 474-479.

39. Randomised trial of cholesterol lowering in 4444 patients with coronary heart disease: the Scandinavian Simvastatin Survival Study (4S).//Lancet. 1994. - n.344 - pp. 1383—1389.

40. Scandinavian Simvastatin Survival Study Group. Baseline serum cholesterol and treatment effect in the Scandinavian Simvastatin Survival Study (4S).//Lancet. 1995. - n.345 - pp.12741275.

41. Pedersen T.R., Kjekshus J., Pyorala K. et al. Effect of simvastatin on ischemic signs and symptoms in the Scandinavian Simvastatin Survival Study (4S).//Am. J. Cardiol. 1998. -vol.81 - pp. 333-335.

42. Strandberg Т.Е., Vanhanen H., Tikkanen M.J. et al. Effect of statins on С reactive protein in patients with coronary artery disease.//Lancet. - 1999. - vol. 353 - pp. 118-119.

43. Slaels В., Koenig W., Habib A. et al. Activation of human aortic smooth muscle cells is inhibited by PPAR a but not PPARg activators // Nature. 1998. - vol. 393 - № 6687 - pp. 790793.

44. Rosenson R.S., Tangney C.C. Antiatherothrombotic properties of statins. Implications for cardiovascular event reduction.//JAMA. 1998. - n.279 - pp. 1643-1650.

45. Bellosta S„ Bernini F., Ferri N. et al. Direct vascular effects of HMGCoA reductase inhibitors.//Atherosclerosis. 1998. - 137 (Suppl.)-pp. S101- SI09.

46. Kuzuya F., Kuzuya M„ Yasue M. et al. Clinical and experimental approaches to the prevention of atherosclerosis by immunological regulations//Ann. N.Y. Acad. Sci. 1990. - vol. 598. - pp. 458-463.

47. Vaughan C.J., Murphy M.B., Bucklay B.M. Statins do more than just lower cholesterol.//Lancet. 1996. - vol. 348 - pp. 1079-1082.

48. Berliner J., Navab M., Fogelman A. el al. Atherosclerosis: basic mechanisms: oxidation, inflammation and genetics.//Circulation. 1995. - vol. 91 - pp. 2488-2496.

49. Pierce L.R., Wysowski D.K., Gross T. P. Myopathy and rhabdomyolysis associated with lovastatin-gemfibrozil combination therapy .//J. Am. Med. Assoc. 1990. - n.264 - pp. 71-75.

50. Hargreaves LP., Heals S. Statins and myopathy .//Lancet. 2002. - n. 359 - pp. 711-7I2.

51. Muldon M.F., FloryJ.D., Marsland A. et al. Effects of lovastatin on the immune system//Amer. J. Cardiology. 1997. - vol. 80-pp. 1391-1394.

52. Аронов Д.М. Лечение и профилактика атеросклероза. М.: 2000. - 411 с.

53. Hill M.R., Clarke S., Rodgers К. et al. Effect of peroxisome proliferator- activated receptors alpha activators on tumor necrosis factor expression in mice during endotoxemia//Infect. Immun. 1999. - vol. 67 - № 7 - pp. 3488-3493.

54. Rosenson R.S. Tangey C.C., Casey L. Inhibition of proinflammatory cytokine production by pravastatine//Lancet. 1999. - vol. 353 - pp. 983-984.

55. Meigs T. Farnesol as a regulator of HMG-CoA reductase degradation: characterization and role of famesyl pyrophosphatase.//Arch. Biochem. Biophys. 1997. - vol. 345 - pp. 1-9.

56. Goldstein J. L., Brown M. S. Regulatation of the Mevalonate Pathway .//Nature. 1990. - vol. 343 - pp. 425-430.

57. Егоров H.C., Баранова H.A., Крейгер В.Г. и соавт. Микробные ингибиторы ферментов биосинтеза и этерификации холестерина.//Антибиотики и химиотерапия. 1999. - Т.44. -С.38-44

58. Blows W.M., Foster G., Lake S.J. et al. The squalestatins, novel inhibitors of squalene synthase produced by a species of Phoma. 5. Minor metabolites.//.!. Antibiot. 1994. - vol. 47 -{7) - pp. 740-755.

