Конструирование штамма Esherichia coli, экспрессирующего ген zonula occludens toxin Vibrio cholerae тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Писанов, Руслан Вячеславович

• Писанов, Руслан Вячеславович
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Писанов, Руслан Вячеславович

Список сокращений используемых в работе.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. СТХ-ЭЛЕМЕНТ И ДРУГИЕ ФАКТОРЫ

ВИРУЛЕНТНОСТИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ.

1.1. Структурная организация СТХ-элемента.

1.2. Особенности размножения, горизонтальной передачи и интеграции СТХф в хромосому хозяина.

1.3. Неполный СТХ-элемент (pre- СТХф).

1.4 Характеристика Zonula occludens toxin.

1.4.1. Физико-химические свойства Zot и его биологическая активность.

1.4.2. Зонулин.

1.4.3. Рецептор и механизм действия Zot/зонулина.

4 1.5. Accessory cholera enterotoxin.

1.6. Другие дополнительные токсины холерных вибрионов.

1.6.1. Цитотоксический комплекс RTX.

1.6.2. Новый холерный токсин (NCT).

1.6.3. Токсин NMDCY.

1.6.4. Токсин W07.

1.6.5. Токсин Cef(S-CEP).

1.6.6. Термостабильный токсин.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы и плазмиды.

2.2. Материалы и реактивы.

2.3. Культивирование микроорганизмов.

-32.4. Изучение биохимических свойств.

2.5. Молекулярно-генетические методы.

2.5.1.Выделение ДНК.

2.5.2. Электорофоретические методы исследования ДНК.

2.5.3. Молекулярное зондирование.

2.5.4. Полимеразная цепная реакция.

2.5.5. Клонирование генов.

2.6. Методы выделения и характеристики белков.

2.6.1. Выделение и очистка рекомбинантного белка.

2.6.2. Электрофоретическое исследование белка.

2.7. Методы изучения биологического действия и активности токсинов.

2.7.1. Исследования in vivo.

2.7.2. Исследования in vitro.

2.8. Постановка реакции преципитации.

2.9. Методы компьютерного анализа.

ГЛАВА 3. КОМПЬЮТЕРНЫЙ АНАЛИЗ ZONULA OCCLUDENS

TOXIN И ACCESSORY CHOLERAE ENTEROTOXIN.

3.1. Компьютерный анализ гена zot и кодируемого им белка.

3.2. Компьютерный анализ гена асе и кодируемого им белка.

ГЛАВА 4. КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА zot

Vibrio cholerae В Escherichia coli.

4.1. Клонирование гена zot.

4.2. Субклонирование фрагмента ДНК холерного вибриона, содержащего гены zot и асе.

4.3. Анализ рекомбинантных клонов.

-44.4. Изучение биологического действия рекомбинантного белка на культуру СаСо2.

• 4.5. Характеристика рекомбинантного белка Zot.

4.5.1. Выделение препарата Zot.

4.5.2. Изучение биологического действия препарата

Zot in vitro.

ГЛАВА 5. ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ И ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ, СОДЕРЖАЩИХ ПРОКСИМАЛЬНУЮ ЧАСТЬ СТХ-ЭЛЕМЕНТА.

5.1. Биохимические свойства.

5.2. Изучение вирулентности на лабораторных моделях.

5.2.1. Изучение вирулентности in vivo.

5.2.2. Изучение вирулентности in vitro.

5.3. Выявление способности к синтезу NCT.

5.4. Генотипическая характеристика.

5.4.1. Изучение геномного полиморфизма.

5.4.2. Выявление генетических детерминант дополнительных факторов вирулентности с помощью

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Конструирование штамма Esherichia coli, экспрессирующего ген zonula occludens toxin Vibrio cholerae»

Актуальность проблемы. В настоящее время общеизвестным является тот факт, что гены основного фактора вирулентности холерных вибрионов — холерного токсина (ctxAB) - локализованы в дистальной части т.н. кассеты вирулентности (Trucksis М. et al., 1993), или коровой области умеренного фи-ламентозного фага CTXcp (Waldor М.К., Mekalanos J.J., 1996). Проксимальная часть коровой области представлена генами sph (ген одного из белков капси-да), сер (core encoded pilin), orfU (open reading frame of unknown function), ace (accessory cholera enterotoxin) и zot (zonula occludens toxin). Продукты всех этих генов имеют отношение к фаговому морфогенезу. Кроме того, результаты экспериментальных исследований позволяют думать что, по меньшей мере, два из данных факторов — Zot и Асе — являются, скорее всего, белками с двойной функцией, обладая биологической активностью по отношению к клеткам кишечного эпителия. Механизм действия Zot состоит в усилении проницаемости тканей вследствие разрушения межклеточных плотных контактов, обеспечивающего более свободный доступ других токсинов, в т.ч. хо-лерогена, к клеточной мембране (Baudry В., et al., 1992; Fasano A., et al., 1991, 1995; Fasano A., Uzzau S., 1997; Uzzau S., et al., 1999; Wang W., et al., 2000; Di Pierro M.D., et al., 2001). Предполагаемый механизм действия Асе заключается в формировании ион-проницаемых пор в клеточной мембране, вследствие чего жидкость с ионами поступает в просвет кишечника, вызывая диарею (Trucksis М., et al., 1993, 1997, 2000; Sears C.L., Kaper J.D., 1996). Однако на настоящий момент структура и функции Zot и Асе изучены далеко не достаточно.

В первые годы после обнаружения фага СТХф считалось, что все гены его коровой области могли быть дуплицированы или делетированы только совместно (Waldor М.К., Mekalanos J.J., 1996; Sears C.L., Kaper J.D., 1996). Вместе с тем, в литературе появлялись и продолжают появляться сообщения о выделении отдельных штаммов холерных вибрионов 01 и неО! групп, содержащих неполный СТХ-элемент, в котором отсутствовали гены ctxAB, но присутствовали проксимальные по отношению к ним гены сер, orfU, асе и zot (Kumar S. et al., 1993; Karasawa Т., 1993; Chow K.H. et al., 1994; Boyd E.F. et al., 2000; Монахова E.B. с соавт., 2001; Челдышова Н.Б., 2002; Костромитина Е.А. с со-авт., 2002,2003).

В дальнейшем было установлено существование предшественника СТХср (pre-СТХф), содержащего все гены коровой области, кроме ctxAB (Boyd E.F. et al., 2000), который скорее исходно не содержал генов ctxAB, чем утратил их в результате делеции. Эти гены, по-видимому, были приобретены им позже вместе с активаторами их транскрипции. В пользу такой гипотезы свидетельствуют существенные отличия содержания ГЦ в генах ctxA и ctxB от такового всех остальных генов коровой области СТХср.

На сегодняшний день в литературе описано всего три штамма холерных вибрионов, относящихся к Ol, Oil и 037 серогруппам (два первые — клинические) и содержащих в своем геноме pre-CTXcp (Boyd E.F. et al., 2000), а в базе данных GenBank, кроме частичных последовательностей этих трех профа-гов, представлен неполный СТХ-элемент штамма 0139 серогруппы (AF416590). Данные о распространении таких штаммов, наборах продуцируемых ими токсинов и возможной этиологической опасности в литературе отсутствуют.

В нашем распоряжении имеется коллекция ctxAB"ace+zot+RS+ -штаммов холерных вибрионов, включающая 13 штаммов V.cholerae eltor (10 выделенных от больных ОКЗ и 3 - из внешней среды) и 7 штаммов V.cholerae non01/non0139, выделенных от людей. Все они были выделены на различных территориях России, Украины и Узбекистана и в большинстве своем проявляли признаки вирулентности на лабораторных моделях (Монахова Е.В. с соавт., 2001). Не исключено, что диарейный синдром различной степени тяжести, наблюдавшийся у людей, явившихся источником их выделения, мог быть частично или полностью обусловлен токсинами Асе и Zot, гены которых были обнаружены в геноме. Кроме того, они могли оказаться способными к продукции каких-либо других дополнительных токсинов, к числу которых относятся NCT (new cholera toxin) (Sanyal S. et al., 1983), токсины NMDCY (non-membrane-damaging cytotoxin) (Saha P.K. et al., 1996), W07 (novel cholera toxin) (Walia K., et al., 1999), токсический комплекс RTX (repeats-in-toxin) (Lin W., et al., 1999), фактор Cef (CHO-elongating factor) (McCardell B.A., et al., 2000; Sathyamoorthy V., et al., 2000) и термостабильный токсин Stn/Sto (ST) (Arita M., et al., 1986). На момент начала исследований данные штаммы были лишь частично охарактеризованы по генотипическим и фенотипическим признакам. Ничего не известно и об их реальной способности к продукции Zot, который, как было отмечено выше, может усиливать действие других токсинов, увеличивая поверхность контактирующих с ними клеток кишечного эпителия.

Детальное изучение штаммов, содержащих неполный СТХ-элемент, представляет интерес с точки зрения оценки их значимости как этиологических агентов острых диарейных заболеваний, установления источника и путей их распространения, в особенности в связи с их встречаемостью на территории России и пограничных государств.

Дальнейшие исследования в указанных направлениях требуют наличия препаратов Zot. Получение их из штаммов V.cholerae, содержащих полноценный СТХ-элемент, представляется малоэффективным и сопряжено с рядом трудностей. Поэтому одним из перспективных решений данной задачи является создание лабораторного штамма продуцента Zot на основе E.coli с помощью клонирования гена.

