Состав и осахаривающая способность ферментных препаратов, полученных с помощью новых рекомбинантных штаммов Penicillium verruculosum тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат химических наук Правильников, Артем Геннадиевич

• Правильников, Артем Геннадиевич
• кандидат химических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат химических наук Правильников, Артем Геннадиевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ РАСТЕНИЙ И ИХ

СВОЙСТВА

1.1. Целлюлоза

1.2. Гемицеллюлозы и пектины

1.3. Лигнин

ГЛАВА 2. ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЖЕРЖАЩИЕ МАТЕРИАЛЫ (ЦСМ)

2.1. Общая характеристика состава ЦСМ

2.2. ЦСМ как перспективный источник сырья и энергии

2.3. Предобработка целлюлозы и целлюлозосодержащих материалов

ГЛАВА 3. БИОКАТАЛИТИЧЕСКАЯ ДЕГРАДАЦИЯ ЦСМ

3.1. Современная классификация целлюлаз

3.2. Основные ферменты целлюлолитического комплекса

3.3. Механизм биокаталитической деградации целлюлозы

3.4. Факторы, влияющие на эффективность ферментативного гидролиза целлюлозы

ГЛАВА 4. СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ПОЛУЧЕНИЮ НОВЫХ ШТАММОВ-

ПРОДУЦЕНТОВ ЦЕЛЛЮЛАЗ

4.1. Общая характеристика подходов к оптимизации состава ферментных комплексов

4.2. Система экспрессии в грибах рода Pénicillium

II. ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 5. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

5.1. Ферментные препараты

5.2. Субстраты

5.3. Прочие реактивы

5.4. Хроматографические сорбенты

5.5. Получение протопластов и проведение трансформации штамма-реципиента гриба Р. verruculosum

5.6. Культивирование трансформантов

5.7. Метод определения компонентного состава ферментных препаратов

5.8. Определение концентрации белка

5.9. Определение биохимических характеристик ферментов

5.10. Методы определения активности ферментов

5.11. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов белков

5.12. Определение температурного и pH-оптимума действия ферментных препаратов

5.13. Изучение термостабильности ферментных препаратов

5.14. Гидролиз ЦСМ

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 6. Получение ферментных препаратов, полученных с помощью новых

рекомбинантных штаммов Р. verruculosum

6.1. Трансформация штамма - реципиента Р.verruculosum 537

6.2. Результаты первичного скрининга трансформантов «тандем»

6.3. Результаты первичного скрининга трансформантов «дуплет»

6.4. Результаты первичного скрининга трансформантов «триплет»

6.5. Получение сухих ферментных препаратов

ГЛАВА 7. Физико-химические свойства новых ферментных препаратов, полученных с

помощью рекомбинантных штаммов Р. verruculosum

7.1. Анализ ферментных препаратов методом ДДС-электрофореза в денатурирующих условиях

7.2. Анализ активностей ферментных препаратов по отношению к различным субстратам

7.3. pH- и температурные оптимумы активности и стабильности ферментных препаратов

ГЛАВА 8. Определение компонентного состава новых рекомбинантных ферментных

препаратов

глава 9. верификация уровня экспресии ферментов новых рекомбинантных штаммов р. УЕшисиюзим осахаривающей

СПОСОБНОСТЬЮ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ЦСМ

9.1. Результаты гидролиза измельченной микрокристаллической целлюлозы

9.2. Результаты гидролиза измельченной обессмоленной сосновой древесины

9.3. Результаты гидролиза измельченной осиновой древесины

9.4. Результаты гидролиза измельченной багассы

Выводы

Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ Ферменты

ЦБГ - целлобиогидролаза ЭГ - эндоглюканаза рГЛ - р-глюкозидаза Ксил - ксиланаза КГ - ксилоглюканаза

Прочие сокращения

ЦСМ - целлюлозосодержащие материалы

ЦСД - целлюлозосвязывающий домен

КЖ - культуральная жидкость

ВС - восстанавливающие сахара

ИЭФ - изоэлектрофокусирование

КМЦ - Ка-соль карбоксиметилцеллюлозы

МКЦ - микрокристаллическая целлюлоза

ПААГ - полиакриламидный гель

ДДС-Ыа - додецидсульфат натрия

ПГУ - К-соль полигалактуроновой кислоты

/?НФ - и-нитрофенол

иНФГ - я-нитрофенил-Р-Б-глюкопиранозид СП - степень полимеризации

ДДС-ЭФ - электрофорез в денатурирующих условиях

ГКА - гидрофобный кластерный анализ

МУФ - метилумбеллиферил

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ПАВ - поверхностноативные вещества

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Состав и осахаривающая способность ферментных препаратов, полученных с помощью новых рекомбинантных штаммов Penicillium verruculosum»

ВВЕДЕНИЕ

В современном мире четко прослеживается тенденция к приоритетному развитию альтернативной энергетики, основанной на возобновляемых источниках энергии, и к сокращению доли углеводородного сырья в глобальном энергетическом балансе.

Общие запасы на Земном шаре возобновляемого сырья, представляющего собой растительную биомассу, оцениваются в приблизительно в 800-1000 млрд. т, причем ежегодно в результате фиксации 1021 кал солнечной энергии образуется примерно 50 млрд. т биомассы, а также накапливается около 4-5 млрд. т отходов или вторичных продуктов промышленной и сельскохозяйственной переработки растений и древесины [1,2].

Таким образом, в растительная биомасса играет роль возобновляемого источника сырья, в том числе для получения биотоплива и сможет конкурировать с нефтью.

Главным компонентом растительной биомассы являются природные полисахариды - целлюлоза и гемицеллюлоза. Их биодеградация осуществляется под действием целлюлазных и гемицеллюлазных мультиферментных комплексов. Целлюлазы включают в себя эндоглюканазы, целлобиогидролазы и Р-глюкозидазы; гемицеллюлазы представлены ксиланазами, (3-ксилозидазами, маннаназами, арабиназами, галактаназами и рядом других ферментов.

В настоящее время на мировом рынке представлен широкий спектр ферментных препаратов, полученных с помощью грибов рода Тпскойегта. Эти препараты традиционно применяются для гидролиза растительного сырья, однако они обладают рядом существенным недостатком, заключающимся в относительно низкой эффективности гидролиза - в первую очередь из-за того, что в составе ферментных комплексов ТпсЪо(1егта наблюдается недостаток Р-глюкозидазы (целлобиазы), что приводит к накоплению в реакционной смеси в качестве одного из продуктов целлобиозы, которая ингибирует наиболее важные для осахаривания ферменты целлобиогидролазы.

Эффективность процесса получения Сахаров зависит от ряда факторов и в значительной степени - от состава комплекса целлюлолитических ферментов и синергетического взаимодействия индивидуальных ферментов в нем.

Поэтому в настоящее время в области ферментативного гидролиза возобновляемого растительного сырья весьма активно развиваются фундаментальные и прикладные исследования, направленные на поиск и получение новых штаммов-суперпродуцентов целлюлаз, гемицеллюлаз и сопутствующих ферментов, обладающих высокой гидролитической способностью и имеющих «управляемый» состав ферментов,

так, чтобы комплекс продуцируемых ферментов был наилучшим образом адаптирован к осахариванию соответствующих видов целлюлозосодержащих материалов (ЦСМ).

Грибы рода Pénicillium, в отличие от Trichoderma, продуцируют комплексы целлюлитических ферментов более сбалансированного состава, которые эффективнее расщепляют целлюлозу и целлюлозосодержащие материалы [3].

Таким образом, создание новых рекомбинантных штаммов на основе штамма гриба P.verruculosum, продуцирующих мультиферментные комплексы карбогидраз, обладающих улучшенной осахаривающей способностью по отношению к природному растительному сырью, является важной и актуальной задачей, поскольку применение данных мультиферментных комплексов будет способствовать увеличению эффективности процессов переработки целлюлозосодержащих материалов.

Ранее нами были разработаны подходы к получению эффективных ферментных препаратов, основным из которых является создание штаммов-продуцентов, содержащих индивидуальные целевые гены целлюлаз. Стратегия создания таких штаммов-продуцентов заключалась в последовательной трансформации штамма-реципиента одной плазмидой, несущей целевой ген, совместно с ко-трансформацией плазмидой pSTAlO, позволяющей отбирать трансформанты при культивировании на селективной среде. Основываясь на данных по встройке отдельных целевых генов и распределению целевых активностей в конечных ферментных препаратах, нами была разработана новая стратегия получения штаммов-продуцентов с заданными свойствами, заключающаяся в одновременной трансформации штамма-реципиента несколькими плазмидами с целевыми генами, а также трансформация экспрессионной кассетой, представляющей собой линейный участок ДНК с несколькими целевыми генами.

