Использование правастатина в качестве биопестицида против грибных и вирусных патогенов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.01.07, кандидат наук Карташов, Максим Игоревич

• Карташов, Максим Игоревич
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Карташов, Максим Игоревич

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Правастатин - лекарственное вещество для снижения уровня холестерина в крови

1.1.1. История открытия статинов

1.1.2. Физико-химические свойства правастатина

1.1.3. Получение правастатина

1.1.3.1. Методы культивирования штаммов-продуцентов

1.1.3.2. Условия, необходимые при лабораторном культивировании

1.1.3.3. Аппаратура, необходимая для проведения ферментации

1.1.3.4. Мутагенез штаммов продуцентов

1.2. Предпосылки применения статинов в защите растений

1.2.1. Роль фитостеринов для патогенов и вредителей

1.2.2. Роль меланинов патогенных грибов

1.2.3. Химические блокаторы синтеза стеринов

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.1.1. Штамм

2.1.2. Фитопатогены

2.1.3. Растворы правастатина

2.1.4. Эргостерин

2.1.5. Растительные объекты, химические реактивы, компоненты сред

2.2. Методы

2.2.1. Методы изучения меланин-ингибирующих и фунгицидных свойств правастатина in vitro

2.2.2. Приготовление раствора эргостерина

2.2.3. Изучения механизма действия правастатина против фитопатогенных грибов in vitro

2.2.4. Методы изучения фунгицидных свойств правастатина на растениях

2.2.4.1. Методы изучения защитного действия правастатина на устойчивость пшеницы к возбудителю септориоза в лабораторных условиях

2.2.4.2. Методы изучения защитного действия правастатина против возбудителя темно-бурого гельминтоспориоза ярового ячменя в лабораторных условиях

2.2.4.3. Методы изучения защитного действия правастатина против коричневой пятнистости табака в лабораторных условиях

2.2.4.4. Методы изучения защитного действия правастатина против гельминтоспориоза ярового ячменя в лабораторных условиях

2.2.4.5. Методы изучения защитного действия правастатина против гельминтоспориоза ярового ячменя в полевых условиях

2.2.5. Методы изучения антивирусной активности правастатина

2.2.5.1. Методика выявления защитного действия правастатина против вируса табачной мозаики (ВТМ)

2.2.5.2. Методика изучения механизма защитного действия правастатина против ВТМ

2.2.5.3. Методика определения способности правастатина оказывать прямое действие на ВТМ

2.2.5.4. Методика оценки влияния правастатина на устойчивость картофеля к различным вирусам

2.2.6. Методы получения высокопродуктивных мутантов S. xanthochromogenes

2.2.7. Методы биосинтеза правастатина в глубинной культуре

2.2.8. Приготовление водно-спиртового раствора натриевой соли компактина

2.2.9. Методы хроматографического анализа

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Возможность использования правастатина в защите растений

3.1.1. Влияние правастатина на рост ряда фитопатогенных грибов in-vitro

3.1.2. Влияние правастатина на гельминтоспориозную корневую гниль ярового ячменя in-vitro

3.1.3. Влияние правастатина на устойчивость пшеницы к возбудителю септориоза

3.1.4. Влияние правастатина на устойчивость ячменя к возбудителю темно-бурого гельминтоспориоза

3.1.5. Влияние правастатина на развитие коричневой пятнистости на листьях табака

3.1.6. Влияние правастатина на гельминтоспориозную корневую гниль на проростках ячменя в лабораторных условиях

3.1.7. Влияние правастатина на устойчивость ярового ячменя против возбудителей гельминтоспориоза в полевых условиях

3.1.8. Влияние раствора правастатина, содержащегося в культуральной жидкости S. xanthochromogenes, на устойчивость табака сорта Xanthi к вирусу табачной мозаики (ВТМ) при натирании листьев растения

3.1.9. Влияние растворов чистого вещества правастатина на устойчивость табака сорта Xanthi к ВТМ при опрыскивании листьев растения

3.1.10. Определение способности правастатина оказывать прямое действие на ВТМ

3.1.11. Влияние правастатина на устойчивость картофеля к М вирусу при естественном заражении в полевых условиях

3.2. Подбор оптимальных условий получения правастатина

3.2.1. Получение высокопродуктивных штаммов S. xanthochromogenes с помощью многоступенчатого мутагенеза

3.2.2. Влияние различных количеств растворенного кислорода (рО2) на продуктивность культуры

3.2.3. Подбор оптимального количества соевой муки

3.2.4. Подбор оптимальной концентрации глюкозы в исходной питательной среде

3.2.5. Подбор оптимального режима добавления глюкозы во время ферментации

3.2.6. Подбор оптимальных концентраций дрожжевого экстракта и

пептона

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Использование правастатина в качестве биопестицида против грибных и вирусных патогенов»

ВВЕДЕНИЕ

Акуальность темы исследования. Современные задачи интенсификации сельскохозяйственного производства требуют расширения спектра пестицидов и агрохимикатов, обеспечивающих эффективную защиту растений от вредных организмов и повышающих урожайность сельскохозяйственных культур. С другой стороны, существующие тенденции в повышении качества жизни населения предполагают создание действенной системы контроля за оборотом химических средств защиты растений и безусловного выполнения требований по соблюдению безопасности применяемых пестицидов для окружающей среды и здоровья человека.

Одним из наиболее ресурсосберегающим подходом в защите растений является биологический метод защиты, который позволяет с одной стороны защищать растения от патогенов и вредителей, с другой стороны увеличивает их продуктивность без нанесения вреда окружающей среде. Данный метод основан на использовании грибных, бактериальных и вирусных препаратов, а так же насекомых, которые уменьшают риски возникновения резистентности у патогенных организмов, безопасны в применении (Складнев, 2000; Феклистова, Максимова, 2006).

Одним из направлений биологической защиты растений является создание биопестицидов на основе различных штаммов микроорганизмов, а так же продуктов их жизнедеятельности, применение которых, в отличие от большинства современных синтетических пестицидов, не приводит к загрязнению окружающей среды. В настоящее время потенциальными объектами агробиотехнологии являеются грамотрицательные аэробные неспорообразующие бактерии рода Pseudomonas, которые используются для разработки средств защиты, а так же повышения продуктивности растений и как стимуляторы роста (Феклистова, Максимова, 2006; Помелов, 2004). В последнее время появились биологические препараты на основе различных штаммов Bacillus subtilis, грамположительных палочковидных бактерий,

образующих внутриклеточные споры, обладающие фунгицидными, бактерицидными, а так же ростостимулирующими свойствами. Такие препараты, как Бактофит, Алирин, Экстрасол, Фитоспорин, Гамаир и т.д. Известные как продуценты антибиотических веществ - актиномицеты, могут являться сильными антагонистами по отношению к фитопатогенам. В частности, род Б^врШтусвз является самым крупным родом, синтезирующим антибиотики и используется с 1940-1950 г. в промышленном производстве антибиотиков (^ауе е1 а1., 2001). В России зарегистрирован препарат Фитолавин для защиты растений от грибных и бактериальных патогенов на основе штамма Б^вр^тусвз ¡аув^иШв. Этот штамм продуцирует комплекс стрептотрициновых антибиотиков (Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации и дополнения к нему (2013 г.).

