Изучение области связывания IgA на рекомбинантном белке Bac стрептококка группы B тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Устинович, Ирина Анатольевна

• Устинович, Ирина Анатольевна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Устинович, Ирина Анатольевна

Список сокращений и условных обозначений

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Общие сведения о стрептококках

2.2. Факторы патогенности стрептококков группы В

2.3. Иммуноглобулин А: структура и функции

2.4. Иммунная система желудочно-кишечного тракта

2.5. Стрептококковые Fc- рецепторы, реагирующие с иммуноглобулином

А человека

2.5.1. IgA-рецепторы стрептококков группы А и S.pneumoniae

2.5.2. IgA-рецепторы стрептококков группы В

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Бактерии и плазмиды, культуральные среды и условия роста

3.2. Иммуноблоттнг бактриальных колоний (колоний блотт)

3.3. Выделение плазмидной ДНК

3.4. Выделение хромосомной ДНК

3.5. Рестрикция и лигирование ДНК

3.6. Полимеразная ценая ркакция (ПЦР)

3.7. Трансформация Escherichia coli

3.8. Электрофорез ДНК

3.9. Элюция фрагментов ДНК из агарозных гелей

3.10. Гибридизационный анализ ДНК

3.11. Секвенирование ДНК

3.12. Электропорация стрептококков группы В

3.13. Методы лизиса клеток E.coli для выделения рекомбинантных белков

3.14. Выделение и очистка рекомбинантных белков

3.14.1. Выделение и очистка рекомбинантного IgA-связывающего белка из штамма

E.coli JM 109 р4.

3.14.2. Выделение и очистка рекомбинантного белка из штамма E.coli М15 р

3.15. Электрофорез белков

3.16. Электроперенос белков из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозу

3.17. Определение количества белка

3.18. Определение способности рекомбинантного рецептороного белка связывать человеческий IgA методами ИФА

3.18.1. Двухслойный (сэндвич) метод

3.18.2. Метод конкурентного связывания

3.19. Определение константы связывания

3.20. Определение молекулярного веса рекомбинантных белков

3.21. Приготовление аффинных колонок

3.22. Иммунизация животных, получение антисывороток

3.23. Определение концентрации иммуноглобулина А в биоптатах методом блоттинга

3.24. Определение концентрации иммуноглобулина А в биоптатах двухслойным (сэндвич) методом

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 48 4.1. Анализ штаммов стрептококков группы В на присутствие

IgA-рецепторной активности

4.2. Клонирование фрагмента bac гена IgA-рецептора СГВ штамма 219/4849 и анализ клонов на способность экспрессировать рекомбинантный, функционально активный белок

4.3. Субклонирование фрагмента ДНК, содержащего ген bac и анализ экспрессии белка

4.3.1. Субклонирование фрагмента ДНК, содержащего ген IgA-рецептора

4.3.2. Клонирование фрагментов гена bac размером 500 н.п. и 700 н.п

4.4. Определение значения MLKKIE области для IgA-рецепторного белка

4.4.1. Клонирование фрагмента bac гена, ответственного за синтез

MLKKIE области

4.4.2. Получение и очистка рекомбинантного белка, содержащего

MLKKIE область, анализ антисыворотки к этому белку

4.4.3. Клонирование фрагментов гена bac, в которых нарушена последовательность, кодирующая MLKKIE и анализ рекомбинантных белков

4.5. Выделение IgA-рецепторного белка

4.6. Очистка IgA-рецепторного белка

4.7. Характеристика способности полученных рекомбинантных белков связывать IgA методами ИФА

4.8. Определение константы связывания IgA-рецепторного белка

4.9. Создание интеграционных мутантов СГВ по гену IgA-рецептора

4.10. Определение иммуноглобулина А в биоптатах, полученных людей с заболеваниями ЖКТ

4.10.1. Определение А в биоптатах методом блоттинга

4.10.2. Определение концентрации ^А в биоптатах двухслойным методом

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение области связывания IgA на рекомбинантном белке Bac стрептококка группы B»

Инфекции, вызванные стрептококками группы В, являются важной медицинской и социальной проблемой во всех странах мира. Стрептококки группы В способны вызывать тяжелейшие септические заболевания у новорожденных детей. Стрептококковая инфекция у новорожденных протекает быстро, иногда молниеносно. Летальность достигает 50-60%. Ребенок заражается в родах или еще антенатально от матери, в родовых путях которой содержится СГВ. Причиной заболеваний новорожденных становится носительство женщиной СГВ. Процент бессимптомного носительства достигает в разных странах от 30% до 50%, причем наиболее часто инфекция передается половым путем.

Кроме инфекций у детей СГВ вызывают серьезные заболевания у взрослых: пиелонефрит, артрит, эндокардит, мастит, септицемию, бронхопневмонию. Частой причиной самопроизвольного прерывания беременности также может являться инфекция СГВ. В последние годы накопились данные о способности СГВ вызывать серьезные инвазивные поражения различных органов и систем человека с 32% летальных исходов, в том числе токсические состояния и некротические фасциты.

Проблема стрептококковой патологии и детской смертности особенно остро стоит в нашей стране, где в связи с ухудшением экономической ситуации и снижением уровня жизни населения резко понизилась рождаемость. В ряде регионов страны смертность в 2-3 раза превосходит рождаемость.