59. Chan C. The squalestatins: decarboxy and 4-deoxy analogues as potent squalene synthase inhibitors.//.!. Med. Chem. 1996. - vol. 39 - pp. 207-216.

60. Leftheris K, Kline T. Development of highly potent inhibitors of Ras Farnesyltransferase possessing cellular and in vivo activity .//J. Med. Chem. 1996. - vol. 39 - pp. 224-236.

61. Bergstrom J. D. Discovery, biosynthesis, and mechanism of action of the zaragozic acids: Potent inhibitors of squalene synthase.//Annu. Rev. Microbiol. 1995. - vol.49 - pp. 608-639.

62. Squalene synthase inhibitors suppress triglyceride biosynthesis through the farnesol pathway in rat hepatocytes.//J. Lipid Res. 2003 - vol. 44 - (1) - pp. 128 - 135.

63. Aoyama T., Satoh T„ Yonemoto M„ Shibata A. A new class of highly potent Farnesyl Diphosphate-competitive inhibitors of Farnesyltransferase.//.!. Med. Chem. 1998. - vol. 41 -pp.143-147.

64. Tanimoto T„ Hamano K. et al. Biological activities of novel zaragozic acids, the potent inhibitors of squalene synthase, produced by the fungus Mollisia ^p.(SANK 10294).//J. Antibiot. 1997. - vol. 50 - pp. 390-394.

65. Singh S. B., Zinc D. L., Liesch J. Isolation and structure of Chaetomelic Acids A and B from Chaetomellia acutiseta: Farnesyl Pyrophosphate inhibitors of Ras Farnesyl-Protein Transferase.//Tetrahedron. 1993. - vol. 49 - pp. 5917-5926.

66. Stark W. W. Inhibition of Geranylgeranylation, but not Farnesylation, promotes apoptosis in vasular smooth mucle cells.//Amer. J. Physiology. 1998. - vol. 275 - pp. L55-L63.

67. Bostedor R.G. Farnesol-derived dicarboxylic acids in the urine of animals treated with zaragozic acid A or with farnesol.//J. Biol. Chem 1997. - vol. 272, - pp. 9197-9203.

68. Flint O.P. Inhibition of cholesterol synthesis by squalene synthase inhibitors does notmyotoxicity in vitro. //J.Toxicol. Appl. Pharmacol. 1997. - vol.145 - pp. 91-98.

69. Minagawa K. J., Kouzuki Sh., Nomura K et al. Bisabosquals, novel squalene synthase inhibitors. I. Taxonomy, fermentation, isolation and biological activities.//.!. Antibiot. 2001. -vol.54-(11)-pp. 890-895.

70. Minagawa K. J., Kouzuki Sh., Nomura K. et al. Bisabosquals, novel squalene synthase inhibitors produced by Stahybotrys ruwenzoriensis. 2. Physico-chemical properties and structure elucidation.//.!. Antibiot. 2001. - vol.54 - (11) - pp. 896-903.

71. Watanabe S„ Hirai H., Ishiguro M. et al. CJ 15-183, new inhibitor of squalene synthase produced by a fungus Aspergillus aculeatus CL38916.//J. Antibiot. - 2001. - vol.54 — (11) - pp. 904-910.

72. Nakayama H., Izuta M. et al. Depletion of squalene synthase (ERG9) dose not impair of Candida glabrata in mice//Antimicrob. Agents Chemother. 2000. - vol. 44 - pp. 2411-2418.

73. Watanabe S., Hirai H., Ishiguro M. et al. CJ 13-981 and CJ - 13-982, new squalene synthase inhibitors produced by a fungus CL 15036 .//J. Antibiot. - 2001. - vol.54 - (12) - pp. 10251030.

