Гидроксилирование 3-кетостероидов прегнанового и андростанового ряда мицелиальными грибами Curvularia lunata и Gongronella butleri тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Коллеров, Вячеслав Владимирович

• Коллеров, Вячеслав Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Коллеров, Вячеслав Владимирович

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Микробиологическое гидроксилирование стероидов 11 андростанового и прегнанового ряда

2.1.1. Распространенность 3-кетостероид-11р-гидроксилазной активности 11 среди микроорганизмов

2.1.2. Свойства 11 р-гидроксилазы

2.1.3. Механизм действия цитохром-Р-450-монооксигеназы

2.2. Проявление субстратной специфичности при микробиологическом 19 гидроксилировании 3-кетостероидов

2.3. Влияние условий культивирования на морфо-физиологические 21 особенности мицелиальных грибов

2.4. Особенности протопластировання и мутагенеза мицелиальных 23 грибов

2.5. Гидроксилирование стероидных соединений растущим и отмытым 27 мицелием

2.6. Биоконверсия стероидных субстратов

2.6.1. Конверсия стероидных субстратов в микрокристаллической форме

2.6.2. Использование органических растворителей

2.6.3. Использование циклодекстринов и их производных

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1.1. Реактивы

3.1.2. Культивирование Curvularia lunata ВКМ F

3.1.3. Культивирование Gongronella butleri ВКМ F

3.1.4. Получение внутриклеточных фракций дезинтегрированного 35 мицелия С. lunata и G. butleri

3.1.5. Протопластирование С. lunata

3.1.6. Мутагенез С. lunata

3.1.7. Трансформация стероидных субстратов С. lunata и G. butleri

3.1.8. Световая и электронная микроскопия

3.1.9. Аналитические методы

3.1.9.1. ТСХ

3.1.9.2. Колоночная хроматография

3.1.9.3. ВЭЖХ

3.1.9.4. Масс-спектрометрический анализ

3.1.9.5. Спектры ЯМР !Н

3.1.9.6. Определение концентрации белка

3.1.9.7. Определение растворимости стероидов

3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.2.1. Скрининг мицелиальных грибов на наличие 1 ф-гидроксилазной 41 активности в отношении ФМ-ДКА

3.2.2. Трансформация ФМ-ДКА культурами С. lunata и G. butleri 44 3.2.2.1. Анализ продуктов трансформации ФМ-ДКА

3.2.3. Влияние условий трансформации на 11 р-гидроксилазную 53 активность отмытого мицелия С. lunata при конверсии ФМ-ДКА

3.2.3.1. Особенности процесса 1 lp-гидроксилирования ФМ-ДКА в 53 присутствии циклодекстрина, метанола и феназпн метасульфата

3.2.3.2. Влияние индукторов на 11 p-гидроксилазную активность С. lunata

3.2.4. Определение локализации стероидтрансформирующих ферментов

С. lunata и G. butleri

3.2.5. Оптимизация процесса трансформации ФМ-ДКА культурой G. 69 butleri

3.2.5.1. Выбор состава питательной среды для выращивания мицелия G. 70 butleri

3.2.5.2. Влияние различных способов внесения субстрата ФМ-ДКА в среду 72 трансформации на степень его биоеконверсии и выход 110-гидроксипроизводных

3.2.5.3. Зависимость проявления 1 lp-гидроксилазной активности G. butleri 76 в отношении ФМ-ДКА от количества биомассы мицелия

3.2.6. Гидроксилирование стероидов андростанового ряда культурами С. 79 lunata и G. butleri

3.2.6.1. Трансформация АД, АДД и 9а-ОН АД культурой G. butleri

3.2.6.2. Трансформация АД, АДД и 9а-ОН АД культурой С. lunata

3.2.7. Биоконверсия кортексолона и его ацетилированных производных культурой С. lunata

3.2.8. Биоконверсия кортексолона и его ацетилированных производных культурой G. butleri

3.2.9. Протопластирование С. lunata и получение мутантных штаммов с 97 повышенной 11 p-гидроксилазной активностью

3.2.10. Оптимизация процесса трансформации 17,21-диацетата- 106 кортексолона мутантным штаммом С. lunata М

4. ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Гидроксилирование 3-кетостероидов прегнанового и андростанового ряда мицелиальными грибами Curvularia lunata и Gongronella butleri»

Актуальность проблемы.

Высокая физиологическая активность гидрокснлированных 3-кстостероидов обусловливает их широкое использование в терапии многих заболеваний. Наличие гидроксильной группы в позиции 11 р определяет противовоспалительный и антиаллергенный эффект стероидов прегнанового ряда. Такие гидроксистероиды применяют при лечении заболеваний в онкологии, дерматологии, ревматологии, пульманологии и других областях медицины (Femandes et al.2003; Mahato and Garai, 1997; Jiradej et al., 1999). Гидроксилированные в 14а-положении андростаны являются важными интермедиатами синтеза высокоактивных гестагенов (Шувалова с соавт. 2001; Ядерец с соавт., 2009). Известна ингибиторная активность ряда гидроксипроизводных андростанов в отношении тирозиназы и эндопептидазы (Choudhary et al., 2004).

Химический синтез стероидных соединений весьма сложен, например, химический синтез кортизона и гидрокортизона включает более 30 стадий и идет с малым выходом. Одним из наиболее сложных этапов такого синтеза является введение гидроксильной группы в 11-е положение (Vitas et al., 1995). Заместить многостадийный химический синтез одной стадией биоконверсии на практике позволяет осуществление 11 p-гидроксилировання микроорганизмами, что является экономически выгодным для производства биоактивных кортикостероидов (Herbert and Holland, 1999).

Важной проблемой остается усиление противовоспалительной активности гидрокснлированных стероидов и устранение глюкокортикоидной, вызывающей нежелательные побочные явления (Thalen et al., 1998). Решение этого вопроса связано с модификацией структуры стероидов, что обычно приводит к улучшению их терапевтических свойств по сравнению с немодифицированными аналогами (Машковский, 1997, Thalen et al., 1998). Известно, что введение в молекулу заместителей (фтор-, метил-, ацетил-, гидроксил) или двойных связей существенным образом влияет на физико-химические свойства и реакционную активность стероида в отношении ферментных систем микроорганизмов и может изменять положение введения гидроксильной группы. Между тем, сведения о микробиологическом гидроксилировании замещенных производных дезоксикортикостерона и кортексолона весьма ограничены.

Основной проблемой практической реализации процессов микробиологического гидроксилирования 3-кетостероидов является низкая селективность, образование нежелательных примесных стероидов, осложняющее процедуры очистки и снижающее общую эффективность биотехнологических способов. Эта ситуация диктует 5 необходимость поиска новых продуцентов, обладающих стерео- и региоспецифичной гидроксилазной активностью. Выбор эффективного биокатализатора и оптимальных условий биоконверсии может приводить к высоким показателям биологических процессов (Fernandes, et al., 2003).

Таким образом, актуальным является поиск и изучение свойств штаммов, обладающих стероидгидроксилирующей активностью, а также разработка методов повышения селективности процессов гидроксилирования 3-кетостероидов андростанового и прегнанового ряда.

Состояние вопроса.

Со времени открытия в 50-х годах 11 а-гидроксилирования прогестерона культурой Rhizopus orchidis описаны реакции микробиологического гидроксилирования стероидов в различных положениях: 11 (а и Р), 7 (а н (3), б (а и Р), 9 (а), 14 (а и р), 15 (а и р) (Herbert and Holland, 1999, Choudhary et al., 2004; Турута с соавт., 1992).

В настоящее время микробиологическое 1 ip-гидроксилирование кортексолона и его производных является наиболее приемлемым способом получения гидрокортизона, поскольку химические способы проведения данной реакции крайне неэффективны. Описаны различные подходы, направленные на увеличение выхода lip-гидроксипроизводных (Суходольская с соавт., 1996; Abdel-Salam, 2004; Manosroi ct al., 2008; Lu et al., 2007; Fromming and Szejtli, 1994; Wilmanska et al. 1992, Rozman et al. 1992, Vlahov et al. 1981, Paraszkiewicz et al. 1992, Wang et al. 2001, Zhang et al. 2004, Ядерец с соавт., 2007), однако значительного прогресса в разработке биотехнологических способов получения гидрокортизона и его производных не наблюдается. Основной причиной этого является низкая селективность биопроцессов, приводящая к образованию целого ряда побочных соединений.

Многочисленные исследования привели к образованию двух основных путей получения гидрокортизона: 1) прямая биоконверсия кортексолона (вещества S Рейхштепна) или его ацетилированных производных до гидрокортизона дейтеромицетом Curvularia lunata (или его телеоморфом - Cochliobolus hmatas), сопровождающаяся нежелательным образованием побочных 14а- и 7а -гидроксистероидов; 2) биоконверсия кортексолона или его 21-ацетата культурой Aspergillus ochraceus с образованием смеси lip- и 11а -производных, с последующим разделением изомеров и химическим преобразованием 11 а-гидроксипроизводного в 1 ip-гидроксистероид (несколько химических стадий с использованием токсичных химических реагентов).