Во многих исследованиях продемонстрирована возможность использования знаний о характере взаимоотношений паразита и хозяина в защите растений для разработки специфических ингибиторов процессов патогенеза. Одним из направлений таких исследований является изучение влияния продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, которые способны подавлять развитие фитопатогенов путем специфического воздействия на их метаболизм, в частности, изменять уровень биосинтеза фитостеринов в растении, тем самым воздействуя на жизненный цикл фитостеринзависимых патогенов и вредителей.

Степень разработанности темы исследований. Статины - вторичные метаболиты ряда грибов и актиномицетов, ингибирующие биосинтез стеринов. Как известно, фитопаразитические нематоды, насекомые и оомицеты не способны к самостоятельному синтезу стеринов (Метлицкий и др., 1976; Щербакова и др. 1981; Зиновьева и др. 1989). Между тем, производные стеринов необходимы им для роста и развития. Единственным источником стеринов для этих паразитов является растение-хозяин. В этой связи,

снижение уровня содержания фитостеринов в растении должно отрицательно сказываться на развитие стеринзависимых патогенов и вредителей. К примеру, при отсутствии большинства фитостеринов в пшенице (Triticum sativum) у самок саранчи перелетной (Locusta migratoria) нарушалось развитие яичников, в результате чего увеличивалась смертность эмбрионов. Так же снижение содержания стеринов в растениях картофеля позитивно коррелировало со степенью устойчивости сортов к фитофторозу, возбудителем которой является патогенный оомицет Phytophthora infestans (Ходжайова и др., 2000). В связи с этим ингибиторы биосинтеза фитостеринов могут рассматриваться как потенциальные средства защиты растений от стеринзависимых паразитов (Инге-Вечтомов, 1997).

Эффективность статинов, таких как компактин и ловастатин против ряда фитопатогенных грибов, нематод и вирусов была продемонстрирована в опытах in vitro (Джавахия и др., 2008; Приданников и др., 2003; Украинцева и др., 2008) и в полевых испытаниях (Украинцева и др., 2007).

Одним из ключевых ферментов, участвующих в биосинтезе стеринов, является 3-окси-3-метилглютарат-КоА-редуктаза, катализирующая реакцию образования мевалоната из 3-окси-3-метилглютарат-коэнзима А (ОМГ-КоА) (Serizawa and Matsuoka, 1998). Известно, что вещества, относящиеся к группе статинов, являются специфическими ингибиторами этого фермента (Шевченко и Шевченко, 2003). Это позволило предположить, что статины, ингибируя ОМГ-КоА-редуктазу и снижая уровень содержания фитостеринов в тканях растения, будут препятствовать их поражению стерин-зависимыми патогенами и вредителями. Справедливость этого предположения была подтверждена на примере одного из представителей статинов - компактина. Было показано, что компактин обладает фунгицидной активностью против ряда фитопатогенных грибов при тестировании на твердой питательной среде (Украинцева и др., 2008). Опыты на растениях выявили защитные свойства компактина против грибных и вирусных патогенов.

Правастатин является производным компактина, но в отличие от последнего широко применяется в медицине как препарат, снижающий уровень холестерина в крови. Можно предположить, что правастатин, как и компактин, обладает защитными свойствами против патогенов растений, так как является более активным игибитором редуктазы.

Цель исследований. Целью данной работы было изучение влияния правастатина на рост и развитие ряда фитопатогенных грибов и вирусов, на инфекционный процесс, вызываемый этими патогенами в лабораторных и полевых экспериментах. Получение высокопродуктивных мутантов Streptomyces xanthochromogenes, продуцента правастатина, методом многоступенчатого индуцированного мутагенеза с последующей селекцией. Подбор оптимальных условий технологии двустадийного получения правастатина. Задачи:

1. Получить высокопродуктивные мутанты актиномицета S. xanthochromogenes - продуцента правастатина.

2. Подобрать оптимальные условия двухстадийного получения правастатина.

3. Определить меланин-ингибирующие и фунгицидные свойства правастатина in vitro и по отношению к некоторым грибным патогенам пшеницы и ячменя в системах растение-патоген в лабораторных и полевых условиях.

4. Определить антивирусную активность правастатина в лабораторных и полевых условиях.

Новизна научной работы. Впервые показаны меланин-ингибирующие и фунгицидные свойства правастатина против фитопатогенных грибов Stagonospora nodorum, Bipolaris sorokiniana, Alternaria alternata, Colletotrichum coccodes in vitro.

Впервые показаны защитные свойства правастатина против септориоза пшеницы и альтернариоза табака на изолированных листьях.

Впервые показана способность правастатина оказывать защитное действие в полевых условиях против ряда фитопатогенных грибов B. sorokiniana, Drechslera gramínea, D. teres, поражающих как корневую систему, так и надземную часть растений ярового ячменя.

Впервые обнаружена антивирусная активность правастатина против вируса табачной мозаики на табаке и М-вируса картофеля на картофеле.

Получен высокопродуктивный штамм 32-1 S. xanthochromogenes с повышенным уровнем конверсии компактина в правастатин.

Оптимизирована исходная ферментативная среда и условия для глубинного культивирования S. xanthochromogenes , продуцента вторичного метаболита правастатина, в лабораторном ферментере.

Теоритическая и практическая значимость работы.

Показанные фунгицидные свойства правастатина против В. sorokiniana, S. nodorum, A. longipes, D. graminea, D. teres A. alternata, C. coccodes свидетельствуют о принципиальной возможности разработки потенциального биопестицида, обладающего активностью, которая направлена не только на подавление роста гриба по типу прямого фунгицидного действия, но и на ингибирование меланиногенеза, т.е. на специфическое подавление его патогенных свойств (непрямое фунгицидное действие).

Полученные в ходе работы результаты об антивирусной активности правастатина против вируса табачной мозаики на табаке и М-вируса картофеля на картофеле позволяют предположить возможность разработки на основе этого соединения вирулицидов против фитовирусов.

Полученный высокопродуктивный штамм 32-1 S. xanthochromogenes и оптимизация питательной среды для глубинного культивирования штамма

позволяют предположить в дальнейшем разработку промышленной технологии производства правастатина.

Методология и методы диссертационного исследования. В данной диссертационной работе использовались современные микробиологические, молекулярно-генетические методы и фитопатологические методы, которые были разработаны или модифицированы ведущими учеными в этой области (Дьяков, Попов, Пыжикова, Игнатов, Джавахия, Бидлингмейер, Kysilka и др.)

Положения выносимые на защиту.

1. Меланин-ингибирующие и фунгицидные свойства правастатина т^Нго в лабораторных и полевых условиях.

2. Антивирусная активность правастатина в лабораторных и полевых условиях.

3. Получение мутантных штаммов xanthochromogenes с увеличенной продуктивностью правастатина и биосинтез правастатина в процессе глубинного культивирования для использования против грибных и вирусных патогенов.