Следовательно, изучение биологии и патогенных свойств стрептококков группы В актуально как с научной, так с социальной и экономической точек зрения. В настоящее время накоплена значительная информация относительно полисахаридной капсулы - основного фактора патогенности стрептококков группы В. Однако, кроме полисахаридов, СГВ продуцируют большую группу веществ белкового происхождения, таких как нуклеазы, протеазы, CAMP фактор, С5а пептидаза и др., роль которых в формировании вирулентности изучена недостаточно. В частности, на поверхности СГВ экспрессируется белок Вас, обладающий способностью связывать иммуноглобулин А человека через Fc часть молекулы. Роль этого белка в развитии инфекционного процесса, структурная организация белковой молекулы и особенности строения гена мало изучены. Однако очевидно, что в местах колонизации СГВ (влагалище, прямая кишка), где IgA превалирует в пуле иммуноглобулинов, наличие белка, связывающего IgA, биологически оправдано. Уровень IgA на слизистых и в биологических жидкостях часто указывает на общее состояние иммунной системы, а его изменение свидетельствует о возникновении серьезных заболеваний, таких как IgA нефропатии, иммунодефициты, вирусные заболевания, включая ВИЧ-инфекции. Белок, способный связывать иммуноглобулин А человека, может быть использован для определения содержания IgA в биологических секретах, а значит, представляет интерес с практической точки зрения.

Все вышесказанное определило цели и задачи настоящего исследования.

Целью работы явилось изучение рекомбинантного IgA-рецепторного белка Вас СГВ. Для этого планировалось выполнить следующие задачи:

1. Осуществить клонирование фрагмента гена IgA-рецептора СГВ и получить рекомбинантный белок Вас, обладающий IgA-рецепторной активностью.

2. Выделить и охарактеризовать рекомбинантный IgA-рецепторный белок.

3. Установить область связывания IgA на молекуле белка Вас. Для этого предполагается:

- проклонировать фрагмент ДНК, кодирующий аминокислотную последовательность MLKKIE, по предварительным исследованиям отвечающую за связывание IgA. Получить рекомбинантный белок, содержащий последовательность MLKKIE и проанализировать его на способность связывать иммуноглобулин А. осуществить сайт-специфический мутагенез области MLKKIE. Получить рекомбинантный белок с измененной областью MLKKIE и оценить его IgA связывающую способность.

4. Получить изогенные мутанты СГВ с нарушенной экспрессией гена IgA-рецептора.

5. Оценить возможность использования рекомбинантного IgA-рецепторного белка для определения иммуноглобулина А в биоптатах слизистой желудка и прямой кишки.

Научная новизна и теоретическая ценность работы.

1. Проклонирован фрагмент гена bac, кодирующий функционально активный IgA-рецепторный белок. Получен и охарактеризован иммунохимическими и биохимическими методами рекомбинантный белок Вас, обладающий IgA-рецепторной активностью.

2. Осуществлено клонирование фрагмента гена bac, ответственного за синтез аминокислотной последовательности MLKKIE. Полученный рекомбинантный белок обладает IgA-рецепторной активностью и вызывает образование антител у кроликов.

3. Путем создания генно-инженерных конструкций доказана значимость MLKKIE последовательности для проявления белком Вас функциональной IgA-рецепторной активности.

4. Впервые были сконструированы изогенные мутанты СГВ с нарушенной экспрессией белка IgA-рецептора.

5. Впервые рекомбинантный IgA-рецепторный белок был использован для определения количества иммуноглобулина А в биоптатах слизистой желудка и прямой кишки.

Практическая ценность.

Проведенные исследования позволили сконструировать штамм, продуцирующий рекомбинантный IgA-рецепторный белок, который может быть использован в клинико-лабораторной практике для определения количества иммуноглобулина А в биологических жидкостях. Полученные рекомбинанатные белки, кодируемые фрагментами гена bac и не обладающие IgA-рецепторной активностью, могут послужить основой для создания комплексных вакцин против СГВ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Проклонированная часть гена bac стрептококка группы В кодирует функционально активный IgA-рецепторный белок.

2. Аминокислотная последовательность MLKKIE, присутствующая в белке Вас действительно необходима для проявления белком Ig А связывающих свойств.

3. Рекомбинантный IgA-рецепторный белок может быть использован для определения концентрации иммуноглобулина А в биологических жидкостях.

Достоверность полученных результатов подтверждается высокой специфичностью использованных молекулярно-генетических методов (полимеразная цепная реакция, ДНК -ДНК гибридизация, секвенирование ДНК) и иммунологических методов исследования (ELISA, Western-blott анализа и т.д.), которые в совокупности позволяют однозначно трактовать полученные результаты.

Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 8 научных работах и доложены на 6 симпозиумах и конференциях: 4-ой Международной Конференции по стрептококковой генетике, Санта Фе, США, в 1994 г.; Конференции "Новые направления биотехнологии", Пущино, Россия, в 1994 г.; Международной Конференции "Биотехнология-94", Санкт-Петербург, Россия, в 1994 г.; Международной Конференции памяти акад. А.А.Баева, Москва, Россия, в 1996 г.; Международном конгрессе по клинической химии и лабораторной медицине, Флоренция, 1999 г., XIV Международном Симпозиуме по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям, Новая Зеландия, 1999 г. Материалы работы докладывались на заседаниях отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН (1996, 1997, 1998, 1999 гг.).

