Изучение возможности применения ловастатина для защиты растений от болезней и разработка технологии производства статинов на основе использования новых штаммов-продуцентов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.01.11, кандидат биологических наук Джавахия, Вахтанг Витальевич

• Джавахия, Вахтанг Витальевич
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Джавахия, Вахтанг Витальевич

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Использование статинов в качестве ингибиторов бпоспптеза стсрннов.

1.1.1. Физико-химическая характеристика ловаетатина п компактна.

1.1.1.1. Ловастатин и его свойства.

1.1.1.2. Компактин и его свойства.

1.1.2. История открытия и исследования статинов.

1.1.3. Стернпы и нх роль для растении, патогенов н вредителей.

1.1.3.1. Фнтостерины - растительные стсрипы.

1.1.4. Роль фнтостерннов для стерннзавнснмых организмов.

1.1.5. Продуценты статинов родов Aspergillus н Pénicillium.

1.2. Культнвированне грибов - продуцентов экономически важных вторичных метаболитов.

1.2.1. Основные способы культивирования штаммов-продуцентов.

1.2.2. Аэрация микроорганизмов.

1.2.3. Техника для проведения ферментации.

1.2.4. Вспомогательные операции.

1.2.5. Сырье для микробиологических процессов.

1.2.6. Культивирование грибов A. terreus и P. citrinum в лабораторных ферментерах.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Патогенны.

2.2. Штаммы-продуцепты статинов.

2.3. Методы изучения антивирусной активности н фунгнтокснчностн ловастатнна in vitro.

2.4. Метод нммуноферментного анализа.

2.5. Методы исследования влияния ловастатнна на развитие возбудителен сспториоза и стеблевой ржавчины па изолированных листьях растений пшешщы.

2.6. Вегетационные опыты по оценке фитотокснчностн ловастатнна на проростки пшеницы.

2.7. Методы проведения ферментацнй штаммов-продуцентов.

2.8. Методы хроматографнчсского анализа содержания ловастатнна и компактнпа в культуралыюн жидкости.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1.1. Влняипя ловастатнна на грибы фнтонатогены in vitro.

3.1.2. Влияние ловастатнна па развитие сспториоза п стеблевой ржавчины па отрезках пшеницы.

3.1.3. Изучение активности ловастатнна против вируса табачной мозаики.

3.1.4. Исследование влияния ловастатнна на устойчивость картофеля к вирусам в полевых условиях.

3.1.5. Влияние ловастатнна на развитие проростков пшеницы в вегетационных экспериментах.

3.2. Оптимизация процессов производства ловастатнна и компактнпа с использованием новых высокопродуктивных штаммов продуцентов.

3.2.1. Подбор оптимальных параметров для ферментации гриба Aspergillus terreus - продуцента ловастатнпа.

3.2.1.1. Влияние количества растворенного кислорода (рОг) на биосинтез ловастатнпа.

3.2.1.2. Влияние количественного и качественного состава питательной среды на биосинтез ловастатнпа.

3.2.1.2. Влияние количественного н качественного состава пнтателыюй среды па биосинтез ловастатнпа.

3.2.2. Подбор оптимальных параметров для ферментации гриба PenicHHum citrinum продуцента компактипа.

3.2.2.1. Влияние количества растворенного кислорода (рОг) на биосинтез компактипа.

3.2.2.2. Влияние количественного н качественного состава пнтателыюй среды на бноеннтез компактипа.

3.3. Разработка модифицированной методики очистки и выделения ловастатнпа для получения препаратов защитного свойства, нрнгодпых для использования в сельском хозяйстве.

4. ВЫВОДЫ.

5. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение возможности применения ловастатина для защиты растений от болезней и разработка технологии производства статинов на основе использования новых штаммов-продуцентов»

Актуальность проблемы. Защита растений от патогенов и вредителей является экономически значимой проблемой и важным направлением научных исследований. Преобладающими методами защиты растений до сих пор являются различные способы обработки посевов и семенного материала синтетическими пестицидами, созданными на основе химических соединений. Наряду с эффективностью защитного действия, синтетические пестициды имеют ряд недостатков.