Степень достоверности и апробация работы. Диссертационная работа выполнена на современном оборудовании с использованием современных и модифицированных методик. Для оценки достоверности полученных результатов использовали современные методы статистической обработки данных. Материалы работы были представлены на Всероссийской научно производственной конференции "Современные иммунологические исследования, их роль в создании новых сортов и интенсификации растениеводства", 18 ноября 2009 г., Большие Вяземы, Московская область; Международной научно-практической конференции, посвященной 125-летию со дня рождения Н.И. Вавилова "Иммуногенетическая защита сельскохозяйственных культур от болезней: теория и практика", 17-21 июля

2012 г., Большие Вяземы, Московская область; Конференция молодых ученых и специалистов "Актуальные исследования молодых ученых в биологии и защите растений" 26 декабря 2014 г., Большие Вяземы, Московская область.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 2 статьи в российских рецензируемых журналах, входящих в список ВАК РФ, 1 статья входящих в список ВАК РФ и индексируемая в web of science, 1 статья в иностранном издании, индексируемая в web of science и scopus.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов, результаты и обсуждения, заключение, выводы, список публикаций по теме диссертации и список использованной литературы. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц, 43 рисунка, 1 приложение. Список литературы включает 143 работы, в том числе 72 иностранных авторов.

Автор искренне признателен научному руководителя заведующему отделом молекулярной биологии ФГБНУ ВНИИФ, к.б.н. В.Г. Джавахия. Благодарит за ценные консультации и помощь в работе сотрудников отдела молекулярной биологии ФГБНУ ВНИИФ Т.М. Воинову, Т.Н. Шманенкову.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Правастатин - лекарственное вещество для снижения уровня холестерина в крови

В настоящее время остро стоит проблема заболеваний сердечнососудистой системы (ССЗ), которые являются основной причиной смерти во всем мире. В 2008 году от ССЗ умерло 17,3 миллиона человек, что составило 30% всех случаев смерти в мире, из них 7,3 миллиона человек умерло от ишемической болезни сердца (ИБС) и 6,2 миллиона человек от инсульта (по данным всемирной организации здравоохранения на 2011год). Более 80% случаев смертности от CC3 происходит в странах c низким и средним уровнем дохода, в равной мере среди женского и мужского населения. По прогнозам к 2030 году почти 23,3 миллиона человек умрет от ССЗ (по данным Мирового отчета по неинфекционным заболеваниям, 2010 г. Женева, ВОЗ). Самой распространенной причиной инфарктов и инсультов является закупоривание сосудов, которое препятствует притоку крови к сердцу и мозгу. Причиной этому является образование жировых отложений на внутренних стенках кровеносных сосудов, атеросклеротическим поражением артерий, в большинстве случаев из-за высокого уровня холестерина в крови. (Аронов, 2001; Шевченко, 2003).

Из всех известных на сегодняшний день антигиперлипидемических препаратов наиболее оптимальными в плане клинической эффективности являются статины - как природные, так и синтетические соединения. Статины способны эффективно замедлять процесс развития атеросклероза, снижая показатели заболеваемости и летальности у больных с различными формами атеросклеротического поражения ССЗ (Tonkin , Illingworth 1997 г.) Данные соединения, являясь продуктами вторичного метаболизма ряда грибов и актиномицетов, способны специфически ингибировать 3-окси-3-метилглютарат-КоА-редуктазу, катализирующую реакцию образования

мевалоната из 3-окси-3-метилглютарат-коэнзима А (ОМГ-КоА), одного из ключевых ферментов, участвующих в биосинтезе стеринов (Шевченко и Шевченко, 2003).

Статины снижают содержание внутриклеточных пулов за счет обратимого подавления активности ОМГ-КоА редуктазы, что приводит к увеличению количества рецепторов для липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) на поверхности клетки и к повышению уровня разложения и выведения из организма ЛПНП. Так же статины подавляют образование ЛПНП за счет подавления синтеза в печени липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП) и их предшественников (Kaneko et al., 1978; Tsujita et al.,1979; Kuroda et al., 1979; Yamamoto et al., 1980; Manzoni, Rollini, 2002; Endo, 2004).

1.1.1. История открытия статинов

В 1950-х и 1960-х годах, стало очевидно, что повышенное содержание холестерина в плазме крови человека является основным фактором риска для развития ИБС. Об этом свидетельствовали работы многочисленных исследовательских групп (Tennet et al., 1960; Altshul et al., 1955 Thorp, Waring, 1962; Goldsmith et al., 1960; Hollander, Chobanian, 1959; Starr et al., 1960; Taupitz, Otaguro, 1959). Это привело к поиску лекарств, которые могли бы снизить уровень холестерина в крови. В течение 50-х и 60-х годов велся поиск ингибиторов биосинтеза холестерина, и было обнаружено много веществ, способных снижать его уровень в животных тканях. Такие найденные соединения как, никотиновая кислота (Altshul et al., 1955), холестирамин (Tennet et al., 1960), хлорфеноксиизобутиловая кислота, CPIB (Thorp, Waring, 1962), неомицин (Goldsmith et al., 1960) растительные стерины (Pollak, 1953) трипаранол (Hollander, Chobanian, 1959) Д-тироксин (Starr et al., 1960) и эстрогенные гормоны (Taupitz, Otaguro, 1959) могли блокировать различные стадии биосинтеза холестерина и существенно

снижать его содержание в тканях исследуемых организмов. Однако, побочные эффекты этих препаратов ограничивали их применение на практике. Механизм действия растительных стеринов был основан на препятствовании всасывания холестерина в пищеварительном тракте. Эффективность действия растительных стеринов варьировала от пациента к пациенту (Endo et al., 1978).

Исследование путей биосинтеза холестерина показало, что начальным этапом этого пути является превращение ОМГ-КоА в мевалонат. (Siperstein, 1970; Siperstein, Fagon, 1966). Данный процесс катализируется ОМГ-КоА редуктазой. Блокирование активности этого фермента стало привлекательной целью в поиске лекарств для снижения концентрации холестерина в плазме крови. (Jonathan, 2003).

Группа японских ученых в 1970-х годах, возглавляемая доктором Akira Endo, протестировала более 6 000 штаммов микроорганизмов. В ходе исследований ими были получены первые субстанции, ингибирующие биосинтез холестерина в плазме крови человека: цитринин (citrinin) из гриба Pythium ultimum и компактин (мевастатин, ML-236B) из метаболитов гриба Penicillium citrinum. (Endo et al., 1976; Tanazawa et al., 1977; Сусеков, 2001). Впоследствии были обнаружены такие статины как ловастатин и правастатин. Цитринин необратимо связывался с ОМГ-КоА-редуктазой, но обладал нефротоксичностью, что исключало его использование в качестве лекарства. В 1980 году, испытания компактина были приостановлены по неизвестным причинам (предположительно, это было связано с серьезной токсичностью для животных). Из-за близкого структурного сходства между компактином и ловастатином, клинические исследования ловастатина также были приостановлены.

В 1982 были проведены незначительные клинические исследования ловастатина на пациентах с очень высоким риском, у которых, в результате приема ловастатина, наблюдалось резкое снижение холестерина в крови, с

небольшими побочными эффектами. В результате дополнительных исследований по безопасности ловастатина на животных не было выявлено такой токсичности, как у компактина, которую предполагали из-за близкого структурного сходства, в связи с этим клинические исследования были возобновлены.

Крупномасштабные испытания подтвердили эффективность ловастатина, и он был одобрен FDA США в 1987 году.