Целью диссертационной работы являлось получение новых рекомбинантных штаммов Pénicillium verruculosum и ферментных препаратов на их основе, обладающих увеличенной осахаривающей способностью.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• получить экспрессионные плазмиды, содержащие гены целлюлаз (эндо-1,4-ß-глюканазы II (egl2) P.verruculosum), целлобиогидролазы II (cbhll)) Trichoderma reesei и P.verruculosum и ß-глюкозидазы Aspergillus niger под контролем сильного индуцибельного промотора целлобиогидролазы I (cbhl);

• провести трансформацию штамма-реципиента P.verruculosum 537 (niaD~) и осуществить скрининг трансформантов на целевые активности;

• исследовать каталитические, физико-химические и биохимические свойства новых ферментных комплексов, продуцируемых полученными новыми рекомбинантными штаммами;

• определить компонентный состав ферментных комплексов;

• проанализировать осахарившощую способность наиболее перспективных ферментных комплексов по отношению к различным видам цел л юл о з о с о держат ни х материалов (измельченной багассе, измельченной обессмоленной сосновой древесине, измельченной осиновой древесине и микрокристаллической целлюлозе) и сравнить ее с осахаривающей способностью имеющихся коммерческих и лабораторных ферментных препаратов.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Правильников, Артем Геннадиевич

ВЫВОДЫ:

1. Впервые с помощью метода одновременной трансформации несколькими плазмидами, несущими индивидуальные гены гомологичных и гетерологичных целлюлаз, грибного штамма-реципиента Penicillum verruculosum, созданы новые рекомбинантные штаммы, обладающие способностью к повышенной продукции гетерологичной (3-глюкозидазы Aspergillus niger, а также штаммы с увеличенным уровнем продукции гомологичных эндо-1,4-[3-глюканазы II и целлобиогидролазы II.

2. Анализ компонентного состава ферментных препаратов, полученных с помощью новых рекомбинантных штаммов P.verruculosum рГл+ЭГП (с увеличенным содержанием РГЛ A.niger), рГл-ЦБГП Р.у и рГл-ЦБГПР. v-ЭГН-1 (с увеличенным содержанием РГЛ A.niger и ЭГП P.verruculosum) показал, что содержание рекомбинантных ферментов в них составляет 2-30% от общего пула секретируемого белка, при этом в целом сохраняется состав целлюлолитического комплекса реципиентного штамма P. verruculosum.

3. Ферментные препараты, полученные на основе новых рекомбинантных штаммов Р. verruculosum, значительно эффективнее гидролизуют различные виды предобработанных хвойной и лиственной древесины, а также багассы, обеспечивая увеличение выхода восстанавливающих Сахаров и глюкозы на 19-50% по сравнению с коммерческими ферментными препаратами, полученными с использованием штаммов грибов рода Trichoderma, и препаратами, полученными на основе исходного штамма P.verruculosum.

4. Исследованы физико-химические и биохимические свойства ферментных препаратов, обладающих наибольшей осахаривающей способностью. Установлено, что оптимумы действия ферментных препаратов располагаются в области рН 3,5-6,5 и при температурах от 50 до 60°С, а также стабильны в температурном диапазоне 35-65°С.

В заключение сформулируем общие выводы из литературного обзора:

1. Отходы дерево - перерабатывающей и сельскохозяйственной промышленности (ЦСМ) являются перспективным сырьем для получения различных полезных продуктов, в том числе биотоплива.

2. Для эффективного гидролиза различных видов ЦСМ необходимо получать сложные целлюлолитические ферментные комплексы заданного состава и свойств.

3. Создание новых стратегий к получению высокоэффективных продуцентов целлюлолитических ферментов является одной из приоритетных задач современной энзимологии, биохимии и биотехнологии целлюлаз.

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 5. Объекты исследования и методы экспериментов

5.1. Ферментные препараты

В работе использовали следующие лабораторные и коммерческие ферментные препараты:

Лабораторные ферментные препараты:

В1 -221-151 (препарат исходного штамма P. verruculosum В1 -221-151)

Ферментные препараты на основе новых рекомбинантных штаммов Р. verruculosum: рГл+ЭГП, рГл-ЭГП-1, рГл-ЭГИ-2, рГл-ЭГИ-З, рГл-ЦБГПР.у., рГл-ЦБГПТ.г., рГл-ЦБГПР.у-ЭГП-1, рГл-ЦБГИР.у-ЭГ11-2, рГл-ЦБГИР.у-ЭГП-З, рГл-ЦБГПТ.г.-ЭГИ-1, рГл-ЦБГПТ.г.-ЭГН-2, рГл-ЦБГИТ.г.-ЭГИ-3, рГл-ЦБГИТ.г.-ЭГ11-4.

Коммерческие ферментные препараты на основе грибов рода Т.reesei: Ксибетен-Целл, («Biovet», Болгария), препараты Celluclast 1.5L и CellicCtec (Novozymes, Дания), Spezyme CP и AccelleraselOOO (Genencor&Danisco, США).

5.2. Субстраты

Для определения активностей препаратов использовали следующие субстраты: и-НФ-Р-О-глюкопиранозид (иНФГ) {Sigma, США), глюкуроноксилан из березы, Р-глюкан ячменя, целлобиоза (Merck, ФРГ) и КМЦ средней вязкости {Sigma, США), а также измельченную на планетарной шаровой мельнице АГО-2 МКЦ (Дзержинск, Россия)

В экспериментах по ферментативному гидролизу ЦСМ использовали измельченные на планетарной шаровой мельнице АГО-2 осиновую древесину, обессмоленную сосновую древесину, багассу и МКЦ (предоставлены ГосНИИСинтезбелок).

5.3. Прочие реактивы

В качестве калибровочного стандарта при определении концентрации белков в растворе методом Лоури использовали комплексный препарат P. verruculosum.

При изготовлении пластин (70 х 80 х 0.75 мм) с полиакриламидным гелем (ПААГ) для электрофореза в денатурирующих условиях (ДДС-ЭФ) с концентрирующим (4%) и разделяющим (12%) гелями, а также для изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в 4% ПААГ (125 х 65 х 0.75 мм) использовали реактивы и наборы производства Reanal (Венгрия), Sigma и Bio-Rad (США).

Окраску белка в гелях производили красителем Coomassie-Brilliant Blue R-250 производства Ferak (Германия) в 25% трихлоруксусной кислоте или уксусной кислоте производства Poch (Польша). Перед электрофорезом исследуемые растворы ферментов предварительно обрабатывали 1% додецилсульфатом натрия (ДДС-Na) и 5% ß-меркаптоэтанолом при 100°С в течение 15 мин.

В качестве стандартов для ДДС-ЭФ использовали смеси белков #SM0431 (14,4-116 кДа) и #SM0441 (19-117 кДа) производства Fermentas, включающие лизоцим (14,4 либо 19,0 кДа), ß-лактоглобулин (18,4 либо 26,0 кДа), REase Bsp98I (25,0 кДа), карбоангидразу (34,0 кДа), лактатдегидрогеназу (35,0 кДа), овальбумин (45,0 либо 48,0 кДа), БСА (66,2 либо 85,0 кДа), ß-галактозидазу (116,0 кДа).

В качестве стандартов для ИЭФ использовали смеси белков IEF Calibration kit (pi 2,5-6.5) производства Pharmacia (Швеция), включающие пепсиноген (pi 2,80), амилоглюкозидазу (pi 3,0), метиловый красный (pi 3,5), глюкозооксидазу (pi 4,5), соевый ингибитор трипсина (pi 4,5), ß-лактоглобулин A (pi 5,20), карбоангидразы В быка (pi 5,85), карбоангидразу В человека (pi 6,55).

Для приготовления буферных растворов использовали реактивы марок х.ч., ч.д.а. и ос.ч. производства Реахим, Pharmacia и Sigma. Растворы, использовавшиеся в качестве элюентов для хроматографии, фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0.45 мкм производства Millipore (США) и тщательно дегазировали.

5.4. Хроматографические сорбенты

Для определения компонентного состава ферментных препаратов использовали хроматографические носители:

- для гель-проникающей хроматографии (ГПХ) - Bio Gel Р2 фирмы «Bio-Rad» (США); для анионообменной хроматографии среднего давления - Source 15Q фирмы «Pharmacia» (Швеция); для гидрофобной хроматографии среднего давления - Source 15 Iso фирмы «Pharmacia».