Они являются ксенобиотками, которые загрязняют окружающую среду и сельскохозяйственную продукцию и могут представлять опасность для здоровья. Во многих случаях для достижения надежного защитного эффекта необходимо проводить многократную обработку растений и почвы пестицидами, что усиливает нежелательные последствия их применения. Использование веществ биологического происхождения, по-видимому, является более безопасным для окружающей среды методом защиты растений от патогенов и вредителей.

Другой недостаток защитных технологий, использующих синтетические пестициды - возникновение резистентных к ним форм патогенов и вредителей. Это снижает эффективность применения препаратов, вынуждает увеличивать дозы и количество обработок, что в конечном итоге приводит к потере экономической целесообразности применения пестицидов. Одним из возможных путей решения этой проблемы является поиск защитных средств «непрямого действия», то есть препаратов, не действующих непосредственно на патоген или вредитель, а воздействующих на определенные пути биосинтеза в растепии-хозяипе, частичное блокирование или изменение которых приводит к нарушениям питательной цепочки в системе растение-паразит. В качестве препаратов «непрямого действия» для ряда патогенов и вредителей, которые в процессе своего развития потребляют стероидные метаболиты растений, могли бы быть использованы ингибиторы биосинтеза стеринов в растительных тканях.

В течение последних десяти лет интенсивно изучаются вещества, относящиеся к новому поколению высокоспецифических ингибиторов биосинтеза стеринов - так называемых статинов, являющихся продуктами вторичного метаболизма у ряда грибов. Эти соединения являются лидерами продаж на мировом фармацевтическом рынке в категории препаратов снижающих уровень холестерина. Статины отличаются от вышеупомянутых фунгицидов чрезвычайно высокой специфичностью действия и способностью ингибировать фермент окси-З-метилглутарил-КоА-редуктазу (ОМГ-КоА-редуктазу), фупкциоптрующий на ранних этапах биосинтеза стеринов (Serizawa, N. and Т. Matsuoka, 1991). Фитопаразитические нематоды, насекомые и оомицеты не способны синтезировать стерипы (Метлицкий и др., 1976; Щербакова JI.A. и др. 1980; Зиновьева и др. 1989). Эти организмы получают стерины из растительных тканей, то есть, в этом смысле, они полностью зависят от стеринов, синтезируемых растениями-хозяевами. Вмешательство в биосинтез фитостеринов может приводить к нарушению жизненного цикла у данных патогенов и вредителей.

В этой связи представляется актуальным изучение действия статинов па фитопатогенные грибы, а также, на их растения-хозяева.

Типичными представителями группы статинов являются ловастатип и компактен. Это первые, полученные микробиологическим путем метаболиты, способные ингибировать биосинтез стеринов. В данной работе ловастатин и компактен выбраны в качестве объектов исследований как наиболее подходящие статины по механизмам их воздействия па метаболические пути растений, специфическим особенностям их биологической активности, физико-химическим свойствам, а также в связи с относительной доступностью их технологий производства и применения. Выбор статинов в качестве объектов исследования для изучения возможности их применения в защите сельскохозяйственных культур от патогенов, помимо способности данных веществ специфически ингибировать синтез стеринов у растений и фитопатогеппых грибов, обусловлен также отсутствием у этих соединений антибиотической активности, направленной против синтеза первичных метаболитов - белков и нуклеиновых кислот, и отсутствием, в этой связи, выраженной токсичности по отношению к теплокровным.

В работе также предпринята попытка создания простой и сравнительно дешевой схемы выделения и очистки целевого продукта ловастатина из получаемой при ферментации культуралыюй жидкости, поскольку опубликованные в научной литературе или запатентованные методы выделения и очистки статинов, рассчитанные на получение высокоочищениых медицинских препаратов, отличаются сложностью и дороговизной. Сравнительно простая и дешевая схема получения ловастатина могла бы найти применение при создании препаратов для защиты растений, поскольку в сельском хозяйстве могут быть использованы вещества с менее высокой степенью очистки, чем в фармакологии.

Цели и задачи. Основной целью исследований было изучение возможного защитного действия ловастатина против фитопатогенов. Кроме того, была поставлена цель разработать оптимальную технологическую схему ферментации для вновь полученных мутантных штаммов - продуцентов ловастатина и компактина и разработать простую и сравнительно дешевую технологическую схему выделения и очистки ловастатина.