Правастатин (торговое название Pravachol) был обнаружен в Японии учеными фармацевтической компании Sankyo Co, Ltd (сейчас Sankyo Daiichi Sankyo Co.). В 1979 году правастатин производился путем модификации компактина в два этапа ферментации. Процесс биосинтеза осуществлялся актиномицетом Nocardia autotrophica. Правастатин впервые был произведен в Sankyo Co, Ltd в Японии в 1989 году (Hosobuchi et al., 1993). В 1991 году, после одобрения FDA, правастатин был введен на рынок США компанией Bristol-Myers Squibb, которая приобрела права на продажу его за пределами Японии.

Некоторые другие ингибиторы редуктазы ОМГ-КоА, широко известные в настоящее время как статины, впоследствии стали доступны для назначения в качестве медицинских препаратов: симвастатин, флувастатин, аторвастатин, церивастатин и розувастатин (Сусеков, 2005).

1.1.2. Физико-химические свойства правастатина

Правастатин является одним из представителей нового класса гиполипидемических средств, снижающих уровень холестерина в крови у человека, ингибирующих активность ОМГ-КоА редуктазы, основного фермента в биосинтезе холестерина. ОМГ-КоА-редуктаза - фермент, катализирующий раннюю стадию синтеза холестерина.

Правастатин - белый или почти белый порошок. Основное наименование (USAN) - правастатин. Легко растворим в воде, в спирте и ДМСО. Конечный

продукт - натриевая соль правастатина. Химическая брутто-формула - С23 Н35 № О7. Молекулярная масса 446.51.

Структурная формула правастатина представлена на (Рис. 1).

НО

Рисунок 1. Структурная формула правастатина

1.1.3. Получение правастатина

Правастатин является вторичным продуктом метаболизма, в результате реакции микробиологического гидроксилирования натриевой соли компактина в процессе культивирования актиномицета xanthochromogenes, морфологически культура которого представляет собой микроскопический лучистый гриб, растущий компактными, овальными колониями, при росте в жидкой питательной среде (Рис. 2).

о

50 ^m <—>

200 ^m <—>

Рисунок 2. Морфология S. xanthochromogenes при глубинном культивировании

Получение правастатина включает в себя 2 этапа ферментации: первый -получение компактина, который синтезируется несовершенным грибом Pénicillium citrinum в процессе ферментации при кислых значениях рН; второй - получение правастатина в результате микробиологического гидроксилирования натриевой соли компактина в процессе ферментация актиномицета S. xanthochromogenes (Рис. 3).

но

права статин

Рисунок 3. Микробиологическая трансформация компактина в правастатин (НоБоЬисЫ, 1993)

1.1.3.1. Методы культивирования штаммов-продуцентов

Существует ряд методов культивирования микроорганизмов, которые делятся на периодические и непрерывные (Былинкина, 1973).

Периодическое культивирование.

При периодическом процессе весь объем питательной среды загружают в аппарат сразу, добавляют посевной материал и при оптимальных условиях

продолжают процесс до тех пор, пока не накопится нужное количество биомассы или определенного метаболита в ферментере (Бекер, 1978).

Каждый периодический цикл ферментации начинается с засева вегетативной культуры в аппарат для проведения биосинтеза. Данный этап является начальным и определяющим положительный результат процесса культивирования. Объем вегетативной культуры, засеваемой в аппарат, должен быть на том уровне, который обеспечивает активный рост и накопление биомассы в первые дни ферментативного процесса. Объем засеваемой культуры для ферментативных процессов составляет от 2% до 10% от рабочего объема ферментера, и зависит от микроорганизма.

На протяжении всего процесса ферментации ведется постоянное измерение динамики роста и накопления биомассы, для этого периодически производится отбор проб с последующим анализом и обработкой результатов. Исходя из полученных результатов, планируются стимулирующие добавки для оптимизации процесса ферментации и увеличения выхода целевого продукта. Анализ и обработка проб в процессе ферментации позволяет определить, является ли активный рост культуры основным условием для синтеза целевого продукта или же культура способна накапливать целевой продукт после накопления биомассы, синтезируя вторичные метаболиты (Аркадьева, Безбородов и др. 1989; Calam, 1979; Lai et al., 2001). Образование вторичных метаболитов не является обязательным условием в процессе культивирования продуцента.

Для оптимизации условий культивирования применяют методы математического планирования экспериментов, но для знания потребностей продуцента в условиях роста и биосинтеза целевых продуктов необходимо изучение его физиологии питания (Печуркин, Тресков, 1975).

Непрерывное культивирование микроорганизмов.

В ходе периодического культивирования возникает ряд технологических трудностей - циклический ход операций, сменные режимы, что затрудняет

контроль и регуляцию роста. Эти недостатки устраняются при непрерывном культивировании, методы которого разработали С.В. Лебедев, А.А. Андреев,

H.Д. Иерусалимский и другие ученые (Бекер, 1978). В случае непрерывного культивирования в ферментер с культурой продуцента непрерывным потоком подается стерильная среда, а из него непрерывно вытекает готовая культуральная жидкость. Процесс может быть гомо- и гетерогенно непрерывным. При гомогенно непрерывном процессе в аппарате, где идет интенсивное перемешивание, все параметры (концентрация питательных веществ, клеточный титр и др.) постоянны во времени. При гетерогенно непрерывном процессе несколько ферментеров соединены вместе и образуют каскад. Питательная среда поступает в первый ферментер и готовая культуральная жидкость вытекает из последнего ферментера (Бекер, 1978; Работнова, 1980).

I.1.3.2. Условия, необходимые при лабораторном культивировании

Микроорганизмы, культивируемые в лабораторных условиях, как правило, выделяются из естественных мест обитания и попадают в исключительно благоприятные условия питания, не свойственные для их условий существования. В лабораториях подбирается оптимальная температура развития, состав и кислотность среды, влажность и другие параметры культивирования. Организмы, выделенные из природы и перенесенные в лабораторные условия - это, по выражению Виноградского, «одомашненные, тепличные организмы». (Егоров, 2004).

При выращивании микроорганизмов в условиях лаборатории существует ряд факторов, влияющих на их свойства синтезировать те или иные метаболиты в процессе роста. К числу наиболее значимых, относится состав питательной среды и ее кислотность, температура культивирования, окислительно-восстановительные условия.

Составы питательных сред.

Для активного роста и синтеза метаболитов необходимо учитывать не только качественный и количественный состав тех или иных компонентов среды (источники углеводов, азота, микроэлементы, витамины и другие), но так же очень важны физико-химические и физические факторы, такие как температура, рН, аэрация и другие. Все эти параметры вместе, и каждый взятый в отдельности играют очень важную роль в культивировании микроорганизмов.

Все среды для выращивания микроорганизмов делятся на 2 группы: натуральные (неопределенного химического состава) и синтетические среды.

Натуральные среды состоят из продуктов растительного или животного происхождения и имеют неопределенный состав. Преимуществом таких сред является то, что в них есть все необходимые вещества для роста и развития микроорганизмов. Однако, для изучения физиологии и обменных процессов применяют синтетические среды, в состав которых входят химически чистые соединения, которые берутся в точных концентрациях (Егоров, 2004).

Компоненты питательных сред.

С целью повышения содержания полезных метаболитов при культивировании микроорганизмов очень важное значение имеет качественная характеристика компонентов питательной среды. В зависимости от содержания в питательной среде разных форм источников углерода, азота, микро и макроэлементов, других компонентов будет меняться количественное содержание целевых продуктов (метаболитов) в процессе роста и развития микроорганизма.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Карташов, Максим Игоревич, 2017 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Аверьянов А.А., Лапикова В.П., Петелина Г.Г. Защита грибными меланинами от фотодинамического повреждения. Известия Академии Наук СССР. 1986. №4: стр. 541 -549.