5.5. Получение протопластов и проведение трансформации штамма-реципиента гриба P.verruculosum

В качестве штамма-реципиента был выбран штамм P.verruculosum NiaD", в котором на основе дикого штамма гриба посредством ненаправленного мутагенеза было увеличено количество секретируемого белка, а затем получена мутация в гене нитратредуктазы. библиотпла^]

Протопласты для трансформации получали согласно лабораторной методике [146], все буферы, использованные как для получения протопластов, так и для трансформации, кроме буфера с ПЭГ, стерилизовали автоклавированием при 0,5 атм в течение 30 мин. Буфер с ПЭГ стерилизовали кипячением в течение 20 мин на водяной бане.

В начале проводили посев смывом спор с культуры гриба в 100 мл минимальной среды с ]ЧН4С1, колбы с посевом инкубировали в шейкере при 30°С и 200-250 об/мин в течение 12-14 ч. Затем фильтровали мицелий, ресуспендировали его в буфере с рН 5,6-5,8 добавляли 15 мг/мл лизирующего фермента из Т.Иагггапит и 2,5 мг/мл БСА и инкубировали 2-3 ч при 30°С в шейкере (200-500 об/мин).

Далее переносили гидролизат в стерильную центрифужную пробирку, наслаивали буфер с концентрацией сорбитола 0,6 М, центрифугировали, отбирали слой протопластов на границе раздела фаз и перерастворяли их в буфере с концентрацией сорбитола 1,2 М. Количество полученных протопластов определяли при помощи камеры Горяева по формуле: количество протопластов в 1 мл = Хх4х Ю6, где Х- количество протопластов в маленькой клетке камеры Горяева.

Для одной трансформации использовали 3*107 протопластов, растворенных в 200 мкл буфера 8СТ (1,2 М сорбитол, 10 мМ трис-НС1, 10 мМ СаС12, рН 7,5), 10 и 1 мкг целевой и котрансформационной ДНК соответственно и 50 мкл буфера РСТ (50% ПЭГ-4000,10 мМ трис-НС1,10 мМ СаС12, рН 7,5).

Смесь инкубировали во льду в течение 20 мин. Затем добавляли к ней 500 мкл буфера РСТ, инкубировали 5 мин при комнатной температуре и перерастворяли в 200 мкл 1,2 М сорбитола.

Для посева использовали чашки Петри с нижним агаром и пробирки с верхним агаром. В состав верхнего агара входили агар-агар (0,7%), 1,2 М сорбитол, глюкоза (0,8%) и источник азота, ИаМОз (селективная среда) или №14С1 (неселективная среда). Состав нижнего агара отличался только концентрацией агара - 2%.

Пробирки с верхним агаром перед посевом помещали в кипящую водяную баню, чтобы расплавить агар, а затем в водяной термостат при температуре 48°С, чтобы остудить его.

Трансформационную смесь добавляли в пробирки с расплавленным и остывшим до 48°С верхним агаром, содержимое пробирки перемешивали и выливали на чашку с нижним агаром. Трансформанты высевали на селективную среду, в качестве контролей делали посев протопластов без ДНК на селективную и неселективную среду.

Чашки Петри с трансформантами и контролями помещали в инкубатор при температуре 30°С на 5 суток.

5.6. Культивирование трансформантов

Глубинное культивирование проводили в шейкере Innova40 фирмы "New Brunswick Scientific" (США). Для культивирования трансформантов P.verruculosum использовали стандартную ферментационную среду следующего состава - 4% целлюлозы, 1,5% КН2РО4, по 1% дрожжевого экстракта и пшеничных отрубей, 0,5% (NH4)2S04, по 0,03% MgSC>4*7H20 и СаСЬ*2Н20. Предварительную стерилизацию среды проводили автоклавированием при 1 атм в течение 1 ч.

Для первичного скрининга целевых активностей культивирование проводили в 500 мл колбах в течение 6-ти суток при 220 об/мин и 30°С, объем ферментационной среды составлял 100 мл. Посевной материал наращивали на чашках Петри с агаризованной селективной минимальной средой в течение 6-ти суток в инкубаторе при температуре 30°С. Посев в колбы осуществляли смывом спор культуры после укола в колонию трансформанта. Все операции проводили в стерильных условиях.

После культивирования производили отбор культуральной жидкости (КЖ) с последующим центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин на центрифуге «Universal 320 R» (Германия). Далее декантированием отделяли надосадочную жидкость и хранили при температуре 4°С.

5.7. Метод определения компонентного состава ферментных препаратов

Фракционирование и выделение ферментов для определения компонентного состава ферментных препаратов осуществляли с использованием жидкостного хроматографа среднего давления FPLC фирмы «Pharmacia» (Швеция).

Хроматографическая система состояла из автоматического контроллера процесса, насосов, ультрафиолетового проточного детектора и коллектора фракций. В процессе выделения за элюцией белка с колонок следили спектрофотометрически по поглощению на длине волны 280 нм.

Для фракционирования мутантных ферментных препаратов P.verruculosum проводили с использованием различных методов хроматографии:

• анионообменной хроматографии на колонке Source 15Q (1,6 х 5 см, объем геля 10 мл, «Pharmacia», Швеция),

• гидрофобной хроматографии на колонках Source 15 Isopropyl (объемом 1 и 8 мл) фирмы «Pharmacia» (Швеция);

Оценку гомогенности выделенных ферментов и определение их молекулярных параметров осуществляли с помощью ДДС-Ыа-ПААГ-электрофореза. Электрофорез белков проводили в 12%-ном ПААГ в присутствии ДДС-Na на приборе Mini Protean («Bio-Rad Laboratories», США) согласно руководству к прибору. Белковые полосы в гелях окрашивали кумасси R-250.

5.8. Определение концентрации белка

Содержание белка в пробах определяли модифицированным методом Лоури [146] или по поглощению на длинах волн 280 (А280). Калибровку проводили, используя раствор

БСА. Концентрация белка в комплексном препарате P.verruculosum равнялась 900 мг/г.

Для построения калибровочной кривой готовился запасной раствор стандарта с концентрацией белка 10 мг/мл, из которого путем разбавления получали растворы с концентрациями белка 0,05, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6 и 0,8 мг/мл.

Для спектрофотометрических измерений использовали спектрофотометр Сагу 50-Scan (Varían, США).

5.9. Определение биохимических характеристик ферментов

Аналитическое изоэлектрофокусирование белков проводили на приборе Model 111 IEF Cell {Bio-Rad), согласно руководству к эксплуатации прибора. Электрофорез проводили в 12% ПААГ в присутствии ДДС-Na на приборе Mini Protean {Bio-Rad) согласно руководству к эксплуатации прибора.

5.10. Методы определения активности ферментов

Определение активности по отношению к полисахаридным субстратам.

Активности ферментных препаратов и гомогенных ферментов по отношению к полисахаридным субстратам определяли по начальным скоростям образования ВС, определяемых методом Шомоди-Нельсона [147, 148]. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое приводит к образованию 1 мкмоль ВС в минуту в рН-оптимуме действия фермента, при концентрации субстрата 5 г/л и температуре 50°С.

Для анализа активностей большого количества фракций, полученных после разделения ферментного препарата, использовали автоматизированный бицинхонинатный метод (БЦХ) определения активности на планшете [149]. Суть метода заключается в количественном взаимодействии ВС с солью двухвалентной меди: в ходе реакции Си2+ восстанавливается до Си+.

Катионы Си+ образуют интенсивно окрашенные комплексы с бицинхонинатом натрия в присутствии дополнительных органических лигандов. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации ВС и, в итоге, ферментативной активности по отношению к конкретному полисахариду. Анализ проводили с использованием 96-луночных планшетов. В лунку планшета вносили 40 мкл запасного раствора субстрата (10 г/л в 0,1 М Ыа-ацетатном буфере, рН 5,0), 30 мкл 0,1 М Иа-ацетатного буфера, рН 5,0, и инкубировали на термостатируемом шейкере ЕЬМ1 БТ-З фирмы «ЕЬМ1» (Россия) при 50°С в течение 10 мин. Затем добавляли 10 мкл раствора фермента и быстро перемешивали реакционную смесь. Инкубировали реакционную смесь при 50°С и перемешивании (300 об/мин) в течение 15 мин. Далее отбирали 10 мкл реакционной смеси во второй планшет, куда предварительно было внесено 190 мкл бицинхонинантного реагента. Термостатировали второй планшет при 85°С в течение 45 мин. Интенсивность образующейся окраски регистрировали во втором планшете с помощью микроплашечного ридера Апйюз 2020 фирмы «Апйюэ» (Австрия) при длине волны 562 нм.