Задачи исследований:

1. Изучение фунгитоксичности ловастатина по отношению к фитопатогенным грибам.

2. Изучение защитного действия ловастатина против возбудителей септориоза и стеблевой ржавчины пшеницы.

3. Изучение влияния ловастатина на болезни, вызываемые фитовирусами.

4. Оценка влияния ловастатина па рост и развитие растений.

5. Поиск оптимальных концентраций компонентов питательной среды для достижения максимальной продуктивности штаммов грибов - продуцентов ловастатипа и компактипа.

6. Подбор оптимальных параметров аэрации способствующих максимальной продуктивности этих штаммов.

7. Разработка простой и дешевой технологической схемы получения целевого продукта для использования в качестве средства защиты растений.

Новизна научной работы. Впервые показаны фунгицидпые свойства ловастатина против грибов Stagonospora nodorum, Magnaporthe grisea и Colletotrichum atramentarium. Впервые показана способность ловастатина блокировать биосинтез грибного меланина на его ранних этапах. Впервые показана антивирусная активность ловастатина.

Подобраны оптимальные параметры ферментации для глубинного культивирования в ферментерах вновь полученных высокопродуктивных штаммов грибов Aspergillus terreus и Pénicillium citrinum.

Разработана простая и сравнительно дешевая технологическая схема выделения и очистки ловастатина. Эти данные были включены в патент (Джавахия и др., 2005).

Практическое значение. Полученные данные по защитному действию ловастатина против патогенов растений и вредителей были подтверждены в исследовательском отделе итальянской фирмы ISARGO (Милан, Италия). Подписан договор о конфиденциальности и совместных испытаниях, планируется патентование пестицидной активности ловастатина и технологии производства ловастатипа для использования его в качестве средства защиты растений от патогенов и вредителей.

На основе данных по оптимизации процессов ферментации, выделения и очистки ловастатина был разработан лабораторно-технологический регламент производства ловастатина, на базе которого совместно с сотрудниками Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН и фирмы ООО «БИОБЭК» был разработан полупромышленный регламент на производство ловастатина. Налажено производство пробных партий ловастатина на производственной базе ООО «БИОБЭК» -Ефремовском заводе биопрепаратов (получена справка о внедрении). Разработанная технология выделения ловастатина запатентована (совместный патент с ООО «БИОБЭК»). Разработанные технологии ферментации, выделения и очистки ловастатина, прошли успешные пилотные испытания и масштабируются на фармацевтическом предприятии ОАО «Красфарма» (получена справка о внедрении).

Заключение диссертации по теме «Защита растений», Джавахия, Вахтанг Витальевич

4. ВЫВОДЫ.

1. Добавление ловастатина в питательную среду приводило к ингибированию роста in vitro грибов С. alramentarium, М. grísea и St. nodorum. Это свидетельствует о фунгитоксичности ловастатина при контактном действии.

2. При росте этих грибов на агаризованных средах, содержащих ловастатин, наблюдалось также обесцвечивание мицелия, что свидетельствует о мелапинингибирующих свойствах этого соединения. Поскольку для ряда фитопатогенных грибов показана ключевая роль поликетидного пути биосинтеза меланина в реализации их патогенных свойств, то можно предположить наличие у ловастатина и другого механизма защитного действия, а именно, фунгицида непрямого действия.

3. Обработка листьев табака ловастатипом с последующей инокуляцией ВТМ приводила к подавлению процесса некрозообразования.

4. Способность ловастатина подавлять развитие вирусной инфекции была подтверждена на примере М-вируса картофеля. Проведенные полевые опыты на картофеле, на естественном инфекционном фоне, показали, что обработка ловастатином вызывает задержку накопления антигена МВК в тканях растения.

5. Опыты по оценке влияния ловастатина на развитие возбудителей септориоза и ржавчины на листьях пшеницы показали способность ловастатина замедлять развитие этих болезней.

6. В результате проведенных опытов был показан ретардантный эффект ловастатина на растения пшеницы. Однако, минимальная эффективная защитная доза ловастатина на два порядка меньше минимальной дозы, вызывающий ретардантный эффект.

7. Путем подбора оптимальных параметров культивирования в ферментере новых мутантов гриба А. (еггеш был увеличен выход целевого продукта ловастатина с 6,2 до 9,7 г/л.

