Физическая и функциональная характеристика криптической плазмиды pPМ1 возбудителя мелиоидоза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Захарова, Ирина Борисовна

• Захарова, Ирина Борисовна
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Захарова, Ирина Борисовна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Плазмиды резистентности

1.2 Роль плазм ид в биологии патогенных микроорганизмов

1.3 Некоторые аспекты изучения генетики и естественной изменчивости возбудителя мелиоидоза

1.4 Собственные плазмиды возбудителя мелиоидоза

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Бактериальные штаммы

2.2 Питательные среды и условия культивирования

2.3 Выделение ДНК

2.4 Ферментативные реакции

2.5 Трансформация клеток Е.соН

2.6 Методы электрофореза

2.7 Иммунохимические методы

2.8 ДНК-ДНК гибридизация

2.9 Получение препаратов клеточных мембран

2.10 Определение размеров рестрикционных фрагментов

3. ФИЗИЧЕСКОЕ КАРТИРОВАНИЕ КРИПТИЧЕСКОЙ ПЛАЗМИДЫ рРМ1 ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА

3.1 Рестрикционный анализ нативной рРМ1

3.2 Рестрикционный анализ фрагментов рРМ1, клонированных на мультикопийных векторах рВИ322 и рЦС19

3.3 Построение рестрикционной карты рРМ1

4.ГИБРИДИЗАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ рРМ1

4.1.Изучение гомологии ДНК рРМ1 с геномными ДНК

В.р8еиёота11е1, близкородственных и гетерологичных видов микроорганизмов

4.2.Изучение гомологии ДНК критической плазмиды рРМ 1 и фагов

возбудителя мелиоидоза

5. КЛОНИРОВАНИЕ рРМ1 В ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ СИСТЕМАХ

5.1 Конструирование интегративного вектора на основе Со1Е1 репликона для клонирования в В.р8еис1ота11е1

5.2 Локализация области начала репликации рРМ1

5.3 Получение библиотеки рРМ1

5.4 Клонирование Крп 1-фрагментов рРМ1

5.5 Анализ продуктов экспрессии рекомбинантных плазмид

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДСН (БОБ) - додецилсульфат натрия

ИПТГ - изопропилтио- р -В-галактозид

ИФА - иммуноферментный анализ

м.к. - микробные клетки

МТТК - минимальная подавляющая концентрация

НМ - наружные мембраны

ПААГ - полиакриламидный гель

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

т.п.н - тысяча пар нуклеотидов

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

Ша - килодальтон

МОа - мегадальтон

Мг - относительная молекулярная масса

ХОа1 - 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-(3 -Б-галактозид

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Физическая и функциональная характеристика криптической плазмиды pPМ1 возбудителя мелиоидоза»

ВВЕДЕНИЕ

Мелиоидоз - инфекционное заболевание, вызываемое Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei. Само заболевание и свойства его возбудителя были впервые описаны английским патологоанатомом Уитмором в 1912 году. Длительное время мелиоидоз считался довольно ограниченно распространенной инфекцией. Однако, по оценкам специалистов, проблема ме-лиоидоза сейчас значима не только для традиционно эндемичных регионов, но и для ряда областей, где заболевание ранее не регистрировалось (16, 35, 90,113,161).

Возбудитель мелиоидоза обладает чрезвычайно пластичными адаптационными механизмами, обеспечивающими существование как в постоянно меняющихся условиях природных биоценозов, так и в условиях пресса иммунной системы макроорганизма при развитии инфекционного процесса. Природная хромосомная трансформабелыюсть В.pseudomallei, наличие криптических плазмид, полилизогения - все эти факторы создают большие резервы для регулярных и нерегулярных перестроек генома, и, по-видимому, лежат в основе диссоциативного и адаптационного процессов (16).

Накопление знаний о структуре и функции геномов, анализ закономерностей и механизмов, лежащих в основе выражения важнейших биологических признаков многих микроорганизмов, включая известные высокопатогенные виды (Y.pestis, V.cholerae, B.anthracis), позволили раскрыть природу патогенности перечисленных бактерий и создать реальные предпосылки к совершенствованию средств профилактики и лечения вызываемых ими заболеваний (23, 28, 38, 43, 103, 126, 157, 165). На сегодняшний день достаточно много известно об основных биологических свойствах возбудителя мелиоидоза - составе и биохим ической активности клеток (21,112, 125, 170), наличии и функции отдельных ферментов и токсинов

(22, 61, 132,152, 169), продукции и структуре антигенов (5, 58, 59, 84, 114, 186), резистентности бактерий к разного рода ингибиторам и антибиотикам (12, 13, 14, 92, 115,198). Можно ожидать, что выявление генетических детерминант указанных факторов послужит основанием для дальнейшего целенаправленного генетического и молекулярно-биологического изучения патогенных свойств B.pseudomallei.

Одна из наименее исследованных областей генетики возбудителя ме-лиоидоза - внехромосом ные элементы наследственности. Имеющиеся публикации лишь констатируют факты наличия в штаммах Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei различного географического происхождения криптических плазм ид, стабильность их наследования, наличие специфических гомологичных последовательностей с хромосомными ДНК собственного и близкородственных видов (11, 41, 69, 75, 77), а также передаче в Salmonella typhi плазмиды от возбудителя мелиоидоза (187). Однако, в работах вышеназванных авторов не приводится каких-либо сведений о физической организации и функциональной роли обнаруженных плазмид. Изучение их физической структуры и выявление фенотипа су щественно дополнят знания о генетических детерминантах, лежащих в основе выражения важнейших биологических признаков Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei.

Цель работы

Изучение физической структуры и определение фенотипа криптиче-ской плазмиды pPMl Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei.

Задачи исследования

1. Физическое картирование pPMl.

2. Гибридизационный анализ pPMl.

3. Клонирование и изучение возможности репликации рРМ1 в гетеро-логичных видах микроорганизмов.

4. Характеристика продуктов экспрессии плазмиды рРМ1 в кишечной палочке.

Научная новизна

Впервые на критической плазмиде рРМ1 обнаружены и локализованы сайты узнавания для рестриктаз В gl И, Kpn I, а также пятый сайт для SalG I. Уточнены размеры фрагментов и взаиморасположение сайтов рестрикции в секторе карты с координатами: 5,4 -12,0. В целом, для рРМ1 построена физическая карта сайтов узнавания для специфических эндонукле-аз BarnH I, Bgl II, EcoR I, EcoR V, Hind III, Kpn I, Pst I, SalG I.

Локализована область начала репликации критической плазмиды рРМ1.

Показана экспрессия генов B.pseudomallei в клетках кишечной палочки.

На рРМ1 обнаружена детерминанта, ответственная за синтез белков наружной клеточной мембраны и определяющая множественную лекарственную резистентность рекомбинантных клонов E.coli.

Практическая ценность

Сконструирована библиотека щэиптической плазмиды рРМ1 в составе мультикопийных векторов pUC19 и pBR322.

Получены рекомбинантные штаммы кишечной палочки, продуцирующие поверхностный антигенный комплекс, специфически взаимодействующий с иммуноглобулинами поликлональной мелиоидозной сыворотки.

Разработан ускоренный метод плазмидного скрининга при исследовании большого количества рекомбинантных клонов кишечной палочки и утверждены методические рекомендации "Ускоренный метод обнаружения

плазм ид в штаммах Escherichia coli", утвержденные 10 марта 1998г. директором ВолгНИПЧИ Заслуженным деятелем науки РФ, профессором Тихоновым Н.Г.

Апробация работы

Материалы диссертации были обсуждены на институтских и межлабораторных конференциях ВолгНИПЧИ (1991-1996), на юбилейной конференции ВолгНИПЧИ (Волгоград, 1995), на международной научной конференции "Идеи И.И.Мечникова и развитие современного естествознания" (Харьков, 1995) и научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, отражающих основное ее содержание.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Уточнена и дополнена рестрикционная карта рРМ1, локализована и клонирована область начала репликации, установлена возможность функционирования origin криптической плазмиды Burkholderia pseudomallei в кишечной палочке.

2. рРМ1 является резидентной плазмидой Burkholderia pseudomallei, обладающей гомологией с геномными ДНК различных штаммов возбудителя мелиоидоза и не содержащей последовательностей, гомологичных ДНК мелиоидозных бактериофагов.

3. Проклонирован фрагмент рРМ1, несущий детерминанту, экспрессия которой приводит к изменению белкового состава наружной мембраны и развитию множественной антибиотикорезистентности у рекомбинантных клонов кишечной палочки.

4. рРМ1 детерминирует синтез белков 23 и 27 kDa, входящих в состав наружной мембраны рекомбинантных штаммов кишечной палочки. Эти

белки специфически взаимодействуют с иммуноглобулинами поликло-нальной мелиоидозной сыворотки и способны к ассоциации в более высокомолекулярные формы.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 115 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, иллюстрированных 6 таблицами и 28 рисунками, заключения, выводов и библиографического указателя по 198 литературным источникам (87 отечественных и 111 иностранных авторов).

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Захарова, Ирина Борисовна

ВЫВОДЫ

1. Для критической плазм иды рРМ1 построена физическая карта сайтов узнавания для следующих эндонуклеаз: BamH I, Bgl II, EcoR I, EcoR V, Hind III, Kpn I, Pst I, SalG I.