Определение активности по и-НФ производным Сахаров. Активность по отношению к и-НФ производным Сахаров определяли, измеряя начальную скорость образования и-нитрофенола. За единицу активности принимали количество фермента, необходимое для образования 1 мкмоль ^-нитрофенола в минуту в рН-оптимуме действия фермента при 40°С.

Для определения активности большого числа фракций, полученных после хроматографического разделения препаратов, использовали автоматизированный метод определения активности на планшете.

В лунку планшета вносили 90 мкл 1 мМ раствора субстрата (в 0.1 М Ыа-ацетатном буфере, рН 5.0) и инкубировали в термостатируемом шейкере при 40°С в течение 10 мин. Затем добавляли 10 мкл раствора фермента, быстро перемешивали реакционную смесь и инкубировали 15 мин при 40°С и перемешивании (300 об/мин). Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1 М раствора ИагСОз. Интенсивность образующейся окраски регистрировали с помощью микроплашечного ридера АпШов НТ2 (Аыкоз) при длине волны 405 нм.

Рассчитывали активность фермента (ед/мл) по формуле:

А = А405 • И. • 1• V / (Уе • 1 • 8 • 1), где А405 - оптическое поглощение реакционной смеси при 405 нм относительно контрольного раствора (в качестве контроля использовали раствор субстрата), Яе - предварительное разбавление фермента,

103 - коэффициент, учитывающий переход единиц измерения (от моль/л к мкмоль/мл),

V - финальный объем раствора в лунке планшета (0.15 мл в условиях метода), Ve - объем добавленного в реакционную смесь раствора фермента (0.01 мл в условиях метода), t - время ферментативной реакции (15 мин в условиях метода), в - разностный коэффициент молярного поглощения и-нигрофенолят иона при рН~10 (18300 М-1 см"1 при длине волны 405 нм),

1 - длина оптического пути в растворе (0.45 см для 150 мкл раствора в лунке планшета).

5.11. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов белков

Из окрашенных кумасси белковых полос гелей после ДДС-ЭФ вырезали участки размером около 1 мм и помещали их в пластиковые пробирки объемом 0,5 мл, после чего проводили трипсинолиз белков [150], включающий следующие стадии: Удаление красителя

Для этого в каждую лунку добавляли 150 мкл раствора 50%-ного ацетонитрила в 0,05 М NH4HCO3. Смесь инкубировали 20-30 мин при 56°С. После этого растворы сливали и добавляли свежие, повторяя процедуру до полного обесцвечивания кусочков геля. Дегидратация

После промывки к участкам геля добавляли по 150 мкл ацетонитрила. Смесь инкубировали 5-10 мин при комнатной температуре. После удаления ацетонитрила кусочки подсушивали в течение 10 мин при 56°С. Гидролиз трипсином

На участки геля наносили по 1,5 мкл рабочего раствора трипсина (модифицированный, для секвенирования белков, фирмы "Pr omega", США) с концентрацией 10 мкг/мл в 0,025 М NH4HCO3. После регидратации геля (через 10-15 мин) добавляли 1,5 мкл 0,025 М NH4HCO3. Трипсинолиз проводили в течение 2 ч при комнатной температуре, закрыв планшет специальной пленкой для планшетов. Экстракция пептидов

По истечении 2 ч трипсинолиза в лунку планшета добавляли 5 мкл раствора 0,1% ТФУ в 30%-ном ацетонитриле. Планшет закрывали пленкой и инкубировали 40 мин при комнатной температуре. Далее при перемешивании отбирали экстракт в пластиковые пробирки объемом 0,2 мл. Полученные пептиды использовали для MALDI-TOF масс-спектрометрии.

В качестве матриц для MALDI-TOF масс-сиектрометрии использовали а-циано-4-гидроксициниамовую кислоту. При нанесении образцов на мишень использовали «dried droplet» метод. На ячейку мишени наносили 0,5 мкл насыщенного раствора матрицы (в 0,1% ТФУ, 30%-ный ацетонитрил) и добавляли 0,5 мкл образца. После перемешивания смесь сушили на воздухе в течение 10-20 мин.

Масс-спектрометрические исследования проводили в лаборатории Физической органической химии Химического факультета МГУ на приборе ULTRAFLEX фирмы "Bruker Daltonics" (США).

5.12. Определение температурного и рН-оптимума действия ферментных препаратов

Определение температурного профиля активности ферментных препаратов проводили, измеряя активность ферментов при различных температурах (в диапазоне 25-70°С, с шагом 5°С) при рН 5,0. Определение рН - профиля активности ферментных препаратов проводили, измеряя активность в диапазоне значений рН от 3 до 8, с шагом 0,5 единиц рН. Для создания растворов с заданным значением рН использовали буферную систему на основе 0,1 М уксусной, 0,1 М борной и 0,1 М фосфорной кислот. При построении графиков рН - зависимости активности ферментов отражали значение рН реакционной смеси, измеренное непосредственно в реакционной смеси.

5.13. Изучение термостабильности ферментных препаратов

Растворы ферментных препаратов инкубировали при рН 5,0 при заданной температуре от 40 до 70°С с шагом в 10°С. С начала инкубации через определенные промежутки времени отбирали аликвоты инкубируемых растворов и измеряли активность ферментов по соответствующему субстрату. Результаты представляли в виде зависимости остаточной активности (в процентах от исходной) от времени инкубирования при данной температуре и рН.

5.14 Гидролиз ЦСМ

Гидролиз проводили в термостатируемой при 50°С ячейке, помещенной на качалку. Концентрация субстрата в реакционной смеси составляла 100 г/л (в пересчете на сухое вещество). Реакцию проводили в 0,1 М ацетатном буфере, содержащем 1 мМ №N3 и антибиотик ампиокс (20 мкл, при концентрации 1 г/мл), при перемешивании 250 об/мин. Конечный объем реакционной смеси составлял 20 мл.

В реакционную смесь добавляли рассчитанный объем раствора исследуемого ферментного препарата и раствор ферментного препарата целлобиазы FIO (F10 из расчета 40 ед. целлобиазной активности на 1 г субстрата). Объем раствора исследуемого препарата определяли из расчета:

1. 2 мг белка на 1 г субстрата

2. 5 мг белка на 1 г субстрата

3. 10 мг белка на 1 г субстрата

Гидролиз проводился в течение 2 суток. Реакционная ячейка представляет собой ёмкость с крышкой объемом 50 мл, для обеспечения дополнительного перемешивания реакционной смеси в ячейку помещают металлический мешальник (цилиндр d = 7 мм, h = 10 мм) из нержавеющей стали.

Через определенные промежутки времени (3, 24 и 48 часов) из реакционной смеси отбирали пробы (0,5 мл), центрифугировали 3 мин при 12000 об./мин и в супернатанте измеряли концентрацию ВС (методом Шомоди-Нельсона) и глюкозы (глюкозооксидазно-пероксидазным методом 151]). За критерий гидролитической способности препаратов брался выход глюкозы и ВС. iii. результаты и их обсуждение

глава 6. получение ферментных препаратов с помощью новых рекомбинантных штаммов р. УЕшисиюзим

Исследования, проведенные в нашей лаборатории ранее, показали, что ферментный комплекс, секретируемый мицелиальным грибом Р. \erruculosum. В1-221-151, содержит недостаточное для эффективного гидролиза ЦСМ количество целлобиазы. Это не позволяет ферментным препаратам, полученным на основе штамма В1-221-151 Р.уеггисЫояит, эффективно осахаривать лигноцеллюлозное сырье за счет ингибирования целлюлолитических ферментов целлобиозой. Кроме того, осахаривающая способность целлюлазного комплекса Р.уеггисиШит может быть увеличена за счет повышения содержания таких ферментов, как ЭГП и ЦБГП.

В нашей лаборатории были проведены, также, исследования по получению штаммов-продуцентов различных целлюлаз с помощью системы экспрессии под контролем индуцибельного промотора гена сЪМ. При трансформации плазмидами, содержащих один целевой ген, такая система позволяет получить продуценты с высоким содержанием целевого белка, однако, за счет процесса «титровки промотора» возможна потеря продукции основного целлюлазного комплекса. Поэтому нами было решено создать на основе штамма-реципиента Р.уеггиси1озит 537 рекомбинантные штаммы, продуцирующие мультиферментные комплексы с повышенным уровнем активности указанных выше ферментов методом ко-трансформации смесью двух и трех целевых плазмид, несущих индивидуальные гены гомологичных эндоглкжаназы II (ЭГП 36 кДа) и целлобиогидролазы II (ЦБГИ 60 кДа) и гетерологичных целлобиогидролазы II (ЦБГП 57 кДа Т.геезег), Р-глюкозидазы (РГЛ 120 кДа A.niger). В случае двух плазмид полученные ферментные препараты называли «дуплетами», в случае трех - «триплетами». Кроме того нами был получены ферментный препарат «тандем» на основе штамма, созданного методом трансформации линейной плазмидой, несущей одновременно 2 гена целлюлаз (гомологичной ЭГП 36 кДа и гетерологичной рГЛ 120 кДа).