8. В результате проведенных экспериментов был оптимизирован процесс биосинтеза компактииа в ферментере. Подбор оптимальных параметров для культивирования новых мутантов гриба Р. сИгтит позволил увеличить выход целевого продукта компактииа с 6,4 до 10,2 г/л.

9. На основе полученных данных был разработан лабораторно-технологический регламент производства ловастатина, который послужил основанием при создании сотрудниками ООО «БиоБек» полупромышленного регламента на производство ловастатина.

5. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Джавахия В. В., Воинова Т. М. "Оптимизация условий культивирования гриба Aspergillus terreus - продуцента ловастатина - вещества оказывающего защитное влияние на растения". Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии. Материалы Всероссийского совещания Голицыно, 16-18 июля 2003 года, стр. 198-201.

2. Dzhavakhiya V.V., Voinova Т.М. "Optimization of fermentation conditions of culture Aspergillus terreus". 2-й Московский Международный Конгресс Биотехнология: состояние и перспективы развития, Москва 10-14 ноября 2003 года, ч. 1, стр.286.

3. Джавахия В. В., Украинцева С. П., Воинова Т. М. "Технологии получения микробиологическим путем холестерип-ипгибирующих реагентов-статинов". Сборник тезисов Международной Конференции «Наука и Бизнес: поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина.» Пущино, 10-12 марта, 2004 года, стр.235

4. Dzhavakhiya V.V., Voinova Т.М. Newly developed strains-producers of cholesterol-lowcring drugs - statins - with industrial level of productivities, Fermentation Technology for industrial production and Recovery Technologies of statins. The Proceedings for the 26th ISTC Japan Conference on Advanced Biotechnologies in Russia/CIS. Япония, Токио, 19 сентября, 2003.стр. 149-159.

5. V.V. Dzhavakhiya, Т.М. Voiniva. Optimization of Fermentation Conditions for High Lovastatin Producing Mutant 45-50 of Fungus Aspergillus terreus. In book: Biotechnology and Industry. Nova Science Publisher Inc. New York, ISBN 1-59454-116-7, 2004, pp. 81-87.

6. Джавахия В.В., Воииова Т.М., Украинцева С.Н. Изучение процесса ферментации штамма гриба PeniciUium crustosum - продуцента компактина. Сборник 2-я Международной конференции «Наука - Бизнес - Образование» Пущино, 10-13 мая 2005года, стр.71-73.

7. Джавахия В.В., Воинова Т.М., Подбор оптимальных условий для культивирования мутантов гриба Penicillium citrinum - продуцента компактина. Сборник тезисов 3-й Московского Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва 14-18 марта 2005года стр. 95

8. V.V. Dzhavakhiya Т.М. Voiniva. Development of optimal conditions for production of compactin by strain 18-12 of Penicillium citrinum in labscale fermenter. In book: Biotechnology in Biology and Medicine. Nova Science Publishers Inc. New York, ISBN: 160021-092-9, 2006, pp.285-292.

9. Патент RU 2261901 «Штамм гриба Aspergillus terreus 44-62 - продуцент ловастатина, промышленный способ выделения ловастатипа и способ лактонизации статинов» 2005. Авторы: Джавахия В.Г., Воинова Т.М., Вавилова Н.А., Санцевич Н. И., Винокурова Н. Т., Кадомцева В. М, Джавахия В. В., Мишин А. Г.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Джавахия, Вахтанг Витальевич, 2007 год

1. Аиба Ш., Хемфри А., Миллс Н. Биохимическая технология и аппаратура. М., 1975.стр. 78.

2. Аверьянов A.A., Лапикова В.П., Петелина Г.Г. Защита грибными меланинами от фотодинамического повреждения. Известия Академии Наук СССР. 1986. №4: стр. 541 -549.

3. Аверьянов А. А., Лапикова В. П., Петелина Г. Г. 1989. Повышенная чуствительность пигментных мутантов Pyricularia oryzae к токсическим выделениям листьев риса. Физиология растений, т 36, в. 6: стр. 1088 1095.

4. Билай В. И., Основы общей микологии, Высшая школа, 1989. стр. 154-166.

5. Билай В. И., Коваль Э. 3., Аспергиллы. Киев. Наук. Думка, 1988. стр. 177-179.