Доказано, что 1 ip-гидроксилпрование катализируется ферментами надсемейства цитохром-Р-450 (CYP) с близкими свойствами (Nelson et al., 1996; Suzuki et al., 1993; Herbert and Holland, 1999). У млекопитающих, напротив, различные семейства CYP связаны со стероидным биосинтезом. Свойства стероид-1 ip-гидроксилазы низших эукариот исследованы на примере штаммов Curvularia lunata NRRL 2380 и Cochliobolus lunatus m 118, показана также её микросомальная локализация (Suzuki et al., 1993; Zakelj-Mavric et al., 1990). Сообщалось о переносе биосинтетического пути синтеза гидрокортизона высшими эукариотами в низшие эукариоты: 13 генов высших эукариот были экспрессированы в Saccharomyces cerevisiae (Szczebara et al., 2003). Однако крайне низкая продуктивность полученного рекомбинантного штамма явилась серьезным препятствием для практической реализации предложенного метода. Попытки создания эффективных мутантных штаммов с 1 ip-гидроксилазной активностью также не привели к серьезному повышению продуктивности и селективности 1 ip-гидроксилирования (Lu et al., 2007; Wilmanska et al., 1992).

Данные о 1 ip-гидроксилировании фторзамещенных, метилированных и ацетилированных стероидов прегнанового ряда культурами Curvularia lunata {Cochliobolus lunatus) крайне ограничены. Сведений о возможности осуществления реакции грибами рода Gongronella в доступной литературе не обнаружено.

Известно, что С. lunata гидроксилнрует андростендион преимущественно в положение 14а с образованием ряда побочных соединений (Шувалова с соавт., 2001; Войшвилло с соавт., 2004; Choudhary et al., 2004). Однако в литературе отсутствовала информация по гидроксилированию других стероидов андростанового ряда (андростадиендиона, 9а-гидроксиандростендиона и др.).

Ранее в нашей лаборатории в результате широкого скрининга мицелиальных грибов были отобраны штаммы, проявляющие 7а-гидроксилазную активность в отношении ЗР-гидрокси-андроста-5-ен-3,17-диона (дегидроэпиандростерона, ДГЭА) (Lobastova et al., 2007). Однако возможности использования этих культур для гидроксилирования 3-кетостероидов андростанового и прегнанового ряда не были оценены. Между тем, известно, что позиция введения гидроксильной группы мицелиальными грибами может изменяться в зависимости от структуры субстрата.

В связи с этим, целесообразной представлялась оценка стероидтрансформирующей активности в отношении ряда производных 3-оксопрегнанов и андростанов у штаммов, осуществляющих 7а-гидроксилирование ДГЭА, и сравнительное исследование особенностей гидроксилирования стероидов наиболее активным штаммом в сравнении с Curvularia lunata ВКМ F-644.

Биоконверсия стероидов осложнена их низкой растворимостью в водных средах. Так, растворимость кортексолона составляет 150-200 мг/л, растворимость его ацетилированных форм - в несколько раз ниже. В целях повышения общей производительности биотехнологических процессов гидроксилирования предложены различные способы внесения гидрофобного стероидного субстрата в водные среды, в том числе основанные на использовании органических растворителей, детергентов, циклодекстринов (Кощеенко с соавт., 1981;Santhanam and Shreve, 1994; Herbert and Holland, 1999; Ядерец с соавт., 2007; Abdel-Salam, 2004; Lu et al., 2007; Manosroi et al., 2008). С учетом этого было необходимо разработать и оптимизировать методы, обеспечивающие максимальный контакт стероидных субстратов с мицелием культур, в том числе подбор условий, обеспечивающих рост мицелия в виде мелких глобул и способов микронизации стероидов.

Цель и задачи работы.

Целью работы являлось изучение процессов гидроксилирования 3-кетостероидов прегнанового и андростанового ряда культурами Curvularia lunata и Gongronella butleri и разработка способов получения 11 Р-гидроксипроизводных.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) оценить возможности 11 р-гидроксилирования 21-ацетата 6а-фтор-16а-метил-дезоксикортикостерона (ФМ-ДКА) мицелиальными грибами различной таксономической принадлежности и выявить наиболее активные штаммы;

2) изучить в сравнительном аспекте пути биоконверсии 21-ацетата 6а-фтор-16а-метил-дезокспкортикостерона (ФМ-ДКА) культурами Curvularia lunata и Gongronella butleri;

3) определить внутриклеточную локализацию гидроксилазной и стероидэстеразной активностей С. lunata и G. butleri;

4) исследовать особенности биоконверсии андростендиона и его 1(2)-дсгидро и 9а-гидроксипроизводных культурами С. lunata и G. butleri;

5) разработать эффективные методы получения 11 Р-гидроксипроизводных из ФМ-ДКА и 17а,21-диацетата кортексолона.

Научная новизна работы.

Определена биокаталитическая активность более 100 штаммов 31 рода мицелиальных грибов в отношении 21-ацетата 6а-фтор-16а-метил-дезоксикортикостерона (ФМ-ДКА) и производных кортексолона. Способность к lip-гидроксилированню установлена для представителей родов Curvularia, Cunninghamella,

Absidia, Trichothecium, для представителей родов Gongronella, Colletotrichum, Scopulariopsis и Epicoccum данная активность обнаружена впервые.

Выявлены особенности трансформации 21-ацетата 6а-фтор-16а-метил-дезоксикортикостерона культурами С. liinata ВКМ F-644 и G. butleri ВКМ F-1033, выделены и идентифицированы основные продукты и интермедиаты. Впервые установлен конститутивный характер и мембраносвязанная локализация стероид-lip-гидроксилирующей активности у G. butleri. Показано, что стероидные эстеразы обеих культур имеют конститутивный характер, присутствуют в мембраносвязанной и растворимой формах. Установлено, что гидроксилирование ацетатной формы стероидного субстрата культурой С. lunata предваряется дезацетнлированием. Впервые показана возможность 1 ip-гидроксилирования ацетатной формы фторметилдезоксикортикостерона культурой G. butleri, а также особенность гидроксилирования андростендиона, его 1(2)-дегидро и 9-альфа-гидроксипроизводных культурой G. butleri.

Практическая значимость работы.

Результаты, полученные в работе, явились основой новых биотехнологических методов получения ценных стероидных соединений. Разработан не имеющий аналогов метод получения 6а-фтор-16а-метил-11р-гидроксикортикостерона на основе трансформации 21-ацетата 6а-фтор-16а-метил-дезоксикортикостерона культурой G. butleri. Метод обеспечивает мольный выход кристаллического целевого стероида не ниже 44% при высокой (8 г/л) нагрузке субстрата. Предложен способ получения гидрокортизона из 17а,21-диацетата кортексолона с использованием мутантного штамма Curvularia lunata М4 и выходом lip-гидрокснпроизводных более 75% при нагрузке субстрата 3-4 г/л. Полученные в работе штаммы и разработанные с их использованием биотехнологические методы могут быть применены при производстве современных гидроксистероидов с ценными терапевтическими свойствами. Результаты исследований по локализации стероидтрансформирующих активностей культур G. butleri и С. lunata имеют большое значение для решения вопросов, связанных с возможностью управления реакциями микробиологического гидроксилирования стероидов. Изучение процессов биоконверсии замещенных стероидов андростанового ряда исследуемыми культурами расширило представление о метаболизме стероидов мицелиальными грибами и позволило получить продукты трансформации, которые могут быть использованы для производства высокоактивных фармакологических стероидных препаратов.

Разработаны оригинальные процедуры протопластирования, мутагенеза и селекции грибной культуры С. lunata, позволившие получить кетоконазолустойчивые мутантные штаммы с высокой lip-гидроксилазной п 20-редуктазной активностью. Методы могут быть использованы для получения мутантных штаммов других мицелиальных грибов с целевой стероидтрансформирующей активностью.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: на 9-й и 10-ой Пущинских конференциях молодых ученых (2005, 2006 г.г.), на 2-ой и 3-й международных конференциях « Наука. Бизнес. Образование » (Пущино, 2005, 2006 г.г.), па 8-ом международном семинаре-презентации инновационных проектов и научно-практической конференции «Биотехнология-2005» (Пущино, 2005 г.), на второй международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии, (Москва, 2006 г.), на ежегодных конкурсах научных работ ИБФМ РАН (2004-2008 г.г.). Основные положения диссертации были представлены па совместном семинаре Лаборатории микробиологической трансформации органических соединений и Лаборатории энзиматической деградации органических соединений.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них 1 статья и 8 тезисов.