2. Установлено, что pPMl является резидентной плазмидой Burkholderia pseudomallei, содержащей специфические последовательности, гомологичные геномным ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза. Гомологии между ДНК собственных фагов и критической плазмиды pPMl В.pseudomallei не обнаружено.

3. На основе Со1Е1-репликона и фрагмента pPMl сконструирован вектор размером 4,3 т.п.н. с уникальными сайтами для рестриктаз Pstl , EcoR 1, Hind III, который может быть использован в качестве интегративного вектора для Burkholderia pseudomallei.

4. Локализована область начала репликации рРМ 1 между 10-й и 12-й координатами физической карты критической плазмиды.

5. Установлена возможность функционирования origin собственной плазмиды Biirkholderia pseudomallei в кишечной палочке.

6. Плазмида pPMl содержит детерминанту, ответственную за синтез белков наружной мембраны. Экспрессия данной детерминанты в клетках E.coli приводит к существенному изменению белкового состава наружной мембраны и развитию множественной антибиотикорезистентности неспецифического характера.

7. Белки наружной мембраны рекомбинантных клонов кишечной палочки 23 и 27 kDa специфически взаимодействуют с иммуноглобулинами по-ликлональной сыворотки к клеткам В.pseudomallei и способны к ассоциации в более высокомолекулярные формы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что плазм иды играют значительную роль в биологии патогенных видов микроорганизмов. Они детерминируют различные факторы патогенное I и, устойчивость к самым разнообразным неблагоприятным факторам внешней среды, придают способность подавлять рост других бактерий, служат для обмена генетической информацией, повышают адаптационные свойства микробных клеток (18, 30, 43, 55, 56, 65, 76 и др.).

Внехромосомные элементы наследственности Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei - одно из наименее освещенных направлений в изучении данного микроорганизма. Имеются отдельные сообщения о выявлении критических плазмид, их взаимной гомологии и гомологии с тотальной ДНК возбудителей сапа, мелиоидоза и частично В.cepacia ( 11, 41, 54, 69 ), а также передаче в Salmonella typhi Ту 21 плазмиды от В.pseudomallei с последующим серологическим выявлением в рекомби-нантном штамме антигенов возбудителя мелиоидоза (187).

В настоящей работе мы предприняли попытку изучить физическую структуру одной из плазмид В.pseudomallei - pPMl, определить ее фенотип и охарактеризовать продукты экспрессии .

Первым этапом исследования плазмиды явилось построение физической карты сайтов узнавания для специфических эндонуклеаз. Проведя ре-стрикционный анализ как нативного препарата плазмидной ДНК, так и ее фрагментов, мы впервые обнаружили и локализовали сайты для рестриктаз Kpn I, Bgl II, а также пятый сайт для SalG I, уточнили размеры фрагментов и взаиморасположение сайтов для ферментов BamH I, EcoR I, Hind III, Pst I и SalG I в секторе карты с координатами: 5,4 -12,0. Кроме того, на ДНК pPMl присутствовали сайты для Ара I, Hind II, Pvu II, Sph I и отсутствовали для рестриктаз AspA I, Pvu I, Xho I. В целом, для криптической плазмиды pPMl построена физическая карта сайтов узнавания для следующих эндонуклеаз: BamH I, Bgl II, EcoR I, EcoR V, Hind III, Kpn I, Pst I, SalG I, которая на сегодняшний день является наиболее полным вариантом современной физической карты данной плазмиды.

Известно, что многие плазмиды имеют широкий круг хозяев и могут быть переданы во многие бактериальные виды. А поскольку возбудитель мелиоидоза обладает естественной ком петентностью и способен спонтанно трансформироваться как хромосомной, так и плазмидной ДНК, было необходимо определить: не является ли pPMl для мелиоидозного микроба случайно приобретенной. С этой целью был проведен ряд экспериментов по выявлению гомологии между ДНК pPM l и геномными ДНК возбудителя мелиоидоза, а также близкородственных и гетерологичных видов микроорганизмов. Показано, что ДНК нативной pPMl и ее BamH I-фрагмента размером 1,6 т.п.н. гибридизуются с тотальной ДНК всех исследованных штаммов возбудителей мелиоидоза и сапа, а также с В.cepacia. Однако, в реакции гибридизации со штаммами В.cepacia сигнал радиоавтографа был гораздо менее выраженный, что, по-видимому, отражает наличие в геноме B.cepacia лишь небольших по протяженности последовательностей, гомологичных ДНК pPMl. По интенсивности сигналы на радиоавтографе при гибридизации pPMl с геномными ДНК различных штаммов возбудителя сапа практически не отличались от таковых при гибридизации с ДНК B.pseudomalíei. Так как у возбудителя сапа внехромосомных элементов наследственности до настоящего времени не обнаружено, можно с определенной долей уверенности утверждать, что В.mallei содержит достаточно протяженные последовательности, гомологичные pPMl, в составе своей хромосомы.

Гомологии между ДНК рРМ1 и ДНК гетерологичных видов микроорганизмов - Е.соН и псевдомонад: Р.аепщтоза, Р.риМа и Р.йиогеБсеш обнаружено не было.

Таким образом, в реакции ДНК-ДНК гибридизации критической плазмиды рРМ1 с геномными ДНК близкородственных и гетерологичных видов микроорганизмов получены результаты, аналогичные данным ряда авторов о гибридизации хромосомных ДНК В.рэеидошаНе! (75, 160, 197), то есть ДНК критической плазмиды рРМ1 в гибридизационном анализе ведет себя идентично хромосомной ДНК штаммов В.р8в1к1ота11е1.

Необходимо также отметить, что рРМ1 имела выраженную гомологию с другими критическими плазмидами возбудителя мелиоидоза (рСМ2, рСМЗ и рСМ4), кроме того, все плазмиды В.рБе1^ота11е1 обладали взаимной гомологией и гомологией с тотальной ДНК собственного и близкородственных видов (41).

Наличие в геноме всех исследованных штаммов возбудителя мелиоидоза (как несущих критические плазмиды, так и безплазмидных) специфических последовательностей, гомологичных ДНК рРМ1 свидетельствует о том, что рРМ1 является собственной плазмидой возбудителя мелиоидоза.

Полученные в ходе нашей работы данные, в совокупности с опубликованными ранее (11, 33, 41 и др.), позволяют предположить, что рРМ1 являясь резидентной плазмидой ВшМюМепа р8еш1ота11е1, способна обратимо интегрировать в хромосому хозяина. Не исключена возможность, что более крупные критические плазмиды являются продуктами выщепления ДНК рРМ1 совместно с прилегающими фрагментами хромосомы.

Известно, что возбудителю мелиоидоза свойственна полилизогения (24). Выяснилось, что круг хозяев для мелиоидозных бактериофагов совпадает с группой ДНК-ДНК гомологии критических плазмид. Обнаружить достоверных различий в картине ПДРФ между ДНК фагов третьей группы и pPMl, гидролизованных рестриктазой EcoRI, не удалось. В то же время, при использовании других эндонуклеаз, обнаружены существенные различия. Так, на ДНК pPMl имеется 4 сайта Pst I, а на ДНК фагов этой группы они не выявлены; но присутствуют 11 сайтов для Xho I, которых нет на ДНК pPM l.

В связи с вышеизложенным, было необходимо решить вопрос о филогенетических связях внехромосомных элементов наследственности B.pseudomallei. Отрицательный результат дот-гибридизации ДНК фагов различных групп, выделенных из большого количества штаммов B.pseudomallei, и pPMl достаточно убедительно показал, что плазмиды и бактериофаги возбудителя мелиоидоза имеют различное происхождение.

Для исследований наследственного аппарата любых микроорганизмов молекулярно-биологическими методами необходима векторная система, стабильно функционирующая как в реципиентном, так и в донорном видах бактерий. Это позволяет изучать экспрессию исследуемых генетических детерминант в гетерологичных видах и, при необходимости, проводить комплементационный анализ в собственном. Векторные системы для клонирования и экспрессии, разработанные для кишечной палочки и других энтеробактерий основаны на репликонах с узким кругом хозяев, что часто создает определенные трудности при реинтрадукции клонированной мелиоидозной ДНК в естественного хозяина.

Выбор вектора для клонирования в B.pseudomallei осложняется высоким уровнем природной резистентности возбудителя мелиоидоза к целому ряду антимикробных препаратов (12, 92,115,198). Кроме того, к настоящему времени установлено, что трансформация гшазмидной ДНК у видов, обладающих естественной компетентностью, требует наличия на плаз-ми де участков гомологии с хромосомой или резидентной плазмидой (39). В связи с этим, для возбудителя мелиоидоза было целесообразно получить вектор на основе его собственной плазмиды и несущий детерминанту резистентности к одному из антибиотиков, позволяющих проводить селекцию при клонировании в B.pseudomallei.

Нами сконструирован векгор (pY70) размером 4,3 т.п.н. с уникальными сайтами для рестриктаз Pst I, EcoR I, Hind III, содержащий область начала репликации и тетрацикл и новую детерм ин анту pBR322 и фрагмент рРМ1. Выбор тетрациклинового маркера объясняется тем, что максимальная МПК тетрациклина для штаммов возбудителя мелиоидоза не превышает 12,5 мкг/мл.