Схема получения ферментных препаратов включает следующие стадии:

1) выделение генов целевых ферментов, создание экспрессионных плазмид, получение трансформированных штаммов;

2) проведение первичного скрининга полученных трансформантов;

3) культивирование отобранных трансформантов и наработка сухих ферментных препаратов;

6.1. Трансформация штамма-реципиента Р.уеггиси^ит 537

На этом этапе работы была проведена серия трансформаций штамма-реципиента Р.уеггиси1атт 537 (шаБ") плазмидами (рРгСВН1-р01иАзр-Е0ПВ1, рРгСВН1-ЕОПВ1, рРгСВН1-СВНПВ1, рРгСВН188-СВНПТг, рРгСВН1-р01иАзр) совместно с плазмидой рБТАЮ, несущей ген нитратредуктазы (таП). В табл. 4 представлены варианты смесей плазмид, использованных для трансформации.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Правильников, Артем Геннадиевич, 2012 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Тиунова Н.А. Применение целлюлаз. Целлюлазы микроорганизмов. Под ред. Клетовича В.Л. М., 1981, с. 40-73.

2. Грачева И.М., Гаврилова Н.Н., Иванова Л.А. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и жиров. М., 1980, с. 83-90.

3. Морозова В.В. Свойства целлюлолитических ферментов Pénicillium verruculosum и их применение для осахаривания лигноцеллюлозного сырья. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 2009, 159 с.

4. Collmer A., Keen N.T. The role of pectic enzymes in plant pathogenesis. Ann. Rev. Phytopathol., 1986, 24, p. 383-409.

5. Albersheim P., Jones T.N. Biochemistry of the cell wall in relation to infective processes. Ann. Rev. Phytopathol., 1969, 7, p. 171-194.

6. Dey P.M. and Brinston K. Plant cell-walls. Adv. in carbohydrate chem. and biochem., 1984, 42, p. 265-382.

7. Stephen A.M. (ed.) Food polysaccharides and their applications. Marcel Dekker, Inc., New York, 1995, 654 p.

8. Hopkins W.G. Introduction to Plant Physiology, 2nd edition. John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999, 512 p.

9. Синицын А.П., Гусаков A.B., Черноглазое B.M. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. М., МГУ, 1995, 224 с.

10. Роговин З.А. Химия целлюлозы. М., Химия, 1972, 519 с.

11. Prabuddha Bansal, Mélanie Hall, Matthew J. Realff, Jay H. Lee, Andreas S. Bommarius. Multivariate statistical analysis of X-ray data from cellulose: A new method to determine degree of crystallinity and predict hydrolysis rates. Bioresource Technology, 2010, 101, p. 4461-4471

12. Stone B.A, Clarke A.E. Chemistry and biology of 1,3-P-glucans. La Trobe University Press, Bundoora, Australia, 1992, 426 p.

13. Izydorczyk M.S., Macri L.J., MacGregor A.W. Structure and physicochemical properties of barley non-starch polysaccharides. I. Water-extractable B-glucans and arabinoxylans. Carbohydr. Polym., 1998, 35, p. 249-258.

14. Coughlan M.P., Hazlewood G.P. Hemicellulose and hemicellulases. Portland Press Research Monograph., London-Chapel Hill, 1993, 4, 120 p.

15. McNeil M., Darvill A.G., Fry S.C., Albersheim P. Structure and function of the primary cell walls of plants. Annu. Rev. Biochem., 1984, 53, 625 p.

16. Rombouts F.M., Thibault J.F. Feruloylated pectic substances from sugar beet pulp. Carbohydr. Res., 1986, 154, p. 177-187.

17. Закис Г.Ф., Крейцберг 3.H., Можейко Jl.H., Сергеева В.H. Лигнин. В сб.: Клеточная стенка древесины и ее изменения при химическом воздействии. Рига, Зинатне, 1972, с. 136-242.

18. Евилевич А.З., Ахмина Е.И., Раскин М.Н. Безотходное производство в гидролизной промышленности. М., 1982, с. 4-40.

19. Roger M. Rowell, Tor P. Schultz, Ramani Narayan. Emerging Technologies for Materials and Chemicals from Biomass. ACS Symposium Series, 1992, v. 476, p. 12-27.

20. Reshamwala S., Shawky B.T., Dale B.E., Ethanol production from enzymatic hydrolysates of AFEX-treated coastal Bermuda grass and switchgrass. Appl. Biochem. Biotechnol., 1995, v. 5152, p. 43-55.

21. Xiushan Yang, Sijin Zhang, Zhuang Zuo, Xun Men, Shen Tian. Ethanol production from the enzymatic hydrolysis of non-detoxified steam-exploded corn stalk. Bioresource Technology, 2011, 102, p. 7840-7844.

22. Jiele Xu, Ziyu Wang, Jay J. Cheng. Bermuda grass as feedstock for biofuel production: A review. Bioresource Technology, 2011, 102, p. 7613-7620.

23. Кальнина B.K., Бейнарт И.И., Ведерников H.A. Клеточная стенка древесины и ее изменения при химическом воздействии. Изд-во «ЗИНАТНЕ», 1972, с.73-105.

24. Carmen Sánchez. Lignocellulosic residues: Biodégradation and bioconversion by fungi. Biotechnology Advances, 2009, 27, p. 185-194.

25. Евилевич A.3., Ахмина Е.И., Раскин М.Н. Безотходное производство в гидролизной промышленности. М., 1982, с.4-40.

26. Шарков В.И., Куйбина И.И., Соловьева Ю.П. и др. Количественный и химический анализ растительного сырья. М., 1976, с. 203.

27. В. Gullôn, R. Yânez, J.L. Alonso, J.C. Parajô. Production of oligosaccharides and sugars from rye straw: A kinetic approach. Bioresource Technology, 2010, 101, p. 6676-6684.

28. Максимов В.Ф., Вольф И.В., Яковлева О.И. Борьба с загрязнениями окружающей среды в целлюлозно-бумажной промышленности. М., 1976, с.30.

29. Parameswaran Binod, Raveendran Sindhu, Reeta Rani Singhania, Surender Vikram, Lalitha Devi, Satya Nagalakshmi, Noble Kurien, Rajeev K. Sukumaran, Ashok Pandey. Bioethanol production from rice straw: An overview. Bioresource Technology, 2010, 101, p. 4767^-774.

30. Ryosuke Yamada,Naho Taniguchi, Tsutomu Tanaka, Chiaki Ogino, Hideki Fukuda and Akihiko Kondo. Direct ethanol production from cellulosic material using a diploid strain of Saccharomyces cerevisiae with optimized cellulose expression. Biotechnology for Biofuels 2011,4:8.

31. José Goldemberg. The Brazilian biofuels industry. Biotechnology for Biofuels 2008, 1:6.

32. Rajeev K. Sukumaran *, Vikram Joshua Surender, Raveendran Sindhu, Parameshwaran Binod, Kanakambaran Usha Janu, Kuttavan Yalappil Sajna, Kuni Parambil Rajasree, Ashok Pandey. Lignocellulosic ethanol in India: Prospects, challenges and feedstock availability. Bioresource Technology, 2010, 101, p. 4826^1833.

33. Xumeng Gel,2, David M. ВигпегЗ, Jianfeng Xul,4, Gregory C. Phillipsl,4, Ganapathy Sivakumar. oethanol production from dedicated energy crops and residues in Arkansas, USA. Biotechnol. J. 2011, 6, 66-73.

34. Chang M., Chou T., Tsao G.T. Structure, pretreatment and hydrolysis of cellulose. In: Bioenergy (Fiechter A., ed.). Berlin, Heidelberg, New York, 1981, p. 15-32.

35. Gharpuray M.M., Lee Y.H., Fan L.T. Structural modification of lignocellulosics by pretreatments to enhance enzymatic hydrolysis. Biotechnol. Bioeng., 1983, 25, p. 157-172.

36. Lin K.W., Ladisch M.R., Voloch M., Patterson J.A., Noller C.H. Effect of pretreatments and fermentation on pore size in cellulosic materials. Biotechnol. Bioeng., 1985, 27, p. 1427-1433.