Структура и объём диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа содержит 131 страницу машинописного текста, 32 таблицы и 37 рисунков. Библиография включает 148 наименований, из них 129 иностранных работ.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Коллеров, Вячеслав Владимирович

4. ВЫВОДЫ

1. Впервые установлена способность 23 штаммов мицелиальных грибов различного таксономического положения к осуществлению 11 Р-гидроксилирования 21-ацетата 6а-фтор-1 ба-метил-дезоксикортикостерона. Максимальная активность выявлена у представителей родов Curvularia и Gongronella.

2. Впервые исследованы реакции трансформации 21-ацетата 6а-фтор-1 ба-метил-дезоксикортикостерона культурами С. lunata ВКМ F-644 и G. butleri ВКМ F-1033, выделены и идентифицированы основные продукты биоконверсии. Показано, что начальным этапом конверсии данного субстрата культурой С.lunata является дезацетилирование с последующим введением гидроксильных групп в положения lip, 9а и 14а и образованием соответствующих дезацетилировапных моногидроксилированных производных. В отличие от этого, штамм G. butleri осуществляет гидроксилирование ацетатной формы субстрата с образованием в качестве основного продукта 21-ацетата 6а-фтор-1ба-метил-11 (З-гидроксикортикостерона.

3. Установлена конститутивная природа и мембраносвязанная локализация стероид-1 ip-гидроксилирующей активности у G. butleri. Подтверждены индуцибельность и микросомальная локализация 11 р-гидроксилазы С. lunata. Показано, что стероидные эстеразы обеих культур имеют конститутивный характер, присутствуют в мембраносвязанной и растворимой формах.

4. Впервые изучены особенности гидроксилирования стероидов андростанового ряда культурой G. butleri. Установлено, что наличие в структуре субстрата дополнительной двойной 1(2)-связи и 9а-гидроксигруппы способствует преимущественному образованию 14а-гидроксипроизводных.

5. Полученные результаты явились основой новых способов синтеза ценных стероидных соединений. Разработан не имеющий аналогов метод получения 6а-фтор- Заметил- 11 Р-гидроксикортикостерона на основе трансформации 21-ацетата 6а-фтор-16а-метил-дезоксикортикостерона культурой G. butleri. Метод обеспечивает мольный выход кристаллического целевого стероида не ниже 44% при высокой (8 г/л) нагрузке субстрата. Предложен способ получения гидрокортизона из 17,21-диацетата кортексолона с использованием мутантного штамма Curvularia lunata М4. Способ обеспечивает выход 1 ip-гидроксипроизводных более 75% при нагрузке субстрата 3 г/л. Полученные в работе штаммы и разработанные с их использованием биотехнологические методы могут быть применены при производстве современных гидроксистероидов терапевтическими свойствами.

2.7. Заключение

Таким образом, анализ литературных данных свидетельствует о том, что изучение процессов микробиологического гидроксилирования стероидов является актуальной задачей современной биотехнологии в области создания эффективных способов получения физиологически активных стероидных соединений, химический синтез которых крайне сложен. Показано, что гидроксилирующей активностью в отношении стероидов андростанового и прегнанового ряда обладают мицелиальные грибы различной таксономической принадлежности. Один из самых распространенных видов биоконверсии стероидов - микробиологическое 11 Р-гидроксилирование изучено на примере трансформации кортексолона в гидрокортизон культурой гриба Curvularia lunata, исследованы свойства и механизм действия 11 p-гидроксилазы. Процессы гидроксилирования стероидов андростанового ряда изучены преимущественно на примерах трансформации андростендиона, тестостерона и их производных. Показано, что структурная модификация стероидного ядра путем введения различных функциональных заместителей является удобным инструментом для регуляции стереои региоспецифичности процессов гидроксилирования. Описаны примеры по влиянию условий культивирования на морфо-физиологические особенности мицелиальных грибов, исследованы процессы гидроксилирования стероидных соединений растущим и отмытым мицелием, а также различные способы внесения стероидных субстратов на стадию биоконверсии. Из данных литературы становится очевидным, что биоконверсия стероидов осложнена их низкой растворимостью в водных средах. Данные о гидроксилировании замещенных кортикостероидов с улучшенными терапевтическими свойствами ограничены. Возможность эффективной конверсии замещенных стероидов при высоких нагрузках субстрата не была исследована.

В этой связи представляет практический интерес изучение процесса 11|3-гидроксилирования ацетилированных производных кортексолона и фторметилдезоксикортикостерона, особенностей гидроксилирования АД, его 1(2)-дегидро и 9-альфа-гидроксипроизводных, а также разработка биотехнологического метода получения 1 ip-гидроксипроизводных из ацетатов кортексолона и фторметилдезоксикортикостерона.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1.1. Реактивы

В работе использовали следующие реактивы: кортексолон (прегн-4-ен-17а,21-диол-3,20-дион), гидрокортизон (11р,17а.21-тригидроксипрегн-4-ен-3,20-диои), преднизолон (11р,17а,21-тригидроксипрегна-1,4-диен-3,20-дион), дегидроэпиандросте-рон (андрост-5-ен-Зр-ол-17-он), 19-нортестостерон (19-пор-андрост-4-ен-17р-ол-3-он), прогестерон (прегн-4-ен-3.20-дион), гидроксиметилпрогестерон (20-гидроксиметил-прсгн-4-ен-З-он) фирмы «Sigma» (США), кортексолон (прегн-4-ен-17а,21-диол-3,20-дион), его 17а- и 21-мопоацетаты и 17а,21-днацетат, андростендион (андрост-4-ен-3,17-дион), андростаднендион (андрост-1,4-диен-3,17-дион) и 9а-ОН-андростендион (9а-гидрокси-андрост-4-ен-3,17-дион) фирмы «Symbiotec» (Индия), 21-ацетат ба-фтор-1ба-метил-прегнен-3.20-дион-21-ола фирмы «Schering AG» (Германия), феназинметасульфат фирмы «Calbiochem» (Швейцария), метилированное производное р-циклодекстрина фирмы «Wacker-Chemie GmbH» (Германия). Остальные реактивы марки ХЧ н ЧДА были получены от российских производителей.

3.1.2. Культивирование С. lunata ВКМ F-644

Штамм С. lunata ВКМ F-644, полученный из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ ИБФМ РАН), поддерживали на скошенной агаризованной среде на ОД М К2НРО4-КН2РО4 буфере рН 6.0-6.1 состава (г/л): сахароза-30.0; дрожжевой экстракт-2.5; NaN03-2.0; (ИЩьНРО^З.О; КС1-0.5; MgS04 х 6Н20 -0.5; FeS04 х 2Н20 -0.01; агар-20; (стерилизация - 0,5 атм 30 мин).

Для выращивания С. lunata суспензию спор (2-3 мл) с поверхности агаризованной среды переносили в жидкую среду на 0,1 М К2НРО4-КН2РО4 буфере (рН 6,0-6,1) следующего состава (г/л): сахароза-30.0; дрожжевой экстракт-2.5; NaN03-2.0; (NH4)2HP04-3.0; КС1-0.5; MgS04 x 6H20-0.5; FeS04 x 2H20-0.01. Культуру выращивали в 100 мл среды в колбах Эрленмейера объемом 750 мл в течение 48 часов при 29°С при перемешивании на качалке (200 об/мин). Посевной материал (10% по объему) переносили в свежую среду того же состава, и продолжали инкубацию в течение 48 часов. Для индукции 11 p-гидроксилазной активности на момент 36 часов роста второго инокулюма в колбу в стерильных условиях вносили метанольный раствор индуктора до конечной концентрации 0.25 г/л (концентрация метанола — 1%)

При осуществлении экспериментов в ферментере АНКУМ 2М с общим объемом 3 л использовали следующий режим ферментации: объем среды в ферментере - 1.5 л, рОг- 20-25%, скорость перемешивания - от 300 до 400 об/мин, температура 28°С, рН среды 6.0-6.2 поддерживали добавлением 10%-ного КОН или 10%-ной НС1.

3.1.3. Культивирование G. butleri ВКМ F-1033

Культуру G. butleri ВКМ F-1033 выращивали на сусле в течение 24-28 ч при 220 об./мин и 29°С. Полученный инокулят (10%, объемн.) переносили в среду состава (г/л): сахароза - 50; кукурузный экстракт - 10; КН2РО4 - 5; MgSC>4 х 6Н2О - 5; (рН - 6.0) и культивировали 32-36 ч при 29°С при перемешивании на качалке (200 об/мин).

При осуществлении экспериментов в ферментере АНКУМ 2М с общим объемом 3 л использовали следующий режим ферментации: объем среды в ферментере - 1.5 л, рОг - 30-35%, скорость перемешивания - от 400 до 600 об/мин, температура 28°С, рН среды 6.0-6.2 поддерживали добавлением 10%-ного КОН или 10%-ной НС1.