Штамм B.pseudomallei С-141 pur'206 (pY70) оказался стабильно резистентным к тетрациклину в концентрации 50 мкг/мл, ингибирующей рост реципиентного штамма возбудителя мелиоидоза, но попытки выделить из него автономную плазмидную ДНК успехом не увенчались. По-видимому, фрагмент рРМ1, обладающий гомологией с хромосомной ДНК возбудителя мелиоидоза, обеспечивает интеграцию рекомбинантной плазмиды в хромосому реципиента и, как следствие, "спасение" тетрациклинового маркера. Необходимо отметить, что, по литературным данным, в большинстве случаев трансформации возбудителей сапа и мелиоидоза происходила интеграция плазм ид с хромосомой, так как их не обнаруживали в клетках микроорганизмов при электрофоретическом исследовании. Однако в последующем они могли быть мобилизованы из клеток полученных трансформантов в другие реципиенты, где находились в автономном состоянии (51,68).

Таким образом, сконструирована рекомбинантная плазмида pY70, которая автономно реплицируется в E.coli, но сегрегационно нестабильна в клетках возбудителя мелиоидоза, в связи с чем, может быть использована в качестве интегративного вектора для B.pseudomallei.

Изучение функций собственной плазмиды возбудителя мелиоидоза рРМ1 осложнялось полным отсутствием информации о ее генетической организации. В связи с этим была поставлена задача локализовать на физической карте регион, ответственный за инициацию репликации. Получен мини-репликон критической плазмиды, обозначенный pSIlO, состоящий из неполного ВатШ-фрагмента рРМ1 и детерминанты резистентности к канамицйну, изолированной из pUC4K. Поскольку векторная часть реком-бинантной молекулы не содержит точку начала репликации, есть все основания полагать, что репликативные функции плазмиды pSIlO, обеспечиваются origin, прокл онированны м из рРМ1. Сопоставление данных рест-рикционного анализа pSIllO с физической картой критической плазмиды позволило сделать вывод о наличии в рекомбинантной плазмиде частично делетированного 5,2 т.п.н. ВатШ-фрагмента рРМ1.

Таким образом, нами обнаружена и локализована между 10-й и 12-й координатами физической карты область начала репликации рРМ1 и впервые показана возможность функционирования origin собственной плазмиды B.pseudomallei в клетках E.coli.

В целях выяснения функциональной роли критической плазмиды возбудителя мелиоидоза мы предприняли попытку определить фенотип рРМ1 путем анализа продуктов ее экспрессии в кишечной палочке. Для получения представительной библиотеки клонировали перекрывающиеся фрагменты плазмидной ДНК рРМ1, образующиеся при рестрикции эндо-нуклеазами BamHI, Sal I, Kpn I, на мультикопийных векторах pBR322 и pUS19.

Были проклонированы следующие фрагменты рРМ1: на pBR322 - 2,7 т.п.н. Sail (рекомбинантная плазмида pYl размером 7,0 т.п.н.); на pUC19 -3,6 т.п.н. Sail фрагмент (рекомбинантная плазмида pSI15 размером 6,3 т.п.н.), 1,6 т.п.н. BamHI фрагмент (рекомбинантная плазмида pY5 размером

4,3 т.п.н.), 5,4 т.п.н. Kpnl фрагмент (рекомбинантная плазмида pSI14 размером 8,0 т.п.н.). Рекомбинантные плазмиды стабильно наследовались и сохраняли физическую структуру. Сравнительное исследование исходных и полученных штаммов Б. coli показало, что приобретение вышеперечисленных гибридных плазмид, несущих фрагменты, охватывающие область карты рРМ1 с координатами 0 - 10.1, не приводило к изменению культурально - морфологических свойств, а также белкового и антигенного спектра ре-комбинантных клонов.

В штаммах Б.coli С600 и DH1 в составе мультикопийного вектора pUC 19 ююнировали Kpnl-фрагменты рРМ1. Были отобраны два реком би-нантных клона E.coli С600, несущих плазмиды, обозначенные pSI 2 и pSI 4. Исследование этих клонов на чувствительность к антибиотикам показало, что, помимо детерминируемой pUC19 резистентности к ампициллину, имела место резистентность к стрептомицину7, гентамицину и канамицину, причем рекомбинантные клоны оказались устойчивы к концентрации Sm 10 ООО мкг/мл и выше. При клонировании в E.coli DH1, был отобран клон с фенотипом ApRSmR, содержащий рекомбинантную плазмиду, обозначенную pSI 9. Уровень резистентности этого трансформанта к антибиотикам аминогликозидного ряда был аналогично высоким. Кроме того, штамм E.coli DHl(pSI 9) оказался устойчивым к офлоксацину и пефлоксацину, E.coli С600 (pSI 2) - к пефлоксацину .

Рестрикционный анализ рекомбинантных плазмид pSI 2, pSI 4, pSI 9 показал нетипичную для исходных фрагментов рРМ 1 картину ПДРФ, однако присутствие последовательностей рРМ1 в составе генома всех рекомбинантных клонов было доказано при помощи дот-гибридизации их плазмид-ных и хромосомных дНК с ДНК рРМ1, меченной "Р. В связи с тем, что при отсутствии в составе автономных плазмид pSI 2 и pSI 4 электрофорети-чески определяемых последовательностей рРМ1 наблюдалась экспрессия чужеродных для реципиентных штаммов генов, не имеющих отношения к вектору, мы предположили интеграцию фрагментов рРМ1 в хромосому ре-ком бинантных клонов E.coli С600 (pSI 2) и E.coli C600(pSI 4). Результаты блот-гибридизации показали присутствие гомологичных pPMl последовательностей на хромосоме рекомбинантных клонов E.coli С600 в области рестриктов размером -5 и более т.п.н., что, несомненно, указывает на интеграцию фрагментов pPM l в хромосому кишечной палочки.

Таким образом, установлено, что при клонировании фрагмента pPMl, содержащего участок в пределах координат физической карты от 12.0 до 0, у реком бинантных клонов кишечной палочки появлялись новые фенотипи-ческие свойства, выражающиеся в приобретении множественной лекарственной резистентности. Одновременно наблюдались сложные рекомбина-ционные процессы, приводящие либо к интеграции части клонированного фрагмента в хромосомную ДНК реципиента, либо структурными перестройками самой рекомбинантной плазмиды. Исходя из полученных данных, можно предположить наличие на pPMl IS-элемента или транспозона, которые обеспечивают рекомбинационный процесс и связанные с ним структурные перестройки плазмидной ДНК.

Для выявления и характеристики продуктов экспрессии рекомби-нантных плазмид, мы провели изучение белковых и антигенных спектров, а также исследования особенностей клеточной морфологии несущих их штаммов кишечной палочки.

Анализ электрофоре грамм общеклеточных белков в ДСН-ПААГ показал, что рекомбинантные клоны E.coli С600 и E.coli DH1 продуцируют высокомолекулярный белок 120 kDa, отсутствующий у исходных штаммов кишечной палочки и имеющийся у донорного штамма B.pseudomallei ВКМ-900. В целом, рекомбинантные клоны E.coli DH1 характеризовались большими количественными изменениями белкового спектра в широком диапазоне молекулярных масс, по сравнению с производными E.coli С600.

По данным электронно-микроскопических исследований, наиболее выраженные изменения клеточной морфологии наблюдались у E.coli DH1 (pSI 9). По сравнению с реципиентным штаммом, клетки рекомбинантного клона обладали хорошо заметной капсулоподобной структурой; ее величина варьировала от 40 нм при выращивании микробных клеток на плотной питательной среде, содержащей ампициллин, до 100 нм при выращивании в присутствии стрептомицина. Интересно, что по данным электрофоретиче-ского анализа, наблюдалось приблизительно 2-х кратное увеличение уровня продукции биополимера 120 Ша у E.coli DH1 (pSI 9), выращенной в присутствие Sm, по сравнению с культурой, выращенной на среде с Ар.

Дот-ИФА исходных штаммов E.coli и рекомбинантных клонов, содержащих плазмиды pSI 2, pSI 4, pSI 9, с использованием иммуноглобулинов поликлональной иммунной сыворотки к B.pseudomallei показал специфическое взаимодействие с антителами клеток всех перечисленных выше рекомбинантных штаммов кишечной палочки, в отличие от исходных. Данные результаты, а также выявленные изменения клеточной морфологии рекомбинантных клонов E.coli и сведения о продукции ими белков, отсутствующих у реципиентных штаммов, позволили нам сделать предварительное заключение об экспрессии клонированного в кишечной палочке генетического материала B.pseudomallei, детерминирующего, предположительно, синтез поверхностных антигенов.

Идентификация антигенов, продуцируемых клетками рекомбинантных штаммов кишечной палочки, была проведена методом иммуноблот-тинга с применением поликлональной сыворотки к клеткам B.pseudomallei. Мы проанализировали антигенный спектр препаратов суммарного клеточного белка, а также наружной мембраны клеток рекомбинантных клонов

E.coli DH1 (pSI 9) и исходной E.coli DHl, несущей векторную плазм иду pUC19. В составе наружной мембраны E.coli DHl (pSI 9) было выявлено 6 антигенов -120, 95, 75, 30, 27 и 23 Ша, из них 4 (95, 75, 27 и 23 Ша) имели наибольшую интенсивность окраски. В составе препаратов общеклеточного белка рекомбинангных клонов E.coli были также отмечены антигены 120, 95, 30, 27 kDa - у клонов E.coli DH1( pSI 9), а также 120, 95, 35 kDa - у клонов E.coli С600 ( pSI 4) и 120, 95 Ша - у E.coli С600 (pSI 2). Интенсивность специфического окрашивания антигенных фракций в последнем случае была более низкой, что, по-видимому, следует объяснить меньшей парциальной концентрацией мембранных биополимеров в тотальных клеточных ли-затах.