12

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 110 страницах машинописного текста, включающего: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, главу собственных исследований и обсуждение полученных результатов, заключение, выводы, список литературы. Работа проиллюстрирована 4 таблицами и 22 рисунками, указатель литературы содержит 131 источник, в том числе 5 отечественных и 126 иностранных.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Устинович, Ирина Анатольевна

6. ВЫВОДЫ

1. Осуществлено клонирование в гетерологичной системе E.coli фрагмента гена IgA рецептора (гена bac) стрептококка группы В, кодирующего область связывания IgA. Получен и охарактеризован хроматографически очищенный рекомбинантный белок IgA рецептора стрептококка группы В.

2. Осуществлено клонироваиние в векторную систему pQE фрагмента гена IgA рецептора, ответственного за синтез белка, содержащего последовательность MLKKIE. Выделен рекомбинантный белок, содержащий область MLKKIE и обладающий IgA рецепторной активностью. Получена антисыворотка к этому белку.

3. Доказано участие области MLKKIE белка Вас в связывании иммуноглобулина А.

4. Получены интеграционные мутанты стрептококков группы В с нарушенной экспрессией гена IgA рецептора, актуальные для более полного изучения роли IgA рецепторного белка в формировании вирулентного фенотипа микроба.

5. Показана возможность использования рекомбинантного IgA рецепторного белка для анализа содержания иммуноглобулина А в биоптатах людей с заболеваниями желудочно-кишечного тракта и мониторинга количества IgA в процессе лечения.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Стрептококки группы В являются причиной возникновения серьезных заболеваний новорожденных и взрослых людей, в первую очередь беременных женщин. Несмотря на интенсивное изучение этой бактериальной инфекции, во всем мире проблема лечения и профилактики заболеваний, вызванных стрептококком группы В, остается актуальной. Известно, что белки стрептококков группы В участвуют в формировании вирулентности, однако роль отдельных белков в формировании вирулентного фенотипа изучена недостаточно. К числу белков - факторов патогенности стрептококков группы В, относится Вас белок (Р антиген), способный связывать иммуноглобулины А через Fc часть молекулы.

Представленное исследование имело целью дополнить имеющиеся данные относительно IgA-рецепторного белка Вас стрептококков группы В. В связи с этим был поставлен ряд задач, включающих в себя клонирование рецепторного участка гена IgA-рецептора; локализацию области ДНК, кодирующей центр связывания Вас белка, ответственного за IgA связывание; выделение и использование рекомбинантного IgA-рецепторного белка в клинико-лабораторной диагностике, создание изогенных мутантов СГВ по bac гену.

Работа проводилась с использованием современных методов молекулярной генетики, иммунохимии и молекулярной микробиологии. В исследовании были применены разнообразные методы молекулярной биологии: клонирование и секвенирование, полимеразная цепная реакция, гибридизационный анализ, хроматографическая очистка белков и методы иммуноферментного анализа, инсерционный мутагенез.

С целью клонирования участка bac гена, кодирующего область связывания IgA, был выбран один из клинических штаммов СГВ, активно связывающий иммуноглобулин А . ДНК этого штамма была использована в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции. Праймеры были синтезированы на основе известной нуклеотидной последовательности bac гена штамма SB 35 [66]. Синтезированный фрагмент ДНК в размером 1,5 т.н.п. был проклонирован в систему E.coli. В результате удалось получить рекомбинантный клон E.coli, обладающий IgA-рецепторной активностью. Это свидетельствовало о том, что проклонированный фрагмент ДНК действительно содержал участок гена bac стрептококка группы В. Учитывая тот факт, что проклонированный фрагмент не имел стрептококкового промотора, было сделано заключение о том, что в данном случае транскрипция инициировалась с промотора вектора и о том, что при клонировании нам удалось попасть в рамку считывания белка. Рекомбинантный белок из этого штамма, названного JM109 р4.2, был выделен и хроматографически очищен на аффинной колонке с иммуноглобулином А. Способность очищенного белка связывать IgA была охарактеризована методами в иммуноприципитации на нитроцеллюлозных мембранах и иммуноферментного анализа. Была определена константа связывания сывороточного иммуноглобулина А рекомбинантным белком из штамма JM109 р4.2, она оказалась равной 3,7х108 М"1.

На следующем этапе были предприняты попытки субклонировать участок bac гена из плазмиды р4.2 и тем самым локализовать область, ответственную за связывание иммуноглобулина А. Два фрагмента ДНК, 700 н.п. и 500 н.п., были получены в результате рестрикции р4.2 ферментами Xbal и HindIII, а затем проклонированы в плазмидный вектор pUC 8. Рекомбинантные плазмиды названы рХ и pH, соответственно. Однако ни в одном из двух вариантов IgA-рецепторной активности обнаружить не удалось. Вероятно, из-за нарушения рамки трансляции при клонировании изменилась аминокислотная последовательность рекомбинантных белков, что привело к утрате их функциональной активности.

Область размером в 100 н.п., принадлежащая 700 н.п. вставке плазмиды рХ, была просеквенирована. Анализ нуклеотидной последовательности показал 99% гомологии с аналогичной областью bac гена штамма SB35, нуклеотидная последовательность которого опубликована ранее [66]. Этот факт дает возможность убедиться в точности выполненных операций по синтезу и клонированию фрагмента bac гена.