6. Бирюков В. В., Кантере В. М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза. М., 1985. стр. 97-114.

7. Васюкова Н. И., Платонова Т. А., Неполноценность тканей растений в качестве среды для питания паразита как одна из защитных реакций растений кфитопатогенным организмам. Биохимия иммунитета, покоя, старения растений. Москва. Наука. 1984 Гл 4.

8. Васюкова Н. И., Давыдова М. А., Озерецковская О. Л., Метлицкий Л. В., Сегаль Г. М. Микология и фитопатология. 1977. 11,6,480.

9. Васюкова Н. И., Щербакова Л. А., Чаленко Г. И., Озерецковская О. Л., Метлицкий Л. В. Прикладная биохимия и микробиология. 1978. 14, стр. 4.

10. П.Воинова Т.М., Вавилова Н.А., Терехова В.А., Деблова З.Н., Дьяков Ю.Т. Изменчивость фитопатогенного гриба Pyricularia oryzae cav. II. Характеристика морфологических мутантов гриба. Биологические науки. 1984. №1: стр. 78 82

11. Виестур У. Э., Кристапсонс М. Ж., Былинкина Е. С., Культивирование микроорганизмов, Москва, Пищевая промышленность, 1980. стр. 157-168.

12. Виестур У. Э., Кузнецов А. М., Савенков В. В., Системы ферментации. Рига: Зинатне, 1986. стр.304.

13. Гальцева Р. Д. Стерипообразовапие у дрожжевых организмов. Москва. Наука. 1980. стр.244.

14. Гальцова Р. Д., Вакина И. П., Микробиология. 1964. стр. 33, 390.

15. Дорофеев В. Л., Арзамасцев А. П., Садчикова Н. П. Проект общей фармакопейной статьи «Высокоэффективная жидкостная хроматография». Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2004. стр. 166-172.

16. Жуков Ю.Н., Вавилова Н.А., Воинова Т.М., Хурс Е.Н., Хомутов Р.М. Аминоалкилфосфинаты новые эффективные ингибиторы меланиногенеза и фунгициды. Доклады Академии Наук СССР, Биохимия, Биофизика, Молекулярная Биология. 2004. т. 398, № 5: стр. 1 - 3.

17. Каптере В. М. Учебники и учебные пособия для студентов высших учебных заведений М. Теоретические основы технологии микробиологических производств. Агропромиздат, 1990.-271с.

18. Лапикова В. П. и Джавахия В.Г. Ранние стадии развития Pyricularia oryzae Cav. на листьях риса. Микология и фитопатология. 1987. 21, 4: стр. 358 365.

19. Лутова Л. А., Ходжайова Л.Т. "Молекулярно-генетические аспекты устойчивости высших растений к вредителям сельского хозяйства", Генетика,1998, том 34, №6, стр. 719-729.

20. Межиня Г. Р., Кристапсопс М. Ж., Управляемее получение инокулята при глубинном культивировании микроорганизмов. М.,: ОНТИТЭИ микробиопром, 1977. стр. 42.

21. Матвеев В. Е. Научные основы микробиологической технологии. Кинетика развития и инактивации микробных популяций, асептика, масштабирование. -М., Агропромиздат, 1985. стр. 224.

22. Матвеев В. Е., Смирнов Е. В. Термическая стерилизация растворов Сахаров. М., ОНТИТЭИ микробиопром, 1976. стр. 64.

23. Метлицкий JI. В., Озерецковская О. Л., Васюкова Н. И. Фитостерины и их роль во взаимоотношениях растений с паразитарными грибами (на примере грибов Pythiaceae). Успехи современной биологии. 1980. Т.89. стр. 28-41.

24. Метлицкий JI. В., Озерецковская О. Л., Васюкова Н. И., Давыдова М. А., Сегаль Г. М. Роль стеринов во взаимоотношениях картофеля и Phylophlora infeslans. Доклады АН СССР, 1976. 21в, № 1, 244.

25. Озерецковская О. Д., Ильинская Л. И., Васюкова И. И. Механизмы индуцирования элиситорами системной устойчивости растений к болезням. Физиология растений. 1994. стр. 103-107.

26. Озерецковская О.Л. Клеточные и молекулярные механизмы иммунитета картофеля. Генная и клеточная инженерия М: Наука, 1990. стр. 46-52.