2. Андреева Е.И., Зинченко В.А. Системные фунгициды - ингибиторы биосинтеза эргостерина. Журнал «АгроХХ1», №4, 2002, с.14-15.

3. Аркадьева З. А., Безбородов А. М., Блохина И. Н. и др. Промышленная микробиология, 1989. - 688 с.

4. Аронов Д.М. //Consilium-Medicum. - 2001. - 10.

5. Беккер М.Е. Введение в биотехнологию. - М.: Пищевая промышленность, 1978. - 69 с.

6. Беккер М.Е. Введение в биотехнологию. - М.: Пищевая промышленность, 1978. - 232.

7. Беккер М.Е. Биотехнология микробиологического синтеза. Рига, 1980.

8. Былинкина Е.С. Проблема масштабного перехода в микробиологических процессах //Микробиологическая промышленность. 1973. - № 10.- С. 4955.

9. Билай В. И., Основы общей микологии, Высшая школа, 1989. стр. 154166.

10. Бидлингмейер Б. Препаративная жидкостная хроматография//Пер. с англ. - М.: Мир, 1990. - с.360.

11. Бирюков В.В., Кантере В.М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза. - М.: Наука, 1985. - с. 292.

12. Васюкова Н.И., Давыдова М. А., Щербакова Л.А., Озерецковская О. Л., Фитостерины как фактор, предохраняющий возбудителя фитофтороза картофеля от действия фитоалексинов. //ДАН, т. 235, №1, 1977. - С. 216219.

13. Воинова Т.М., Вавилова Н.А., Терехова В.А., Деблова З.Н., Дьяков Ю.Т. Изменчивость фитопатогенного гриба Pyricularia oryzae cav. II. Характеристика морфологических мутантов гриба. Биологические науки. 1984. №1: стр. 78 - 82.

14. Виестур У. Э., Кузнецов А. М., Савенков В. В., Системы ферментации. -Рига: Зинатне, 1972. стр. 304.

15. Виестур У.Э., Кристапсонс М.Ж., Былинкина Е.С. Культивирование микроорганизмов. - М.: Пищевая промышленность, 1980. стр. 157- 168.

16. Винаров Ю.А., Гордеев Л.С., Кухаренко А.А., Панфилов В.И. Ферментационные аппараты для процессов микробиологического синтеза. Под редакцией Быкова В.А. Москва, ДеЛи принт, 2005.

17. Гальцева Р. Д. Стеринообразование у дрожжевых организмов. Москва. Наука. 1980. стр.244.

18. Ганиев М.М., Недорезков В.Д. Химические средства защиты растений. -М.: КолосС, 2006. - 248 с.

19. Голышин Н.М. Фунгициды. Москва «Колос», 1993. 319 с.

20. ГОСТ 12044-93. Метод анализа развития болезней на проростках зерновых культур в рулонах фильтровальной бумаги. Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения зараженности болезнями. Москва. переиздание 2011.

21. Гришечкина Л.Д., Ишкова Т.И. Корневые гнили: как распознать болезнь и как эффективно ее подавить.//газета Поле Августа. 2004. №2 6. с. 17.

22. Джавахия В.Г., Аверьянов А.А, Минаев В.И., Ермолинский Б.С., Воинова Т.М., Лапикова В.П., Петелина Г.Г., Вавилова Н.А. Структура и функции меланина клеточной стенки микромицнта Pyricularia oryza Сav. -возбудителя пирикуляриоза риса. Журнал общей биологии. 1990. т.51, №4: стр. 528 -535.

23. Джавахия В. В., Воинова Т. М. Оптимизация условий культивирования гриба Aspergillus terreus - продуцента ловастатина - вещества

оказывающего защитное влияние на растения. Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии // Материалы Всероссийского совещания, Голицыно, 16-18 июля 2003, с.198-201.

24. Джавахия В.В., Воинова Т.М., Украинцева С.Н. Изучение процесса ферментации штамма гриба Penicillium crustosum - продуцента компактина // Сборник 2-я Международной конференции «Наука -Бизнес - Образование» Пущино, 10-13 мая 2005, с.71-73.

25. Джавахия В.В., Петелина Г.Г. Влияние ловастатина на фитопатогенные грибы // АгроХХ1, Вып. 4-6, 2008, с. 33 -35.

26. Дорофеев В. Л., Арзамасцев А. П., Садчикова Н. П. Проект общей фармакопейной статьи «Высокоэффективная жидкостная хроматография». Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2004. стр. 166-172.

27. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. Москва. Агропромиздат, 1985.

28. Дьяков Ю.Т., Шнырева А.В., Сергеев А.Ю. Введение в генетику грибов: Учеб. Пособие для студ. высш. учеб. заведений / - М.: Издательский центр "Академия", 2005. стр. 304.

29. Егоров Н.С., Баранова Н.А., Крейер В.Г. Антибиотики и химиотерапия. -1999. - №5. -С.38-44.

30. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках: Классический университетский сборник / Издательство «Наука» /Москва 2004. стр. 63.

31. Жуков Ю.Н., Вавилова Н.А., Воинова Т.М., Хурс Е.Н., Хомутов Р.М. Аминоалкилфосфинаты - новые эффективные ингибиторы меланиногенеза и фунгициды. Доклады Академии Наук СССР, Биохимия, Биофизика, Молекулярная Биология. 2004. т. 398, № 5: стр. 1 - 3.

32. Захаров И.А., Ковальцова С.В., Кожина Т.Н., Федорова И.В., Яровой Б.Ф. Мутационный процесс у грибов: Издательство «Наука», 1980.-287с.

33. Зиновьева C.B., Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л. Роль стеринов во взаимоотношениях растений с паразитическими нематодами // Доклады АН СССР, 1989, Т.309, С.1273-1275.

34. Инге-Вечтомов. Метаболизм стеринов и защита растений. Биология. 1997. стр 64-67.

35. Карташов М.И., Джавахия В.Г. «Изучение возможности использования правастатина в защите растений от грибных и вирусных патогенов». Вестник защиты растений, 2010, № 3, с. 39-43.

36. Карташов М.И., Щербакова Л. А., Дорофеева Л. Л., Джавахия В. Г. Активность правастатина против Bipolaris sorokiniana. Защита и карантин, 2011, № 4, с. 34.

37. Карташов М.И., Дорофеева Л.Л., Щербакова Л.А., Джавахия В.Г. «Защитное действие правастатина против возбудителя гельминтоспориоза на яровом ячмене». Сельскохозяйственная биология, 2014, № 3, с. 108-112.

38. Кантере В. М. Учебники и учебные пособия для студентов высших учебных заведений - М. Теоретические основы технологии микробиологических производств. Агропромиздат, 1990. с. 271.

39. Кирай 3., Клемент 3., Шоймоши и др. Методы фитопатологии, перевод с английского. М.: Колос, 1974.

40. Левитин М.М., Федорова И.В. Генетика фитопатогенных грибов 1972 издательство наука Ленинград ст 26.