3.1.4. Получение внутриклеточных фракций дезинтегрированного мицелия С. lunata и G. butleri

Все манипуляции проводились при температуре 0-4°С. Влажный мицелий (7 г), предварительно замороженный до —70°С, дезинтегрировали на ИБФМ-прессе и суспендировали в 60 мл 30 мМ K-Na-фосфатного буфера I (рН 6.0-6.2), содержащего 10 мМ ЭДТА, 2 мМ фенилметилсульфонилфлорида, 0,5 М сорбитола, 20% глицерина и 0,2 мМ восстановленного глутатиона. Гомогенат центрифугировали при 20000 х g в течение 30 мин при 0°С. Полученный супернатант - бесклеточный экстракт центрифугировали при 100 000 х g в течение 90 мин (Suzuki et al., 1993).

3.1.5. Протопластирование С. lunata

Мицелий С. lunata различного возраста отделяли от культуральной среды фильтрованием через стеклянный фильтр Шотта №1, промывали дистиллированной водой и осаждали при 5000 об/мин (10 мин). Для получения протопластов 100 мг сырого мицелия суспендировали в 1 мл лизирующей смеси, состоящей из 0.1 М К2НРО4-КН2РО4 буфера (рН 6.0-6.1) с добавками одного из осмостабилизаторов (КС1, NH4CI, MgS04) в концентрации 0,6 -1,0 М и литического комплекса ферментов из Trichoderma harzianum в концентрации от 2 до 30 мг. Инкубацию проводили на качалке (200 об/мин) при 29С°. Наличие протопластов проверяли на 1,3, 5, 10 и 20 часов с помощью светового микроскопа. Подсчет числа протопластов проводили в камере Горяева. Протопласты отделяли от остатков мицелия и клеточного дебриса

35 фильтрованием через стеклянный фильтр Шотта №1 и центрифугированием полученной суспензии протопластов при 45000 об/мин в течение 15 мин. Полученный осадок протопластов отделяли от супернатанта, дважды промывали 0,1 М К2НРО4-КН2РО4 буфером рН 6.0-6.1 с добавками одного из осмостабилизаторов (КС1, NH4CI, MgSC>4) в концентрации 0.6-1.0 М и ресуспендировали в 0,8 мл буфера того же состава. Регенерацию протопластов осуществляли на чашках Петри с агаризованной (агар- 2%) средой выращивания и одного из осмостабилизаторов (КС1, NH4CI, MgSC>4, сахароза) в конечной концентрации 0.7-1.0 М.

3.1.6. Мутагенез протопластов С. lunata

Мутагенез С. lunata проводили путем добавления к суспензии протопластов N-метил-М-нитро-И-нитрозогуанидина (НГ) в концентрации от 25 до 300 мкг/мл и инкубирования в течение 20 мин при 29°С. Затем суспензию протопластов осаждали центрифугированием при 45000 об/мин для удаления свободного NG. Осадок промывали 0.1 М К2НРО4-КН2РО4 буфером с 1 MNH4CI в качестве осмостабилизатора и ресуспендировали в 0.8 мл буфера того же состава. 0,1 мл полученной суспензии рассевали на агаризованную среду выращивания с добавками одного из осмостабилизаторов (КС1, NH4CI, MgS04, сахароза) в концентрации 0.7-1.0 М и кетоконазола в концентрации 0.1 — 1.5 рмоль/л.

3.1.7. Трансформация стерондных субстратов С. lunata и G. butleri а) отмытыми целыми клетками

Трансформацию проводили в 100 мл 0,1 М К2НРО4-КН2РО4 буфера (рН 6.0-6.1) с добавлением 10 г влажного мицелия в колбах Эрленмейера объемом 750 мл на качалке (200 об/мин) при 29°С. Стероидные субстраты перед внесением их в трансформационную среду предварительно растворяли, используя для этих целей различные растворители: горячий метанол, ДМФ, ДМСО в конечных концентрациях от 1 до 4% об./об., а также вносили измельченный субстрат в минимальном количестве дистиллированной воды с добавлением 0.01М Твин-80. В отдельных экспериментах трансформацию вели в присутствии МЦД. б) в ростовых условиях

Посевной материал (10% по объему) второго инокулюма переносили в свежую среду выращивания, добавляли стероидные субстраты и проводили трансформацию в условиях, описанных для отмытых клеток мицелия. в) фракциями разрушенного мицелия

Трансформацию проводили в 5 мл 0,1 М К2НРО4-КН2РО4 буфера (рН 6.0-6.1), содержащего дополнительно 1 мМ НАДФН, ЮцМ ФМН, ЮцМ ФАД в конических колбах объемом 50 мл на качалке (200 об/мин) при 29°С. Субстрат в виде метанольного раствора (конечная концентрация метанола - 2%) вносили из расчета 0.25 г/л. г) при дробном внесении субстрата

Порции субстрата по 0.25 г/л и 0.5 г/л вносили в горячем метаноле (конечная концентрация 2% об./об.) каждые 24 и 48 часов, соответственно, и инкубировали от 48 до 120 часов. д) гомогенизированного субстрата

На гомогенизаторе высокого давления при 100 МПа при количестве циклов 10 были получены частицы ФМ-ДКА со средним диаметром 2 микрона при числе полидисперсности 9 (измерения проводили на фотонном корреляционном анализаторе частиц Photon-Corr «Nano-Sizer» фирмы «Coulter», США под руководством к.т.н. Копцова В.В. (с.н.с. ИБК РАН)). д) микронизированного субстрата

Микронизированный стероидный субстрат получали путем растворения 1 г стероида в 5 мл ДМФ с последующим смешиванием полученной суспензии с 1 литром ледяной воды, осаждением осадка и высушиванием его при температуре 60°С.

3.1.8. Световая и электронная микроскопия.

Препараты для световой и электронной микроскопии готовили и микроскопирование осуществляли, как описано ранее (Sukhodolskaya et al., 1996)

3.1.9. Аналитические методы 3.1.9.1. ТСХ

Отбор проб (1 мл) проводили через равные промежутки времени. Стероиды экстрагировали этиловым эфиром уксусной кислоты (1:2, об/об) и анализировали методом ТСХ на пластинах Silufol UV254 и Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия). На старте в точку наносили фиксированное количество этилацетатиого экстракта (10-100 мкл). Пластинку с нанесенными пробами и свидетелями помещали в хроматографическую камеру, содержащую систему растворителей бензол: ацетон 3:1 или бензол: этилацетат 4:1 (об/об). После разделения стероидов проводили визуальную оценку продуктов биоконверсии на хемископе Desaga HP-UVIS (Германия) при 254 нм. Свидетелями служили: ФМ-ДКА, ФМ-ДК, 6а-фтор-16а-метил-кортикостерон ФМ-К,

АД, 9а-0Н-АД, АДД, гидрокортизон и кортексолон, нанесенные количественно (1-10 мкг).

3.1.9.2. Колоночная хроматография

Выделяли стероиды методом колоночной хроматографии (Микеш, 1982) на сорбенте силикагель 60 (Merck, 0,040-0,063 mm) с использованием колонки (16 х 450 мм) с элюцией гексан-этилацетатной смесью. Чистоту полученных соединений проверяли методом ТСХ в системе бензол: ацетон (3:1, об/об).

3.1.9.3. ВЭЖХ*

Анализ стероидов методом ВЭЖХ проводили в следующих условиях:

1) Колонка обращеннофазная Symmetry Cis 250 х 4.6 мм (Waters);

2) Прсдколонка ODS-lOO, 10 х 4.6 мм (Serva);

3) Детекция - по ультрафиолетовой абсорбции при Х=240 нм;

4) Элюент (мобильная фаза) - ацетонитршкНгО в соотношении 40:60 (для ФМ-ДКА и его производных), ацетонитрил:Н20:уксусная кислота в объемном соотношении 60:39.99:0.01 (для АД, АДД и 9а-ОН-АД), 52:47.99:0.01 (для производных кортексолона);

5) Скорость протока - 1 мл/мип

6) Объем петли - 20 мкл;

7) Температура колонки - 50°С;

8) Расчет концентраций производили с использованием значений площадей пиков;

9) Времена удерживания (Rt) составляли: 9,51 мин для ФМ-ДКА, 5,61 мин для ФМ-ДК, 4,16 мин для ФМ-К, 6,07 мин для АД, 4,9 мин для АДД, 3,65 мин для 9а-ОН АД, 5.3 мин для гидрокортизона и 3,78 мин для вещества S Рейхштейна.

Анализ проб:

Ацетонитрил смешивали с водой в пропорции 50/50 (об/об), смесь нагревали до комнатной температуры и фильтровали через нейлоновый мембранный фильтр 0.25 мкм. Полученный раствор использовали для растворения стандартов и разведения проб. Для приготовления исходных растворов делали навески кристаллических порошков с чистотой не менее 98-99%, содержащие по 20 мг чистых веществ. Навеску каждого вещества растворяли в 10 мл смеси ацетонитрил/вода 50/50 (об/об).

ВЭЖХ-анализ продуктов трансформации и исходных стероидов был проведен Андреем Анатольевичем Шутовым (ИБФМ РАН). Автор выражает ему искреннюю признательность за проведение анализов и участие в обсуждении полученных результатов.