74. Lees N.D., Bard M., Kirsch D.R. Biochemistry and molecular biology of sterol syntesis in Sacharomyces cerevisiae/ICnt. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1999. - vol. 34 - pp. 33-47.

75. Susking K. E. Role of ACAT in cellular cholesterol metabolism.//J. of Lipid Res. 1985. - vol. 26-pp. 647-671.

76. Brown M.C et al. ACAT-2, a second mammalian acyl coA: cholesterol acyltransferase: its cloning, expression, and characterization.//J. Biol. Chem. 2001. - vol. 273 - pp. 26755-71.

77. Nozawa K. Biologically active indoloditerpene from Aspergillus and Pénicillium.// Ann. Meet. Mycol.-1994.-pp. 10-11.

78. Huang X.H., Tomoda H., Nishida H. et al. Terpendoles, novel ACAT inhibitors produced by Albophoma yamanashiensis. I. Production, isolation and biological properties.//.!. Antibiot. -1995.-vol. 48-{l)-pp. 1-4.

79. Huang X.H., Nishida H., Tomoda H. et al. Terpendoles, novel ACAT inhibitors produced by Albophoma yamanashiensis. II. Structure elucidation of terpendoles A, B, C and D.//J. Antibiot. 1995. - vol.48-(1)-pp. 5-11.

80. Tomoda H„ Huang X.H., Nishida H. et al. Terpendoles, novel ACAT inhibitors produced by Albophoma yamanashiensis. III. Production, isolation and structure elucidation of new components//J. Antibiot. 1995. - vol.48 - (8) - pp. 793-804.

81. Nishida H„ Tomoda H„ Huang X.H. et al. Terpendoles, novel ACAT inhibitors produced by Albophoma yamanashiensis. IV. Biological properties of new components.//.!. Antibiot. 1995. -vol.48-(8)-pp. 805-811.

82. Matsuzaki K.,Tanaka H., Omura S. et al. Isochromophilones I-II , novel inhibitors inhibitors against gp 120 CD - 4 binding produced by Pénicillium sp 2. Structure elucidation .//J. Antibiot. - 1995. - vol. 48 -Ç7) - pp. 708-713.

83. Arai N., Shiomi K., Tomoda H. et al. Isochromophilones III-VI inhibitors of acyl-CoA-cholesterol acyltransferase produced by Pénicillium multicolor.//J. Antibiot. 1995. - vol. 48 -(7)-pp. 696-702.

84. Omura S., Tanaka H., Matsuzaki К. et al. Isochromophilones I-II, novel inhibitors against gp 120 CD - 4 binding from Pénicillium sp. Hi. Antibiot. - 1993. - vol. 46 - (12) - pp. 19081911.

85. Yang D.J., Tomoda H., Tabata N. et al. New isochromophilones VII IX inhibitors of acyl-CoA-cholesterol acyltransferase produced by Pénicillium multicolor.//J. Antibiot. - 1996. - vol. 49-(3)-pp. 223-228.

86. Tomoda H., Kim Y.K., Nishida H. et al. Pyripyropenes, novel inhibitors of acyl-CoA-cholesterol acyltransferase produced by Aspergillus fumigatus: 1. Production, isolation and biological properties.//.!. Antibiot. 1994. - vol.47 - (2) - pp. 148-154.

87. Kim Y.K., Tomoda H„ Nishida H. et al. Pyripyropenes, novel inhibitors of acyl-CoA-cholesterol acyltransferase produced by Aspergillus fumigatus: 2. Structure elucidation of pyripyropenes A,B,C and D.//J. Antibiot. 1994. - vol.47 - (2) - pp. 154- 162.

88. Tomoda H., Tabata N., Yang D.-J. et al. Pyripyropenes, novel inhibitors of acyl-CoA-cholesterol acyltransferase produced by Aspergillus fumigatus: 3. Structure elucidation of pyripyropenes E to L.//J. Antibiot. 1995. - vol.48 - (6) - pp. 495- 503.