37. Thompson D.N., Chen H.C., Grethlein H.E. Comparison of pretreatment methods on the basis of available surface area. Bioresour. Technol., 1992, 39, p. 155-163.

38. Senta Heiss-Blanquet, Dan Zheng, Nicolas Lopes Ferreira, Catherine Lapierre, Stephanie Baumberger. Effect of pretreatment and enzymatic hydrolysis of wheat straw on cell wall composition, hydrophobicity and cellulase adsorption. Bioresource Technology, 2011, 102, p. 5938-5946.

39. Maohua Yang, Wangliang Li, Binbin Liu, Qiang Li, Jianmin Xing. High-concentration sugars production from corn stover based on combined pretreatments and fed-batch process Bioresource Technology, 2010, 101, p. 4884-^888.

40. Синицын А.П., Клесов A.A. Влияние предобработки на эффективность ферментативного превращения хлопкового линта. Прикл. биохим. микробиол, 1981, 17, с. 682-695.

41. Синицын А.П., Ковалев Г.В., Меса-Манреса С.Р., Козловский Д.Ф., Калязин е.П., Клесов А.А. Сравнительное изучение влияния различных видов предобработки на скорость ферментативного гидролиза природных целлюлозосодержащих материалов. Химия древесины, 1984, 5, с. 60-71.

42. Boominathan К., Reddy С.А. cAMP-mediated differential regulation of lignin peroxidase and manganese-dependent peroxidase production in the white-rot basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1992, 89, p. 5586-5590.

43. Калунянц K.A., Шаненко е.Ф., Зайцева jl.b. Современные способы ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих материалов, Итоги науки и техники, Сер. Химия и технология пищевых продуктов, т.1, М., ВИНИТИ, 1988, 187 с.

44. Bungay H.R. Energy, the biomass options. N.Y. Wiley and sons, 1981, p. 13-15.

45. Selvan P.V., Ghose Т.К., Ghosk P. Catalytic solvent delignification of agricultural residues:inorganic catalysis. Prosess Biochem., 1983, №3, p.13-15.

46. Van Tilbeurgh H., Tomme P., Claeyssens M., Bhikhabhai R., Pettersson G. Limited proteolysis of the cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei. Separation of the functional domains. FEBS Lett. 1986, v. 204, p. 223-227.

47. Ropas M., Marchal R., Porquie J., Wandecasteele P. Large-scale enzymatic hydrolysis of agricultural lignocellulosic biomass. Part 1: Pretreatment procedures. Biosource Technol. 1992, v.42, p. 197-204.

48. Ropas M., Marchal R., Porquie J., Wandecasteele P. Large-scale enzymatic hydrolysis of agricultural lignocellulosic biomass. Part 2: Conversion into acetone-butanol. Biosource Technol. 1992, v.42, p.205-217.

49. Duff S.J.B., Murray W.D. Bioconversion of forest products industry waste cellulosics to fuel ethanol: a review. Bioresour. Technol. 1996, v. 55, p. 1-33.

50. Holtzapple M.T., Humphrey A.E., Taylor J.D. Energy requirements for the size reduction of poplar and aspen wood. Biotechnol. Bioeng. 1989, v. 33, p. 207-210.

51. Clark T.A., Mackie K.L. Steam explosion of the soft-wood Pinus radiata with sulphur dioxide addition. I. Process optimization. J. Wood Chem. Technol. 1987, v. 7, p. 373-403.

52. Holtzapple M.T., Jun J.H., Ashok G., Patibandla S.L et al. The ammonia freeze explosion (AFEX) process: a practical lignocellulose pretreatment. Appl. Biochem. Biotechnol. 1991, v. 28, p. 59-74.

53. Sharma S.K., Kalra K.L., Grewal H.S. Enzymatic saccharification of pretreated sunflower stalks. Biomass. Bioenergy. 2002, v. 23, p. 237-243.

54. Sendich E., Laser M., Kim S., Alizadeh H. et al. Recent process improvements for the ammonia fiber expansion (AFEX) process and resulting reductions in minimum ethanol selling price. Bioresour. Technol. 2008, v. 99, p. 8429-8435.

55. Schultz T.P., Rughani J.R., Meginnis G.D. Comparison of the pretreatment of sweetgum and white oak by steam-explosion and rapid ateam hydrolysis-continuous (RASH) prosesses. Appl. Biochem. Biotechnol., 1989, v. 20, p. 9-28.

56. Van Tilbeurgh H., Tomme P., Claeyssens M., Bhikhabhai R., Pettersson G. Limited proteolysis of the cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei. Separation of the functional domains. FEBS Lett. 1986, v. 204, p. 223-227.

57. Gilkes N.R., Heniissat В., Kilburn D.G., Miller R.C., Warren R.A.J. Domains in microbal (3-1,4-glyeanases: sequence conservation, function and enzyme families. Microbiol. Rev. 1991, v. 55, p. 303-315.

58. Henrissat B. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 1991, v. 280, p. 309-316.

59. Henrissat В., Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 1993, v. 293, p. 781-788.

60. Schulein, M. Protein engineering of cellulases. Biochim. Biophys. Acta. 2000, v. 1543, p. 239252.

61. Гусаков A.B. Биокатализаторы иа основе грибных целлюлаз: фундаментальные и прикладные аспекты. Диссертация на соискание ученой степени доктора хим. наук. МГУ, 2005.

62. Heidelberg J.F., Eisen J.A., Nelson W.C., Clayton R.A., Gwinn M.L. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae. Nature. 2000, v. 406 (6795), p. 477-483.

63. Ladisch, M.R., Lin, K.W., Voloch, M., Tsao, G.T. Process considerations in the enzymatic hydrolysis of biomass. Enzyme Microb. Technol. 1983, v. 5, p. 82-102.

64. Schulein, M. Protein engineering of cellulases. Biochim. Biophys. Acta. 2000, v. 1543, p. 239252.

65. Гусаков A.B. Биокатализаторы на основе грибных целлюлаз: фундаментальные и прикладные аспекты. Диссертация на соискание ученой степени доктора хим. наук. МГУ, 2005.

66. Марков А.В. Свойства ферментных комплексов, продуцируемых мутантными штаммами Trichoderma reesei. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук, Москва, МГУ, 2003, с. 201.

67. Baldrian P., Valaskova V. Degradation of cellulose by basidiomycetous fungi. FEMS Microbiol. Rev. 2008, v. 32, p. 501-521.

68. Claeyssens, M., van Tilbeurgh, H., Kamerling, P., Berg, J., Vrsanska, M., Biely, P. Studies of the cellulolytic system of the filamentous fungus Trichoderma reesei QM 9414. Substrate specificity and transfer activity of endoglucanase I. Biochem. J. 1990, v. 270, p. 251-256.

69. Sandgren M., Stahlberg J., Mitchinson C. Structural and biochemical studies of GH family 12 cellulases: improved thermal stability, and ligand complexes. Prog. Biophys. Mol. Biol. 2005, v. 89, p. 246-291.

70. Bhat K.M., Hay A.J., Claeyssens M., Wood T.M. Study of the mode of action and site-specificity of the endo-l,4-P-D-glucanases of the fungus Penicillium pinophilum with normal, 1-3H-labelled, reduced and chromogenic cello-oligosaccharides. Biochem. J. 1990, v. 266, p. 371 -378.

71. Percival Zhang Y.H., Himmel M.E., Mielenz J.R. Outlook for cellulase improvement: screening and selection strategies. Biotechnol. Adv. 2006, v. 24, p. 452-481.

72. Beguin, P., Aubert, J.P. The biological degradation of cellulose. FEMS Microbiol. Rev., 1994, v.14, p.5-58.

73. Schou C., Rasmussen G., Kaltoft M.B., Henrissat B., Schulein M. Stereochemistry, specificity and kinetics of the hydrolysis of reduced cellodextrins by nine cellulases. Eur. J. Biochem. 1993, v. 217, p. 947-953.

74. Divne C., Stahlberg J., Reinikainen T., Ruohonen L., Pettersson G., Knowles J.K., Teeri T.T., Jones T.A. The three-dimensional crystal structure of the catalytic core of cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei. Science. 1994, v. 265, p. 524-528.

75. Rouvinen J., Bergfors T., Teeri T., Knowles J.K., Jones T.A. Three-dimensional structure of cellobiohydrolase II from Trichoderma reesei. Science. 1990, v. 249, p. 380-386.