27. Пасешниченко В. А. Биосинтез и биологическая активность растительных терпеноидов и стероидов // Итоги пауки и техники. Сер. Биохимия. М., 1987. стр. 187-188.

28. Печуркин Н.С., Тресков И. А. Анализ кинетики роста и эволюции микробных популяций (в управляемых условиях). Новосибирск, 1975. стр. 88-94.

29. Платонова Т. А, Васюкова Н. И., Давыдова М. А. Прикладная биохимия и микробиология. 1977.13, 6, 907.

30. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М., 1978. стр. 321-318.

31. Работнова И. Л., Позмогова И. Н. Хемостатное культивирование и ингибирование роста микроорганизмов. М., 1979. стр. 231-232.

32. Работнова И. Л. Теория и практика непрерывного культивирования. М., 1980. стр. 69-73.

33. Тарлаковский С.А. Стерины: их метаболизм, функции и роль во взаимоотношениях растений с вредными организмами // Биохимические аспекты проблем защиты растений от болезней, вредителей и сорняков: Тр. ВИЗ Ра. 1977. стр. 156-169.

34. Хефтман Э., Биохимия стероидов, Москва. 1972. стр. 44.

35. Ходжайова J1.T., Левашина Е.А., Усольцева М.Ю., Бондаренко Л.В., Лутова Л.А. "Изменение содержания растительных стеринов как биологической борьбы с фитостерин-зависимыми организмами." Генная инженеприя и экология, 2000, №1 стр. 124-128.

36. Физер Л., Физер М., Стероиды, Москва. 1964. стр. 137-144.

37. Федосеев К. Г. Физические основы и аппаратура микробиого синтеза биологически активных соединений. М., 1977. стр. 304.

38. Abid АН Khan М.М., D.C. Jain, R.S. Bhakuni, Mohd Zaim and R.S. Thakur. 1991. Occurrence of some antiviral sterols in Artemisia annua. Plant Science, 75:161 165.

39. Althshul, R., A. Hoffer and J.D. Stephen. 1955. Influence of nicotinic acid on serum cholesterol in man. Archive of Biochemistry and Biophysics, 54: 558 559pp.

40. Benveniste P., Rahier A. Target Sites of Sterol Biosynthesis Inhibitors on Plants. Target Sites of Fungicidal Action. Ed. Koller W. D. London CRC Press, 1991.

41. Buckland. B.C., H. Fasten, K. Gbewonyo. G. Hunt and D. Jain. 1985. Fermentation exhaust gas analysis using mass spectrometry. Bio/Technology. 1985. 3: 92-98 pp.

42. Buckland B.C. The translation of scale in fermentation processes: the impact of computer process control. Biotechnology 1984. 2: 875 893.

43. Bean G. A. Phytosterols, «Advances in Lipid Research», 1973, v. II.

44. Child J. J., Defago G., Haskins R. H. Canada. Microbiology. 1969. 15, 599p.

45. Calam C. T. Secondary metabolism as an expression of microbial growth and development. Folia Microbiology. 1979. 24:276-85 pp.

46. Endo, A. The discovery and development of IlMG-CoA reductase inhibitors. Lipid Res. 1978.33: 1569-1582 pp.

47. Endo, A., M. Kuroda and Y. Tsujila. ML-236A, M1.-236B and MI.-236C, New inhibitors of cholesterogenesis produced by Pinicillium citrinum. J. Anlibiot. 1976. 29: 1346 -1348.

48. Endo A., N. Kitano and S. Fuji. Effects of ML-236B, a competitive inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, on cholesterol metabolism. Advances of Experimental and Medical Biology. 1978. 109: 376p.

49. Endo A. Mevinolin a new hypocholesterolemic agent, produced by a Monascus species. J. Antibiotics. 1979. 32: 852 854 pp.

50. Endo A. and M. Kuroda. Citrinin, an inhibitor of cholesterol synthesis. Journal of Antibiotics (Japan) 1976. 29: 841-843pp.

51. Endo A., Kuroda M. and Tanawn K. Competitive inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase by ML-236A and ML-236B fungal metabolites having hypocholesterolemic activity. FHBS Lett. 1976. 72: 323-326pp.