89. Omura S., Tomoda H., Kim Y.K et al. Pyripyropenes, highly potent inhibitors of acyl-CoA-cholesterol acyltransferase produced by Aspergillus fumigatus//J. Antibiot. 1993. - vol.46 -(11)-pp. 1168-1169.

90. Kim Y.K., Son КН., Jeong T.S. et al. GERI-BP002-A, novel inhibitor of acyl-CoA-cholesterol acyltransferase (ACAT) produced by Aspergillus fumigatus P93 94.//J. Antibiot. 1996. - vol. 49-pp. 31-36.

91. Know O.E., Rho M.-Ch, Song H.Y. et al. Phenylpyropenes A and B, new inhibitors of acyl-CoA-cholesterol acyltransferase (ACAT) produced by Pénicillium griseofulvum F 1959.//J. Antibiot. 2001. - vol. 54 - (11) - pp. 1004-1008.

92. Rho M. -Ch., Lee H.S. Chang K.-T. et al. Phenylpyropene С, a new inhibitor of acyl-CoA-cholesterol acyltransferase (ACAT) produced by Pénicillium griseofulvum F 1959.//J. Antibiot. 2002. - vol. 55 - (2) - pp. 211-214.

93. Климов A.H., Никульчева Н.Г. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения. Руководство для врачей. "Питер", Санкт- Петербург 1999 г, 512 с.

94. Шевченко О.П., Шевченко А. О. Статины. Ингибиторы ГМГ-Ко -А-редуктазы. «Реафарм», Москва, 2003 г, 112с.

95. Brown M.S., Goldstein J.L. Lipoprotein metabolism in the macrophage: implications of cholesterol deposition in atherosclerosis.// Ann. Rev. Biochem. 1983. - vol.52 - pp. 223-261.

96. Бибикова M.В., Бондарева Н.С. Препараты микробного происхождения для лечения атеросклероза.//Антибиотики и химиотерапия 1998. - Т.43. - С. 34-39.

97. Determs Р.А. Patel S., Hernandez M. A target for cholesterol absorption inhibitors in the enterocyte brush border membrane.//Biochim. Biophys. Acta. 2000. - 1486 - pp. 243-252.

98. Namatame I., Tomoda H., Yamaguchi Y. et al. Beauveriolides, specific inhibitors of lipid droplet formation in mouse macrophages (LDFM), produced by Beauveria sp. FO 6979. //J. Antibiot. - 1999. - vol. 52 - ( 1 ) - pp. 1 -6.

99. Namatame I., Tomoda H., Tabata N. et al. Structure elucidation of fungal beauveriolid III, a novel inhibitor of lipid droplet formation in mouse macrophages (LDFM).// J. Antibiot. 1999. -vol. 52-(l)-pp. 7-12.

100. Tomoda H., Namatame I., Si Sh. et al. Phenochalasinss, inhibitors of lipid droplet formation in mouse macrophages (LDFM), produced by Phomopsis sp. FT-0211.//J. Antibiot. 1999. -vol.52-(10)-pp. 851-856.

101. Tomoda H., Namatame I., Tabata N. et al. Structure elucidation of fungal phenochalasins, novel inhibitors of LDFM in mouse macrophages.//J. Antibiot. 1999. - vol. 52 - (10) - pp. 857-861.

102. Witztum J.L., Steinberg D. Cholesterol absorption efficiency regulates plasma cholesterol level in human.//! Clin. Invest. 1991. -88 - pp. 1785-1792

103. Swell L., Byron J.E., Tredwell C.R. et al. Cholesterol esterase IV, cholesterol esterase of rat intestinal mucosa.//Eur. J. Biochem. 1992. - vol. 207 - pp. 383-389.

104. Sakai K„ Watanabe K„ Masuda K. et al. Isolation, characterization and biological activities of novel tryphenil phenol as pancreatic cholesterol esterase inhibitor produced of Stachybotrys sp. F-1839.//J. Antibiot. vol.48 - (6) - pp. 447-455.