Дальнейший электрофоретический анализ наружной мембраны показал, что белки 70 - 120 kDa следует рассматривать как высокомолекулярные олигомерные формы, при нагревании в присутствие восстанавливающего соединения ß-меркаптоэтанола диссоциирующие на ряд фрагментов меньшей молекулярной массы. При этом у E.coli DHl (pSI9) мы отметили преимущественное образование компонентов 23 и 27 kDa, по молекулярной массе не имевших аналогов в составе наружной мембраны реципиентного штамма.

Полученные результаты позволяют сделать заключение, что на клонированном фрагменте рРМ1 имеется детерминанта, ответственная за синтез белков наружной мембраны 23 и 27 kDa, обладающих выраженной антигенной специфичностью. Экспрессия данной детерминанты в клетках E.coli приводит к существенному изменению белкового состава наружной мембраны. Наблюдаемая при этом полирезистентность к антибиотикам ре-комбинантных клонов кишечной палочки имеет, по-видимому, неспецифический характер.

Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что критическая плазмида рРМ1 является резидентной плазмидой Burkholderia pseudomallei, охарактеризована ее физическая структура и установлено, что высокий уровень устойчивости возбудителя мелиоидоза к антибиотикам определенным образом связан с экспрессией генетической детерминанты, локализованной на данной плазмиде и определяющей синтез белков наружной мембраны. Полученные данные существенно дополняют представления о природе полирезистентности Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei и могут быть основанием для дальнейшего генетического и молекулярно-биологического изучения механизмов реализации его важнейших видовых свойств.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Захарова, Ирина Борисовна, 1998 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ источников

1. Абаев И.В., Померанцева О.М., Аеташкин Е.И. Создание библиотек геномной ДНК Pseudomonas mallei и Pseudomonas pseudomallei. // Мол. ге-нет., микробиол. вируеол.-1997,- №1,- С.17-21.

2. Агеева Н.П., Меринова Л.К., Петере М.К. Применение плазмиды рТНЮ для получения донорных штаммов Pseudomonas mallei // Мол. генет., микробиол. вирусол,- 1989,- N4,- С.14-18.

3. Агеева Н.П., Меринова JI.K. Особенности наследования Тп5 клетками Pseudomonas mallei // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций. Материалы Российской научной конференции. - Волгоград, 1992. - С.26.

4. Агеева Н.П., Меринова JI.К. Влияние условий скрещивания на эффективность передачи плазмиды RP4 у Pseudomonas mallei // Микро-биол.журн.- 1986,- N 5,- С.3-6.

5. Адамов А.К., Карпузиди К.С., Акулова Н.Ф. Антигенное строение возбудителей сапа и мелиоидоза // Генетика, биохимия и иммунохимия особо опасн.инфекций. - Ростов н/Д,- 1967,- С.335 - 339.

6. Адимов Л.Б. Бактериофаг возбудителя мелиоидоза // Диагностика особо опасных инфекций: - Ростов н/Д, 1986. - С.33-36.

7. Адимов Л.Б. Поливалентный мелиоидозный диагностический бактериофаг // Состояние проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций. Матер, рабочего совещания. - Обо-ленск,1990. - С.72.

8. Анализ плазмидного состава штаммов Yersinia pseudotuberculosis и его применение для тигшрования возбудителя псевдотуберкулеза / Шубин Ф.Н.,Гинзбург А.Л.,Китаев В.М. и др. // Мол. генет., микробиол. виру-сол,- 1989.- N6,- С.20-25.

9. Анищенко М.А. Основные факторы патогенности псевдомонад и их клонирование // Мол. генет., микробиол. вирусол.-1991.- N5,- С.3-7.

10. Анищенко М.А., Меринова Л.К. Мобилизация с помощью плазм ид группы несовместимости Р-1 в штаммы Pseudomonas pseudomallei и Pseudomonas mallei потенциальных векторов для клонирования ДНК // Мол. генет., микробиол. вирусол,- 1992. - N 5-6. - С. 1316.

11. Антонов В.А. Первичная характеристика плазмид возбудителя мелиоидоза: /Автореф. дис. ...канд.мед.наук. - Саратов, 1995,- 22с.

12. Антонов Ю.В., Поповцева Л.Д., Ярулин Р.Г., Илюхин В.И. Проблемы резистентности возбудителя мелиоидоза к антибиотикам // Антибиотики и химиотерапия. - 1991. - N10. - С.26-28.

13. Батманов В.П. Чувствительность Pseudomonas mall ei к тетрациклинам и их эффективность при экспериментальном сапе //Антибиотики и химиотерапия. - 1994. - N5. - С.ЗЗ - 37.

14. Батманов В.П. Чувствительность Pseudomonas mallei к фторхинолонам и эффективность их при экспериментальном сапе // Антибиотики и химиотерапия.-1991,- N9,- С.31-34.

15. Безопасность работы с микроорганизмами 1-2 групп патогенности. Санитарные правила СП 1.2.011 - 94. //Госкомсанэпиднадзор России - М.: 1994.- 152с.

16. Беляков В.Д., Ряпис Л.А., Илюхин В.И. Псевдомонады и псевдомонозы - М.: Медицина. - 1990. - 224 с.

17. Воронин А.М. Биология плазм ид // Успехи микробиологии .М, 1983. -С.143 - 163.

18. Воронин А.М. Плазмиды резистентности и биодеградации рода Pseudomonas // Проблемы биохимии и физиологии микроорганизмов. -Пущино, 1985. - С.280-288.

19. Воронин А.М., Анисимова Л.А. R-плазмиды Pseudomonas aeruginosa // Антибиотики. - 1984. - N 9. - С.678 - 695.

20. Буланцев А.Л.,Лозовая H.A. Спонтанная генетическая трансформация у Pseudomonas pseudomallei // Мол. генет.,микробиол. вирусол. - 1985. -N9. - С.11-15.

21. Викторов Д.В. Анализ белкового и антигенного состава штаммов Pseudomonas pseudomallei различной вирулентости/ Дис...канд. мед. наук. -Волгоград. - 1997. - 108 с.

22. Голосеев Ю.В., Фарбер С.М., Ефременко В.И., Илюхин В.И. О нейра-минидазной активности возбудителя мелиоидоза // Современные аспекты профилактики зооноз. инф.: Тез.докл. Всесоюзн. конф. специалистов противочумных учреждений. - Иркутск. - 1984. - Ч.З - С.73 - 74.

23. Гончаров А.Ю., Гончаров Е.Л., Агутин И.М., Марченков В.И. Локализация ответственного за синтез фракции I участка ДНК на плазмиде pYT чумного микроба // Молекул, генет. микробиол. вирусол. - 1992. -NN11-12.-С. 10-14.

24. Гришкина Т.А. Явление лизогении у Pseudomonas pseudomallei и сравнительная характеристика мелиоидозных фагов / Дис...канд. мед. наук. -Волгоград. - 1996. - 118 с.

25. Гришкина Т.А., Меринова Л.К. Выделение и характеристика умеренных фагов Pseudomonas pseudomallei // Генетика, микробиол. и совершенствование методов лаб, диагн. особо опасн. инф. Сб. научн. работ. - Саратов,1991. - С.131-135.

26. Гришкина Т.А., Меринова Л.К. Изучение возможности индукции про-фага под действием физических и химических факторов у Pseudomonas pseudomallei // Генетика и биохим. вирулентности возбуд. особо опасн. инф. Матер. Российской научн. конф.: Тез.докл. - Волгоград, 1992. -С.13.

27. Гришкина Т.А., Меринова Л.К. Изучение спонтанной фагопродукции Pseudomonas pseudomallei и крута "хозяев" мелиоидозных фагов среди представителей рода Pseudomonas //Микробиол. журн. - 1993. - N4. -С.43-47.

28. Гуревич Г.К., Некляев В.Н., Бичуль O.K., Лебедева С.А. Выявление и попытки идентификации хромосомного локуса, связанного с экспрессией вирулентности и иммуногенности у Yersinia pestis // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. - 1996. - N 6. - С. 21 - 24

29. Денисов Й.И., Каплиев В.И. Уровень спонтанной фагопродукции и чувствительность к мелиоидозным фагам музейных культур Pseudomonas pseudomallei /7 Микробиол. журн. -1991. - N6. - С.66-69.

30. Домарадский И.В. О "побочных" эффектах плазмид (R-плазмиды и вирулентность).//Молекул. генет. микробиол. вирусол. - 1987. - №6. - С.З-9.

31. Замараев B.C. Образование и переистенция морфологических вариантов возбудителя мелиоидоза в организме экспериментальных животных // Теоретич. и прикладн. инфекцион. иммунолог. Тез. докл. I Всесоюзн. конф. - М, 1982. - С. 89.