Элюент (ацетонитрил/деионизированная вода - 60/40 об/об) готовили путем смешивания компонентов, дегазирования и фильтрации смеси через нейлоновый мембранный фильтр (0.25 мкм).

Колонку тщательно уравновешивали элюентом при скорости протока 0.5 мл/мип и затем - при 1.0 мл/мин. Систему ВЭЖХ проверяли на воспроизводимость и линейность сигнала в рабочем диапазоне концентраций: стандартный раствор вводили несколько раз до получения стабильных величин площади пика.

Пробы разводили в пропорции 1:40 или 1:80 смесью ацетонитрил/вода 50/50 (об/об) в стеклянных центрифужных пробирках и перемешивали. Объём аликвот тщательно контролировали. Разведение проб производили при одинаковой температуре компонентов и с использованием тех же приемов и устройств, что и для приготовления стандартных растворов.

Аликвоты супернатанта разведенных проб (не менее 50 мкл) отбирали инжекциопным микрошприцем и вводили в систему.

Время регистрации хроматограмм составляло не менее 15 мин.

3.1.9.4. Масс-спектромстрический анализ*

Масс-спектры продуктов трансформации и исходных стероидных соединений, использованных в работе, получены на масс-спектрометре " MAT-SS Q710 " (США) при энергии ионизации 70 эВ с прямым вводом образца в ионизационную камеру.

3.1.9.5. Спектры ЯМР 1НАА

Спектры ЯМР [Н получали на спектрометре Unity +400 (Varian) при 400 МГц в CDCI3 в качестве растворителя. В качестве внутреннего стандарта использовали сигнал от следов СНСЬ в растворителе (5 7.24).

Масс-спектры продуктов трансформации и исходных стероидных соединений были сняты Ольгой Сергеевной Аиисимовой (ЦХЛС-ВНИХФИ). Автор выражает искреннюю признательность за снятие масс-спектров и их интерпретацию. ЯМР 'Н продуктов трансформации и исходных стероидных соединений были сняты к.х.н. Константином Фёдоровичем Турчиным (ЦХЛС-ВНИХФИ). Автор выражает искреннюю признательность за снятие спектров ЯМР 'Н и участие в обсуждении полученных результатов.

3.1.6.6. Определение концентрации белка

Концентрацию белка клеток мицелия определяли по методу Лоури (Lowry et al.,

1951).

3.1.6.7. Определение растворимости стероидов

Растворимость 3-кетостероидов и их ацетатных форм измеряли согласно методике (Higushi and Connors, 1965). В пробирки Эппендорф объёмом 2 мл, наполненные 1 мл дистиллированной воды, добавляли избыток 3-кетостероидов (~3 мг) и перемешивали на роторной качалке (200 об/мин) при температуре 29°С в течение 72 часов. Затем нерастворимый осадок осаждали центрифугированием при 4500 х g. Отбирали аликвоты супернатанта и делали разведения в 50% этаноле при температуре 29°С. Измерения содержания 3-кетостероидов проводили спектрофотометрически при 242 нм против 50% этанола. Концентрацию 3-кетостероидов рассчитывали на основании калибровочных кривых.

3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.2.1. Скрининг мицелиальных грибов на наличие lip~ гидроксилазной активности в отношении ФМ-ДКА

Как указывалось выше в обзоре литературы, данные о гидроксилировании производных дезоксикортикостерона, замещенных по положениям 6 и 16, в литературе крайне ограничены. Возможность введения гидроксильной группы в положение lip 6-фторзамещенного дезоксикортикостерона была показана только для Curvularia lunata (Kieslich et al., 1969). В связи с этим, проводили изучение возможности lip-гидроксилирования ФМ-ДКА миделиальными грибами различного таксономического положения, потенциально обладающими стероидтрансформирующими гидроксилазными системами.

В работе по скринингу микроорганизмов на наличие 11 Р-гидроксилазпой активности в отношении ФМ-ДКА использовали 100 штаммов 31 рода мицелиальных грибов (табл. 1). Культивирование микроорганизмов и ведение трансформации ФМ-ДКА проводили, как описано в раделах 3.1.2. и 3.1.7.(а), соответственно. Из 14 представителей рода Curvularia только штаммы вида lunata (С.lunata ВКМ F-644 и C.lunata ВКМ F-645) проявляли искомую активность с ее максимальным уровнем у штамма C.lunata ВКМ F-644. Среди 14 протестированных штаммов рода Cunninghamella 11 Р-гидроксилазную активность проявляли все представители за исключением штамма Cunninghamella echinulata ВКМ F-663. Наибольшая активность была отмечена для штамма Cunninghamella japonica ВКМ F-1205. Высокую lip-гидроксилирующую активность проявляли 4 штамма Gongronella butleri и 1 штамм рода Trichotecium. Следут отметить, что ни один из 9 протестированных штаммов рода Rhizopus и 4 штаммов рода Backusella не проявляли искомой активности. Способность к 11 р-гидроксилированию ФМ-ДКА была установлена также для 9 из 12 штаммов рода Absidia, 2 штаммов рода Colletotrichum, 1 штамма рода Scopulariopsis и 1 штамма рода Epicoccum (табл. 1). В доступной научной и патентной литературе о возможности представителей указанных родов к 11 p-гидроксилированию 6-фтор,16-метилзамещенных стероидов не сообщалось. Известно лишь о проявлении lip-гидроксилазной активности культур родов Curvularia, Cunninghamella, Absidia в отношении кортесолона и его производных (Lu et al., 2006; Lu et al., 2007; Wang et al., 2001; Manosroi et al., 2007).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Коллеров, Вячеслав Владимирович, 2009 год

1. Ангелова Б.А. 1986. Гидроксилирование в 11-м положении стероидного ядра свободными и иммобилизованными микроорганизмами. Канд. дисс. ИБФМ РАН, Пущино.

2. Аринбасарова А.Ю., Кощеенко К.А., Андрюшина В.А., Гриненко Г.С., Скрябин Г.К. Патент РФ. 1995. № 1830949.

3. Ахрем А.А., Титов Ю.А. 1970. Стероиды и микроорганизмы. Москва, "Наука".

4. Войшвилло Н.Е., Андрюшина В.А., Савинова Т.С., Стыценко Т.С. 2004. Трансформация андростендиона и андростадиендиона бактериями, деградирующими стерины. Прикл. бнохпм. микробиол. Т. 40. № 5. С. 536-543.

5. Кощеенко К.А. 1981. Живые иммобилизованные клетки как биокатализаторы процессов трансформации и биосинтеза органических соединений. Прикл. биохим. микробиол. Т. 17. Вып. 4. С.477-493.

6. Люцканова Д. Г., Стонлова-Дишева М. М., Пелтекова В. Т. 2005. Увеличение продукции тилозпна у производственного штамма Streptomyces fradiae. Прикладная Биохимия и Микробиология. Т. 41. №2. С. 189-193.

7. Машковский М.Д. 1997. Лекарственные средства (пособие для врачей). Том 2 (издание 13, новое). Харьков "Торсинг". С. 28-45.

8. Микеш О. Н. 1982. Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам. Т. 2. Москва, «Мир».

9. Могильницкий Г.М., Габинская К.Н. 1974. Физиолого-биохимические особенности микробиологического гидроксилирования стероидов. Микробиологическая промышленность. Т.9. Вып. 117. С. 25-32.

10. Неклюдов А. Д., Иванкин А. Н. 2002. Биохимическая переработка жиров и масел в новые липидные продукты с улучшенными биологическими и физико-химическими свойствами (обзор). Прикладная биохимия и микробиология. Том 38. №5. С. 469-481.

11. Сотникова И. В., Жуков В. Г. 1992. Особенности образования протопластов у двух штаммов Tolypocladium Inflatum Subsp. Blastosporum. Антибиотики и химиотерапия. Т. 37. №2. С 6-10.

12. Суходольская Г.В. Гулевская С. А., Чинчолкар С. Б., Кощеенко К. А., Джоши А. К., Бихари В., Басу С. К. 1991. Стероид-11 Р-гидроксилазная активность С. lunata и факторы ее стабилизации. Прикладная биохимия и микробиология. Том 32. №1. С.69-77.

13. Турута A.M., Войшвилло Н.Е., Камерницкий А.В. 1992. Микробиологическое гидроксилирование 5-Н-стероидов. Успехи химии. Т. 61. № 10. С. 1883-1931.

14. Христова К. Р., Петкова В. Т., Даниленко В. Н., Иванова И. В., Бакалов Б. В. 1992. Получение и регенерация протопластов штамма Streptomyces hygroscopicus 155. Антибиотики и химиотерапия. Т. 37. №12. С. 24-26.

15. Чередчснко О. В., Зверева Е. А., Шумаев К. Б., Козлов Ю. П., Рабинович М. JI. 2002. Влияние антиоксидантов на регенерацию протопластов мицелнального гриба Trichoderma reesei 6/16. Прикладная биохимия и микробиология. Т. 38. №5. С. 482-485.