76. Divne C., Stahlberg J., Teeri T.T., Jones T.A. High-resolution crystal structures reveal how a cellulose chain is bound in the 50 A long tunnel of cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei. J. Mo.l Biol. 1998, v. 275, p. 309-325.

77. Teeri, T.T. Crystalline cellulose degradation: new insight into the function of cellobiohydrolases. Trends Biotechnol. 1997, v. 15, p. 160-167

78. Vrsanska, M., Biely, P. The cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei QM 9414: action on cellooligosaccharides. Carbohydr. Res. 1992, v. 227, p. 19-27.

79. Ladisch, M.R., Lin, K.W., Voloch, M., Tsao, G.T. Process considerations in the enzymatic hydrolysis of biomass. Enzyme Microb. Technol. 1983, v. 5, p. 82-102.

80. Wilson, R.W., Niederpruem, D.J. Control of [3-glucosidases in Schyzophyllum commune. Can. J. Microbiol. 1967, v. 13, p. 1009-1020.

81. Morais H., Ramos C., Matos N., Forgacs E., Cserhati T., Almeida V., Oliveira J., Darwish Y., lies Z. Liquid chromatographic and electrophoretic characterisation of extracellular beta-glucosidase of Pleurotus ostreatus grown in organic waste. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2002, v. 770, p. 111 -119.

82. Cao W.G., Crawford D.L. Purification and some properties of beta-glucosidase from the ectomycorrhizal fungus Pisolithus tinctorius Strain Smf. Can. J. Microbiol. 1993, v. 39, p. 125129.

83. Dan S., Marton I., Dekel M., Bravdo B.A., He S., Withers S.G., Shoseyov O. Cloning, expression, characterization, and nucleophile identification of family 3, Aspergillus niger beta-glucosidase. J. Biol. Chem. 2000, v. 275, p. 4973-4980.

84. Evans CS: Properties of the beta-D-glucosidase (cellobiase) from the wood-rotting fungus, Coriolus versicolor. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1985, v. 22, p. 128-131.

85. Ishikawa E., Sakai T., Ikemura H., Matsumoto K., Abe H. Identification, cloning, and characterization of a Sporobolomyces singularis beta-galactosidase-like enzyme involved in galacto- oligosaccharide production. J. Biosci. Bioeng. 2005, v. 99, p. 331-339.

86. Shewale, J.G., Sadana, J. Purification, characterization and properties of [3-glucosidase enzymes from Sclerotium rolfsii. Arch. Biochem. Biophys. 1981, v. 207, p.185-196.

87. Chen, H., Hayn, M., Esterbauer, H. Purification and characterization of two extracellular p-glucosidases from Trichoderma reesei. Biochim Biophys. Acta. 1992, v. 1121, p. 54-60.

88. Gong, C.-S., Ladisch, M.R., Tsao, G.T. Cellobiase from Trichoderma viride: purification, properties, kinetics and mechanism. Biotechnol. Bioeng. 1977, v. 19, p. 959-981.

89. McHale, A., Coughlan, M.P. The cellulolytic system of Talaromyces emersonii. Purification and characterization of the extracellular and intracellular (3-glucosidases. Biochim. Biophys. Acta. 1981, v. 662, p. 152-159.

90. Hash, J.H., King, K.W. Some properties at an aryl-(3-glucosidase from culture filtrates of Myrothecium verrucaria. J. Biol. Chem. 1958, v. 232, p. 395-402.

91. Schultz T.P., Rughani J.R., Meginnis G.D. Comparison of the pretreatment of sweetgum and white oak by steam-explosion and rapid ateam hydrolysis-continuous (RASH) prosesses. Appl. Biochem. Biotechnol., 1989, v. 20, p. 9-28.

92. NC-IUBMB Enzyme nomenclature. Recommendations of the nomenclature committee of the international Union of Biochemistry and Molecular Biology on nomenclature and classification of enzymes. Academic Press, Orlando, 1992.

93. Henrissat, B., Davies G. Structural and sequence-based classification of hydrolases. Curr.Opin. Struct.Biol. 1997, v. 7, p. 637-644.

94. Henrissat B., Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J., 1993, v. 293, p. 781-788.

95. Davies, G., and B. Henrissat. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure. 1995, v. 3, p. 853-859.

96. Bayer, E., Y. Shoham, and R. Lamed. Cellulose-decomposing Bacteria and Their Enzyme Systems. Springer, New York. 2006, v. 2, p. 578-617.

97. Tomme, P., H. Van Tilbeurgh, G. Pettersson, J. Van Damme, J. Vandekerckhove, J. Knowles, T. Teeri, and M. Claeyssens. Studies of the cellulolytic system of Trichoderma reesei QM 9414. Analysis of domain function in two cellobiohydrolases by limited proteolysis. Eur J Biochem., 1988b, v. 170, p. 575-81.

98. Bhat K.M., Hay A.J., Claeyssens M., Wood T.M. Study of the mode of action and site-specificity of the endo-l,4-P"D-glucanases of the fungus Penicillium pinophilum with normal, 1-

o

H-labelled, reduced and chromogenic cello-oligosaccharides. Biochem. J., 1990, v. 266, p. 371378.

99. Gilkes N.R., Henrissat В., Kilburn D.C., Miller R.C., Warren R.A.J. Domains in microbial beta-1,4-glycanases: sequence conservation, function, and enzyme families. Microbiol Rev., 1991, v. 55, p. 303-315.

100. Umezurike G.M. Kinetic analysis of the mechanism of action of (3-glucosidase from Bortyodiplodia theobromae pat. Biochim. Biophys. Acta. 1975, v. 397, p. 164-178.

101. Iwashita K, Todoroki K, Kimura H, Shimoi H, Ito K. Purification and characterization of extracellular and cell wall bound beta-glucosidases from Aspergillus kawachii. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998 oct., v. 62(10), p. 1938-46.

102. Pitson SM, Seviour RJ, McDougall BM. Purification and characterization of an extracellular beta-glucosidase from the filamentous fungus Acremonium persicinum and its probable role in beta-glucan degradation. Enzyme Microb. Technol. 1997 aug., v. 15, p. 182-190.

103. Reese E.T., Sue R.G., Levinson H.S. The biological degradation of soluble cellulose derivates and its relationship to the mechanism of cellulose hydrolysis. J. Biotechnol. 1950, v. 59, p. 485497.

104. Гусаков A.B. Кинетическое описание ферментативного гидролиза целлюлозы (сырье, ферменты, процесс, реакторы). Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук, Москва, МГУ, 1984, с. 192.

105. Karlsson J., Siika-aho М., Tenkanen М., Tjerneld F. Enzymatic properties of the low molecular mass endoglucanases Cell2A (EG III) and Cel45A (EG V) of Trichoderma reesei. J. Biotechnol. 2002, v. 99, p.63-68.

106. Henriksson G., Nutt A., Henriksson H., Pettersson В., Stahlberg J., Johansson G. and Pettersson G. Endoglucanase 28 (cell2A), a new Phanerochaete chrysosporium cellulase. Eur. J. Biochem. 1999, v. 259, p. 88-95.

107. Reese E.T. History of cellulase program at the U.S. Army Development Center. Biotechnol. Bioeng. 1976, v. 6, p. 9-21.

108. Klyosov A. A. Trends in biochemistry and enzymology of cellulose degradation. Biochem., 1990, v. 129, p. 10577-10585.

109. Saloheimo M., Paloheimo M., Hakola S., Pere J., Swanson В., Nyyssonen E., Bhatia A., Ward M., Penttila M. Swollenin, a Trichoderma reesei protein with sequence similarity to the plant expansins, exhibits disruption activity on cellulosic materials. Eur. J. Biochem., 2002, 269, p. 4202-4211.

110. Gusakov A.V., Sinitsyn A.P., Manenkova J.A., Protas O.Y. Enzymatic sacharification of industrial and agricultural lignocellulosic wastes. Appl. Biochem. Biotechnol., 1992, 34, p. 625637.

111. Клесов А.А., Синицын А.П. Ферментативный гидролиз целлюлозы. IV. Влияние физико-химических и структурных факторов на эффективность ферментативного гидролиза Биоорг. химия, 1981, 7, с. 1801-1812.

112. Nystrom J.M., Andren R.K., Allen A.L. Enzymatic hydrolysis of cellulosic waste: the status of process technology and economic accessment. AIChE Symp. Ser., 1978, 74, p. 82-88.

113. Гусаков A.B., Синицын А.П., Клесов A.A. Ферментативный гидролиз целлюлозы. Инактивация и стабилизация ферментов целлюлазного комплекса. Биохимия, 1982, 47, с. 1322-1331.