32. Изучение возможности клонирования детерминант протеолитической и гемолитической активности возбудителя м ел иоидоза.//Отчет по НИР (заключительный) Рук. Илюхин В.И., Замараев B.C.- Волгоград.-1989.-Г.Р.01880019699,-29с.

33. Изучение критических плазмид возбудителя мелиоидоза: Отчет о НИР (заключит.) / Волгогр. науч.- исслед. противочум. ин-т; Руководитель Замараев B.C. - Волгоград, 1993. - ГР. 01.9.10 013827. - 86с.

34. Илюхин В.И. Антигенная структура и серология псевдомонад // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1986. - N5. - С. 88

35. Илюхин В.И. Псевдомонадные инфекции в патологии человека //Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. - 1985. - N 2. - С. 110-114.

36. Илюхин В.И. Фагоцитабельность Pseudomonas pseudomallei //Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол.-1978.-Ы2-С. 130-132.

37. Интеграция с хромосомой - альтернативное состояние плазмид каль-цийзависимости у возбудителей иерсиниозов/ Гинцбург А.Л., Шовадае-ва Г.А., Шубин Ф.Н., Янишевский Н.В., НатерманГ., Хорш Ф., Проценко С П., Покровская М.С.// Молекул, генет. микробиол. вирусол. - 1989. - N5. - С.7-11.

38. Клонирование фрагментов хромосомы Vibrio cholerae 569 В, содержащих структурные гены холерного токсина в клетках Escherichia coli / За-харенко В.И., Бруханский Г.В., Вертиев Ю.В. и др. // Молекул, генет. микробиол., вирусол. - 1984. - N1. - С. 3-9.

39. Косович П.В., Прозоров A.A. Естественная трансформация у бактерий // Молекул, генет. микробиол., вирусол. -1990. - N1. - С.З -6.

40. Кокушкин А.М. Трансформация чумного микроба ДНК собственных плазмид.//Молекулярная биология и генетика возбудителей особо опасных инфекций,- Саратов. 1982.- С.34-40.

41. Криптические плазм иды возбудителя мелиоидоза./ Антонов В. А., Захарова И.Б., Мери нова Л.К., ЗамараевВ. С .//Тезисы докладов международной научной конференции "Идеи И.И.Мечникова и развитие современного естествознания."-Харьков 1995,- С.7-10.

42. Крыстева Р.Т. Генетический и молекулярно-биологический анализ способности ллазмиды RP4 наследоваться в широком круге бактериальных хозяев: Дис...канд.биол.наук. - М, 1985. - 113с.

43. Кутырев В.В. Генетический анализ факторов вирулентности возбудителя чумы: Автореф. дис... докт. мед. наук. - Саратов, 1992. - 38 с.

44. Кутырев В.В., Попов Ю.А., Проценко O.A. Плазм иды патогенности чумного микроба // Мол.генет., микробиол.вирусол,- 1986,- N6,- С.З-10

45. Кутырев В.В., Проценко O.A., Анисимов П.И. Создание штамма чумного микроба, обладающего свойствами эффективного донора // Молекул, генет., микробиол., вирусол. - 1984. - N4. - С.З - 7.

46. Кутырев В.В., Филиппов A.A., Куклева М.Н., Проценко O.A. Значение плазмидных и хромосомных генов возбудителя чумы для вирулентно-

сти. //Бактериальные плазмиды- Тезисы докладовю- Нальчик ,!990. -С.9-10.

47. Кучеряева В.Т., Аншценко М.А., Меринова Л.К. Трансформационная передача плазмиды RP4 Pseudomonas pseudomallei // Особо опасные инфекционные заболевания. Иммунология, генетика и биологические свойства возбудителей. - Волгоград, 1989. - Вып.5. -С. 126-129.

48. Литвин В.Ю. Потенциальная патогенность и случайный паразитизм микроорганизмов // Потенциально патогенные бактерии в природе. - М, 1991.-С. 9-30.

49. Манзенюк О.Ю., Воложанцев Н.В., Светоч Э.А. Идентификация бактерий Pseudomonas mallei с помощью бактериофагов Pseudomonas pseudomallei // Журн.микробиол. - 1994. - N3. - С.537-544.

50. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. -Пер. с англ., М.: Мир, 1984. - 392с.

51. Меринова Л.К. Системы генетического обмена патогенных псевдомонад: Автореф. дис... докт. мед. наук. - Волгоград,1997,- 40с.

52. Меринова Л.К., Сеимова И.К. Мобилизующая способность плазид Р-1 группы несовместимости в отношении хромосомных генов Pseudomonas pseudomallei // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций. Материалы Российской научной конференции,- Волгоград, 1992. - С.44.

53. Мишанькин Б.Н., Гольдберг А.М. Отношение к некоторым пеницилли-нам и пенициллиназная активность у возбудителей сапа и мелиоидоза // Лекарственная устойчивость микроорганизмов. - Ереван, - 1969. - С.87.

54. Петере М.К. Обнаружение собственных плазмид у возбудителя мелиоидоза // Молекул, биол. и генетика возбудителей особо опасных инф. -Саратов, 1982. - 4.1. - С.53-54.

55. Петровская В.Е., Бондаренко В.М. Роль хромосомы и её взаимодействия с внехромосомными детерминантами в процессе генетического контроля патогенных бактерий // Молекул, генет. микробиол., вирусол. - 1994.-N5-C.3-9.

56. Пехов А.П. Плазмиды бактерий.- М.: Медицина, 1986.- 224 с.

57. Пехов А.П., Авдиенко И.Д. Факторы генетического переноса бактерий // Успехи соврем, генет. - М, 1984. - N12. - С.93 - 120.

58. Пивень H.H. Антигенная структура возбудителя мелиоидоза //В кн.: Мелиоидоз,- Волгоград, 1995,- С.47-57.

59. Ливень H.H., Илюхин В.И. Антигенная структура возбудителя мелиои-доза // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. - 1981. - N4. - С.78 -82.

60. Ливень H.H., Илюхин В.И. Иммунохимический анализ термостабильных антигенов морфологических вариантов возбудителя мелиоидоза // Пробл. особо опасн. инф. - 1979. - Вы п. 5 - С.60 - 63.

61. Плеханова Н.Г. Экзопротеазы возбудителя мелиоидоза: выделение, очистка, физико-химические и иммунобиологические свойства //Дис. канд.- Волгоград,- 1995,- 123с.

62. Получение полимаркированных штаммов возбудителя мелиоидоза и сана / Меринова Л.К., Пивень H.H., Замараев B.C. и др. // Особо опас ные инфекционные заболевания: диагностика, профилактика и биологи ческие свойства возбудителей. - Волгоград. - 1990. - Вып.4. - С.57-62.

63. Попов С.Ф., Курилов В.Я., Мельников Б.И. Особенности паразитирова-ния возбудителя мелиоидоза в клетках хозяина //Журн., микробиол., эпидемиол., иммунобиол.- 1991.- N 10.- С.12-14.

64. Попов С.Ф., Курилов В.Я., Яковлев А.Т. Pseudomonas pseudomallei и Pseudomonas mallei - капсулообразующие бактерии //Журн., микробиол., эпидемиол., иммунобиол.- 1995,- N 5,- С.32-36.

65. Попов Ю.А. Структурная и функциональная организация плазмид чумного микроба и генноинженерные разработки на этой модели : Авто-реф. дис...докт.биол .наук. - Саратов, 1991, - 46с.

66. Проценко O.A., Филиппов A.A., Кутырев В.В. Гетерогенность популяций штаммов возбудителя чумы по плазмидному составу //Мол.генет.микробиол.вирусол.- 1992,- N3-4,- С.20-24.

67. ПроценкоО.А., Анисимов П.И., Можаров О Т. Выявление и характеристика плазмид чумного микроба, детерминирующих синтез пестицина 1, антигена фракция 1 и экзотоксина "мышиного " токсина. // Генетика,-1983.-№7.-С. 1081-1090.

68. Pseudomonas mallei и Pseudomonas pseudomallei: введение и поддержание природных и рекомбинантных плазмидных ренликонов / Абаев И.В., Асташкин Е.И. Пачкунов Д.М. и др. // Молекул.генет. микробиол., вирусол. - 1995. -N 1. - С.28-36.

69. Разработка ДНК-зондов для диагностики патогенных псевдомонад и бацилл: Отчет о НИР (заключит.) / Волгогр.науч.-исслед. противочум. ин-т; Руководитель Замараев B.C. - Волгоград, 1994. - N ГР01.9.10013828. - 79 с.

70. Ряпис Л.А., Тарасова Т.Д. Перспективы применения хромосомной трансформации для идентификации возбудителя мелиоидоза // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. - 1988. - N8. - С. 16-19.

71. Ряпис Л.А., Ширяев Д.Т. Ауксотрофные мутанты возбудителя мелиоидоза// Пробл. особо опасн. инф. - Саратов, 1971. - N4. - С.215-219.

72. Рубан Е.Л. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas.-М.: Наука, 1986. - 199 с.

73. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. - Киев.: Наукова думка, 1990. - 262с.

74. Сравнительный анализ структуры плазмид N, Р и W групп несовместимости./ Добрица А.П., Дергунова Л.В., Михайлова Т.Г., Зимин A.A.// Молекул, генет., микробиол., вирусол. - 1987. -№12. - С.3-10ю

75. Совершенствование методов диагностики псевдомонад и бацилл.//Отчет о НИР ( заключит. ) ВолгНИПЧИ; Руководитель Замараев

B.C. - Волгоград, 1990. - ГР. 0188.0 006085. - 45 с.