По-прежнему оставался открытым вопрос относительно локализации центра связывания иммуноглобулина А на молекуле Вас белка. В литературных данных была указана область Вас белка, состоящая из шести аминокислот MLKKIE, которая, по мнению отдельных авторов, играет определенную роль в связывании иммуноглобулина А [74]. Однако представленные тому доказательства не позволяют, на наш взгляд, говорить об этом со всей определенностью. Для локализации центра связывания IgA на молекуле Вас белка и выяснения значения области MLKKIE в связывании IgA было решено получить два рекомбинанатных белка, в одном из которых MLKKIE область присутствует без изменений, а в другом MLKKIE структура нарушена. С этой целью были сконструированы праймеры, позволяющие синтезировать, в первом случае, фрагмент размером 245 н.п., содержащий область, кодирующую MLKKIE. Во втором случае синтезировался 123 н.п. фрагмент с нарушенной MLKKIE последовательностью. Это достигалось за счет того, что обратный праймер соответствовал участку ДНК, кодирующему MLKKIE с двумя нуклеотидными заменами. В результате, вместо области MLKKIE должна была синтезироваться область MLKRIQ. Полученные посредством ПЦР ДНК фрагменты были проклонированы в трех рамках считывания в системе векторов pQE фирмы QIAGEN. Это обеспечивало попадание в рамку считывания белка в одном из трех вариантов. Другим достоинством этой векторной системы являлась возможность легко очищать рекомбинантные белки за счет того, что они синтезируются слитыми с пептидом, состоящим из шести гистидиновых остатков. Ni-NTA агароза, связывающая полигистидиновые остатки, позволяет высокоэффективно очищать слитые белки.

В результате клонирования фрагмента 245 н.п. в pQE 32 удалось получить рекомбинантный белок размером 14 kD, содержащий в своем составе неизмененную последовательность MLKKIE. Этот белок обладал IgA-рецепторной активностью, хотя она была нестабильной. Белок оказался иммуногенным для кроликов и вызывал образование антител. Полученная кроличья антисыворотка реагировала в иммуноблотте как с самим белком, к которому она была получена, так и с полноразмерным Вас белком, полученным HCl экстракцией СГВ, содержащием бета антиген.

Фрагмент, в котором последовательность, кодирующая MLKKIE, была нарушена, был также проклонирован в три вектора системы pQE. Однако выделить рекомбинантный белок посредством очиски на Ni-NTA агарозе не удалось, возможно, из-за его малого размера. Для получения рекомбинантного белка большего размера с измененной областью MLKKIE дополнительно был сконструирован прямой ДНК праймер, соответствующий области bac гена, находящейся на 550 н.п. с 5' конца от обратного праймера. В результате, при помощи ПЦР был синтезирован фрагмент ДНК с нарушеннной последовательностью, кодирующей MLKKIE, и также проклонирован в три плазмидных вектора системы pQE. Из штамма, содержащего pQE 30 со вставкой, удалось выделить рекомбинантный белок размером 20 kD, в котором вместо MLKKIE структуры присутствует последовательность MLKRIQ. Этот белок был проанализирован в Western-блотте и методами иммуноферменотного анализа, однако IgA-связывающей активности обнаружено не было.

Эти данные позволяют сделать заключение о том, что аминокислотная последовательность MLKKIE действительно связана с функциональной активностью белка IgAрецептора СГВ, а нарушения структуры MLKKIE ведут к утрате IgA-связывающей активности белка.

Высокая специфичность взаимодействия IgA-рецепторного белка с иммуноглобулином А человека позволила использовать очищенный рекомбинантный IgA-рецепторный белок из штамма JM109 р4.2 для детекции иммуноглобулина А в пробах биоптатов слизистой желудка и прямой кишки людей с заболеваниями ЖКТ. Были опробованы два варианта анализа биоптатов: метод блоттинга и методы ИФА. Оказалось, что использование рекомбинантного IgA-рецепторного белка в обоих вариантах анализа позволяло с высокой чувствительностью выявлять наличие иммуноглобулина А в образцах и давать количественную оценку его содержания. Использование IgA-рецепторного белка в клинической практике позволяет также следить за динамикой содержания иммуноглобулина А в органах ЖКТ больных. Данный подход может позволить в будущем осуществлять экспресс диагностику уровня иммуноглобулина А в различных биологических жидкостях для оценки клинического состояния больных или их общего иммунного статуса.

Создание изогенных мутантов имеет целью изучение вклада того или иного фактора в формирование вирулентного фенотипа стрептококков группы В. Инсерционный мутагенез позволяет получить штамм, который отличается от родительского лишь по одному признаку. Мутанты СГВ, полученные нами, не обладали IgA связывающей активностью. Для их создания потребовалось фрагмент bac гена встроить в интеграционный плазмидный вектор p7EMR, а затем трансформировать этой рекомбинантной плазмидой родительский штамм СГВ 219/4849. Рекомбинантная плазмида встроилась в хромосому по гомологии, в области bac гена, тем самым, нарушив его экспрессию. Для выяснения биологической роли Вас белка стрептококков группы В планируется провести в будущем ряд экспериментов на животных с использованием мутантов и их родительских штаммов.

95

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Устинович, Ирина Анатольевна, 2000 год

1. Беляков В.Д., Ходырев А.П., Тотолян А.А. Стрептококковая инфекция, 1978.