114. Синицын А.П., Митькевич О.В., Клесов А.А. Инактивация препаратов ферментов целлюлазного комплекса при перемешивании и стабилизация целлюлозой. Прикл. биохим. микробиол., 1986, 2, с. 759-765.

115. Синицын А.П., Митькевич О.В. Различия в кинетических свойствах прочно и слабо адсорбирующихся на целлюлозе целлюлолитических ферментов. Биотехнология, 1987, 3, с. 227-233.

116. Prior В.А., Day D.F. Hydrolysis of ammonia-pretreated sugar cane bagasse with cellulase, beta-glucosidase, and hemicellulase preparations. Appl. Biochem. Biotechnol., 2008, 146, p. 151-164.

117. Sukumaran R.K., Singhania R.R., Mathew G.M. and Mathew P.A. Cellulase production using biomass feed stock and its application in lignocellulose saccharification for bio-ethanol production. Renewable Energy, 2009, 34, p. 421-424.

118. Saddler J.N. Screening of highly cellulolitic fungi and the action of their cellulase enzyme systems. Enzyme Microb. Technol., 1982, 4, p. 414-418.

119. Синицын А.П., Наджеми Б., Клесов А.А. Влияние состава целлюлазного препарата на эффективность ферментативного гидролиза хлопкового линта. Химия древесины, 1982, 2, с. 91-96.

120. Синицын А.П., Наджеми Б., Клесов А.А. Ферментативное получение глюкозы из целлюлозы: влияние ингибирования продуктами и изменение реакционной способности субстрата на скорость ферментативного гидролиза. Прикл. биохим. микробиол., 1981, 17, с. 315-321.

121. Морозов A.M., Рабинович M.JL, Клесов А.А. Биотехнология непрерывного ферментативного гидролиза целлюлозы. II. Гидродинамическое сопротивление аппарата колоночного типа. Биотехнология, 1986, 5, с. 52-59.

122. Chen Н., Jin S. Effect of ethanol and yeast on cellulase activity and hydrolysis of crystalline cellulose. Enzyme Microb. Technol., 2006, 39, p. 1430-1432.

123. Wu Z., Lee Y.Y. Inhibition of the enzymatic hydrolysis of cellulose by ethanol. Biotechnol. Lett., 1997, 19, p. 977-979.

124. Клесов A.A., Черноглазов B.M., Ермолова O.B., Елкин В.В. Влияние лигнина на ферментативный гидролиз лигноцеллюлозных материалов. Биотехнология, 1985, 3, с. 106112.

125. Yang В., Willies D.M., Wyman С.Е. Changes in the enzymatic hydrolysis rate of avicel cellulose with conversion. Biotechnol. Bioeng., 2006, 94, p. 1121-1128.

126. Neilson M.J., Kelsey R.G., Shafizadeh F. Enhacement of enzymatic hydrolysis by simultaneous attrition of cellulose substrates. Biotechnol. Bioeng., 1982, 24, p. 293-304.

127. Berlin A., Balakshin M., Gilkes N., Kadla J., Maximenko V., Kubo S., Saddler J. Inhibition of cellulase, xylanase and beta-glucosidase activities by softwood lignin preparations. J. Biotechnol., 2006, 125, p. 198-209.

128. Palonen H., Tjerneld F., Zacchi G., Tenkanen M. Adsorption of Trichoderma reesei CBH I and EG II and their catalytic domains on steam pretreated softwood and isolated lignin. J. Biotechnol., 2004, 107, p. 65-72.

129. Kristensen J.B., Borjesson J., Bruun M.H., Tjerneld F., Jorgensen H. Use of surface active additives in enzymatic hydrolysis of wheat straw lignocellulose. Enzyme Microb. Technol., 2007, 40, p. 888-895.

130. Синицын А.П., Рожкова A.M., Синицьша O.A.. Федорова E.A., Окунев О.Н., Беккаревич А.О., Соколова JI.M., Матыс В.Ю., Кошелев А.В., Винецкий Ю.П., Черноглазое В.М., Зоров И.Н. Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии целевых гомологичных и гетерологичных генов в клетках мицелиального гриба Penicillium verruculosum, используемого в качестве хозяина, способ получения штамма гриба Penicillium verruculosum и способ получения ферментного препарата. RU2378372 (С2), 10.01.2010

131. D.O. Osipov, A.M. Rozhkova, V.Yu. Matys, A.V. Koshelev, O.N. Okunev, E.A. Rubtsova, A.G. Pravilnikov, I.N. Zorov, I.N. Oveshnikov, E.R.Davidov, O.A. Sinitsyna, A.P. Sinitsyn, Production of Byocatalysts on the Basis of Recombinant Heterologous Xylanase Producer Strains in the Penicillium Verruculosum Fungus: Their Application in the Hydrolysis of Timber and Wood Processing Industry Wastes. Catalysis in Industry, 2011, v.3, N1, pp. 34-40.

132. Gusakov A.V., Kondratyeva E.G., Sinitsyn A.P., Comparison of TwoMethods for Assaying Reducing Sugars in the Determination of Carbohydrase Activities. Int. Journal of Anal. Chem. Volume 2011, Article ID 283658.

133. Осипов.Д.О. Получение и характеристика мультиферментных комплексов карбогидраз и исследование их эффективности при осахаривании различных видов целлюлозосодержащих материалов. Диссертация на соискание ученой степени доктора хим. наук. ИНБИ им. А.Н. Баха РАН, 2011.

134. Szakacs G., Reezey К., Hernadl P.M. Applied Microbiology and Biotechnology Penicillium verruculosum WA 30 a New Source of Cellulase. Journal Of Fermentation Technology. 1981, v. 16, p. 120-124.

135. Берлин A.X. Исследование тополитических эндоглюканаз и ксиланаз ферментных комплексов Penicillium verruculosum и Trichoderma reesei. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 1999, с. 95.

136. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. М., Элвар, 2000, с. 13288.

137. Кастельянос О., Ермолова О.В., Синицын А.П., Попова Н.Н., Окунев О.Н., Керне Г., Куде Е. Схема очистки ферментов целлюлазного комплекса Pénicillium verruculosum, исследование их биохимических свойств и специфичности. Биохимия, 1995, т. 60, с. 925943.

138. Зоров И.Н. Исследование целлобиогидролазы и целлобиазы целлюлазного комплекса Pénicillium verruculosum. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 1998,156 с.

139. Гутиеррес Родригес Б. Каталитические, биохимические и биотехнологические свойства эндоглюканазы В4 целлюлазного комплекса Pénicillium verruculosum. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 1997, 116 с.

140. Сахаров И.Ю., Зоров И.Н., Синицын А.П. Выделение эндоглюканазы Pénicillium verruculosum методом иммуноафинной хроматографии. Биохимия, 1996, т. 61, с. 16581663.

141. Скомаровский А.А. Компонентный состав и гидролитическая способность ферментного комплекса Pénicillium verruculosum. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 2006, 170 с.

142. Морозова В.В. Свойства целлюлолитических ферментов Pénicillium verruculosum и их применение для осахаривания лигноцеллюлозного сырья. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 2009, 159 с.

143. Volme В.Т. Use of sorbose to enhance cellobiase activity in a Trichoderma reesei cellulase system produced on wheat hydrolysate. Biotechnology Techniques. 1993. v. 5, № 5, p. 345-350.

144. Qing Q. and Wyman С. E.. Hydrolysis of different chain length xylooliogmers by cellulase and hemicellulase. Bioresource Technology., 2011, v. 102(2), p. 1359-1366.

145. Aleksenko A.Y., Makarova N.A., Nikolaev I.V., Clutterbuck A.J. Curr.Genet. 1995, v. 28, p. 474-478.

146. Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М., Мир, 1991, 543 с.

147. Nelson N. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of sugars. J. Biol. Chem., 1944, v. 153, p. 375-379.

148. Somogyi M. A new reagent for the determination of sugars. J. Biol. Chem., 1952, v. 195, p. 1923.

149. Doner L.W., Irwin P.L. Assay of reducing end groups in oligosaccharide homologues with 2,2'-bicinchoninate. Anal. Biochem., 1992, v. 202, p. 50-53.

150. Гусаков A.B., Семенова M.B., Синицын А.П. Масс-спектрометрия в исследовании продуцируемых микроскопическими грибами внеклеточных ферментов. Масс-спектрометрия, т. 7, № 1, стр. 5-20.

151. Березин И.В., Рабинович М.Л., Синицын А.П. Исследование возможностей кинетического спектрофотометрического метода определения глюкозы. Биохимия, 1977, т. 42, с. 16311636.