76. Степанов A.C. О молекулярной природе токсина Bacillus anthracis.// Молекул, генет., микробиол., вирусол. - 1991,- N1,- С.3-10.

77. Структурная и функциональная организация плазмид возбудителя мелиоидоза. //Отчет о НИР ( заключит. ) ВолгНИПЧИ; Руководитель Замараев B.C. - Волгоград, 1998. - ГР. 01.9.50 001337,- 90 с.

78. Сухов В.В., Ларионов Г.М. О природе антагонистической активности микроба мелиоидоза // Генетика и биохимия вирулентности возб. особо опасных инф.: Матер. Российской научн. конф. - Волгорад, 1992. -

C.208.

79. Тарасова Т.Д., Антонов Ю.В. Картирование пуринзависимых мутаций у возбудителя мелиоидоза // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. -1984.-N6.-С.8-12.

80. Тарасова Т.Д., Замараев B.C., Антонов Ю.В. Использование трансформации для идентификации возбудителя при поиске мелиоидозной инфекции // Профилакт. природноочаговой инфекции. Тез. докл. Всесоюз. научн.-практич. конф. - Ставрополь,1983. - С.352-353.

81. Тарасова Т.Д., Ряпис Л.А. Оптимальные условия трансформации у возбудителя мелиоидоза и возможность её применения для картирования хромосомы // Молекул, генет«, микробиол., вирусол. - 1983. - N3. - С.26 -29.

82. Трансдукционная и конъюгационная передача плазмиды рХ02 Bacillus anthracis / Степанов А.С., Пузанова О.Б., Гаврилов С.В. и др. // Молекул, генетика. - 1989,-N12,- С.39-43.

83. Трансформация патогенных псевдомонад плазмидной ДНК / Абаев И.В., Акимова Л.А., Шитов В.Т. и др. // Молекул.генет. микробиол., ви-русол. - 1992. - N 3-4. -С. 17- 20.

84. Фарбер С.М., Курилов В.Я. Электронном и кроскопическое изучение поверхностных антигенов возбудителей сапа и мелиоидоза //В кн. Проблемы клинической и экспериментальной медицины. - Волгоград. -1979. - С.52

85. Шиповская Н.П., Меринова Л.К., Ряпис JI.A. Свойства ауксотрофных мутантов Pseudomonas mallei // Журн. микробиол. эпидемиол. иммуно-биол.- 1983.-N4.-С.36-39.

86. Шиповская Н.П., Ряпис Л.А. Полиауксотрофные мутанты возбудителя сапа // Селекция и генетика возбудителей особо опасных инф. - Саратов,1982. - С.52-54.

87. Ярулин Р.Г. Молекулярная организация и иммунохимические свойства липополисахарида возбудителя мелиоидоза //Дисс. канд. - Волгоград. -1990,- 129с.

88. Aalen R.B., Lossius I., Gundersell W.B. Subcellular localisation of protein encoded by the phenotypically cryptic plasmid of Neisseria gonorrhoeae: Biological evidence for outer membrane association of the cppB gene product.// Mol.Microbiol.-l 989.-Vol.3.- P. 1433-1439.

89. A surface protease and the invasive character of Plaque./ Sodiende O.A., Subrahmanyam Y.V.B.K., Stark K.,Goguen J.D.// Science.-1992.-Vol.258.-P.1001-1007.

90. Ashdown L.R. Identification of Pseudomonas pseudomallei in clinical laboratory // J. Clin. Pathol. - 1979. - Vol. 32. - P.500 - 504.

91. Ashdown L.R., Koehler J.M. Production of hemolysin and other extracellular enzymes by clinical isolates of Pseudomonas pseudomallei // J.Clin.Microbiol.- 1990.-Vol.28,N10,- P.2331-2334.

92. Ashdown L.R., Frettingham R. In vitro activity of various cephalosporins against Pseudomonas pseudomallei // J.Infect. Diseases. - 1984. - Vol.150. -P.779-780

93. Association of adhesive, invasive, and virulent phenotypes of Salmonella ty-phimurium with autonomous 60-rnegadalton plasmids./ Jones G.W., Rabert

D.K., Svinarich D.M., Whitfield H.J.//Infect. Immun.- 1982,-Vol. 38:2.-P. 476-486.

94. Association of the encapsulation of Bacillus anthracis with a 60 megadalton plasmid/ Uchida I, Sekizaki T., Hashimoto K., Terakado N.//J.Gen.Microbiol.-1985.- Vol.131.-P.363-367.

95. Bartkus I.A., Leppla S.H. Transcription regulation of the protective antigen gene of Bacillus anthracis //Infect. Immun.-1989.-Vol.57, N8.-P.2295-2300.

96. Beall F.A., Taylor M.J., Thorne C.B. Rapid lethal effect in rats of third component found upon fractionating the toxin Bacillus anthracis//J.Bact.-1962,- Vol.83.-P. 1274-1280.

97. Beckman W., Gaffney T., Lessie T.G. Correlation between auxotrophy and plasmid alteration in mutant strains of Pseudomonas cepacia.// J Bacteriol.-1982,- Vol. 149:3.-P. 1154-1158.

98. Beppi M., Arima K. Decreased permeability as the mechanism of arsenite resistance in Pseudomonas pseudomallei // J.Bacte riol.- 1964,-Vol.88,Nl.- P. 151-154.

99. Bergan T. Human and animal pathogenic members of the genus Pseudomonas // Procariots. - Berlin, 1981. - N1. - P.666 - 700.

100. Birnboim H.C.,Doly J. A rapid alkaline extraction method for screening recombinant plasmid //Nucleic Acids Res. -1979. - Vol.7. - P.15I3

101. Bolin I., PortnoyD., Wolf-Watz H. Expression of the temperatur- inducible Z' outer membran protein of yersiniae.// Infect. Immun.- 1985,- Vol.48.- P.234-

240.

102. Bradley D., Taylos D.E., Cohen D.R. Specification of surface mating systems among conjugative drug resistance plasmids // J.Bacteriol. - 1980. -Vol.143. -P.1466- 11469.

103. Bragg T., Robertson D. Nucleotide sequence and analysis of the lethal factor gene (lei) from Baccilus anthracis // Gene. - Vol.81. - P. 45-54.

104. Brett P.J., Mah D.C., Woods D.E. Isolation and characterisation of Pseudomonas pseudomallei flagellin proteins// Infect. Immun. -1994,- Vol.62.-P.1914-1919.

105. Brubaker R.R. The genus Yersinia: biochemistry and genetics of virulence // Curr.Top.Microbiol.Immunol.- 1972.-Vol.57,- P. 111-158.

106. Cabello F.C. Determinants of pathogenicity of E.coli Kl.-In K.N.Timmis and Puhler (ed), Plasmid of medical, nvironmental and commercial

importance ..//Elsevier/North Holland Publishing Co.-Amsterdam, 1919-P.155-160.

107. Chacrabarty A.M. Plasmids in Pseudomonas // Ann.Rev.Genet. - 1976. -Vol.10.-P.7-30.

108. Characterization of Pseudomonas pseudomallei antigens by SDS-polyacrylamid gel electrophoresis and western blot/ Wongratanacheewin S., Tattawasart U., Lulitanond V., Wongwajana S., Sermswan R.W., Sook-pranee M., Nuntirooj K.// Southeast. Asian J. Trop. Med.- 1993.-Vol.24:1,-P.107-113.

109. Cloning and C02-dependent expression of the genetic region for encapsulation from Bacillus anthracis / Makino S., Sasakawa C., Uchida I. et al. // Mol. Microbiol.-1988,- Vol.2.- P.371-376

110. Cloning and end exression of the calmodium-sensetive Bacillus anthracis adenylate cyclase in Escherichia coli/ Mock M., Labruyere E., Glaser Ph. et al. //Gene.- 1989,- Vol.64.- P.277-284.

111. Comparison of plasmid profile analisis, phage typing, and antimicrobial susceptibility testing in characterizing Salmonella thyphimurium isolates from outbreaks /Holmberg S.D., Washmuth I.K., Hickman-Brenner F.M., Cohen M.L. //J. Clin. Microbiol.- 1984,- Vol. 19.-P. 100-104

112. Demonstration of acid phosphatase activity in antigenic glycoprotein fractions obtained from the culture filtrate of Pseudomonas pseudomallei/ Kondo E., Petkanchanapong V., Naigowit P., Kurata T., Kanai K. // Jpn. J. Med. Sei. Biol.-1991.- Vol.44:5-6.-P.213-224.

113. Dodin A. La melioidose: un probleme mondial. (Melioidosis an asian disease now a Worldproblem) //Recherche.- 1976,- V.7.-N 68,- P.574-577.

114. Dodin A., Fournier J. Antigenes precipitants et antigenes agglutinants de Pseudomonas pseudomallei. I. Complexe thermostable et complexe thermolabile Typage serologique // Ann. Inst. Pasteur. - 1970. - Vol. 119. -P.211 -221.