Препараты, выделенные из рекомбинантных клонов лабораторных штаммов кишечной палочки, могут быть использованы в целях дальнейшего изучения структуры и функций Zot, получения специфических сывороток и разработке тест-систем для скрининга, а также в качестве компонентов химических противохолерных вакцин и лекарственных препаратов, обычно не усваиваемых организмом при пероральном применении.

Рекомбинантные клоны лабораторных штаммов E.coli являются удобными продуцентами токсина, поскольку сами не продуцируют каких-либо собственных токсических субстанций, что обеспечивает возможность использования полученных из них неочищенных экстрактов для изучения биологической активности дополнительных токсинов СТХ-элемента.

В свою очередь изучение биологической активности Zot ограничивается отсутствием доступных моделей, отражающих его действие на эукариотиче-ские клетки. Не являясь собственно диареегенным фактором, он в отдельности не поддается выявлению в опытах in vivo. Данные, представленные в печати зарубежными авторами, получены в основном с использованием камер Юссинга. Поэтому одной из актуальных задач нам представляется подбор адекватной биологической модели для тестирования препаратов Zot in vitro.

Цель работы: конструирование рекомбинантных плазмид и создание штамма E.coli - продуцента zonula occludens toxin V.cholerae для изучения свойств и биологического действия этого токсина.

Задачи исследования:

1. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей генов zot и асе и аминокислотных последовательностей кодируемых ими белков.

2. Клонирование гена zot в составе рекомбинантных плазмид и создание штаммов E.coli - продуцентов zonula occludens toxin холерных вибрионов.

3. Изучение экспрессии клонированного гена zot и подбор адекватных моделей для оценки биологического действия Zot in vitro.

4. Генотипическая и фенотипическая характеристика ctx"ace+zot+ штаммов холерных вибрионов, выделенных на территориях бывшего СССР, изучение их геномного полиморфизма и вирулентности in vivo и in vitro. Научная новизна и теоретическая значимость. Впервые проведен детальный компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей генов zot и асе и аминокислотных последовательностей кодируемых ими белков, в т.ч. входящих в состав представленных на сайтах GenBank неполных профагов СТХф (pre-СТХф). Результаты анализа создали теоретическую основу для выявления их наиболее вероятных функций как в морфогенезе СТХф, так в вирулентности холерных вибрионов, а также для определения их физикохимических свойств, диапазона биохимическиой и биологической активности. Получены новые данные о свойствах Zot и его возможной роли в развитии заболеваний, вызываемых холерогенными и нехолерогенными штаммами.

Впервые получена подробная генетическая характеристика группы штаммов холерных вибрионов, содержащих неполный СТХ-элемент. Методами молекулярной гибридизации и ПЦР определены наборы генетических детерминант дополнительных токсинов и других факторов вирулентности. С помощью блот-гибридизации впервые получена новая информация об изменчивости неполного СТХ-элемента. Показано, что исследуемые ctxAB" профаги действительно являются производными «предшественника» фага СТХф.

На основе результатов изучения вирулентности штаммов, содержащих рге-СТХф, in vivo и in vitro они охарактеризованы как этиологически опасные, способные вызывать не только спорадические случаи заболеваний, но и локальные вспышки.

Научно-практическая ценность работы. На основе штаммов кишечной палочки созданы продуценты рекомбинантных плазмид, экспрессирующих ген Zot под контролем собственного промотора и 1ас-промотора, а также ре-комбинантный штамм E.coli, одновременно экспрессирующий клонированные гены zot и асе. Штаммы депонированы в коллекции Российского противочумного института «Микроб» под номерами КМ 171, КМ 172 и КМ 173. Сконструированы новые праймеры и молекулярные зонды для проведения скрининга свежевыделенных культур на присутствие генов zot и асе. Полученные данные включены в методические рекомендации «Определение генов zot и асе у Vibrio cholerae с помощью полимеразной цепной реакции», одобренные Ученым советом Ростовского НИГТЧИ и утвержденные директором 16 апреля 2004 года (протокол № 5).

Показана возможность использования культур клеток СаСо2, McCoy и L-929 для выявления биологической активности препаратов Zot in vitro, а также летальное действие Асе на культуру СаСо2.

-11

Положения, выносимые на защиту

1. С помощью компьютерного анализа генов zot и асе и кодируемых ими продуктов получены новые данные о свойствах и функциях этих белков. Расширены представленияУ^озможных о механизмах их участия в фаговом морфогенезе и реализации биологического действия на клетки макроорганизма.

2. Клонирование ПЦР-амплификатов гена zot в E.coli позволило получить ре-комбинантные плазмиды с заданными свойствами. Содержащие их штаммы кишечной палочки экспрессирровали клонированный ген под контролем собственного промотора и 1ас-промотора. Штамм, содержащий zot и асе, одновременно экспрессировал оба клонированных гена.

3. Препарат Zot, выделенный из рекомбинантного штамма E.coli, несмотря на отсутствие процессинга в клетках неспицифического хозяина^ сохранял биологическую активность по отношению к клеткам СаСо2, McCoy и L-929, которые представляли адекватную модель для тестирования токсина.

4. Генотипическая и фенотипическая характеристика 20 штаммов холерных вибрионов, содержащих неполный СТХ-элемент, свидетельствует о том, что, несмотря на отсутствие генов холерного токсина, эти штаммы обладают вирулентностью за счет экспрессии других факторов. С помощью блот-гибридизации выявлено по меньшей мере 6 этиологически опасных клонов.

Апробация работы. Результаты исследования были доложены на научных конференциях молодых ученых Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института в 2001-2002 гг., на заседании проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» межведомственного научного совета по санитарно-эпидемической охране территории РФ в 2002 г., на VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера», Ростов-на-Дону, 2003. План диссертационной работы одобрен Ученым советом РНИПЧИ и утвержден директором 14.10.2003 (протокол №6). Исследования выполнены в рамках плановой научной темы «Изучение структурно-функциональных особенностей и биологического действия дополнительных токсинов (zot и асе) кассеты вирулентности холерных виб-* рионов», номер госрегистрации № 033-4-03.

Публикация результатов исследований. Материалы исследования отражены в 7 опубликованных работах.

Структура работы. Диссертация изложена на 151 странице и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3-х глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 46 работ отечественных и 133 зарубежных авторов. Работа содержит 8 таблиц и иллюстрирована 26 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Писанов, Руслан Вячеславович

выводы

1. Результаты компьютерного анализа zonula occludens toxin и accessory cholera enterotoxin V.cholerae показали, что Zot и Асе являются необходимыми составляющими фагового морфогенеза, так как подобные белки выявлены у других филаментозных фагов.

2. В структуре Zot обнаружены потенциальные ДНК-связывающий и АТФазный домены, что свидетельствует в пользу того, что Zot участвует в процессе фагосборки как фермент, осуществляющий связывание ДНК по типу ДНК-хеликаз и свободных нуклеотидтрифосфатов. Участие Асе в ви-рогении заключается в образовании акцепторных участков для фаговой ДНК и формировании фагового капсида.

3. Сконструированные нами клоны E.coli Jml03, содержащие рекомбинант-ные плазмиды pZotPRM и pZot 197, способны экспрессировать клонированный в их составе ген zot под контролем собственного промотора и 1ас-промотора. Клоны, содержащие плазмиду pUS192, экспрессируют одновременно гены zot и асе.

4. Рекомбинантный белок Zot сохраняет биологическую активность по отношению к культурам клеток, выражающуюся в разрушении плотных межклеточных контактов в монослое.

5. Разработана и использована схема выделения и предварительной очистки рекомбинантного белка Zot на основе его свойств, установленных с помощью компьютерного анализа, и специфической сорбции с лигандами.

6. Культуры тканей СаСо2, McCoy и L-929 чувствительны к специфическому действию Zot за счет наличия на поверхности клеток рецепторов Zot/зонулина, и могут быть использованы для тестирования препаратов токсина. Асе вызывает гибель части клеток культуры СаСо2.

7. Согласно данным изучения геномного полиморфизма, ctxAB"zot+ace+-штаммы холерных вибрионов, выделенные в России, Крыму и Узбекистане, действительно содержат одну-две копии т.н. предшественника СТХф (pre-СТХф), локализованные либо в виде тандема, либо в разных участках генома.

8. Среди изученных рге-СТХф+-штаммов выявлено 6 этиологически опасных клонов, каждый из которых связан с определенным временем и местом выделения, а по меньшей мере один из них — с локальной вспышкой диарей-ных заболеваний.

9. Вирулентность рге-СТХф+-штаммов для лабораторных животных и вызванные ими диарейные заболевания людей могли быть обусловлены способностью к синтезу в различных сочетаниях дополнительных токсинов Асе, RtxA, NCT, Cef и ST, действие которых усиливается присутствием Zot.

- 132

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основная цель настоящей работы состояла в клонировании гена zonula occludens toxin (zot) Vibrio cholerae в составе рекомбинантных плазмид и изучении его экспрессии в E.coli. Наш интерес к этому дополнительному токсину, ген которого входит в состав филаментозного фага СТХф, был обусловлен недостаточной изученностью его роли в фаговом морфогенезе, в патогенезе типичной холеры, а также в качестве фактора вирулентности штаммов, лишенных генов холерного токсина и содержащих т.н. предшественник СТХф (pre-СТХф) (Boyd E.F. et al., 2000), тем более, что такие штаммы были выделены на территории России и пограничных государств - бывших республик СССР (Монахова Е.В. с соавт., 2001).