41. Лутова Л.А., Ходжайова Л.Т. "Молекулярно-генетические аспекты устойчивости высших растений к вредителям сельского хозяйства", Генетика,1998, том 34, №6, стр. 719-729.

42. Лутова Л.А., Бондаренко Л.В., Козырева О.Г., Инге-Вечтомов С.Г. Получение мутантов растений с измененным составом фитостеринов, обладающих устойчивостью к насекомым. Создание лабораторной

модели "растение - насекомое'7/Вестник Ленинградского университета. -Сер.3. - вып.2. - №10, 1990.- Стр. 82-87.

43. Матвеев В. Е. Научные основы микробиологической технологии. Кинетика развития и инактивации микробных популяций, асептика, масштабирование. - М., Агропромиздат, 1985. стр. 224.

44. Метлицкий Л. В., Озерецковская О. Л., Васюкова Н. И., Давыдова М. А., Сегаль Г. М. Роль стеринов во взаимоотношениях картофеля и Phytophtora infestans. Доклады АН СССР, 1976. 276, № 1, 244.

45. Метлицкий Л. В., Озерецковская О. Л., Васюкова Н. И. Фитостерины и их роль во взаимоотношениях растений с паразитарными грибами (на примере грибов Pythiaceae). Успехи современной биологии. 1980. Т.89. стр. 28-41.

46. Минкевич И.И., Захарова Т.И. Математические методы в фитопатологии, 1977. - с. 18-27.

47. Пересыпкин В.Ф. Сельскохозяйственная фитопатология. М.: Колос, 1974. стр. 559.

48. Пересыпкин В.Ф., Тютерев С.Л., Баталова Т.С. Болезни зерновых культур при интенсивных технологиях их возделывания. - М.: Агропромиздат, 1991. - с. 271.

49. Пересыпкин В. Ф., Марков И. JI., Коваленко С. Н. Сельскохозяйственная фитопатология: Метод, указания по изучению дисциплины для контрольных работ и курсового проекта. // Всесоюзн. с.-х. ин-т заоч. Образования. - 1992. -с. 110.

50. Печуркин Н.С., Тресков И. А. Анализ кинетики роста и эволюции микробных популяций (в управляемых условиях). Новосибирск, 1975. стр. 88-94.

51. Платонова Т.А., Васюкова Н.И., Давыдова М.А. Влияние дефицита стеринов на спороношение Phytophthora infestans (Mont) de Bary //

Прикладная биохимия и микробиология. - 1977. - Т.13. - Вып. 6. - с. 907-913.

52. Помелов А.В. Эффективность использования биопрепаратов планриз и псевдобактерин-2 в борьбе с Bipolaris sorokiniana и Fusarium spp. Влияние псевдомонадных препаратов на корневые гнили ячменя // Современные аспекты селекции, семеноводства, технологии, переработки ячменя и овса/ Науч.-исслед. ин-т сел. хоз-ва Северо-Востока.-Киров, 2004.-С. 140-142.

53. Попов С.Я. Основы химической защиты растений. Попов С.Я., Дорожкина Л.А., Калинин В.А./ Под ред. профессора С.Я Попова. - М.: Арт-Лион, 2003. - 208 с.

54. Приданников М.В., Петелина Г.Г., Пальчук М.В., Воинова Т.М., Джавахия В.Г. Изучение возможности использования компактина и ловастатина в защите растений от фитопатогенов и вредителей. Мат. Всероссийского совещания «Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии». Голицыно, 2003: 179.

55. Пыжикова Г.В., Санина А.А., Супрун Л.М., Курахтанова Т.И., Гогаева Т.И., Мепаришвили С.У., Анциферова Л.В., Кузнецов Н.С., Игнатов А.Н., Кузьмичев А.А. Методы оценки устойчивости селекционного материала и сортов пшеницы к септориозу. - М. - 1989. - 44 С.

56. Работнова И. Л. Теория и практика непрерывного культивирования. М., 1980. стр. 69-73.

57. РАСХН ГНУ ВНИИ картофельного хозяйства им А. Г. Лорха//Инстркуция по применению иммуноферментного диагностического набора для определения вирусов картофеля. -Коренево, 2006.

58. Складнев Д. А. Метилотрофные бактерии как основа биотехнологического получения стабильно меченых биологически

активных соединений: Диссертация доктора биологических наук: 03.00.23 М., 2000

59. Сусеков А.В. Обоснование увеличения доз статинов в клинической практике. Терапевтический архив, 2001. - №4. - С. 76-80

60. Сусеков А.В. Ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы при вторичной профилактике атеросклероза: 30 лет спустя. // Consilium medicum. - 2005. - N 11. - С. 896-903.

61. Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая Высокоэффективная Жидкостная хроматография, М. 1986.

62. ТАРР С. "Основы патологии растений" -. Изд. Мир,1975 г.

63. Тарлаковский С.А. Стерины: их метаболизм, функции и роль во взаимоотношениях растений с вредными организмами. Биохимические аспекты проблем защиты растений от болезней, вредителей и сорняков: Тр. ВИЗ Ра. 1977. стр. 156-169.

64. Тютерев С.Л. Химические протравители. Протравливание семян зерновых колосовых культур. Москва: Журнал «Защита и карантин растений», 2005. - с.106-109.

65. Украинцева С.Н., Приданников М.В., Джавахия В.Г. Компактин -потенциальный биопестицид. Защита и карантин растений. 2008. № 2. 64.

66. Украинцева С.Н. Изучение возможности использования компактина в качестве биопестицида против фитопатогенов и получение высокопродуктивных штаммов гриба Penicillium citrinum - продуцента компактина. Автореферат диссертации, 2007.

67. Федосеев К. Г. Физические основы и аппаратура микробного синтеза биологически активных соединений. М., 1977.

68. Феклистова И.Н., Максимова Н.П. Бактерии Pseudomonas aurantiaca B-162 как основа биопрепарата для защиты растений // Земляробства i ахова раслш. 2006. № 2. С. 42-44.

69. Ходжайова Л.Т., Левашина Е.А., Усольцева М.Ю., Бондаренко Л.В., Лутова Л.А. "Изменение содержания растительных стеринов как способ биологической борьбы с фитостерин-зависимыми организмами." Генетическая инженерия и экология, 2000, №1 стр. 124-128.

70. Шевченко О.П., Шевченко А.О. Статины ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы. М.: Реафарм, 2003.

71. Щербакова Л.А. Участие стеринов во взаимоотношениях картофеля и возбудителя фитофтороза Phytophthora infestans (Mont.) De Вагу.// Автореф. диссер. канд. биол. наук. - М.-1981.-23с

72. Abbott W.S.. A method for computing the effectiveness of an insecticide. J. Econ. Entomol. 1925. 18: 265-267.

73. Allard H.A. The mosaic disease of tobacco // USDA Bull. - 1914. - P. 40.

74. Altshul R., Hoffer A., Stephen J.D. Influence of nicotinic acid on serum cholesterol in man. Archive of Biochemistry and Biophysics, 1955.54: 558 -559.

75. Baker B., Zambryski P., Staskawicz B. and Dinesh-Kumar S.P. Signaling in plant-microbe interactions // Science. - 1997. - V. 276. - P. 726-733.