2. Маниатис Т., Фрич Э., Самбрук Дж. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984.

3. Ройт. А. Основы иммунологии. М: «Мир», 1991.

4. Тернер М., Ричарде Ф., Варга Дж. и др. Структура и функции антител. М.: Мир, 1993, 200с.

5. Хиатов P.M., Пинегин Б.В. Иммунная система желудочно кишечного тракта: особенности строения и функционирования в норме и при патологии. Иммунология, 1997, 5, 1-4.

6. Akerstrom В., Lindahl G., Bjorck L., Lindqvist A. Protein Arp and protein H from group A streptococci: Ig binding and dimerization are regulated by temperature. J. Immunol. 1992, 148, 3238-3243.

7. Akerstrom В., Lindguist A. and Lindahl G. Binding properties of protein Arp, a bacterial IgA-receptor. Mol. Immunol., 1991, 28, P. 249-357.

8. Akerstrom В., Lindqist A., Vander Mallen V., Grubb A., Lindahl G., Vaerman J.P. Interaction between streptococcal protein Arp and different molecular forms of human immunoglobulin A. Mol. Immunol., 1994, 5, 393-400.

9. Allison L.H., Moyle M., Shales M. and Ingles C.J. Extensive homology among the largest subunits of eukaryotic and prokaryotic RNA polymerases. Cell, 1985, 42, P. 599-610.

10. Anthony B. F., Concepcion N. F., Puentes S. M., Payne N.R. Nonimmune bindinng of human immunoglobulin A to type II group В streptococci. Infect. Immun.1990, 58 (6), 1789-95.

11. Armstrong G., Blevins A., Louria D.B., Henkel J.S., Moddy M.D., Sukany M. Group В, С and G streptjcoccal infections in a cancer hospital. Arm. N. Y. Acad. Sci., 1970, 174, 511-522.

12. Avelino C.C. and Benchetrit L.C.- Penicillin tolerance among beta-hemolytic streptococci and production of the group carbohydrates, hyaluronidase and desoxyribonucleasesc Mem.Inst.Oswaldo.Cruz., 1995,90,p 529-534.

13. Barton L.L., Feigin R.D. and Lins R. Group B beta hemolytic streptococcal meningitis in infants. J. Pediatr., 1973, 82, P. 719-721.

14. Bateman A., Eddy S.R., Chothia C. Members of the immunoglobulin superfamily in bacteria. Protein Science, 1996, 5, 1939-1941.

15. Bessen D.E. Localization of immunoglobulin A-binding sites within M or M-like proteins of groupA streptococci. Infect.Immun. 62:1968-1974, 1994.

16. Bessen D.E., Fischetti V.A. A human IgG receptor of group streptococci in associated with tissue site of infection and streptococcal class. J. Inf. Dis. 1990, 161, 747-754.

17. Bevanger L. Ibc protein as serotype markers of group B streptococci. Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand., 1983, B 91, 231-234.

18. Bevanger, L. Ibc proteins as serotype markers of group B streptococci. Acta Path. Microb. Immunol. Scand. Sect. B, 1991, P. 231-234.

19. Bimboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant DNA. Nucl. Acid. Res., 1979, 7, 1513-1523.

20. Blake M.S., Donets M., Carr D., Qi H., Tai J.Y. Identification of the IgA binding domain on group B streptococcal p antigen. Abstracts of XIII Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases, 1996.

21. Bohnsack J.F., Zhou X., Williams P.A., Cleary P.P., Parker C.J. and Hill H.R.- Purification of the proteinase from group B streptococci that inactivates human C5ac Biochim. Biophys. Acta, 1991,1079,p 222-228.

22. Boyer K.M. Neonatal group B streptococcal infections. Curr. Opin. Pediatr., 1995, 7, No.l, P. 1318.

23. Brady L.J., Boyle M.D. Identification of non-immunoglobulin A-Fc-binding forms and low-molecular-weight secreted forms of the group B streptococcal P antigen. Infect. Immun., 1989, 57, P.1573-1581.

24. Brady L.J., Hosana A., Askeland D., Tai J. Cloning of non-IgA Fc binding forms of the group B streptococcal bata antigen. Abstracts of 4th International ASM Conference on Streptococcal Genetics., 1994, P. 33.

25. Brdy L.J., Daphtary U. D., Ayub E.M., and Boyle M. D. P. Two novel antigens associated with group B streptococci identified by a rapid two stage radioimmunossay. J. Infect. Dis., 1988, 158, 965-972.

26. Cherhi G.B., Kaplan E.L., Schlievert P.M., Bitti A. and Orefici G.- First reported case of Streptococcus pyogenes infection with toxic shock-like syndrome in Italyc Eur J Clin Microbiol Infect Dis,1992,ll,p 836-838.

27. Chmourygina I., Suvorov A.N., Ferrieri P., and Cleary P.P. Conservation of the C5a peptidase genes in group A and B streptococci. Infect.Immun. 64:2387-2390, 1996.

28. Christensen K.K., Svennigsen N., Pahlader K., Ingermarsson E., Linden V. and Chrestensen P.Relation between neonatal pneumonia and maternal carrige of B streptococcic Scand. J. Infect. Dis.,1982,14,p 261-266.

29. Christie R., Atkins N.E. and Munch-Petersen E.- A note on a lytic phenomenon shown by group B streptococcic Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci.,1944,22,p 197-202.