Согласно имеющимся в литературе данным анализа нуклеотидной и аминокислотной последовательности, первичный продукт гена zot - белок с ММ 45 кДа, который подвергается протеолитическому процессингу, приводящему к образованию двух молекул. Первая из них (N-терминальная часть исходной формы) размером 33 кДа остается связанной с клеточной поверхностью и, по мнению некоторых авторов (Uzzau S. et al., 1999), является одной из субъединиц СТХф. С другой стороны, Zot гомологичен фаговым белкам, содержащим нуклеозидтрифосфат-связывающий мотив, таким как продукт гена I колифага М13 (белок внутренней мембраны, необходимый для сборки вирионов) и др. Этот мотив обладает АТФазной активностью и способствует сборке и выходу фага из .бактериальной клетки. Возможно, что Zot, как и продукт гена I, является трансмембранным белком, модифицирующим структуру мембраны клетки-мишени посредством АТФ-зависимого механизма. (Koonin E.V., 1992). Поэтому другие авторы предполагают, что Zot не является элементом капсида СТХф, а только участвует в образовании и освобождении из клетки фаговых частиц (Faruque et al., 1998). Вторая молекула, образующаяся в результате процессинга (С-терминальный фрагмент размером ~12 кДа), секретируется в просвет кишечника, адсорбируется на специфическом рецепторе сходного с

Zot эукариотического модулятора межклеточных контактов (tj) зонулина и обусловливает биологическое действие токсина, которое состоит в обратимом разрушении tj и повышении таким образом доступа других токсинов, в том числе холерогена, к клеточной поверхности.

Поскольку механизм участия Zot в сборке фага и его роль в патогенезе точно не установлены, на первом этапе работы мы провели более подробный анализ нуклеотидных (НК) и аминокислотных (АК) последовательностей гена zot и кодируемого им протеина различных штаммов V.cholerae О I/O 139 и V.mimicus с помощью компьютерной программы Vector NTI Suite 9 (www.informax.com).

По данным анализа, 33 кДа форма представляет собой преимущественно гидрофильный основной белок из 287 АК остатков с ММ 32 кДа и pi 9,0, возможная вторичная структура которого представлена четырьмя а-спиралями. С-конец образован гидрофобными АК, формирующими потенциальный трансмембранный домен. 12 кДа форма Zot состоит из 112 АК-остатков и » представляет собой слабокислый белок с ММ 12,9 кДа и pi 6,32. Его вторичная структура представлена двумя потенциальными а-спиралями, одна из которых располагается на N-конце и образует трансмембранный домен с АК мотивом, связывающимся с рецептором клеток кишечного эпителия.

В молекуле Zot были выявлены возможные сайты фосфор ил ирования и N-миристилирования, т.е. Zot с определенной долей вероятности может участвовать в процессах обратимого фосфорилирования и образовывать липоглико-протеиновые комплексы, в пользу чего свидетельствует и его локализация на клеточной стенке (Uzzau S. et al., 1999).

Ранее ген zot был описан как одна открытая рамка считывания (orf) размером 1197 п.н. (Baudry В. et al., 1992; Trucksis М. et al., 1993). Нами внутри этого гена обнаружены четыре дополнительные orf и возможные сайты связывания рибосомы для их трансляции. Потенциальные продукты трансляции этих * orf имеют до 60% сходства с белками капсидов и нуклеинового обмена ряда вирусов и фагов. Эти данные позволяют предположить, что роль гена zot не ограничивается синтезом одного белка и он, вероятно, представляет собой своего рода "кластер" из 4-х генов, ответственных за вирогению СТХф.

Установлено структурно-функциональное сходство Zot с белками филаментозных фагов VSK, VSKK, FS1, FS2, VGJphi, f237(p03K6), М13, Pfl, Pf3, Vfl2, Vf33, pl2J. Однако сходные с Zot АК блоки были обнаружены только в проксимальных частях молекул (1-250 АК), а собственно токсиновая область Zot (260-399 АК) оказалась уникальной. Скорее всего, Zot-подобные белки названных фагов, в отличие от Zot, несут только морфогенетическую нагрузку, не обладая токсическим действием.

В начале 33 кДа части молекулы Zot нами найден сайт связывания три-фосфатов, что может свидетельствовать о непосредственном участии Zot в процессах прямого фосфорилирования. Аналогичный сайт выявлен и у Zot-подобных белков других филаментозных фагов.

Известно, что С-конец Zot имеет существенные АК различия у СТ1" и СТ" штаммов V.cholerae 01/139 (Boyd E.F. et al., 2000). Мы обнаружили, что эта > изменчивость не затрагивает участка, ответственного за связывание с клеточным рецептором. В консервативной части молекулы Zot и всех Zot-подобных белков есть область, содержащая ACT мотив. Вероятно, в молекуле Zot имеется функциональный домен, ответственный за связывание с другими белками фагового капсида, что необходимо для осуществления процесса фагосборки.

В области молекулы Zot, гомологичной всем Zot-подобным белкам, найден потенциальный ДНК-связывающий домен HRDC (Helicase and RNase D C-terminal) — необходимый компонент функциональной структуры АТФ-зависимых ДНК-хеликаз (ферментов репликации/репарации), ответственный за связывание с ДНК и стабилизацию ее структуры. Это указывает на вероятное участие Zot в нуклеиновом обмене. Возможно, именно Zot осуществляет непосредственную упаковку ДНК фага с последующей стабилизацией ее структуры в вирионе и сам является составной частью и связующим звеном * фаговой частицы.

Поскольку ген zot непосредственно связан с геном другого дополнительного токсина, Асе, а промотор первого располагается в области второго (Fando R. et al., 1997), мы также провели компьютерный анализ гена асе и кодируемого им белка.

Согласно литературным данным, продукт гена асе — низкомолекулярный гидрофобный белок, входящий в состав фаговой частицы. Он имеет сходство с продуктом гена VI филаментозного фага РП (Waldor М.К., Mekalanos J.J., 1996) и с белками семейства ион-транспортных АТФаз (Trucksis М. et al., 1993). Очевидно, Асе способен агрегироваться в димер, формируя структуру, сходную с ион-проницаемой порой (Trucksis М. et al., 1997).

Ген асе представляет собой orf размером 291 п.н., его продукт — преимущественно гидрофобный протеин из 96 АК с ММ 11,4 кДа и pi 4,41. В состав молекулы не входят аминокислоты цистеин и гистидин. Проведенный нами сравнительный компьютерный анализ первичной структуры Асе различных штаммов V.cholerae показал полную консервативность протеина Асе. » Мы установили 49% сходства АК последовательности Асе с белком Orf93 филаментозного фага Pf3 P.aeruginosa. Сходные с Асе АК блоки были найдены и в белках других филаментозных фагов. Как и Асе, они не содержат остатков цистеина и гистидина. Из них только VSK-receptor V.cholerae 0139 известен как фаговый рецептор (Basu I. et al., 1998), остальные имеют статус гипотетических. Мы установили, что наибольшим родством Асе обладает белок ОгП41 фага Pfl. У проанализированных филаментозных фагов асе-подобные гены располагаются перед zot-подобными, причем эти orf перекрываются, что позволяет предполагать наличие сопряженной экспрессии.

Из всех фагов только функции белков М13 известны достоверно. Капсид фага М13 состоит из двух гидрофобных белков VIII и VI. Последний является Ace-подобным, не содержащим остатков цистеина и гистидина. Благодаря своей гидрофобности эти белки локально встраиваются в мембрану E.coli, об* разуя своего рода рецепторный участок. Однонитевая кольцевая молекула фага, сразу после синтеза ведомая белком-лоцманом III, транспортируется именно к такому участку. Проходя сквозь него, она покрывается белками фагового капсида VI и VIII, превращаясь в фаговую частицу. Мы предполагаем наличие подобного механизма и для фага СТХф с участием белка Асе в качестве субъединицы капсида. По нашему мнению, в СТХф Асе является аналогом белка VI в М13. Белка, подобного VIII, в СТХф нами не выявлено. Таким образом,\ из полученных результатов можно сделать вывод о том, что Асе, как и Zot,/ действительно является необходимой составляющей фагового морфогенеза, j Способность Асе интегрировать в клеточную мембрану клетки-хозяина благодаря гидрофобности объясняет его токсичность для энтероцитов кишечника человека. Возможно, он интегрирует в мембрану энтероцита так же, как в бактериальную мембрану, и формирует в ней подобные рецепторные участки, что и приводит к нарушению ионного баланса эукариотической клетки.

Анализ НК и АК последовательностей с помощью компьютерных программ позволяет создать теоретическую основу для экспериментальных исследований. Однако дальнейшее изучение проанализированных белков тре-» буют наличия их препаратов. Что касается препарата Zot, то получение его из штаммов V.cholerae представляется малоэффективным и сопряжено с рядом трудностей. Одним из перспективных решений данной задачи является клонирование гена zot в составе плазмидного вектора и создание продуцентов на основе лабораторных штаммов E.coli. Поэтому мы клонировали в составе рекомбинантных плазмид ген zot, синтезированный с помощью ПЦР.