115. Eickhoff T.C., Bennett J. V.,Hay es P.S. Pseudomonas pseudomallei: susceptibility to cheinatherapeutic agents // J.Infect.Diseases. - 1970. -VoL121.-P.95- 102.

116. Electron microscopy study of the mode of growth of Pseudomonas pseudomallei in vitro and in vivo/ Vorachit M., Lam K., Jayanetra P., Costerton J.W.//J. Trop. Med. Hyg.-1995.- Vol. 98:6.-P.379-391.

117. Engelkirk P.G., Schoenhard D.E. Physical evidence of plasmid in Neisseria gonorrhoeae // J.Infect.Dis.- 1972,- Vol.127.-P. 197-200

118. Evidence for Plasmid-Mediated Toxin Production in Bacillus anthracis/Mikesell P., Ivins B.E., Ristroph J.D.,Dreier T.M.//Infect.Immun.-

1983,-Vol.39.-P.371-376.

119. Evidence of coordinate regulation of virulence in Salmonella typhimurium involving the rsk element of the 95-kilobase plasmid./Vandenbosch J.L., Kurlandsky D.R., Urdangaray R., Jones G.W./7 infect. Immun.-1989,-Vol.57:8.-P. 2566-2568.

120. Ferber D.M., Brubacer R R. Plasmids in Yersinia pestis // Inf. Immun.-1981.-Vol.31,N2,- P.839-841.

121. Ferreiras C.M., Criado M.T. Expression of surface hydrophobicity encoded by R-plasmids in Escherichia coli laboratory strains.// Arch Microbiol.-

1984.-Vol. 138:3.-P.191-194 .

122. Filutowicz M., Me Eachern M.J., Mukhopadhyay P. DNA and protein interactions in the regulation of plasmid replication //J.Cell Sei. Suppl. -1987. -Vol.7. -P.15- 31.

123. Finlay B.B., Falkovv S. Common themes in microbial pathogenicity.// Microbiol. Rev.-1989.-Vol. 53:2.-P.210-230.

124. Galán .I.E., Curtiss R. Distribution of the invA, -B, -C, and -D genes of Salmonella typhimurium among other Salmonella serovars: invA mutants of Salmonella typhi are deficient for entry into mammalian cells. //Infect. Immun.- 1991.-Vol. 59:9.-P. 2901-2908.

125. Gilardi G.L. Characterization of Pseudomonas species isolated from clinical specimens // Appl. Microbiol. -1971. - Vol.21. - P.414 - 419.

126. Goguen J., Yother J., Straley S. Genetic analysis of the low calcium response in Yersinia pestis MUD1 (Ap lac) insertion mutants // J.Bacteriol. - 1984. -Vol.160.-P. 842-848.

127. Guan K., Dixon J.E. Protein tyrosine phosphatse activity of an essential virulence determinant in Yersinia.//Science.- 1990.-№249.- P.553-556.

128. Guiney D.G. Host range of conjugation and replication functions of the E.coli sex F lac, comparison with the broad host range plasmid RK2 //J.Mol.Biol. - 1982. - Vol.162. - P.699 - 703.

129. Guiney D.G., Yakobson E. Location and nucleotide sequence of the transfer origin of the broad host range plasmid RK2 // Proc.Natl.Acad. Sei.USA. -1983. Vol.80. - P.3595 - 3598.

130. Haas D., Holloway B.W. Chromosome mobilization by the R-plasmid R 68.45: a tool in Pseudomonas genetics // Mol.Gen.Genet. - 1978. - Vol.158. -P.229 - 237.

131. Heat-stable and heat-labile components of nonspecific acid phosphatase de-tectid in Pseudomonas pseudomallei/ Kondo E., Dejsirilert S., Wejprasit N., Chiewsilp D., Kauai KM Jpn. J. Med. Sci. Biol.-1991.- Vol.44:2.- P.51-62/

132. Heckly R.J. Toxins of Pseudomonas pseudomallei 11 Microbiol. Toxins. -New York- London. - 1970. - Vol.3. - P.474 - 505.

133. Holloway B., Crowther C., Royle P. Nayudu M. R plasmids and bacterial chromosome transfer // Antibiotic Resistance Transposon and other mechanisms. - 1980. - P.19 - 27.

134. Holloway B., Krishnapillai V., Stanisich V. Pseudomonas genetics // Ann. Rev. Genet. -1971. - Vol.5. - P.425 - 446.

135. Holloway B., Puhler A. R 68.45, a plasmid with chromosome mobilizing ability (Cma) carries a tandem duplication // Genet. Res. - 1980. - Vol.36. -P. 99-109.

136. Homology between cryptic plasmid from Neisseria gonorrhoeae and genomic DNA from Neisseria meningitidis / Grimholt U.,01saker I., Aalen R„ Gundersen W.B. // APM1S.- 1993.-Vol.101.-P.201-206.

137. Hu Y. The effect of plasmids on the resistance of E. coli to phages. //Wei Sheng Wu Hsueh Pao.- 1992.-Vol.32:6.-P.456-458.

138. Immunoblot analysis to demonstrate antigenic variability of clinical isolated Pseudomonas pseudomallei/ Lertmemongkolchai G., Manmontri W., Leela-yuwat C., Romphruk A., Waropastrakul s.// Asian Pac. J. Allergy Immunol.-1991,- Vol. 9:1,- P.5-8.

139. Influence of R-plasmid RP1 of Pseudomonas aeruginosa on cell wall composition, drug resistance, and sensitivity to cold shock./ Kenward M.A., Brown M.R., Hesslewood S R., Dillon C.// Antimicrob Agents Chemother.- 1978,-Vol. 13:3.-P. 446-453.

140. Intragenetic variation by site-specific recombination in the criptyc plasmidof Neisseria gonorrhoeae./ Hagblom P., Korch C., Jonsson A.B.// J.Bacteriol.-1986.-Vol. 167,- P.231-237.

141. Isolation and characterization of the outer-membrane proteins of Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei /N. Gotoh, N. White, W. Chawaqul, D. Woods //J. Microbiol.- 1994,- Apr.(140).- P.797-805.

142. Jacobi G.A. Antimicrobial drug resistance././ Ed. L.E.Bryan.- New-York 1984.-P.497-514.

143. Kado C.I., Liu S.I. Rapid procedure for detection of large and small plasmids //J.Bacteriol. -1981. - Vol.145. - P. 1365 - 1369.

144. Kaspar R.L., Robertson D.L. Purification and physical analisis of Bacillus anthracis plasmid pXOl and pX02// Biochem. and Biophys.Res.Comm.-1987.-Vol.149, N2,-P.362-368.

145. Klemperer R.M., Ismail N.T., Brown M.R. Effect of R plasmid RPI on the nutritional requirements of Escherichia coli in batch culture.// J.Gen. Microbiol.- 1979,-Vol. 115:2.-P. 325-331.

146. Kondo E., Wangroongsaub P., Naigowit P. Effects of tunicamycin on the pH-activity pattern of acid phosphatase in Pseudomonas pseudomallei// Southeast. Asian J. Trop. Med.- 1994.-Vol.25:L- P.144-151.

147. Legroux R., Djemil K. Sur la lyse du bacille de la onve et du bacillus pyocianique // Compt.Rend.Acad.Sci. - 1931. - N.193. -P.l 117-1119.

148. Leppla S.H. Anthrax toxin edema factor: a bacterial adenylate cyclase that increases cyclic AMP concentrations in eucaryotic cells//Proc.Nat.Acad.Sei. USA.-1982.- Vol.79.- P.3162-3166.

149. Leung K.Y., Reisner B.S.,Starley S.C.YopM inhibits plateledaggregation and is necessary for virulence of Yersinia pestis in mice.// Infect. Immun.-1990,- Vol.58.-P. 1634-1639.

150. Levine H.B., Maurer R.L. Immunization with an induced a virulent auxotrophic mutant of Pseudomonas pseudomallei // J. Immunol. - 1958. -Vol.81. -P.433 -438.

151. Linder P., Charchward G., Guinian X. et al. An essential replication gene rep A, of plasmid pSC 101 is autoregulated // J. Mol. Biol. - 1985. - Vol. 181. -

P.383 -393.

152. Liu P. Differentiation of pathogenic pseudomonads by heat resistance of alcaline phosphatase // Amer. J. Clin. Pathol. - 1966. - N45. - P.639 - 642.

153. Livermore D., Chan P., Wong A., Leng Y. b-lactamase of Pseudomonas pseudomallei and its contribution to antibiotic resistance // J. Antimicrob.

Chemother. - 1987. - Vol.20. - P.313-320.

154. Makino S., Uchida L, Terakado N. Molecular Characterisation and protein analisis of the cap region,wich is essential for encapsulation in Bacillus anthracis//J.Bacteriol.- 1989,- Vol.171, N2,- P.722-730.

155. Marmur J. A procedure for isolation of deoxyribonucleicacid from microorcanisms//J.Mol.Biol. -1961. - Vol.3.- P.208-218.

156. McEniry D.W., Gillespie S.H., Felmingham D. Susceptibility of Pseudomonas pseudomallei to new B-lactam and aminoglycoside antibiotics // J. Antimicrob. Chemother. - 1988. - Vol.21. - P.171 - 175.

157. Mekalanos J . Genetic construction of cholera vaccine prototypes / Vaccines 85 / Mol.and Chem. Basis Resist. Parasitic., Baci., and Virol. Dis.. - Cold Spring Harbor.: New York, 1985. - P. 101-105.