52. Elliot C. G., Hendrix M. R„ Knights B. A., Parker W. Nature. 1964. 203-427pp.

53. Hasie-wood G. A. Steroids in organisms, «Annals of the New York Academy of Sciences», 1960, v. 90, p. 877;

54. Hendrix J., W., Mycologia. 1970. 58, 307p.

55. Heftmann E., Biochemistry of plant steroids, «Annual Review of Plant Physiology», 1963, v. 14; Bean G. A., Phytosterols, «Advances in Lipid Research», 1973, v. 11.

56. Hollander W. and Chobanian A. Effect of an inhibitor of cholesterol biosynthesis, triparanol (MER-29) in subjects with and without coronary artery diseases. Boston Medicine Quarter. 1959. 10 : 37-44

57. Gbewonyo K., Hunt G., Buckland B. Interactions of cell morphology and transport process in the lovastatin fermentation. Biopress Engineering. Rahway, USA, 8 (1992) 1-7 pp.

58. Goldfarb S., H.C. Pitot. Improved assay of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Journal of Lipid Research. 1971. 12:512- 515pp.

59. Goldsmith G. A., Hamilton J.G. and Miller O.N. 1960. Lowering of serum lipid concentrations. Mechanisms used by unsaturated fats, nicotinic acid and neomycin: excretion of sterols and bile acids. Archives of International Medicine, 105: 512 -517pp.

60. Jain D.C., M.M. Abid Ali Khan, Mohd. Zaim and R.S. Thakur. 1990. Antiviral evaluations of some steroids and their glycosides of medicinal plant origin: A new report. National Academy of Sciences Letters. 13: 41 -42.

61. Lai LST, Kuo CM, Tsai SY, Influence of increased dissolved oxygen tensions by agitation on the secondary metabolite production by a mutant Aspergillus terreus in a 5L fermenter. J Chin Inst Chem Eng. 2001; 32: 42-135pp.

62. Maxwell. M. C. Principles of fermentation technology. Bergamo International Library of Science, Technology, Engineering and social Studies. 1992. 172-185p.

63. Novak N., Gerdin S., Berovic M., Increased lovastatin formation by Aspergillus terreus using repeated fed-batch process. Biotechnology. 1997. 19: 947p.

64. Kato T. Sterol Biosynthesis in Fungi, a Target for Broad Spectrum Fungicides // Sterol Biosynthesis Inhibitors and Anti-Feeding Compounds. 1. Chemistry of Plant Protection Berlin, 1986. 288-312 pp.

65. Koller W. Antifungal Agents with Target Sites in Ste-rols. Function and Biosynthesis. Target Sites of Fungicide Action/Ed. Koiler W. London: CRC Press, 1991. 70-82 pp.

66. Kubo Y., Suzuki K., Furusawa I., Ishida N. and Yamamoto M. Relation of appressorium pigmentation and penetration of nitrocellulose membranes by Colletotrichum lagenarium. Phytopathology. 1982. 72: 498 501pp.

67. Kubo Y., Suzuki K., Furusawa I. and Yamamoto M. Effect of tricyclazole on appressorial pigmentation and penetration from appressoria of Colletotrichum lagenarium. Phytopathology. 1982. 72: 1198 1200pp.

68. Kubo Y., Furusawa I. and Yamamoto M. Regulation of melanin biosynthesis during appressorium formation in Colletotrichum lagenarium. Experimental Mycology. 1984. 8: 364-369pp.

69. Kysilka R. Determination of lovastatin (mevinolin) and mevinolinic acid in fermentation liquid. Chromatograph. 1993. 415p.

70. Laughlin R. C. and T. F. Carey. Cataracts in patients treated with triparanol. The Journal of American Medical association. 1962. 181: 339-340pp.

71. Long-Shan T. Lai, Chen-Chang Pan, Bo-Kun Tzeng. The influence of medium design on lovastatin production and pellet formation with a high producing mutant of Aspergillus terreus in submerged cultures. Process Biochemistry 00 (2003) 1-10 pp.

72. Manzoni M., Rollini R., Bergomi S, Cavazzoni C. Production and purification of statins form Aspergillus terreus strains. Biotechnology Techniques, 1998, 529-532 pp.