Используя сконструированные нами праймеры, мы получили два вида амплификатов гена zot. Один из них, zotPRM, содержал, помимо полной последовательности гена (включая старт- и стоп-кодоны, область терминации и место посадки рибосомы), собственную промоторную область гена zot; второй, Zotl97, не включал промоторной области. Оба амплификата, содержащие на концах сайты рестриктаз Hindlll и PstI, были встроены по этим сайтам в полилинкер плазмидного вектора pUC19 в ориентации, обеспечивающей на» правление транскрипции под контролем Ьас-промотора. В результате были получены две рекомбинантные плазмиды, обозначенные pZotl97 и pZotPRM.

Первая содержала область гена zot без собственного промотора, а синтез токсина осуществлялся под контролем lacZ-промотора. Поэтому экспрессия гена ;4 возможна только при индукции ИПТГ. Продукт — белок Zot с ММ 44.8 кДа такой же, как у холерного вибриона). Плазмида pZotPRM содержала область гена zot с собственным промотором. Поскольку при клонировании область транскрипции гена zot стала продолжением гена lacZ, при индукции ИПТГ образовался гибридный белок с ММ 49,5 кДа, включающий 42 дополнительных аминокислотных остатка на N-конце, из которых первые 6 принадлежали белку LacZ, остальные — промоторно-операторной области, расположенной в пределах гена асе (Trucksis М. et al., 1993). С другой стороны, параллельно под контролем собственного промотора осуществлялся синтез интактного Zot с ММ 44.8 кДа. Таким образом, при индукции ИПТГ в клетках рекомбинант-ных клонов E.coli должны присутствовать два белка - гибридный и собственно Zot, а без индукции - только последний.

В нашем распоряжении имелась рекомбинантная плазмида pCTllO, скон-» струированная Гинцбургом А Л. с соавт. (1984), содержащая помимо генов ctxAB, консервативный PstI-XbaI-фрагмент с расположенными на нем генами zot и асе. Этот фрагмент мы субклонировали в составе рекомбинантной плазмиды pUS192 в такой ориентации, чтобы синтез искомых продуктов осуществлялся под контролем 1ас-промотора pUC19. Содержащие ее рекомбинантные клоны E.coli способны к синтезу обоих токсинов.

Из литературных данных известно, что Zot (до процессинга) локализуется на поверхности клеток не только холерных вибрионов, но и рекомбинантных клонов E.coli, экспрессирующих клонированный ген (Uzzau S. et al., 1999). Поэтому для выявления способности рекомбинантов к продукции токсина мы использовали супернатанты дезинтегратов клеток клонов E.coli Jml03pZotPRM, Jml03pZotl97 и Jml03pUS192. Только в супернатанте дезин-теграта E.coli Jml03pZotPRM с помощью электрофореза в ПААГ с SDS была * выявлена белковая линия с электрофоретической подвижностью, соответствующей белку с молекулярной массой -45 кДа, что подтвердило способность этого клона к активной экспрессии клонированного гена. В супернатантах деч зинтегратов Jml03pZotl97 и Jml03pUS 192 такого полипептида обнаружено не было. По-видимому, количество нового продукта было слишком мало для его выявления с помощью электрофореза. Однако при изучении биологической активности in vitro оказалось, что все полученные клоны экспрессирова-ли клонированные гены. Для этих целей мы использовали культуры эпителиальных клеток тонкого кишечника человека СаСо2, поскольку рядом авторов (Uzzau S. et al., 2001; Watts T.L. et al., 2000) достоверно установлено присутствие на их поверхности рецепторов Zot/зонулина. Ранее СаСо2 использовали лишь для выделения данного рецептора, но не для детекции токсина in vitro. Супернатанты дезинтегратов клеток, внесенные в лунки с плотным клеточным монослоем, вызывали отделение клеток друг от друга и увеличение межклеточного пространства, что постепенно приводило к образованию в монослое многочисленных «дыр». Такая картина вполне согласовалась с описанным в литературе механизмом действия Zot на животные ткани и свидетель» ствовала в пользу адекватности модели СаСо2 для выявления этого токсина in vitro. Описанные изменения были наиболее ярко выражены под действием препарата из клона E.coli Jml03pZotPRM, выращенного с индукцией ИНН, тогда как при выращивании без индукции уровень активности был значительно ниже, как и у клонов E.coli Jml03pZot 197 (только с индукцией) и E.coli Jml03pUS192 (независимо от индукции). Эти результаты еще раз подтвердили наши выводы о том, что ген, клонированный в составе плазмиды pZotPRM (с собственным промотором), обеспечивает достаточно высокий уровень токси-нопродукции, в отличие от гена, клонированного в составе pZotl97 (без промотора). Препарат из клона E.coli Jml03pUS192 наряду с изменениями, характерными для действия Zot, вызывал также гибель части клеток культуры. Поскольку гибели клеток не наблюдалось в других препаратах, мы отнесли ее за счет действия Асе. По-видимому, синтез обоих продуктов происходил под контролем собственных промоторов.

Такое же действие на культуру СаСо2 оказывал препарат-сырец Zot, выделенный из клона E.coli Jml03pZotPRM. Более того, разрушение tj и разреже-4 ние монослоя под его влиянием наблюдалось также в культурах McCoy и L

929, но не СНО (вероятно, за счет отсутствия специфических рецепторов у клеток данной культуры).

Условия выделения рекомбинантного белка были подобраны на основе данных компьютерного анализа, который показал, что молекулы Zot при нейтральном значении рН имеют положительный заряд, поэтому мы использовали слабый катионообменник BioRex 70, имеющий отрицательный заряд. Далее в качестве аффинного сорбента мы использовали гепарин-сефарозу, поскольку в структуре Zot был обнаружен потенциальный ДНК-связывающий домен, который специфически связывался с гепарином по типу взаимодействия с ДНК. Zot полностью сорбировался гепарин-сефарозой. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что Zot присоединяется к гепарину по анологии с ДНК, как ферменты нуклеинового обмена. Весьма вероятно, что » Zot как фермент функционирует по типу ДНК-хеликаз, осуществляя АТФзависимую суперспирализацию ДНК фага. В процессе такой упаковки Zot может оставаться связанным с ДНК, стабилизируя образовавшуюся структуру, что может служить сигналом сборки фаговых частиц. Мы предполагаем, что Zot является связующим звеном между ДНК и другими белками фагового капсида.

Помимо гепарин-сефарозы для дальнейшей очистки использовали Affigel Blue, поскольку в структуре Zot был обнаружен потенциальный домен АТФаз и прилегающий к нему акцепторный сайт связывания нуклеотидтрифосфатов ATP/GTP. В состав Affigel Blue входит краситель цибакрон голубой, структура которого «имитирует» структуру ATP. Zot действительно сорбировался Affigel Blue. По-видимому, он способен связывать свободные нуклеотидтри-фосфаты, вероятно, для участия в процессах сборки фаговых частиц и в нук-* леиновом обмене.

Таким образом, препарат Zot, выделенный из рекомбинантного клона E.coli Jml03pZotPRM, несмотря на то, что он не подвергался процессингу в клетках неспецифического хозяина, тем не менее, сохранял специфическую биологическую активность, выражающуюся в разрушении tj в различных культурах тканей (кишечной СаСо2, McCoy, L-929). Наши результаты согласуются с литературными данными о биологической активности гибридных молекул Zot, содержащих дополнительные аминокислотные последовательности других белков либо олигопептидов (Uzzau S. et al., 1999; Baudry В. et al., 1992; Marinaro M. et al., 2003; Rossi M. et al., 2002).

Полученные рекомбинантные клоны E.coli Jml03pZotPRM, Jml03pZotl97 и Jml03pUS192 депонированы в коллекции ВНИПЧИ «Микроб» под номерами КМ 171, КМ 172, КМ 173 соответственно.

Далее нами было проведено детальное изучение 20 штаммов холерных вибрионов Ol и не01 групп, содержащих в своем геноме неполный СТХ-элемент. Все они были выделены в Узбекистане, России и Крыму от больных ОКЗ и из объектов внешней среды. Их исследование представляло интерес с точки зрения оценки их значимости как этиологических агентов острых диа-рейных заболеваний, установления^эодственных связей между ними.

При изучении на модели кроликов-сосунков все они, за исключением одного (выделенного от носителя), давали более или менее выраженный энтеро-патогенный эффект. При этом часть штаммов обнаружила способность к дис-семинации в различные органы и ткани. Два штамма вызывали эффект, занимающий промежуточное положение между энтеропатогенным и холероген-ным. Супернатанты 18-часовых культур, выращенных в синказной среде с шуттелированием при 120-150 об/мин (т.е. в условиях, исключающих синтез гемолизина), вызывали повышение кожной проницаемости в пробе Крейга с образованием отека 8-13 мм, иногда сопровождающегося гиперемией, ишемией и геморрагией. Супернатант одного штамма вызывал также некроз диаметром 3-5 мм, а также гибель 100% клеток культуры СНО, тогда как все остальные - лишь округление большинства клеток. Однако при изучении этих же супернатантов на клетках линий McCoy и L-929 единственным видимым эффектом было разрежение монослоя, аналогичное наблюдаемому при тестировании рекомбинантных E.coli и препарата Zot.