158. Meyer R., Helinski D. Undirectional replication of the P group plasmid RK2 // Biochiin. Biophys. Acta. - 1977. - Vol.478. - P.109 -113.

159. Molecular cloning of invasion plasmid antigen (ipa) genes from Shigella flexneri: analysis of ipa gene products and genetic mapping./ Buysse J.M., Stover C.K., Oaks E.V., Venkatesan M., Kopecko D.J.// J Bacteriol.- 1987,-Vol. 169:6.-P.2561-2569.

160. Palleroni N.J. Bergey's Mannual of systematic bacteriology.- Baltimore, 1984.-Vol.l.-P. 140-199.

161. Paredes L., Avila R. Infectiones por Pseudomonas pseudomallei. Estudio bacteriológico y significado clínico //Rev. Med. Chile.- 1976,- V. 104,- N 8,-P.531-537.

162. Penaloza-Vazquez A., Mena G., Herrera-Estrella L., Bailey A. Cloning and sequencing of the genes involved in glyphosate utilization by Pseudomonas pseudomallei // Appl.Environ. Microbiol. - 1995. - Vol.61. - P. 538-543.

163. Pfeifer F., Weidinger G., Goebel W. Genetic variability in Halobacterium halobium,// J. Bacteriol.-1981 .-Vol 145:1 .-P. 375-381.

164. Pinkey M., Thomas C. Replication and maintenance of promiscuous Plasmids of gram-negative bacteria // Microbiol. Sei. - 1987. - Vol 4. - P. 186 -191.

165. Portnoy D., Blanh H., Kinsbury D., Falkow S. Genetic analisis of essential plasmid determinants of pathogenicity in Yersinia pestis // J.Infect. Diseases. - 1983. - Vol.148. - P.297-304.

166. Portnoy D., Falkow S. Virulence- associated plasmids from Yersinia entero-colitica and Yersinia pestis.// J.Bacteriol.-1981.- Vol. 148.-P.877-883.

167. Prise S.B., Starley S.C. Lcr-H, a gene necessery for virulence of Yersinia pestis and for the normal response of Y.pestis to ATF and calcium.// Infect. Immun.-1989.-Vol.57.-P. 1491-1498.

168. Protsenko O.A., Fillippov A.A., Kutyrev V.V. Integration of the plasmid encoding the sinthesis of capsuler antigen and murine toxin in Yersinia pestis chromosom.// Microbiol Patogénesis.-1991.- №11,- P.123-128.

169. Redfearn M.S. Toxic lysolipoid: isolation from Pseudomonas pseudomallei // Science. - 1964. - Vol.146. - P.648 - 649.

170. Redfearn M.S., Palleroni N., Stanier R.J. A comparative study of Pseudomonas pseudomallei and Bacillus mallei // J. Gen. Microbiol. - 1966. -Vol.43. -P.293 -313.

171. Robertson D.L., Leppla S.H. Molecular cloning and expression in Escherichia coli of the lethal factor gene of Bacillus anthracis //Gene.-1986.-Vol.44.-P.71-78.

172. Rosqvist R., Forsberg A., Rimpilainen M The cytotoxic protein YopE of Yersinia obstructs the primary host defence.// Mol.Microbiol.-1990.- №4,-P.657-667.

173. Sandstrom G., Lofgren S., Tarnvik A. A capsule-deficient mutant of Francisella tularensis LVS exhibits enheneed sensetivity to killing by serum but diminished sensitivity to killing by polymorphonuclear leukocytes //Infect. Iinmun.- 1988,- Vol.56.- P. 1194-1202.

174. Sansonetti P.J., Kopecko D.J., Formal S.B. Involvement of a plasmid in the invasive ability of Shigella flexneri.// infect. Immun.- 1982.-Vol. 35:3.-P. 852-860.

175. Scott J.R. Regulation of plasmid replication // Microbiol. Rev. - 1984. -Vol.48. - P. 1 -23.

176. Separation of antigenic glycoprotein fractions from cell-free homogenate of Pseudomonas pseudomallei and characterization as tvrosin phosphatase/ Kondo E., Wangroongsaub P., Naigowit P. Kanai K.// Southeast. Asian J. Trop. Med.- 1994.-Vol.25:3,- P.436-442.

177. Sequens and analisis of the DNA encoding protective antigen of Bacillus anthracis / Welkos S.L., Lowe J R., Eden-McCutchan F. et al. // Gene.-1988,-Vol.69.-P.287-300.

178. Skurnik M. Studies on the virulence plasmids of Yersinia species // Acta Univ.Ouluen.- 1985.- A.- N169,- P.l-61

179. Smith H., Keppie J., Stanley J.L. The chemical basis of the virulence of Bacillus anthracis. V. The specific toxin produced by B.anthracis in vivo//Brit.J.exp.Path.-1955.- Vol.36.-P.460-472.

180. Smith P.B., Cherry W.B. Identification of Malleomyces by specific bacteriofages // J.Bacteriol. - 1957. - Vol.74,N5. - P.668-672.

181. Sodiende O.A., Sample A.K., Brubaker R R. et al. Plasminogen activator coagulase gene of Yersinia pestis is responsible for degradation of plasmid-encoded outer membran protein.// Infect.Immun.. - 1988. - Vol.56. - P.2749-2752

182. Sodiende O.A.,Goguen J.D. Genetic analysis of the 9,5-kilobase virulence plasmid of Yersinia pestis. // Infect.Immun.. - 1988. - Vol.56. - P.2743-2748.

183. Stalker D M., Thomas C., Helinski D. Nucleotide sequence of the region of the origin of replication of the broad host range plasmid RK2 // Mol.Gen. Genet. - 1981. - Vol. 181. - P.8 - 12.

184. StarleyS.C., Brubaker R.R. Cytoplasinatic and membrane proteins of yersinia cultivated under conditions simulating mammalian intracellular envi-ronment.//Proc. Natl. Acad. USA.-1981.- Vol.78.- P.1224-1228.

185. Stenlay J.L., Smith H. The three factors of anthrax toxin: their immunogenicity and lack of demonstrable enzimic activity // Brit. J. Exp. Path.- 1963,- Vol.31.-P.329-337.

186. Structural characterization of the lipopolysacharide O antigens of Burkholderia pseudomallei / Perry M.B., Mac Lean L., Schollardt T. et al. // Infect.Immun.. - 1995. - Vol.63. - P.3348-3352.

187. Tanphachitra D. Introduction of Pseudomonas pseudomallei (melioidosis) antigen into the gale Salmonella typhi TY 21 vaccine strains as carrries of melioidosis antigens to the immune system // J.Cell.Biochem. - 1989. - N13. - P.246 - 251.

188. Thomas C.M. Genetic evidence for the direction of transcription of the trf A gene of of broad host range plasmid RK2 // J.Gen.Microbiol. - 1984. -Vol.130 - P. 1641 - 1650,

189. Thomas C.M., Meyer R., Helinski D. Regions of broad host range plasmid RK2 essential for replication and maintenance // J. Bacteriol. - 1980. -Vol.141. -P.213 -222.

190. Thomm M., Altenbuchner J., Stetter K.O. Evidence for a plasmid in a methanogenic bacterium.// J. Bacteriol - 1983.-Vol. 153:2.-P. 1060-1062.

191. Thome C.B. Biochemical properties of virulent and avirulent strains of Bacillus anthracis.- Ann. N.Y. Acad. Sci.- 1960.-Vol.88.-P. 1024-1033.

192. Tippetts T.M., Robertson D.L. Molecular cloning and expression of the Bacillus anthracis edema factor toxin gene:a calmodium-depedent adenylate cyclase // J.Bact.-1988.- Vol.170, N5,- P.2263-2266.

193. Traub W.H. Incomplete cross-resistance of nalidixic and pipemidic acid-resistant variants of Serratia marcescens against ciprofloxacin, enoxacin, and norfloxacin.// Chemotherapy.- 1985.-Vol. 31:1.-P. 34-39 .

194. Unusual lipopolysaccharide antigens of a Salmonella typhi oral vaccine strain expressing the Shigella sonnei form I antigen./ Seid R.CJr., Kopecko D.J.,

Sadoff J.C., Schneider H., Baron L.S., Formal SB J/ J. Biol. Chem.- 1984.-№ 25.-Vol. 259:14.-P.9028-9034.

195. Vodkin M., Leppla S.H. Cloning of the protective antigen gene of Bacillus anthracis // Cell.- 1983,- Vol.34.- P.693-697.

196. Willetts N., Wilkins B. Processing of plasmid DNA during bacterial conjugation// Microbiol.Rev. - 1984. - Vol.48. - P.24 - 41.

197. Yabuuchi E; Kosako Y; Oyaizu H. Proposal of Burkholderia gen. nov. and transfer of seven species of the genus Pseudomonas homology group II to the new genus, with the type species Burkholderia cepacia (Palleroni and Holmes 1981).//Microbiol Immunol.- 1992,-Vol. 36:12.-P. 1251-1275.

198. Yamamoto T., Naigowit P., Dejsirilert S. In vitro susceptibilities of Pseudomonas pseudomallei to 27 antimicrobial agents // Antimicrob. Agents Chemother. - 1990. - Vol.32. - P.2027 - 27029.