105. Kaise H., Shinohara M., Miyazaki W. et al. Structure of K-76, a compliment inhibitor produced by Stachybotrys sp. F-1839.//J.C. S. Chem. comm. 1979. - pp. 729-727.

106. Vahouny G.V., Chanderbhan R., Kharroubi A. et al. Role of pancreatic juice in cholesterol absorption and esterification.//Am. J. Physiol. 1964. - vol. 206 - pp. 223-228.

107. Galleo L.L., Clark S.B., Meyers S. et al. Cholesterol absorption in rat intestine role of cholesterol esterase and acyl-CoA-cholesterol acyltransferase (ACAT).//J. Lipid Res. 1984. -vol.25-pp. 604-612.

108. Van Heek M.A. In vivo metabolism- based discovery of potent inhibitor of cholesterol absorption SCH-58235 and SCH-48461 in the rat and rhesus monkey.//J. Pharm. 1997. - vol. 283-pp. 157-163.

109. Cagne C., Bays H.E., Weiss S.R. et al. Efficacy and safety of ezetimibe added to ongoing statin therapy for treatment of patients with primary hypercholesterolemia.//Am. J. Cardiol. 2002. -90-pp. 108491.

110. Dujovne C.A, Ettinger M.P., McNeer J.F. et al. Efficacy and safety of a potent new selective absoption inhibitor, ezetimibe, in patients with primary hypercholesterolemia.//Am. J. Cardiol. -2002.-90-pp. 109297.

111. Koizumi J., Mabuchi H., Yoshimura A. et al. Deficiency of serum cholesterol- ester transfer protein activity in patient with familial hyperalphalipoproteinemiae.//Aterosclerosis. 1985. -vol.58-pp. 176-186.

112. Kwon B.-M., Nam., J.-Y., Lee S.-H. et al. A new inhibition of CETP produced from Trichothecium roseum F1064.//Tetrahedron Letter. 1995. - vol.36 - pp.6487-6490.

113. Kim Y.-K., Son K.-H., Nam J.-Y et al. Inhibition of cholesteryl ester transfer protein by Rosenonolactone derivatives.//J. Antibiot. 1997. - vol.49 - (8) - pp. 815-816.

114. Weng Sh-H., Su N.-W., Choong Y.-M. et al. HPLC\ Colorimetry combination method of quantitative analyses of sclerotiorin produced by Pénicillium sclerotiorum.!'/J. of food and drug analysis. 2004. - vol. 12 - (3) - pp. 199-204.

115. Kato H., Nakanishi T., Arai H. et al. Purification, microhetterogeneity, and stability of human lipid transfer protein.//! Biol. Chem. 1989. - vol. 264. - pp. 4082-4087.

116. Tomoda H., Matsushima Ch., Tabata N. et al. Structure -specific inhibition of cholesteryl ester transfer protein by Azaphilones.//J. Antibiot. 1999. - vol.52 - (2) - pp. 160-170.

117. Demain A. L. Pharmaceutical^ active secondary metabolites of microorganisms.//Appl. Microbiol. Biotech. 1999. - vol. 52. - pp. 455-463.

118. Tabata N., Tomoda II, Yamaguchi Y. et al. Inhibition of cholesteryl ester transfer protein by fungal metabolite L 681,512.//J Antibiot. 1999. - vol.52 - (11) - pp. 1042-1045.

119. Richard W.B., Yuin L. D. Anti-inflamatory and anti-degenerative compounds, isolated from L-681,512.//J. Pharm. 1989. - 9 - pp. 221-231.

120. Семенов С.M. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов.

121. М."Агропромиздат", 1990, 360с.

122. Бибикова М.В., Селехова Г.Н., Вострое С.Н. и др. Оптимизация состава ферментационной среды для выделения продуцентов антибиотиков из микромоноспор.//Антибиотики и химиотерапия. 1981. - Т 12. - С. 899-904.

123. Государственная фармакопея СССР, Министерства здравоохранения СССР, «Медицина» Москва -1989.