Таким образом, исследуемые штаммы холерных вибрионов в основном давали один и тот же эффект на лабораторных моделях, а у людей вызывали ОКЗ со сходной клинической картиной. Тем не менее, их вирулентность могла быть связана с разными факторами, набор и уровень экспрессии которых неодинаков у разных штаммов. В связи с этим представляла интерес подробная генотипическая характеристика холерных вибрионов, содержащих неполный СТХ-элемент, которая была проведена нами с помощью ПЦР, гибридизации колоний и блот-гибридизации.

Полученные результаты показали, что в геноме всех исследованных штаммов отсутствовали гены ctxAB, но присутствовали гены проксимальной части коровой области СТХф - асе и zot, причем последний, по-видимому, имел 3'-конец, отличный от такового, входящего в состав полного СТХ-» элемента, что соответствует характеристике pre-СТХф (Boyd E.F. et al., 2000).

Кроме того, у 17 из 20 штаммов присутствовал и ген RS2, входящий в состав профага, но только у одного был найден ген rstC, специфичный для RS1. Вместе с тем, все 20 штаммов гибридизовались с зондом RS. Это обстоятельство вместе с данными блот-гибридизации, которые указывали на присутствие 1-2 копий профага в геноме, позволяют полагать, что все штаммы содержат, по крайней мере, RS2, но у некоторых из них он утратил способность узнаваться использованными нами праймерми вследствие мутаций. Что касается RS 1, то его отсутствие, обычно характерное для штаммов классического биовара, делает невозможным образование инфекционных фаговых частиц и, соответственно, горизонтальную передачу умеренного фага другим штаммам (Davis В.М., Waldor М.К., 2000; Davis В.М. et al., 2000). Тем не менее, полученыые данные позволяют думать, что исследуемые штаммы действительно содержат pre-СТХф, интегрированный либо в один и тот же (в виде тандема или единственной копии), либо в разные участки генома. По поводу одного из штамmob Ol группы, содержащего RSI и RS2 и две тандемные копии, можно с большой долей вероятности предположить, что он способен к продукции фага » рге-СТХф и RSltp.

Что касается возможных способов приобретения рге-СТХф, то, с одной стороны, присутствие гена tcpA, выявленное с помощью молекулярного зондирования, свидетельствует в пользу «традиционного» пути, т.е. за счет инфицирования фаговыми частицами, использующими пили адгезии в качестве рецептора. С другой - при ПЦР-анализе оказалось, что в пределах этой группы ген tcpA подвержен повышенной изменчивости, поскольку только часть штаммов дала положительный ответ при использовании праймеров на tcpA типа эльтор и классического типа. Поэтому вопрос о реальной способности штаммов к пилеобразованию остался открытым. Это обстоятельство, а также данные блот-гибридизации позволяют предполагать, что у большинства штаммов профаг интегрирован в альтернативные сайты. В таком случае геном рге-СТХф мог быть передан другим фагом, осуществляющим общую транс-<• дукцию, таким как СР-Т1. Также нельзя исключить, что дополнительные копии RS1-элемента, обнаруженные у одного из штаммов Ol групы с помощью блот-гибридизации, могли быть приобретены за счет альтернативного механизма горизонтальной передачи RS^ с участием филаментозного фага KSF-1ф, использующего отличный от TCP рецептор (Faruque S.M. et al., 2003). Возможность же приобретения штаммами, содержащими неполный СТХ-элемент, полноценного фага СТХф, представляется нам весьма ограниченной, поскольку оба содержат ген rstR, кодирующий белок-репрессор, обеспечивающий иммунитет клетки-хозяина к инфицированию гомологичным фагом.

У большинства штаммов выявлен функционально активный ген нейрами-нидазы, у всех - гены гемагглютинин/протеазы (hap) и цитотоксического комплекса RTX - rtxA (собственно токсина) и rtxC (его активатора). Присутствие в геноме детерминант токсина и его активатора позволяет с большой долей * вероятности предположить, что штаммы содержат интактный RTX-кластер, способный к экспрессии. Мы не исключаем, что округление клеток СНО под действием супернатантов большинства исследуемых штаммов могло отчасти быть обусловлено этим токсином, который, хотя в основном и остается свя-» занным с клеткой, частично может освобождаеться во внешнюю среду (Fullner

K.J., Mekalanos J.J., 2000). Неожиданным оказалось обнаружение у всех штаммов Ol (но не не01) группы нуклеотидной последовательности редко встречающегося гена термостабильного токсина stn/sto, продукт которого обладает диареегенной активностью. Однако, несмотря на положительный результат ПЦР с использованной нами парой праймеров вопрос о полноценности гена и способности к экспрессии требует экспериментального подтверждения. У 13 из 20 штаммов выявлен ген cef, продукт которого может способствовать развитию диареи, реализуя механизм действия, отличный от такового СТ (McCardell В.А. et al., 2000). Кроме того, у всех штаммов Ol группы и одного штамма не01 группы с помощью реакции преципитации со специфической сывороткой выявлена способность к синтезу NCT.

Таким образом, этиологическая опасность нехолерогенных штаммов хо-<. лерных вибрионов, содержащих неполный СТХ-элемент, связана с присутствием в их геноме не всегда идентичных наборов генов дополнительных фак торов вирулентности. Не исключено, что диарейный синдром различной степени тяжести, наблюдавшийся у людей, явившихся источником их выделения, а также признаки вирулентности, выявляемые на лабораторных моделях, могли быть обусловлены токсинами Асе, RtxA, NCT, Cef и термостабильным токсином (ST), действие которых усиливалось присутствием Zot. Не исключено также участие других токсинов, генетические детерминанты которых до сих пор не установлены (таких как NMDCY и W07).

Сравнительный анализ профилей гибридизации позволил выявить среди изученных нехолерогенных штаммов, выделенных от людей, 5 этиологически опасных клонов, каждый из которых был связан с определенным временем и местом выделения, а по меньшей мере один из них - с локальной вспышкой ч диарейных заболеваний.

- 130

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Писанов, Руслан Вячеславович, 2004 год

1. Аберкромби Д., Алленмарк С., Арамэ С. и др. Аффинная хроматография. Методы. / Пер. с англ. — М.: Мир, 1988 — 278с.

2. Атарова Г.Т., Помухина О.И., Мишанькин Б.Н. и др. Выделение дер-мотоксина Vibrio cholerae и характеристика его биологических свойств // Журн. микробиол. 1995. - Приложение 2. — С. 21-24.

3. Бардахчьян Э.А., Ломов Ю.М., Харланова Н.Г. и др. Особенности ультраструктурных изменений в тонкой кишке кроликов-сосунков при действии vct'-штамма холерных вибрионов // Арх. патол. — 2000. — №1. — С.24-29.

4. Бардахчьян Э.А., Харланова Н.Г., Ломов Ю.М., Ткачева Т.И. Ультраструктурные изменения эпителиоцитов и сосудов микроциркуляторного русла тонкой кишки кроликов-сосунков, инфицированных холерными вибрионами // Морфология. 2001. - Т. 120, №5. - С.79-84.

5. Власов В.П., Бардахчьян Э.А., Харланова Н.Г. и др. Сравнительное изучение вирулентности vct+ и vet- холерных вибрионов // Холера: Матер. Росс, науч.-практ. конф. по проблеме холера, Ростов н/Д. — 1995. — С.92-98.

6. Водопьянов С.О., Мишанькин Б.Н., Олейников И.П. и др. Разработка способа выявления гена tcpA холерного вибриона биотипа эльтор и серовари-анта 0139 Бенгал с помощью полимеразной цепной реакции // Биотехнология. — 1999. №6. - С.19-23.

7. Водопьянов С.О., Парамонов И.В., Сучков И.Ю. и др. Конструирование специфических праймеров для выявления гена toxR холерного вибриона // Биотехнология. 2001. - №5. - С.70-74.

8. Гинцбург A.JL, Брюханов А.Ф., Янишевский Н.В. с соавт. Определение наличия гена токсинообразования у холерного вибриона // Метод, рекомендации. НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи АМН СССР, Москва, 1986.

9. Гинцбург A.JI., Янишевский Н.В., Мотин B.JI. и др. Организация и клонирование структурных генов энтеротоксина Vibrio cholerae eltor RV79 // Мол.генетика, микробиол. и вирусол. — 1984. — №9. — С. 12-19.

10. Гинцбург A.JI., Янишевский Н.В., Мотин В.П. и др. Природа последовательностей RS1, фланкирующих ген холерного токсина у Vibrio cholerae КМ79 // Мол.генетика, микробиол. и вирусол. 1986. - №2.- С. 11-19.

11. Дэвис Р., Ботстайн Д., Рот Дж. Генетика бактерий // М.: Мир, 1984. — 176с.

12. Ерошенко Г.А., Осин А.В., Челдышова Н.Б., Смирнова Н.И. Генетические особенности авирулентных штаммов холерных вибрионов 0139херо-группы, выделенных на территории России // Проблемы ООИ. 2001. — Вып. 1 (81). -С.69-75.

13. Зыкин Л.Ф. Получение экзотоксина холерного вибриона (холерогена) и изучение его свойств // Проблемы ООИ. 1970. - № 6(16). - С. 17-23.

14. Костромитина Е.А., Ерошенко Г.А., Савостина Е.П. Сравнительный анализ информативности различных методов генотипирования Vibrio cholerae биовара эльтор с различной эпидемической значимостью // Проблемы ООН. — 2003а. Вып.85. - С.75-84.