76. Bri G. T., Drew S.W., and B.C. Buckland. Fermentation process development within a computer controlled pilot plant. Computers in Fermentation Technology: Progress in Industrial Microbiology Vol. 25 (Bushnell, M.H., ed.) Science Publishers. Amsterdam. 1988. 151-194.

77. Brown M.S., Goldstein J.L. A tribute to Akira Endo, discoverer of a "Penicillin" for cholesterol.// Athersclerosis. - 2004. - 5(Suppl.). - P. 13-16.

78. Butler M.J., Day A.W., Henson J.M. and Money N.P. Pathogenic properties of fungal melanins. //Mycologia . - 2001. - 93. - P. 1-8.

79. Butler MJ, Gardiner RB, Day AW Degradation of melanin or inhibition of its synthesis: are these a significant approach as a biological control of phytopathogenic fungi? Biol Control. 2005. 32:326-336.

80. Calam C. T. Secondary metabolism as an expression of microbial growth and development. Folia Microbiology. 1979. 24:276-85.

81. Chen Z, Nunes MA, Silva MC, Rodrigues CJ Jr Appressorium turgor pressure of Colletotrichum kahawae might have a role in coffee cuticle penetration. Mycologia 96: 2004. - 1199-1208.

82. Dadachova E, Bryan RA, Huang X, Moadel T, Schweitzer AD, Aisen P, Nosanchuk JD, Casadevall A. Ionizing radiation changes the electronic properties of melanin and enhances the growth of melanized fungi. PLoS One 2. 2007. e. 457.

83. Demain Arnold, Peng Yulin, Yashphe Jacob, Davis Joseph. Conversion of compactin to pravastatin by actinomadura.//World Intellectual Property Organization: International Bureu; International Publication Number: WO 96/40863; International Publication Date: 19 December 1996.

84. De Bolle M.F.C., Osborn R.W., Goderis I.J., Noe L., Acland D., Hart C.A., Torrekens S., Leuven F.V., Broekaert W.F. Antimicrobial peptides from Mirabilis jalapa and Amaranthus caudatus: expression, processing, localization and biological activity in transgenic tobacco // Plant Mol. Biol. -1996. - V. 31. - P. 993-1008.

85. Dhingra O.D., Sinclair J.B. Basic Plant Pathology Methods // CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida - 1986.

86. Dinesh-Kumar S.P., Whitham S., Choi D., Hehl R., Corr C. and Baker B. Transposon tagging of tobacco mosaic virus resistance gene N: its possible role in the TMV- N-mediated signal transduction pathway // Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 1995. - V. 92. - P. 4175-4180.

87. Dighton J, Tugay T, Zhdanova N Fungi and ionizing radiation from radionuclides. FEMS Microbiol Lett. 2008. 281:109-120.

88. Djavakhia V.G., Nikolaev O.N., Voinova T.M., Battchikova N.V., Korpela T. and Khomutov, R.M. DNA sequence of gene and amino acid sequence of protein from Bacillus thuringiensis, which induces non-specific resistance of

plants to viral and fungal diseases // J. Russ. Phytopathol. Soc. - 2000 - V. 1. -P. 75-81.

89. Dzhavakhiya V.V., Voinova T.M. Newly developed strains-producers of cholesterol-lowering drugs - statins - with industrial level of productivities, Fermentation Technology for industrial production and Recovery Technologies of statins // The Proceedings for the 26th ISTC Japan Conference on Advanced Biotechnologies in Russia/CIS. Япония, Токио, 19 сентября, 2003, с.149-159.

90. Dzhavakhiya V.V., Voinova T.M. Optimization of Fermentation Conditions for High Lovastatin Producing Mutant 45-50 of Fungus Aspergillus terreus // Biotechnology and Industry. Nova Science Publisher Inc. New York, ISBN1-59454-116-7, 2004, pp. 81-87.

91. Elliot C. G., Hendrix M. R., Knights B. A., Parker W. Interactions between steroids in the growth of Phytophthora Nature. 1964. 203-427.

92. Endo A United States Patent No.3, 983,140; September, 28, 1976.

93. Endo A., Compactin (ML-236B) and related compounds as potential cholesterol-lowering agents that inhibit HMG-CoA reductase.// J. Med. Chem. - 1985. - 28. - P. 1401-1425.

94. Endo A., Brown, M.S., J.R. Faust, J.I.. Goldstein, 1. Kaneko and. Induction of 3-hydroxy-3-methylglularyl coenzyme A red net use activity in human fibroblasts incubated with compactin (ML-236B], a competitive inhibitor of the reductase. J. Biol. Chem. 1992. 253: 1121-1128.

95. Endo A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors.// Atherosclerosis Supplements. - 2004.

96. Endo A. and M. Kuroda. Citrinin, an inhibitor of cholesterol synthesis. Journal of Antibiotics (Japan) 1976.

97. Endo A., Discovery and development of the strains, in: Statins The HMG-CoA Reductase Inhibitors in Perspective.// Martin Dunitz, London. - 2000. - P. 3547.

98. Endo A., Kuroda M. and Tanzawa K. Competitive inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase by ML-236A and ML-236B fungal metabolites, having hypocholesterolemic activity.// Atherosclerosis Supplements. - 2004.

99. Gachomo EW, Seufferheld MJ, Kotchoni SO. Melanization of appressoria is critical for the pathogenicity of Diplocarpon rosae. Mol. Biol. 2010. Rep 37:3583-3591.

100. Gaw A., Packard C.J., Shepherd J. Statins: The HMG-CoA reductase inhibitors in perspective. - 2004. - Second editon. - P. 262.

101. Goldsmith G. A., Hamilton J.G. and Miller O.N. Lowering of serum lipid concentrations. Mechanisms used by unsaturated fats, nicotinic acid and neomycin: excretion of sterols and bile acids. Archives of International Medicine, 1960. 105: 512 - 517.

102. Henson J.M., Butler M.J., Day A.W. The dark side of the mycelium: melanins of phytopathogenic fungi, Annu. Rev. Phytopathol., 1999, 37: 447471.

103. Holmes F.O. Inheritance of resistance to tobacco mosaic disease in tobacco // Phytopathol. - 1938. - V. 28. - P. 553-561.

104. Hosobuchi M., Kurosawa K. and Yoshikawa H. Applicatioin of computer to monitoring and control of fermentation process: nicrobial conversion of ML-236B Na to pravastatin. // Biotechnology and Bioengineering. - 1993. - V. 42. - P. 815-820.

105. Howard R.J., Valent B. Breaking and entering: host penetration by the fungal rice blast pathogen Magnaporthe grisea. Annu Rev Microbiol. 1996. 50:491-512.

106. Jonathan A. Lovastatin and beyond: the history of the HMG-CoA reductase inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery 2, 517-526 (July 2003) doi:10.1038/nrd1112

107. Kaneko I., Hazama-Shimada Y., Endo A. Inhibitory effects on lipid metabolism in cultured cells of ML-236B, a potent inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase.// Eur. J. Biochem. - 1978. -87. -P.313-321.

108. Kysilka R. Determination of lovastatin (mevinolin) and mevinolinic acid in fermentation liquid. Chromatograph. 1993. 415.

109. Kubo Y., Suzuki K., Furusawa I. and Yamamoto M. Melanin biosynthesis as a prerequisite for penetration by appressoria of Colletotrichum lagenarium: site of inhibition by melanin-inhibiting fungicides and their action on appressoria. Pesticide Biochemistry and Physiology. 1985. 23: 47 - 55.