124. ЧмельЯ. В., Бибикова М.В., Спиридонова H.A., Тертое В.В., КатлинскийА. В. Скрининг природных соединений с гиполипидемической активностью.//Антибиотики и химиотерапия. М. 2004. -т 49 - № 8-9 -С. 8-12.

125. Крейгер В.Г., Выборных С.Н., Баранова H.A., Егоров Н.С. Влияние ловастатина на синтез стеринов и резистентность дрожжей к полиеновым антибиотикам .//Антибиотики и химиотерапия. 1993. - N10 - С. 16-19.

126. Ландау Н.С., Баранова H.A., Крейер В.Г. и др. Действие ловастатина ингибитора синтеза стеринов на рост дрожжей.//Микробиология. - 1991. - №60 -(3) - С.479-484.

127. Ъ\Миповецкий Б.М. Клиническая липидология. Санкт- Петербург «Наука» - 2000г, 119с.

128. Park J.К., Hasumi К., Endo A. Iturine С a new cholesterol - lowering substanses from Bacillus sp. A2822.//J. Antibiot. 1995. - vol.48 - pp. 226-232.

129. Бибикова M.B., Согонов M.B., Грамматикова Н.Э., Чмель Я.В., Тертое B.B. Образование регуляторов синтеза стеролов грибными культурами//Микология и фитопатология. 2003. -т. 37 — (6) - С.83-86.

130. Weis М., Heeschen С., Glassford AJ., Cooke JP. Statins have biphasic effects on angiogenesis.//Circulation. 2002. - v. 105 - pp. 739-745.

131. Бибикова M.B., Спиридонова H.A., Согонов M.B., Чмель Я.В., Тертое В.В. Образование регуляторов синтеза стеролов грибными культурами.//«Современная микология в России». Тезисы докладов первого съезда микологов России. М. - 2002. - С.250

132. Баранова H.A., Крейер В.Г., Егоров Н.С. Рост дрожжей Rhodotorula rubra и биосинтез ими эргостерина на средах с ловастатином.//Антибиотики и химиотерапия. 1996. - №41 -(11)-С. 3-6.

133. Бибикова М.В., Грамматикова Н.Э., Тертое В.В., Пинегин Б.В., Чмель Я.В., Катлинский A.B. Отбор природных иммуносупрессоров по способности изменять уровень стеролов клетками гепатоцитов.//Антибиотики и химиотерапия М. 2003. - т. №48 - №8 -С. 3-6.

134. Бибикова M.B., Чмель Я.В., Спиридонова И.А., Катлинский A.B. Влияние ловастатина на рост и образование эргостерола культурой Tolypocladium inflatum 1 Об.//Антибиотики и химиотерапия. М. 2004. - т 49 - №4 - С. 3-6.

135. Подколют A.A., Гуревич КГ. Действие биологически активных веществ в малых дозах. М. - «КМК» - 2002. - с. 170

136. Dobrucki L. W., Kalinowski L., Dobrucki I. Т., Malinski Т. Statin stimulated nitric oxide release from endothelium//Med. Sei. Monit. - 2001. - vol.7 - № 4. - pp. 622 - 627

137. Чиель Я.В. Скрининг природных гиполипидемических соединений. Материалы конгресса. Третий московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». М. 2005.- ч. 1- С.96-99.

138. Enomoto Y., Shiomi К., Matsumoto A. et. al. Isolation of a new antibiotic oligomicin G hroduced by Streptomyces sp. WR-6150M. Antibiot. 2001. vol.54 - (3) - pp. 308-313.

139. Грамматикова Н.Э. Олигомицины, биологическое действие и новые продуценты.: Автореферат дис. канд. биол. наук. М., 2005. - 23с.

140. Laatschi Н, Kellner М., WolfG. et. al. Oligomycin F, a new immunosupressive homologue of oligomicin АУ/J. Antibiot. 1993.-vol.46-pp. 1334-1341.

141. GottoA.M. Treating hypercholesterolaemia: Looking forward.//Clin. Cardiol. 2003. - 26 -pp. 21-28.