15. Костромитина Е.А., Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. Рибо- и ПЦР-типирование штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор с различной эпидемической значимостью // Холера: Матер. VIII Росс.науч.-практ. конф. — Ростов-н/Д, 20036.-С.120-124.

16. Мазин А.В., Кузнеделов К.Д., Краев А.С. и др. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Новосибирск.: Наука. Сиб. отделение, 1990. — 248с.

17. Мазрухо А.Б., Михась Н.К., Монахова Е.В., Рожков К.К. Изучение продукции ряда факторов вирулентности холерных вибрионов на универсальной триптоновой среде // Журн. микробиол.— 2000. — №1. — С. 21-24.

18. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. / Пер. с англ. М.: Мир, 1984. - 480с.

19. Монахова Е.В., Михась Н.К. tol-кластер холерных вибрионов и его роль в горизонтальной передаче СТХ-элемента // Холера: Матер. VIII Росс, науч.-практ. конф. — Ростов-н/Д, 2003. С. 134-137.

20. Монахова Е.В., Михась Н.К., Мазрухо А.Б. Токсины холерных вибрионов // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер, пробл. комиссии. Ростов-н/Д, 1999. - Вып. 12. - С.56-60.

21. Монахова Е.В., Михась Н.К., Смоликова Л.М., Мишанькин Б.Н. Изучение генетических детерминант токсинов кассеты вирулентности и нейраминидазы холерных вибрионов с помощью молекулярного зондирования //

22. Журн. микробиол. 2001. - №2. - С.25-29.«

23. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультацентрифугирование. М.: Наука, 1981. — 288с.

24. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. — М.: Наука, 1985.-536с.

25. Помухина О.И. Дермонекротический фактор холерных вибрионов // Автореф. дис. . канд. биол. наук. — Ростов-н/Д, 1990. 24с.

26. Помухина О.И., Уралева B.C., Фецайлова О.П. Комплексная оценка кожной пробы для выявления дермонекротического, геморрагического факторов и фактора кожной сосудистой проницаемости холерных вибрионов // ВМО. Ростов-н/Д, 1989. - Вып.1. - С.87-91.

27. Помухина О.И., Уралева B.C., Фецайлова О.П. Методические рекомендации по комплексной оценке кожной пробы для выявления биологическиактивных факторов у холерных вибрионов. Утверждены на Ученом совете РПЧИ.-1986.

28. Романова Ю.М., Гинцбург A.JI. Участие мобильных элементов в формировании свойств патогенных бактерий // Мол. генетика, микробиол. и виру-сол. 1999. - №2. - С.22-29.

29. Сальникова О.И., Лобанов В.В., Шиманюк Н.Я. Использование культур клеток СНО при изучении холерных вибрионов // Микробиол. журн. -1991. №6. - С.94-99.

30. Смирнова Н.И. Возбудитель холеры новой 0139 серогруппы: молеку-лярно-генетические особенности и происхождение // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 2002. - №3. - С.23-33.

31. Смирнова Н.И., Челдышова Н.Б., Костромитина Е.А. Эволюция пато-генности возбудителя холеры // Холера: Матер. VIII Росс, науч.-практ. конф. — Ростов-н/Д, 2003. С.101-104.

32. Челдышова Н.Б. Дифференциация штаммов Vibrio cholerae OI с различной эпидемической значимостью на основании четырех генов вирулентности: ctxA, tcpA, toxR и hapA" : Автореф. дисс. . канд. биол. наук. — Саратов, 2002.-24с.

33. Четина Е.В., Грижебовский Г.М., Брюханов А.Ф. и др. О возможном механизме эндемичности современной холеры (роль некультивируемых форм Vibrio cholerae OI) // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. — 1993. — №6. — С. 18-22

34. Arita М., Takeda Т., Honda Т., Miwatani Т. Purification and characterization of Vibrio cholerae non-Ol heat-stable enterotoxin // Infect.Immun. — 1986. -Vol.52, N1.-P.45-49.

35. Basu A., Garg P., Datta S. et al. Vibrio cholerae 0139 in Calcutta, 19921998: incidence, antibiograms and genotypes // Emerging Infect. Diseases.-2000. -Vol.6, N2. P.139-147.

36. Basu I., Mitra R., Saha P.K. et al. Morphological and cytoskeletal changes caused by non-membrane damaging cytotoxin of Vibrio cholerae on Int407 and HeLa cells // FEMS Microbiol. Lett. 1999. - Vol.179, N2. - P. 255-263.

37. Baudry В., Fasano A., Ketley J., Kaper J.B. Cloning of a gene (zot) encoding a new toxin produced by Vibrio cholerae // Infect.Immun. 1992. - Vol.60, N2.1. P.428-434.

38. Berche P., Poyart C., Abachin E. et al. The novel epidemic strain 0139 is closely related to the pandemic strain Ol of Vibrio cholerae // J.Infect Dis. 1994.- Vol.170, N3-P.701-704.

39. Birnboim H.C., Doly I. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucleic Acid Res. 1979. - Vol.7., N6. - P. 15131523.

40. СТХф precursor and evidence for independent acquisition of distinct CTXcps bytoxigenic Vibrio cholerae // J.Bacteriol. 2000. - Vol.182, N19. - P.5530-5538.

41. Boyd E.F., Waldor M.K. Alternative mechanism of cholera toxin acquisition by Vibrio cholerae: generalized transduction of СТХф by bacteriophage CP-T1 // Infect.Immun. 1999. - Vol.67, N11.- P.5898-5905.

42. Campos J., Fando R., SilvaA. et al. Replicating function of the RSI element associated with Vibrio cholerae СТХф prophage // FEMS Microbiol. Lett. — 1998-Vol.164.-P.141-147.

43. Campos J., Martinez E., Suzarte E. et al. VGJphi, a novel lysogenic filamentous phage of Vibrio cholerae which shares the same integration site with CTXphi // J. Bacteriol. 2003. - Vol.185, N19. - P.5685-96.

44. Chang В., Taniguchi H., Miyamoto H., and Yoshida S. Filamentous bacteriophages of Vibrio parahaemolyticus as a possible clue to genetic transmission // J. Bacteriol. 1998. - Vol.180, N19. - P.5094-5101.

45. Chow K.H., Ng Т.К., Yuen K.Y., Yam W.C. Detection of RTX toxin gene in Vibrio cholerae by PCR // J.Clin.Microbiol. 2001. - Vol.39, N7. - P.2594-2597.

46. Chowdury M.A.R., Hill R.T., Colwell R.R. A gene for the enterotoxin zonula occludens toxin is present in Vibrio mimicus and Vibrio cholerae 0139 // FEMS Microbiol.Lett. Vol.119. - P.377-380.

47. Cox D.S., Raje S., Gao H. et al. Enhanced permeability of molecular weight markers and poorly bioavailable compounds across CaCo-2 cell monolayers using the absorption enhancer, zonula occludens toxin // Pharm. Res. — 2002. -Vol.19, N11.-P.1680-1688.

48. Craig J.P. Preparation of the vascular permeability factor of Vibrio cholerae // J.Bacteriol. 1966. - Vol.92, N3. - P.793-795.

49. Davis B.M., Moyer K.E., Boyd E.F., Waldor M.K. CTX profages in classical biotype Vibrio cholerae: functional phage genes but disfunctional phage genome // J.Bacteriol. 2000. - Vol. 182. - N.24. - P.6992-6998.

50. Davis B.M., Waldor M.K. СТХф contains a hybrid genome derived from tandemely integrated elements // Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000. - Vol.97, N15. -P.8572-8577.

51. Di Pierro M.D., Lu R., Uzzau S. et al. Zonulin occludens toxin structure-function analysis: identification of active fragments and the receptor binding domain // J.Invest.Med. 2000. - Vol.48. - P.202.

52. Dutta N.K., Habbu M.K. Experimental cholera in infant rabbits: a method for chemotherapeutic investigation // Brit.J.Pharmacol. 1955. - Vol.10, N2: -P.153-159.

53. Faruque S.M., Ahmed K.M., Alim A.R. et al. Emergence of a new clone of toxigenic Vibrio cholerae OI biotype El Tor displacing V. cholerae 0139 Bengal in Bangladesh // J.Clin.Microbiol. 1997a. - Vol.35, N3. - P.624-630.

54. Faruque S.M., Asadulghani, Kamruzzaman M. et al. RSI element of Vibrio cholerae can propagate horizontally as a filamentous phage exploiting the morphogenesis genes of СТХф // Infect.Immun. 2002. - Vol.70, N1. - P. 163-170.

55. Faruque S.M., Asadulghani, Rahman M.M. et al. Sunlight-induced propagation of lysogenic phage encoding cholera toxin // Infect.Immun. -2000. Vol.68, N8. — P.4795-4801.

56. Faruque S.M., Kamruzzaman M., Asadulghani et al. СТХф-independent production of the RSI satellite phage by Vibrio cholerae // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 2003. - Vol.100, N3. - P.1280-1285.

57. Fasano A. Intestinal zonulin: open sesame! // Gut. 2001b. — Vol.49. -P.159-162.

58. Fasano A. Modulation of intestinal permeability: an innovative method of oral drug delivery for the treatment of inherited and acquired human diseases // Mol. Genet. Metab. 1998a. - Vol.64, N1. - P.12-18.