16. Шувалова С.Д., Габинская К.П., Попова Е.В., Савинова Т.С., Андрюшина В.А. 2001. Гидроксилирование андрост-4-ен-3,17-диона с помощью гриба Curvularia limata. Химико-фармацевтический журнал. Том 35. №5. С. 44-46.

17. Ядерец В. В., Андрюшина В. А, Бартошевич Ю. А., Домрачева А. Г., Норвак М. И., Стыценко Т. С., Войшвилло Н. Е. 2007. Изучение стероидгидроксилирующей активнсоти мицелия Curvularia lunata. Прикладная биохимия и микробиология. Т. 43, №6, С.695-700.

18. Яковенко К. Н, Троицкий Н. А. 1985. Протопласты микроорганизмов. Минск, «Наука и Техника».

19. Abdel-Salam I. S. 2004. Optimization progesrerone 14a-hydroxylation in the presense of P-cyclodextrin. J. Sci. Ind. Res. V. 47. №4. pp. 275-280.

20. Adham N., El-Hady A., Nairn N. 2003. Process Biochem. V.36. pp. 897-902

21. Backes WL., Kelley RW. 2003. Organization of multiple cytochrome P450s with NADPH- cytochrome P450 reductase in membranes. Pharmacol Ther. V. 98. pp. 221-233.

22. Balasubramanian N., Juliet GA., Srikalaivani P., Latithakumari D. 2003. Release and regeneration of protoplasts from the fungus Trichotecium roseum. Can J Microbiol. V 49. №4. pp. 263-268.

23. Baltz R. H. 1986. Manual of industrial Microbiology and biotechnology. American Soc. Microbiol, pp. 184-190.

24. Bernhardt R. 2006.Cytochrome P450 as versatile biocatalysts. J Biotechnol. V. 124. pp. 128-145.

25. Berry D.R. 1975. The environmental control of the physiology of filamentous fungi. Edward Arnold publications. 1975. V. l.pp. 16-32.

26. Bhacca N.S., Williams D.H. 1964. Applications of NMR Spectroscopy in Organic Chemistry. Holden-Day, San Francisco.

27. Brink H., Gorcom R., Hondel C., Punt P. 1998. Cytochrome P450 enzyme systems in fungi. Fungal Genetics and Biology. V. 23. pp. 1-17.

28. Brzezowska E, Dmochowska-Gladysz J, Kolek T. Biotransformation XXXIX. Metabolism of testosterone, androstenedione, progesterone and testosterone derivatives in Absidia coerulea culture. J. Steroid Biochem Mol Biol. 1996. V. 57. № 5/6. pp. 357-62.

29. Carruthers N., Garshasb S., Mchail A. 1992. Synthesis of corticoids from 9 alpha-hedroxyandrost-4-ene-3,17-dione. J. Org. Chcm. V. 57. №3. pp. 961-965.

30. Cauet G., Balbuena D., Achstetter Т., Dumas B. 2001 CYP11A1 stimulates the hydroxylase activity of CYP11B1 in mitochondria of recombinant yeast in vivo and in vitro. Eur. J. Biochem. V. 268. pp. 4054-4062.

31. Cotillon A., Doostzadeh J., Morfin R. 1997. The Inducible and Cytochrome P450-containing dehydroepiandrosterone 7a-hydroxylating enzyme system of Fusarium moniliforme. Steroid Biochem. Molec. Biol. V. 62. №5/6. pp. 467-475.

32. Chadegani M., Brink J., Shehata A., Admadjian V. 1989. Optimization of protoplast formation, regeneration and viability in Microsporum gypseum. Mycopathologia. V. 107. №1. pp. 33-50.

33. Chen K., Tong W-Y., Wei D-Z., Jiang W. 2007. The 11 p-hedroxylation of 16,17a-epoxyprogesterone and the purification of the 11 p-hydroxylase from Absidia coerulea IBL02. Enzyme and Microbial Technology. V 41. pp. 71-79.

34. Cheng Y., Belanger. 2000. Protoplast preparation and regeneration from spores of the biocontrol fungus Pseudozyma flocculosa. FEMS Microbiol Lett. V 190. №2. pp. 287-291.

35. Choudhary MI, Musharraf SG, Shaheen F, Atta-Ur-Rahman. Microbial transformation of (+)-androsta-l,4-diene-3,17-dione by Cephalosporium aphidocola. Nat. Prod. Lett. 2002. V16. №6. pp. 377-82.

36. Choudhary MI, Sultan S, Khan MT, Yasin A, Shaheen F, Altta-ur-Rahman. Biotransformation of (+)-androst-4-ene-3,17-dione. Nat Prod Res. 2004. V.18. №6. pp. 529-35.

37. Choudhary MI, Sultan S, Khan MT, Rahman AU. Microbial transformation of 17alpha-ethynyl- and 17alpha-ethylsteroids, and tyrosinase inhibitory activity of transformed products. Steroids. 2005. V.70. №12. ppP. 798-802.

38. Cresnar В., Zakelj-Marvic M. 2009. Aspects of the steroid response in fungi. Chemico-biological interactions. V. 178. pp. 303-309.

39. Dlugonski J., Sedlaczek K. 1981. Regulation der steroid 16-hydroxylierung bei Streptomyces olivoviridis. Z. Algem. Microbiol., V. 21. №7. pp. 499-507.

40. Dlugonski J., Staba M., Wilmanska D. 1998. The use of cryopreserved apical protoplasts from Curvularia lunata for electrotransfomation. Microbios. V. 95. pp. 71-77.

41. Donova M.V., Egorova O.V., Nikolayeva V.M. 2005. Steroid 17 beta-reduction by microorganisms a revie. Process Biochem. V.40. P. 2253-2262.

42. Duchene D. 1991. New trends in cyclodextrins and derivatives. Duchene. Editions de Sante. Paris, p. 604.

43. Duport C., Spangoli R., Degryse E., Pompon D. 1998. Self-sufficient biosynthesis of pregnenolone and progesterone in engineered yeast. Nat Bitechnol. V. 16. №2. pp. 186-189.

44. El-Kadi IA, Mostafa ME. 2004 Hydroxylation of progesteron by some Trichoderma species. Folia Microbiol (Praha). V. 49. №3. pp. 285-290.

45. El-Refai AM., Sallam L., El-Kady I. 1970. Transformation of progesterone by Rhizopus nigricans REF 129 as influenced by modification of the fermentation medium. Bulletin of the Chem. Soc. Japan. V.43. №.9. pp. 2878-2884.

46. Emerson S., Emerson M. 1958. Production, reproduction and reversion of protoplast-like structures of the osmotic strain of Neurospora crassa. Proceed. Nat. Acad, of Sciences USA. V 44. pp. 668-671.

47. Estabrook R.W., Cooper D.Y., Rosenthal O. 1963. The light reversible carbon monoxide inhibition of the steroid c21 -hydroxylase system in the adrenal cortex. Biochemische Zeitschrift. V. 338. pp. 741-55.

48. Faramarzi M.A., Aghelnejad M., Tabatabaei Y. M., Amini M., Hajarolasvadi N. 2007. Metabolism of androst-4-en-3,17-dione by the filamentous fungus Neurospora crassa. Steroids. V. 73. pp. 13-18.

49. Faramarzi M.A., Hajarolasvadi N., Tabatabaei Y. M., Amini M., Aghelnejad M. 2007. Microbiological hydroxylation of androst-l,4-dien-3,17-dione by Neurospora crassa. Biocat. Biotransform. V. 25. P. 72-78.

50. Farinal J. I., Molina О. E., Figueroa. 2004. Formation and regeneration of protoplasts in Sclerotium rolfsii ATCC 201126. J. Appl. Microbiol. V. 96. pp. 254.

51. Fernandes P., Cruz A., Angelova В., Pinheiro H.M. 2003. Microbial conversion of steroid compounds: recent developments. Ensyme and Microbial Technology. V. 32. pp. 688705.

52. Fromming K.H., Szejtli J. 1994. Topics in inclusion science. V. 5. Cyclodextrins in pharmacy. Series Editor: Davies J.E.D. Editorial board: Iwamoto Т., Lipkovvski J., Saenger W. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht. Boston. London, pp. 1-224.

53. Garraway M.O., Evans R.C. 1984. Carbon nutrition in Fungal nutrition and physiology. Jhon Wiley and Sons. New York. pp. 71-95.

54. Grinberg A.V., Hannemann F., Schiffler В., Muller J., Heinemann U., Bernhardt R. 2000. Adrenodoxin: structure, stability and electron transfer properties. Proteins. V 40. pp. 590612.

55. Hampl R., Morfin R., Starka L. 1997. 7-Hydroxylated derivatives of dehydroepiandrosterone: what they are good for? Endocrine Reg. V 31. pp. 211-218.

56. Hanson J. R., Nasir H., Parvez A. 1996. The hydroxylation of testosterone and some relatives by Cephalosporium aphidicola. Phytochemistry. V. 42. pp. 411-415.