30. Cimolai N. and Roscoe D.L. Contemporary context for early-oneset group B streptococcal sepsis of the newborn. Am. J.Perinatol. 12 No. 1:46-49, 1995.

31. Chun C.S.Y., Brady L.J., BoyleM.D.P., Dilon H.C. and Ayoub E.M .Group B streptococcal C protein-associated antigens: association with neonatal sepsisc JID,1991,163,p 786-791.

32. Cleary P.P., Kaplan E.L., Handley J.P., et al- Clonal basis for resurgence of serious Streptococcus pyogenes disease in the 1980sc Lancet, 1992,339,p 518-521.

33. Cleat P. and K.N.Timmis Cloning and Expression of the b protein gene of group B streptococci and a study of its product's binding capacity of human IgA. BIBP 1:225-232, 1990.

34. Cleat P.H. and Timmis K.N. Cloning and expression in Escherichia coli of the Ibc protein genes of group B streptococci: binding of human immunoglobulin A to the beta antigen. Infect. Immun. 1987, 55,No.5,P. 1151-1155.

35. Colman G, Efstratiou A. and Marrison D. Streptococci and related organisms, identification methods in applied and enviromental microbiology, 1992. pp. 221-249.

36. Colman G., Tanna A., Efstration A., Gaworzewska E.T. The serotypes of Streptococcus pyogenes present in Britain during 1980-1990 and their association with disease. J. Med. Microbiol., 1993, 39,165-178.

37. Cumming C.G. Group B streptococcal cell surfaces. J.Med.Microbiol. 18 No.2:151-155, 1984. 148

38. Cunniff H., Bump C.M. Extra-respiratory non-group D isolates of streptococci. Am.J.Med.Technol., 1976, 42, 195-200.

39. Curtis S.N., Krause R.M. Identification of rham nose as an antigenic determinant of group B streptococci carbohydrate. Federation Proceeding, 1964, 23, 151-155.

40. Dagert M., Ehrlich S.D. Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells. Gene, 1979, 6, 23-28.

41. Demers B., Simor A.E., Vellend H., et al- Severe invasive group A streptococcal infections in Ontario, Canada: Streptococcal Infections, 1993, pi987-1991.

42. Düben J., Jelinkova J. and Neubauer M.- Group B streptococci in the female genital tract and nosocomial colonization of newbornc Infect.Immun.,1978,23,p 89-94.

43. Dunna R.L., Wienberg A.N., Medrek T.F., Kunz L.J. Streptococcal infections. Medicine, 1969, 48, 87-127.

44. Eloy C., Handrois J.P. Aspect clinigues et biologigu es des infections humaines a streptocogue du group B. Sci.Vet.Med.comp., 1985, 87(4), 3-18.

45. Ferrieri P.- GBS infections in the newborn infant: diagnosis and tretmentc Antibiot. Chemother.,1985,35,p 211-215.

46. Ferrieri P. Neonatal susceptibility and immunity to major bacterial pathogens. Rev.Infect.Dis. 12 Suppl.4:394-400, 1990.

47. Ferrieri P. Neonatal susceptibility and immunity to major bacterial pathogens. Rev. Infect. Dis., 1990, 12, Suppl.4, P. 394-400.

48. Ferrieri P., Flores A. Surface protein expression in group B streptococcal invasive isolates. Abstracts of XIII Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases, 1996.

49. Flingold D.S., Wienberg A.N., Medrek T.F., Kunz L.J. Extra-respiratory streptococcal infections. Importance of various serological groups. N. Engl. J. Med., 1966, 275, 356-361.

50. Franciosi R.A., Knostman J.D. and Zimmerman R.A.- Group B streptococcal neonatal and infant infectionsc J. Pediatr.,1973,82,p 707-710.

51. Friquet B., Chffotte A.F., Djavadi-Chaniancel L., Goldberg M.E. J.Immunol. Meth., 1985, 77, 305319.

52. Frithz E., Heden L.O., Lindahl G. Extensive sequence homology between IgA receptor and M proteins in Streptococcus pyogenes. Mol. Microbiol., 1988, 3, 1111-1119.

53. Ganapathy M.E. and Rissing J.R. Group B streptococcal vertebral osteomyelitis bacteremia. South. Med. J., 1995, 88, No.3, P. 350-351.

54. Garland S.M. and Kelli N. Early-onse neonatal group B streptococcal sepsis: economics of various prevention strategies. Med. J. Aust., 1995,162, No.8, P. 413-417.

55. Gasc A.M., L.Kauc, P.Barraille, M.Sicard, S.Goodgal. Gene localization, size, and physical map of the chromosome of Streptococcus pneumoniae. J. Bacteriol.,1991, 173, P. 7361-7367.

56. Geourjon C. and DelCage G. Intractive and graphic coupling between multiple alignments, secondary structures prediction and motif/pattern scaning into protein sequences. Cabios 9:87-91, 1993.

57. Gomez-Rodrig, Ferreiro J.L. and Formigo E. Osteoarticular infections caused by Streptococcus agalactiae. Report of 4 cases. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., 1995, 13, P. 99-103.

58. Gravekamp C., Horensky D.S., Michel J.L., Madoff L. Variation in repeat number within the alpha C protein of group B streptococci alters antigenicity and protective epitopes. Infect. Immun., 1996, 64, P. 3576-3583.