59. Fasano A. Novel approaches for oral delivery of macromolecules // J.Pharm.Sci. 1998b.-Vol.87, N11.-P.1351-1356.

60. Fasano A. Regulation of intercellular tight junctions by zonula occludens toxin and its eucaryotic analogue zonulin // Ann.N.Y.Acad.Sci. 2001a. — N915. -P.214-222.

61. Fasano A., Baudry В., Pumplin D.W. et al. Vibrio cholerae produces a second enterotoxin, which affects intestinal tight junctions // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1991.-Vol.88.-P.5242-5246.

62. Fasano A., Fiorentini C., Donelli G. et.al. Zonula occludens toxin (Zot) modulates tight junctions through protein kinase C-dependent actin reorganization in vitro // J.Clin.Invest. 1995. - Vol.96. - P.710-720.

63. Fasano A., Not Т., Wang W. et al. Zonulin, a newly discovered modulator of intestinal permeability, and its expression in coeliac disease // Lancet. 2000. -Vol.355, N9214.-P.1518-1519.

64. Fasano A., Uzzau S. Modulation of intestinal tight junctions by zonula oc-cludens toxin permits enteral administration of insulin and other macromolecules in an animal model // J.Clin.Invest. -1997. Vol.99, N6. - P. 1158-1164.

65. Fasano A., Uzzau S., Fiore C., Margaretten K. The enterotoxic effect of zonula occludens toxin on rabbit small intestine involves the paracellular pathway // Gastroenterology. 1997. - Vol.l 12, N3. - P.839-846.

66. Fiore A.E., Michalski J.M., Russel R.G. et al. Cloning, characterization and chromosomal Mapping of a phospholipase (lecithinase) produced by Vibrio cholerae // Infect.Immun. -1997. Vol.65, N8. - P. 3112-3117.

67. Fullner K.J., Boucher J.C., Hanes G.R. et al. The contribution of accessory toxins of Vibrio cholerae Ol El Tor to the proinflammatory response in a murine pulmonary cholera model // J.Exp.Med. 2002. - Vol.195, N11. - P.1455-1462.

68. Fullner K.J., Lencer W.L, Mekalanos J.J. Vibrio cholerae-induced cellularresponses of polarized T84 intestinal epithelial cells are dependent on production of cholera toxin and RTX toxin // Infect.Immun. 2001. - Vol.69, N10. - P.6310-6317.

69. Fullner K.J., Mekalanos J.J. In vivo cross-linking of cellular actin by the Vibrio cholerae RTX toxin // The EMBO Journal. 2000. - Vol.19, N20. - P.5316-5323.

70. Ghosh A.R., Nandy R.K., Dasgupta S. et al. A search for cholera toxin (CT), toxin corregulated pilus (TCP), the regulatory element ToxR and other virulence factors in non01/non0139 V.cholerae // Microb.Pathogen.- 1997. Vol.22, N4.-P. 199-208.

71. Grimont F., Chevrier D., Grimont P.A.D. et al. Acetylaminofluorene-labled ribosomal RNA for use in molecular epidemiology and taxonomy // Res.Microbiol. 1989. - Vol.140. - P. 447-454.

72. Guglielmetti P, Bravo L, Zanchi A. et al. Detection of the Vibrio cholerae heat-stable enterotoxin gene by polymerase chain reaction // Mol.Cell Probes. -1994. Vol.8, N1. - P.39-44.

73. Hasegawa M., Hidaka Y., Matsumoto Y. et al. Determination of the binding site on the extracellular domain of guanylyl cyclase to heat-stable enterotoxin // J.Biol.Chem. 1999. - Vol.274, N44. - P.31713-31718.

74. Heidelberg J.F., Eisen J.A., Nelson W.C. et al. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae // Nature. — 2000. Vol.406. — P.477-483.

75. Heilpern A.J., Waldor M. K. pill07*, a predicted СТХф minor coat protein, can expand the host range of coliphage fd to include Vibrio cholerae // J.Bacteriol. -2003. Vol.183, N3. - P.1037-1044.

76. Heilpern A.J., Waldor M.K. СТХф infection of Vibrio cholerae requires tolQRA gene products // J.Bacteriol. 2000. - Vol.182, N6. - P.1739-1747.

77. Hill D.F., Short N.J., Perham R.N., Petersen G.B. DNA sequence of the filamentous bacteriophage Pfl // J. Mol. Biol. 1991. - Vol.218, N2. - P.349-364.

78. Kar S., Ghosh R. K., Ghosh A. N. et al. Integration of the DNA of a novel filamentous bacteriophage VSK from Vibrio cholerae 0139 into the host chromosomal DNA // FEMS Microbiol. Lett. 1996. - Vol.145. - P. 17-22.

79. Karaolis D.K.R., Somara S., Maneval D.R.Jr et al. A bacteriophage encoding a pathogenicity island, a type IV pilus and a phage receptor in cholera bacteria // Nature. 1999. - Vol.399, N6734. - P.375-379.

80. Karasawa Т., Mihara Т., Kurazono H. Distribution of the zot (zonula occludens toxin) gene among strains of Vibrio cholerae 01 and non-01 // FEMS Microbiol. Lett. 1993. - Vol.106, N2. - P.143-145.

81. Karyekar C.S., Fasano A., Raje S. et al. Zonula occludens toxin increases the permeability of molecular weight markers and chemotherapeutic agents across the bovine brain microvessel endothelial cells // J. Pharm. Sci. 2003. -.Vol.92,N2. — P.414-423.

82. Khetavat G., Bhadra R.K., Nandi S., Das J. Resurgent Vibrio cholerae OI 39: rearrangement of cholera toxin genetic elements and amplification of rnn op-eron // Infect.Immun. 1999. - Vol.67, N1. - P. 148-154.

83. Lazar S., Waldor M.K. ToxR-independent expression of cholera toxin from the replicative form of СТХФ // Infect. Immun. 1998. - Vol.66, N1. - P.394-397.

84. Lin W., Fullner K.J., Clayton R. et al. Identification of a Vibrio cholerae RTX toxin gene cluster that is tightly linked to the cholera toxin prophage // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1999. - Vol.96, N2. - P. 1071-1076.

85. Lu R., Wang W., Uzzau S. et al. Affinity Purification and partial characterization of the zonulin/zonula occludens toxin (Zot) receptor from human brain // J.Neurochem. 2000. - Vol.74. - P.320-326.

86. Luiten R.G., Putterman D.G., Schoenmakers J.G., Konings R.N., Day L.A. Nucleotide sequence of the genome of Pf3, an IncP-1 plasmid-specific filamentous bacteriophage of Pseudomonas aeruginosa // J. Virol. 1985. - Vol.56. - P.268-276.

87. Mallard K.E., Desmarchelier P.M. Detection of heat-stable enterotoxin genes among Australian Vibrio cholerae 01 strains // FEMS Microbiol. Lett. -1995. Vol.127, N1-2. - P.l 11-115.

88. Mann E.A., Cohen M.B., Gianella R.A. Comparasion of receptors for Escherichia coli heat-stable enterotoxin: novel receptor present in IEC-6 cells // Am J.Physiol. (Gastrointest. Liver Physiol.). 1993. - Vol.264, N27. - P. G172-G178.

89. Marinaro M., Di Tomasso A., Uzzau S. et al. Zonula occludens toxin is a powerful mucosal adjuvant for intranasally delivered antigens // Infect.Immun. -1999. Vol.6, N3. - P. 1287-1291.

90. Marinaro M., Fasano A., De Magistris M.T. Zonula occludens toxin acts as an adjuvant through different mucosal routes and induces protective immune responses // Infect. Immun. 2003. - Vol. 71, N4. - P. 1897-1902.

91. Marzari R., Sblattero D., Righi M., Bradbury A. Extending filamentous phage host range by the grafting of a heterologous receptor binding domain // Gene. 1997. - V01.185. - P.27-33.

92. Mazel D., Dychinco В., Webb V.A., Davies J. A distinctive class of inte-gron in the Vibrio cholerae genome // Science. 1998. - Vol.280, N5363. - P.605-607.

93. McCardell B.A., Kothary M.H., Hall R.N., Sathyamoorthy V. Identification of a CHO-elongating factor produced by Vibrio cholerae Ol // Mi-crob.Pathogen. 2000. - Vol.29, N1. - P.l-8.

94. McCardell B.A., Madden J.M., Kothary M.H., Sathyamoorthy V. Purification and characterization of a CHO cell-elongating toxin produced by Aeromonas hydrophila// Microb.Pathogen. 1995. - Vol.19, N1. - P. 1-9.

95. McCardell B.A., Sathyamoorthy V., Michalski J. et al. Cloning, expression and characterization of the CHO cell elongating factor (Cef) from Vibrio cholerae Ol // Microb.Pathogen. 2002. - Vol.32, N4. - P.165-172.

96. Mekalanos J.J. Duplication and amplification of toxin genes in Vibrio cholerae // Cell. 1983. - Vol.35. - P.263-273.

97. Mitra R, Saha P.K., Basu I. et al. Characterization of non-membrane-damaging cytotoxin of non-toxigenic Vibrio cholerae Ol and its relevance to disease//FEMS Microbiol. Lett.- 1998.-Vol.169,N2.-P.331-333.