73. Matsuoka, T. S. Miyakoshi, K. Tanzawa, K. Nakahara, M. Hosobuchi & N. Serizawa: Purification and characterization of cytochrome P-450 from Streptomyces carbophilus. Biochemistry. 1989. 184: 707-713 pp.

74. Michniewicz, Kamienska. Naturwissenschaften. 1965. 52, 623p.

75. Metz B., Kossen N., The growth of molds in the form of pellets a literature review. Biotechnology Bioengineering. 1983. 781-797pp.

76. Pollak O.J. Reduction of blood cholesterol in man ccirculation. Archives of International Medicine, 1953. 7: 702 706pp.

77. Kobayashi T., Moo-Yong M., Oxygen transfer into mycelia pellets. Biotechnology Bioengineering. 1973. 15: 27-45pp.

78. Keys A. Seven Countries: A Multivariate Analysis of Death and Coronary Heart Disease. Harvard University Press, Cambridge, MA. 1980. 381 p.

79. Raper J. R., Amer J., Botanic. 1940. 26: 639p.

80. Serizawa N., Nakagawa K., Tsujita Y., Terahara A. and Kuwano H. 3a-hydroxy-ML-236B (3a-hydrocompactin) microbial transformation product of ML-236B (compactin). J. Antibiotic. 1983. 36:608-610 pp.

81. Serizawa N., Nakagawa K., Furava K., Okazaki T. and Terahara A. Microbial hydroxylation ofML-236B (compactin): Studies on microorganisms capable of 3B-hydroxylation of ML-236B. J. Antibiot.1983. 36: 887-871 pp.

82. Svoboda I., Feldlaufter M. Neutral Sterol Metabolism in Insects Lipids. 1991. 26: 614618 pp.

83. Smedley McLean. J. Biochemistry. 1922. 16: 370p.

84. Starr P., Roen P., Freibrun J.L. Reduction of serum cholesterol by sodium D-thyroxin. Archives of International Medicine, 1960. 105: 830-842pp.

85. Shlosser E., Gottieb D. Bacteriology. 1966. 91: 1080- 1968 pp.

86. Siperstein M.D. Regulation of cholesterol biosynthesis in normal and malignant tissues. Current Topics of Cellular Regulations. 1970. 2: 65 100pp.

87. Siperstein M.D. and V.M. Fagan. Feedback control of mevalonate synthesis by dietary cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 1966. 241: 602-609pp.

88. Tanazawa K., M. Kuroda and A. Endo. Time-dependent, irreversible inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase by citrinin. Biochimica et Biophysica. 1977.488 : 97 101.

89. Taupitz A. and K. Otaguro. The effects of estrogens on the serum cholesterol of male rats. Symposium der Deutschen Gesellschaft fur Endokrinologie, 1959. 430 432pp.

90. Takahashi J., Yamada K., Studies on the effects of some physical conditions on the submerged mold culture. Agricultural Chemistry. 1980/ 100-103pp.

91. Thom C., Raper K. B., A manual of Aspergilli. London: Bailliere Tindal, Cox, 1945-373 p.

92. Thorm C., Church M. B., The Aspergilli. Baltimore: Williams, Wikins, 1925, -272 p.

93. Thorp J.M. and W.S. Warning. 1962. Modification of metabolism and distribution of lipids by ethyl chlorophenoxyisobutyrate. Nature, 194: 194: 948 -949pp.

94. Tennet, D.M., Siegel, M. E., Zanetti G. W., Kuron W. H., and Waif F.J. Plasma cholesterol lowering action of binding polymers in experimental animals. Journal of Lipid Researches. 1960 1:469-473pp.

95. Tennet, D.M., Siegel, M. E., Zanetti G. W„ Kuron W. H., and Waif F.J. Plasma cholesterol lowering action of binding polymers in experimental animals. Journal of Lipid Researches. 1960 1:469 473pp.

96. Venken M., Asard H., Geuns J. Senescence of oat leaves: changes in the three sterol composition and enzyme activities of the membrane. Plant science. 1991. 79. 3-11pp.

97. Whitaker A., Long P., Fungal pelleting. Process Biochemistry 11. 1988. 27-31pp.

98. Yano T., Kodama T., Yamada K., Fundamental studies on the aerobic fermentation. Part 7. Oxygen transfer within a mold pellet. Agriculture. Biology. Chemistry. 1961.580pp.