59. Hackett S.P., Stevens D.L. Stretococcal toxic shock syndrome synthesis of tumor necrosis factor and interleukin-1 by monocytes stimulated with pyrogenic exotoxin A and streptolysin O. J.Infect. Dis., 1992, 165, 879-885.

60. Hammerschmidt S., Verheul A.F.M., Chhatwal G.C. SpsA, a novel surface protein from Streptococcus pneumoniae with specific binding to SigA and secretory component. ASM Conference on streptococcal genetics, 1998, P. 17-18.

61. Hauge M., Jaspersgaard C., Poulsen K., and Kilian M. Population structure of Streptococcus agalacttiae reveals an association between specific evolutionary lineages and putative virulence factors but not disease. Infect.Immun. 64:919-925, 1996.

62. Heden L.O., Lindahl G. Conserved and variable regions in protein Arp, the IgA receptor of Streptococcus pyogenes. J.Gen. Microbiol., 1993, 139, 2067-2074.

63. Hill H.B., Caldwell G.G., Wilson E., Hager D., Zuimmerman R.A. Epidemic of pharingits due to streptococci of Lancefield group G. Lancet., 1969, 371-374.

64. Hill H.R., Bohnsack J.F., Morris E.Z., et al- Group B streptococci inhibit the chemotactic activity of the fifth component of complemente J. Immunol., 1988,141 No.l0,p 3551-3556.

65. Holm E.S., Norrby A., Bergholm A-M. and Norgen M.- Aspects of pathogenesis of serious group A streptococcal infec- tion in Sweden, 1988-1989c JID.,1992,166,p 31-37.

66. Jahnson L., Bjorsell-Ostling E., Bonnersting J. and Holmberg h.- Streptococcal myositisc Scand J Infect Dis.,1993,24,p 661-665.

67. Jennings H.J., Katzenellenbogen C., Lugowski C. and Kasper D.L.Structure of the native polysacharide antigens of type la and type lb group B Streptococcusc Biochemistry,1993,258, p1258-1263.

68. Jerlstrom P.G., Chatwal G.S., and Timmis K.N. The Iga binding b antigen of the c protein complex of group B streptococci: sequence determination of its gene and detection of two binding regions. Molec.Microb. 5(4):843-849, 1991.

69. Jerlstrom P.G., Talay S.R., Valentin-Weigand P., Timmis K.N., and Chatwal G.S. Identification of an immunoglobulin A binding motif located in the b-antigen of the c protein complex of group B streptococci. Infect.Immun. 64:2787-2793,1996.

70. Johnson D.R., Ferrieri P. Group B streptococcal Ibc protein antigen: distribution of two determinants in wild-type strains of common serotypes. J.Clin. Microbiol., 1984, 19, P. 506-510.

71. Johnsson E., Andersson G., Lindahl G., Heden L.-O. Identification of the IgA-binding region in streptococcal protein Arp. J. Immunol., 1994, 153, 3557

72. Kawasaki E. Amplification of genomic DNA. In: PCR protocols, edited by Innis M., Geland D., Sninsky J. and White T. San Diego: Academic Press, 1990, p. 13-28.

73. Kreig N.R. and Holt J.G. Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology, Williams and Wilkins Co., 1984. pp. 1-1599.

74. Kuac L. and Goodgal S.H.- The size and physical map of the chromosome of Haemophilus parainfluenzaec Gene, 1989,83,p 377-380.

75. Kyhse-Andersen J. Elektroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid tranfer of proteins from polyacrilamid to nitrocellulose. J.Biochem. Biophys. Met., 1984, 10, 203-209.

76. Laemmli U.K. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature.(London)., 1970, 227, 680-686.

77. Lancefield R.C.- A serological differentiaion of specific type of bovine hemolityc streptococci (group B)c J. Exp. Med., 1934,59,p 441-458.

78. Lancefield R.C. A serological differentiation of human and other groups of hemolytic streptococci. J.Exp. Med., 1933, 57, 571-595.

79. Leggiadro J., Bugnitz M.C., Peck B.A., et al- Group A streptococcal bacteremia in a mid-south children's hospitalc South Med J.,1993,86,p 615-618.

80. Lindahl G., Akerstrom B. Receptor for IgA in group A streptococci: cloning of the gene and characterization of the protein, expressed in Eschericia coli. Mol. Microbiol., 1989, 3, 239-247.

81. Lindahl G., Akerstrom B., Vaerman J.-P. and Stenberg L. Characterization of an IgA receptor from group B streptococci: specificity for serum IgA. Eur. J. Immunol., 1990, 20, P.2241-2247.

82. Lowry O.H., Rosenbraugh N.J., Ferr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent. J.Mol. Biol., 1957, 193, 265-273.

83. Lumb T.M. Group B streptococcus revisited. Pediatr. Nurs., 1994, 20, No.6, P. 578-580.

84. Madoff L.C., Hori S., Michel J.L., Baker C.J., Kasper D.L. Phenotypic diversity in the alpha C protein of group B streptococci. Infect. Immun., 1991, 59, P. 2638-2644.

85. Madoff L.C., Michel J.L., Gong E.W., Rodewald A.K. and Kasper D.L.- Protection of neonetal mice from group B streptococcal infection by maternal immunization with beta C proteinc Infect.Immun.,1993,60,p 4989-4994.