98. Morris J.G., Jr., Takeda B.D., Tall B.D. et al. Experimental non-Ol group 1 Vibrio cholerae gastroenteritis in humans // J.Clin.Invest. 1990. - Vol.85. -P.697-705

99. Mukhopadhyay A.K., Basu A., Garg S. et al. Molecular epidemiology Of reemergent Vibrio cholerae 0139 Bengal in India // J.Clin.Microbiol. 1998 -Vol.36, N7. - P. 2149-2152.

100. Namdary H., Klaipset C.R., Hoghes J.L. A cytotoxin-producing strain of Vibrio cholerae non-01, non-0139 as a cause of cholera and bacteremia after consumption of raw clams // J.Clin.Microbiol. 2000. - Vol.38, N9. - P.3518-3519.

101. Nasu H., Iida Т., Sugahara Т., Yamaichi Y., Park K.S., Yokoyama K., Ma-kino K., Shinagawa H., Honda T. A filamentous phage associated with recent pandemic Vibrio parahaemolyticus 03:K6 strains // J. Clin. Microbiol. 2000. -Vol.38.-P.2156-2161.

102. Ogawa A., Kato J., Watanabe H. et al. Cloning and nucleotide sequence of a heat-stable enterotoxin from Vibrio cholerae nonOl isolated from a patient with traveler's diarrhea // Infect.Immun. 1990. - Vol.58, N10. - P.3325-3329.

103. Ogawa A., Takeda T. The gene encoding the heat-stable enterotoxin of Vibrio cholerae is flanked by 123-base pair direct repeats // Microbiol. Immunol. -1993. Vol.37, N8. - P.607-616.

104. Ogierman M.A., Fallarino A., Riess T. et al. Characterization of the Vibrio cholerae El Tor lipase operon lipAB and a protease gene downstream of the hly region // J.Bacteriol. 1997. - Vol.179, N22. - P.7072-7080.

105. Ouchterlony O. Gel-diffusion techniques // Immunochemie.-Berlin, Heidelberg, New-York, 1965.-P.13-35

106. Qu M., Xu J., Ding Y. et al. Molecular epidemiology of Vibrio cholerae 0139 in China: polymorphism of ribotypes and CTX elements // J.Clin.Microbiol. -2003. Vol.41, N6. - P.2306-2310.

107. Rivera I.N.G., Chun J., Huq A. et al. Genotypes associated with virulence in environmental isolates of Vibrio cholerae // Appl.Environ.Microbiol. — 2001. — Vol.67, N6. — P.2421-2429

108. Rossi M., Maurano F., Luongo D. Zonula occludens toxin (Zot) interferes with the induction of nasal tolerance to gliadin // Immunol. Lett. 2002. - Vol.81, N3. - P.217-221.

109. Saha P.K., Koley H., Nair G.B. Purification and characterization of an extracellular secretogenic non-membrane-damaging cytotoxin produced by clinical strains of Vibrio cholerae non-Ol // Infect.Immun. 1996. — Vol.64, N8. - P.3101-3108.

110. Saha S., Sanyal S.C. Cholera toxin gene-positive Vibrio cholerae Ol Ogawa and Inaba strains produce the new cholera toxin // FEMS Microbiol. Letters. 1988.-Vol.50.-P.l 13-116.

111. Saha S., Sanyal S.C. Immunobiological relationships among new cholera toxins produced by CT gene-negative strains of Vibrio cholerae Ol // J.Med.Microbiol. 1989a. - Vol.28. - N1. - P.33-37.

112. Saha S., Sanyal S.C. Immunobiological relationships of the enterotoxins produced by cholera toxin gene-positive (CT+)) and cholera toxin gene-negative

113. СТ-) strains of Vibrio cholerae 01.// J.Med.Microbiol. 1990. - Vol.32, N1. -P.33-37.

114. Saha S., Sanyal.S.C. Neutralization of the new cholera toxin by antiserum against crude enterotoxin of cholera toxin gene-positive Vibrio cholerae Ol in rabbit ileal loop model// Indian J.Med.Res. 1989b. - Vol.89. - P.l 17-120.

115. Sanyal S.C. A new diarrhoeagenic cholera toxin: Abstr. Int. Symp.Natur. Toxins (ISNT-89) // J.Toxicol.Toxin Rev. 1990. - N1. - P. 125.

116. Sanyal S.C. Toxins of Vibrio cholerae Ol other than cholera enterotoxin // 3rd Meet.of the Working groop on bact.enteric inf., WHO. 1984. - Geneva, 12-14 Sept.

117. Sanyal S.C., Alam K., Neogi P.K.B. et al. A new cholera toxin // Lancet. -1983.-N 8337. -P.1337.

118. Sanyal S.C., Saha S.K., Saha S., Ahsan C.R. Interrelationship between en-terotoxins//Toxicon. 1988. - Vol.26, N1. - P.38-39.

119. Sathyamoorthy V., Hall R.H., McCardell B.A. et al. Purification and characterization of a cytotonic protein expressed in vitro by the live cholera vaccine candidate CVD 103-HgR // Infect.Immun. 2000. - Vol.68, N10. - P.6062-6065.

120. Sears C.L., Kaper J.D. Enteric bacterial toxins: mechanisms of action and linkage to intestinal secretion // Microbiol.Revs. 1996. - Vol.60, N1. — P. 167-215.

121. Shaanan В., Chipman D.M. The ACT domain family // Curr. Opin. Struct. Biol. 2001. - Vol. 11.- P.694-700.

122. Singh D.V., Matte M.H., Matte G. R. et al. Molecular analysis of Vibrio cholerae OI, 0139, non-Ol, and non-0139 strains: clonal relationships between clinical and environmental isolates // Appl. Environ. Microbiol. 2001, - Vol.67, N2.-P. 910-921.

123. Takao-T., Shimonishi Y., Kobayashi M. et al. Amino acid sequence of heat-stable enterotoxin produced by Vibrio cholerae non-01 // FEBS Lett. 1985. -Vol.193, N2.-P.250-254.

124. Takeda Т., Nair G.B., Suzuki K., Shimonishi Y. Production of a monoclonal antibody to Vibrio cholerae non-Ol heat-stable enterotoxin (ST) which is cross-reactive with Yersinia enterocolitica ST // Infect. Immun. 1990. - Vol.58, N9.-P. 2755-2759.

125. Takeda Т., Peina Y., Ogawa A. et al. Detection of heat-stable enterotoxin in a cholera toxin gene-positive strain of Vibrio cholerae 017/ FEMS Microbiol. Lett. 1991. - Vol.64, N1. - P. 23-27.

126. Trucksis M., Conn T.L., Fasano A., Kaper J.B. Production of Vibrio cholerae accessory cholera enterotoxin (Ace) in the yeast Pichia pastoris // Infect. Immun. 1997. - Vol.65, N12. - P.4984-4988.

127. Trucksis M., Conn T.L., Wasserman S.S., Sears C.L. Vibrio cholerae ACEistimulates Ca -dependent СГ/НСО3" secretion in T84 cells in vitro //

128. AmJ.Physiol.Cell Physiol. 2000. - Vol.279. - P.C567-C577.- 150167. Trucksis M., Galen J.E., Michalski J. et al. Accessory cholera enterotoxin

129. Ace), The third toxin of a Vibrio cholerae virulence cassette // Proc.Nat.Acad.Sci.1993. Vol.90, N11. - P.5267-5271.

130. Uzzau S., Cappuchinelli P., Fasano A. Expression of Vibrio cholerae zonula occludens toxin and analysis of its subcellular localization // Microb.Pathogen. 1999. - Vol.27. - P.377-385.

131. Uzzau S., Fasano A. Cross-talk between enteric pathogens and the intestine // Cell. Microbiol. 2000. - Vol.2, N2. - P.83-89.

132. Uzzau S., Lu R., Wang W. et al. Purification and preliminary characterization of the zonula occludens toxin receptor from human (CaCo2) and murine (IEC6) intestinal cell lines // FEMS Microbiol.Lett. 2001. - Vol.194. - P. 1-5.

133. Vicente A.C., Coelho A.M., Salles C.A. Detection of Vibrio cholerae and V. mimicus heat-stable toxin gene sequence by PCR // J. Med. Microbiol. 1997 — Vol.46, N5. — P.398-402.

134. Waldor M.K., Mekalanos J.J. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin // Science. 1996. - Vol.272, N5269. - P. 1910-1914.

135. Waldor M.K., Rubin E.J., Gregory D.N. et al. Regulation, replication and integration functions of the Vibrio cholerae СТХф are encoded by region RS2 // Mol.Microbiol. 1997. - Vol.24. - P.917-926.

136. Waldor M.K., Rubin E.J., Gregory D.N. et al. Regulation, replication and integration functions of the Vibrio cholerae СТХф are encoded by region RS2 // Mol.Microbiol. 1997. - Vol.24. - P.917-926.

137. Walia K., Ghosh S., Singh H. et al. Purification and characterization of novel toxin produced by Vibrio cholerae Ol // Infect.Immun. — 1999. Vol.67, N10.-P.5215-5222.

138. Watts T.L., Alexander Т., Hansen B. et al. Utilizing the paracellular pathway: a novel approach for the delivery of oral insulin in diabetic rhesus macaques // J.Invest.Med. 2000. - Vol.48. - P. 185.

139. Yamamoto K., Al-Omani M., Honda T. et al. Non-Ol Vibrio cholerae hemolysin: purification, partial characterization, and immunological relatedness to El Tor hemolysin // Infect. Immun. 1984. - Vol.45, N1. - P. 192-196.