57. Herbert L., Holland H.L. 1999. Recent advances in applied and mechanistic aspects of the enzymatic hydroxylation of steroids by whole-cell biocatalysts. Steroids. V. 64. № 3. pp. 178-186.

58. Holland H. L., Weber K.H. 2000. Enzymatic hydroxylation reactions. Current opinion in biotechnology. V. 11. № 6. pp. 547-553.

59. Higushi T. and Connors K. 1965. Phase-solubility techniques. In: C.N. Reilly (Ed.). Advances in analitical chemistry and instrumentation. Intercsience. New York. NY. pp. 117-212.

60. Hiwatashi A., Ichikawa Y. 1982. Purification and properties of the tightly bound reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-adrenodoxin reductase of bovine adrenocortical mitochondria. J. Biochem. V. 92. pp. 335-342.

61. Huszcza E., Dmochowska-Gladysz J. 2003. Transformations of testosterone and related steroids by Botrytis cinerea. Phytochemistry. V. 62. P. 166-168.

62. Huszcza E, Dmochowska-Gladysz J. 2003. Transformation of testosterone and related steroids in Absidia glauca culture. J Basic Microbiol. V. 43. №2. pp. 113-20.

63. Huang SH, Xu SW, Fa YH. 1989. 11 beta-hydroxylation of 16 alpha-methyl-Reichstein's compound S 21-acetate by Curvularia lunata. Acta microbiologica Sinica. V.29. № l.pp. 68-71.

64. Irie Т., Honda Y., Watanabe Т., Kuwahara M. 2001. Efficient transformation of filamentous fungus Pleurotus ostreatus using single-strand carrier DNA. Appl. Microbiol. Biolechnol. V. 55. № 5. pp. 563-565.

65. Jaworski A., Dlugonski J., Sedlaczek L. 1976. Changes in the cellular content of the pool constituents of Monosporium olivaceum a steroid hydroxylating mould. Acta Microbiologica Polonica. V. 25. №4. pp. 329-325.

66. Jekkel A., Likoy E., Horvath G., Pallagi I., Suto J., Ambrus G. 1998. Microbial hydroxylation of 13p-ethyl-4-gonene-3,17-dione. J Mol Catal B: Enzym. V 5. pp. 385-387.

67. Jimenes P, Valdez RA, Romano MC. 2006. Metabolism of steroid hormones by Taenia crassiceps cysticerci. J Steroid Biochem Mol Biol. V. 99. №4-5. pp. 203-8.

68. John M., Gervase L., Taylaur C. 1973. The effect of a lipid-rieh diet on the properties and composition of lipoprotein particles from the Golgi apparatus of guinea-pig liver. Biochem. J. V. 131. pp. 177-185.

69. Kalimi M., Shafagoj Y., Loria R., Padgett D., Regelson W. 1994. Anti-glucocorticoid effects of dehydroepiandrosterone (DHEA). Mol Cell Biochem. V 131. pp. 99104.

70. Kastelic-Suhadolc Т., Plemenitas A., Zigon D. 1994. Isolation and identification of testosterone and androstenedione in the fungus Cochliobolus lunatus. Steroids. V.59. №63 pp. 57-61.

71. Kelly D., Kelly S. 2003. Rewiring yeast for drug synthesis.Nat. Biotechnol. V. 21. №2. pp. 133-4.

72. Kieslich K., Petzoldt K., Kosmol H., Koch W. 1969. Synthetische analoga des corticotropins. Liebigs Arm. Chem. V. 726. pp 177-187.

73. Kolek T. Swizdor A. 1998. Biotransformation XLV: Transformations of 4-ene-3-oxo steroids in Fusarium culmorum culture. J Steroid Biochem Mol Biol. V. 67. № 1. pp. 63-9.

74. Krischenowski D, Kieslich K. 1993. Two novel microbial conversion products of progesterone derivatives. Steroids. V. 58. №6. pp. 278-81.

75. Krishnan R., Madyastha KM, Seshadri TP, Viswamitra MA. The identification of 14 alpha, 17 beta-dihydroxyandrosta-l,4-dien-3-one monohydrate, metabolites of androstendione in Mucor piriformis. Steroids. 1991. V.56. №8. pp. 440-5.

76. Lanes N., Hung В., Falero A., Perez C. and Aguita B. 1995. Glucose and lactose effect on AD and ADD bioconversion by Mycobacterium sp. Biotechnology letters. V. 17. №11. pp. 1237-1240.

77. Lanisnic Rizner T, Stojan J, Adamski J. 2001. 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase from the fungus Cochliobolus lunatus: structural and functional aspects. С hem Biol Interact. V. 130. №1/3. pp.793-803.

78. Lisowska K., Dlugonski J., Freeman J P. and Cerniglia С. E. 2006. The effect of the corticosteroid hormone cortexolone on the metabolites produced during phenantrene biotransformation in Cunninghamella elegans. Chemosphere. V. 64. № 9. pp. 1499-1506.

79. Lisowska K., Szemraj J., Rozalska S., Dlugonski J. 2006. The expression of cytochrome P-450 reductase genes in the simultaneous transformation of corticisteroids and phenantrene by Cunninghamella elegans. FEMS Microbiol Lett. V. 261. №2. pp. 175-180.

80. Lowry O., Rosenbrouch N. I., Tazz A. L. Randall R. I. 1951. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent. J Biol Chem. V. 193. №1. pp. 265-275.

81. Lobastova T.G., Gulevskaya S.A., Sukhodolskaya G.V., Turchin K.F., Donova M.V. 2007. Screening of mycelial fungi for 7a- and 7(3-hydroxylase activity towards dehydroepiandrosterone. Biocat. Biotrans. V. 25. №6. pp. 434-442.

82. Loria RM. 1997. Antiglucocorticoid function of androstenetriol. Psychoneuroendocrinology. V. 22. pp. 103-108.

83. Lu W., Du L., Wang M., Wen J., Sun В., Guo Y. 2006. Effect of two-steps substrate addition on steroids 1 lp-hydroxylation by Curvularia lunata CL-114.Biochem. Eng. J. V. 32. pp. 233-238.

84. Lu W., Du L., Wang M., Jia X., Wen J., Huang Y., Guo Y., Gong W., Bao H., Yang J., Sun B. 2007. Optimisation of Hydrocortisone Production by Curvularia lunata. Appl. Biochem. Biotechnol. V. 142. № 1. pp. 7-13.

85. Lu W., Du L., Wang M., Guo Y., Lu F., Sun В., Wen J., Jia X. 2007. A novel substrate addition method in the 11 P-hydroxylation of steroids by Curvularia lunata. Food and bioproducts processing. V. 85. №1. pp. 63-72.

86. Maddox L. A., Perkey D. J., Fritsch J. M. 1981: Evolution of upper tropospheric features during the development of a mesoscale convective complex. J. Atmos. Sci. V. 38. pp. 1664-1674.

87. Madyashta KM., Joseph T. 1993. Studies on the 14a-hydroxylation of progesterone in Mucor piriformis. Journal of steroid biochemistry and molecular biology. V. 45. №6. pp. 563569.

88. Mahato S.B., Garai S. 1997. Advances in microbial steroid biotransformation. Steroids. V 62. pp. 332-345.

89. Mahato S.B., Banerjee S., Podder S. 1989. Steroid transformations by microorganisms-III. Phytochemistry. V. 28. №1. pp. 7-40.

90. Manosroi J., Abe M., Manosroi A. Biotransformation of steroidal drugs using microorganisms screened from various sites in Chiang Mai, Thailand. 1999. Bioresource technology. V. 69. №1. pp. 67-73.

91. Manosroi J. Saowakhon S., Manosroi A. 2007. A novel one-step biotransformation of cortexolone-21-acetate to hydrocortisone acetate using Cunninghamella blakesleeana ATCC 8688a. Enzyme and microbial technology. V. 41. pp. 322-325.

92. Manosroi J., Saowakhon S., Manosroi A. 2008. Enhancement of 17a-hydroxyprogesterone production from progesterone by biotransformation using hydroxypropil-p-cyclodextrin complexation technique. J of Steroid Bichem Mol Biol. V 112. pp. 201-204.

93. Marko V., Smith K., Rozman D. and Komel R. 1993. Progesterone metabolism by the filamentous fungus Cochliobolus lunatus. Steroids. V. 58. pp. 278-81.

94. Marko V., Rozman D., Komel R. and Kelly S. 1995. P450-mediated progesterone hydroxylation in Cochliobolus lunatus. J. Biotechnol. V. 42. №2. pp. 145-150.

95. Mateju J., Marsalkova J., Nohynek M., Steiova N. 1991. Mutant strains of Streptomyces cinnamonensis protoplasts. Folia Microbiol. V. 36. №1. pp. 42-48.

96. Merk E. Aktiengesellshaft. 1959. Verfahren zur Herstellung von 9-Fluor-16-methylen-prednisolon bzw. prednizon und 21-Estern derselben. Patentschrift 1263765.