110. Kuroda M., Tsujita Y., Tanzawa K., Kitano N., Endo A. Hypolipidemic effects in monkeys of ML-236B, a competitive inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. // Lipids. - 1979. - Vol.14. - P. 585589.

111. Lai LST, Kuo CM, Tsai SY, Influence of increased dissolved oxygen tensions by agitation on the secondary metabolite production by a mutant Aspergillus terreus in a 5L fermenter. J Chin Inst Chem Eng. 2001. 32: 42-135

112. Manzoni M., Rollini N. Biosynthesis and biotechnological production of statins by filamentous fungi and application of these cholesterol-lowering drugs. // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2002. - 58. - 5. - P. 555-564.

113. Mohorcic M., Friedrich J., Renimel I., André P., Mandin D., Chaumont J.-P. Production of melanin bleaching enzyme of fungal origin and its application in cosmetics. Biotechnol Bioprocess. 2007 Eng 12:200-206.

114. Nosanchuk J.D., Casadevall A.. Budding of melanized Cryptococcus neoformans in the presence or absence of L-dopa. Microbiology. 2003a. 149:1945-1951.

115. Nosanchuk J.D., Casadevall A.. The contribution of melanin to microbial pathogenesis. Cell Microbiol. 2003b. 5:203-223.

116. Nosanchuk J.D., Casadevall A.. Impact of melanin on microbial virulence and clinical resistance to antimicrobial compounds. Antimicrob Agents Chemother. 2006. 50:3519-3528.

117. Pollak O.J. Reduction of blood cholesterol in man ccirculation. Archives of International Medicine, 1953. 7: 702 - 706.

118. Romanenko N.D., Popov I.O., Pridannikov M.V. and Dzhavakhia V.G. Study of spreading Potato Cyst Nematode - Globodera rostohiensis and evalution of Lovastatin and Compactin nematicide activity. Conference: Theory and Practice of Plant Parasitic Pathogens.Moscow, 2002. - P.251-257.

119. Rosa L.H., Vieira L.M.A., Santiago I.F., Rosa C.A.. Endophytic fungi community associated with the dicotyledonous plant Colobanthus quitensis (Kunth) Bartl. (Caryophyllaceae) in Antarctica. FEMS Microbiol Ecol. 2010. 73:178-189.

120. Samuel G. Some experiments on inoculating methods with plant viruses, and on local lesions // Ann. Appl. Biol. - 1931. - V. 18. - P. 494-507.

121. Shlosser E., Gottieb D. Sterols and the Sensitivity of Pythium Species to Filipin. Bacteriology. 1966. 91: 1080 - 1968.

122. Schweitzer A.D., Howell R.C., Jiang Z., Bryan R.A., Gerfen G., Chen C.C., Mah D., Cahill S., Casadevall A., Dadachova E.. Physicochemical evaluation of rationally designed melanins as novel nature-inspired radioprotectors. PLoS One. 2009. 4:e7229.

123. Schweitzer A.D., Revskaya E., Chu P., Pazo V., Friedman M., Nosanchuk J.D., Cahill S., Frases S., Casadevall A., Dadachova E.. Melanin-covered nanoparticles for protection of bone marrow during radiation therapy of cancer. Int J Radiat Oncol. Biol. Phys. 2010. 78:1494-1502.

124. Serizawa, N. and T. Matsuoka: A two component type cytochrome P-450 monooxygenase system in a prokaryote that catalyzes hydroxylation of ML-236B to pravastatin, a tissue-selective inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Biochemistry Biophysics. 1998. 1084: 36-40.

125. Schlosser E., Gottlieb D. Microbiology, 1968. - P.246.

126. Siperstein M.D. Regulation of cholesterol biosynthesis in normal and malignant tissues. Current Topics of Cellular Regulations. 1970. 2: 65 - 100.

127. Siperstein M.D. and V.M. Fagan. Feedback control of mevalonate synthesis by dietary cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 1966. 241: 602 - 609

128. Starr P., Roen P., Freibrun J.L. Reduction of serum cholesterol by sodium D-thyroxin. Archives of International Medicine, 1960. 105: 830 - 842.

129. Tanazawa K., M. Kuroda and A. Endo. Time-dependent, irreversible inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase by citrinin. Biochimica et Biophysica. 1977. 488: 97 - 101

130. Taupitz A. and K. Otaguro. The effects of estrogens on the serum cholesterol of male rats. Symposium der Deutschen Gesellschaft für Endokrinologie, 1959. 430 - 432.

131. Tennet, D.M., Siegel, M. E., Zanetti G. W., Kuron W. H., and Walf F.J. Plasma cholesterol lowering action of binding polymers in experimental animals. Journal of Lipid Researches. 1960 1:469 - 473.

132. Thorp J.M. and W.S. Warning. Modification of metabolism and distribution of lipids by ethyl chlorophenoxyisobutyrate. Nature, 1962. 194: 948 - 949.

133. Turick C.E., Ekechukwu A.A., Milliken C.E., Casadevall A., Dadachova E.. Gamma radiation interacts with melanin to alter its oxidation-reduction potential and results in electric current production. Bioelectrochemistry. 2011. 82:69-73.

134. Ukraintseva S.N., Voinova T.M., Dzhavakhiya V.G. Obtaining the highly productive mutants Penicillium citrinum producing compactin and optimization of fermentation process in shaken flasks. // Biotechnology in Biology and Medicine. / Ed. A.M. Egorov, G.E. Zaikov / N.Y.: Nova Sci. Publ., 2006. P.95-101.

135. Ukraintseva S.N., Voinova T.M., Dzhavakhiya V.G. Penicillium citrinum strain improvement for compactin production by induced-mutagenesis and

optimization of obtained mutant cultivation conditions. // Biotechnology and Medicine. / Ed. G.E. Zaikov N.Y.: Nova Sci. Publ., 2004. P.69-76.

136. Wakamatsu K., Ito S. Advanced chemical methods in melanin determination. Pigment Cell Res. 2002. 15:174-183.

137. Watve M.G. et al (2001). "How many antibiotics are produced by the genus Streptomyces?". Arch. Microbiol. 176 (5): 386-90

138. Whitham S., Dinesh-Kumar S.P., Choi D., Hehl R., Corr C. and Baker B. The product of the tobacco mosaic virus resistance gene N: similarity to toll and the interleukin-1 receptor // Cell. - 1994. V. - 78. - P. 1101-1115.

139. www.hplc.ru.

140. Yamamoto A., Sudo H., Endo A. Therapeutic effects of ML-236B in primary hypercholesterolemia. // Atherosclerosis. - 1980. - P. 259-266.

141. Zadoks J.C., Schein R.D. Epidemiology and plant disease management. NY, 1979.

142. Zalar P., Novak M., de Hoog G.S., Gunde-Cimerman N. (2011) Dishwashers—a man-made ecological niche accomodating human opportunistic fungal pathogens. Fungal Biol 115:997-1007

143. Zhdanova N.N., Zakharchenko V.A., Vember V.A., Nakonechnaya L.T. (2000) Fungi from Chernobyl: mycobiota of the inner regions of the containment structures of the damaged nuclear reactor. Mycology Research 104:1421 -1426