97. Mukhopadhyay S.N., Ghose Т.К. 1976. Oxygen participation in fermentation. Part 1. Oxygen microorganism interactions. Process Biochem. V. 11. №5. pp. 19-21.

98. Nega E., Grunwaldt G. 1997. Evidance for characterization of cytochrome P-450 in Neurospora crassa. J Basic Microbiol. V. 37. № 2. pp. 139-145.

99. Nelson D., Koumans Z., Kamataki Т., et al. 1996. P-450 superfamily: update on new sequence, gene mapping, accession numbers and nomenclature. Pharmacogenetics. №6. pp. 1-42.

100. Nuotio-Antar AM, Hasty AH, Kovaks WJ. 2006. Quantitation and cellular localization of 1 lbeta-HSDl expression in murine thymus. Steroid Biochem. Molec. Biol. V. 99. №2/3. pp. 93-9.

101. Papadakis A. K., Roubelakis-Angelakis K. A. 1999. The generation of active oxygen species differs in tobacco and grapevine mesophyll protoplasts. Plan Physiol. V. 121. P. 197-205.

102. Paraszkiewicz К., Dlugonski J. 1998. Cortexolone 11 P-hydroxylation in protoplasts of Curvularia lunata. J. Biotechnol. V. 65. pp.217-224.

103. Peberdy J. F. 1978. Protoplasts and their development. The Filamentous Fungi. V 3. pp. 119-131.

104. Pelissier MA. Trap C., Malewiak MI., Morfin R. 2004. Antiioxidant effects of dehydroepiandrosterone and 7a- dehydroepiandrosterone in the rat colon, intestine and liver. Steroids. V. 69. pp. 137-144.

105. Petrini L. 2001. Production and regeneration of protoplasts from Gremmeniella abietina and Ascocalyx abietis. Acta Biol Hung. V. 52. №2-3. pp. 307-313.

106. Rozman D, Komel R. 1992. Transformation of Cochliobolus lunatus with pUT 720 changes the steroid hydroxylating ability of the fungus. Curr Genet. V.22. №2. pp. 123-7.

107. Santhanam H. K., Shreve G. S. 1994. Solvent selection and productivity in multiphase biotransformation systems. Biotechnology progress. V.10. №2. pp. 187-92

108. Schaaf O, Dettner K. Transformation of steroids by Bacillus strains isolated from the foregut of water beetles. I. Metabolism of androst-4-en-3,17-dione (AD). J Steroid Biochem Mol Biol. 1996. V. 67. № 5/6. pp. 451-65.

109. Sedlaczek L., Jaworski A., Wilmanska D. 1981 Transformation of steroids by fungal spores. 1. Chemical changes of Cunninghamella elegans spores and mycelium during cortexolone hydroxylation. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 13. pp. 150-160.

110. Shen Y.K. 1987. Application of microbial conversion in the production of steroid hormone. Gongye Weishengwu. V. 17. №1. pp. 26-33.

111. Shuvendu D., Tapan K. D., Timir B. S. 2002. Influence of substituents at Cll on hydroxylation of progesterone analogs by Bacillus sp. J Steroid Biochem Mol Biol. V. 82. №2-3. pp. 257-261.

112. Sicarrd P.J., Saniez M.H. 1987. Biosynthesis of cycloglycosyltranferase and obtention of its enzymatic reaction products in cyclodextrines and their industrial uses. Ed. D. Duchene. Paris, pp. 75-105.

113. Smith KE, Latif S, Kirk DN. Microbial transformation of steroids—II. Transformations of progesterone, testosterone and androstenedione by Phycomyces blakesleeanus. J Steroid Biochem 1989. V. 32. №3. pp. 445-51

114. Smith KE, Latif S, Kirk DN. Microbial transformation of steroids—VI. Transformation of testosterone and androstenedione by Botryosphaerica obtusa. J Steroid Biochem 1990. V. 35. №1. pp. 115-20.

115. Smith KE., Ahmed F., Antoniou T. 1993. Microbial transformations of steroids. Biochem. Soc. Trans. V. 21. pp. 1077-1080.

116. Sonomoto K., Hoq M.M., Tanaka A., Fukui S. 1983. 11(3- hydroxylation of cortexolone (Reichsteins compound «S») to hydrocortisone by C. lunata intrapped in photo-cross-linked resin gels. Appl. Environ. Microbiol. V. 45. №2. pp. 436-443.

117. Spassov G., Krutzfeldt R., Sheldrick W.S., Wania W., Vlahov R. and Snatzke G. 1983. Crystallographic monitoring of microbiological steroid transformations. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 17. pp. 80-84.

118. Suzuki K., Sanga K., Chikaoka Y., Itagaki E. 1993. Purification and properties of cytochrome P-450 (p-450i„n) catalyzing steroid 11 p-hydroxylation in Curvularia lunata. Biochem. Biophys. Acta. pp. 215-223.

119. Swizdor A., Kolek T. Transformation of 4- and 17alpha-substituted testosterone analogues Fusarium culmorum. Steroids. 2005. V. 70. №12. pp. 817-24.

120. Szczebara F.M., Chandelier C., Villeret C., Masurel A., Bourot S., Duport C„ Blanchard S., Dumas B. 2003. Total biosynthesis of hydrocortisone from a simple carbon source in yeast. Nat. biotechnology. V.21. №2. pp. 133-4.

121. Szejtli J. 1991. The use of cyclodextrins in biotechnological operations. Ed. Duchene D. Editions de Sante. France. 625 p.

122. Vezina C., Singh K. 1975. Transformation of organic compounds by fungal spores. In The Filamentous Fungi. J Steroid Biochem Mol Biol. V.l. pp. 158-192.

123. Vickery L.E. 1997. Molecular recognition and electron transfer in mitochondrial steroid hydroxylase systems. Steroids. V. 62. ppP. 124-127.

124. Vitas M., Smith K., Rozman D. and Komel R. 1994. Progesterone metabolism by the filamentous fungus Cochliobolus lunatus. J Steroid Biochem Mol Biol. V. 49. №1. pp. 87-92.

125. Vitas M., Rozman D., Komel R., Kelly S. 1995. P45o mediated progesterone hydroxylation in Cochliobolus lunatus. J. Biotechnol. V. 42. pp. 145-150.

126. Wadhwaa Lalita, Kelvin E Smitha. 2000. Progesterone side-chain cleavage by Bacillus sphaericus. Microbiol Lett. V.192. №2. pp. 179.

127. Wang J., Chen C., Li В., Zhang J., Yu Y. 1998. Production of hydrocortisone from cortexolone-21-acetate by immobilized Absidia orhidis in cosolvent-containing media. Ensyme Microbial. Technology. V. 22. pp. 368-373.

128. Wang M., Lu FP„ Wang FQ., Jiang Y., Du LX. 2001. Compound RSA 11 beta-hydroxylation with Curvularia lunata. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. V. 17. №6. pp. 710712.

129. Wilson MR, Gallimore WA, Reese PB. 1999. Steroid transformations with Fusarium oxysporum var. cubense and Colletotrichum musae. Steroids. V. 64. №12. ppP. 83443.

130. Xiong Z, Wei Q, Chen H, Chen S, Xu W, Qin G, Leing S, Ни X. 2006. Microbial transformation of androst-4-ene-3,17-dione by Beauveria bassiana. Steroids. V71. №11-12. pp. 979-83.

131. Yang SS., Lei CM. 2001. Formation and regeneration of protoplasts for protease production in Streptomyces rimosus. J Microbiol Immunol Infect. V 34. № 1. pp. 8-16.

132. Zakelj-Mavric M, Belie I. 1991. Induction of steroidal 11 beta-hydroxylase of Cochliobolus lunatus. Steroid Biochem Mol Biol. V. 38. №1 pp. 117-118.

133. Zakelj-Mavric M, Plemenitas A, Komel R, Belie I. 1990. 11 beta-hydroxylation of steroids by Cochliobolus lunatus. J Steroid Biochem. V. 35. №5. pp. 627-629.

134. Zhang В., Zhu H., Liu X. 2004. Effect of supercritical fluids on Cllbeta-hydroxylation activity of Absidia coerulea. Biotechnol. Prog. V.20. №6. pp. 1885-1887.

135. Zhao K., Zhao D., Ping W., Ge J. 2004. Study on the preparation and regeneration of protoplast from taxol-producing fungus Nodulisporium sylviforme. Nature Scince. V. 2. №2. pp. 2004.

136. Российская академия наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина

137. Для определения соответствия данного способа лабораторно-техническому уровню было проведено сравнение балансовых операций по пяти ферментациям в аппаратах АНКУМ 2Мс общим объемом 3 литра.

138. Схема выделения 17а-ацетата 11 (3,17а,21 -тригидроксипрегн-4-ен-3,20-диона (4 г/л) из культуральной жидкости после проведения биоконверсии в ферментере АНКУМ 2