86. Maeland J.A., Brakstad O.G., Bevanger L., Kvan A.I. Streptococcus agalactiae beta gene and gene product variations. J. Med. Microbiol., 1997, 46 (12), 999-1005.

87. Martin T.R., Ruzinski J.T., Rubens C.E., Chi E.Y. and Wilson C.B.- The effect of type-specific polysaccharide capsule the clearence of group B streptococci from the lungs of infant and adult ratsc J. Infect. Dis., 1992,15,p 306-314.

88. Messing J., Gronenborn B., Muller-Hill B., Hofschneider P.H. Filamentous coli phage M13 as a cloning vehicle: Insertion of a Hindll fragment of the lac regulatory region in M13 replicative form in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74, 3642-3646.

89. Michel J.L., Madoff L.C., Olson K., Kling D.E., Kasper D.L. Large, identical, tandem repeating units in the C protein alpha antigen gene, bca, of group B streptococci. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1993, 89, P. 10060-10064.

90. Muller-Adolf H., Adolf J.E. and Kohler W- Erythrogenic toxins A,B and C:occurrence of the genes and exotoxin formation from clinical Streptococcus pyogenes strains associated with streptococcal toxic shock-like syndrome J.Clin.Microbiol.,1993.

91. Nicholas W.C., Steele C. Occurrence of groupable beta-hemolytic streptococci study among school children in Bismarck N.D. J.Am. Med. Assoc., 1962, 182, 197-205.

92. Parker M.T., Ball L.C. Streptococci and aerococci associated with systematic infections in man. J.Med. Microbiol., 1976, 9, 275-309. 259.

93. Podbielski A., Blankenshtein O. and Lutticken R.Molecular characterization of the cfb gene encoding group B streptococcal CAMP-factorc FEBS Lett, 1994,235,p 262-266.

94. Podbielski A., Flosdorff A. and WeberHeynemann J.- The group A streptococcal virR49 gene controls expression of four structural vir regulon genesc Infect.Immun.,1995,63,p 9-20.

95. Pritchard D.G. and Lin B.- Group B streptococcal neuraminidase is actually a hyaluronidasec Infect.Immun., 1993,61 ,p 3234-3239.

96. Rainard P., Sarradin P., and Poutrel B. Phenotypic variability of X-protein expression by mastitis-causing Streptococcus agalactiae of serotype NT/X and opsonic activities of specific antibodies. Microb.Pathog 16 No.5:359-372, 1994.

97. Riordan F.A., Thomson A.P., Sills J.A. and Hart C.A. Bacterial meningitis in the first three months of life. Postgrad. Med. J., 1995, 71, P. 36-38.

98. Rodley P.D., Romling U. and Tümmler B.- A physical genome map of the Burkholderia cepacia type strainc Molec.Microb.,1995,17,p 57-67.

99. Roger S., Wells R., and Rechsteiner M. Amino acid sequances common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science 234:364-369, 1985.

100. Romling U., Greipel J. and Tümmler B.- Gradient of genomic deversity in the Pseudomonas aeruginosa chromosomec Molec.Microb., 1995,17,p 323-332.

101. Rubens C.E., Heggen L.M., Rachel F.H. and Wessels M.R.Identification of cpsD, a gene essential for type III capsule expression in group B streptococcic Molec.Microb.,1993,8,p 843-855.

102. Russell-Jones G.J., Gotsclich E.C. and Blake M.S.- A Surface Receptor Specific for Human IgA on Group B streptococci Posessing the Ibc Protein Antigene J.Exp.Med., 1984,160,p 14671475.

103. Schalen C. Prevalence of IgA receptors in clinical isolates of Streptococcus pyogenes and Streptococcus agalactiae: Serologic distinction between the receptors by blocking antibodies. FEMS I&M, 1993, 7, 39-46.

104. Schalen C., Christensen P., Grubb A.M., Samuelsson G., Svensson M.L. Demonstration of separate regions for human IgA and IgG in group A streptococci type 4. Acta Path. Microbiol. Scand. Sect C, 1980, 88,77-82.

105. Schlievert P.M., Gocke J.E. and Deringer J.R.- Group B streptococcal toxic shock-like syndrome: report of a case and purification of the associated pyrogenic toxinc Clin.Infect.Dis, 1993,17,p 26-31.

106. Schwartz B., Schuchat A., Oxtoby J., Cochi S.L., Hightower A. and Broome C.V.- Invasive group B Streptococcal disease in adultsc JAMA, 1991,266 No.8,p 1112-1114.

107. Stalhammer-Carlemalm M., Stenberg L. and Lindahl G.Protein rib: a novel group B streptococcal cell surface protein that confers protective immunity and is expressed by most strains causing invasive infectionsc J.Exp.Med., 1993,177,p 1593-1603.

108. Stegmayr B., Bjork S., Holm S., Nissel J., Rydvall A and Settergren B.- Septic shock induced by group A streptococcal infection: clinical and theraputical aspectsc Scand J Infect Dis.,1992,24,p 589-597.

109. Stenberg L. Genetics and Biochemistry of group A streptococcal cell surface proteins, with special reference to immunoglobulin A-binding proteins. Doctoral Thesis, Lund University, 1994.

110. Stenberg L., O'Toole P., Mestecky J., Lindahl G. Molecular characterization of protein Sir, a streptococcal cell surface protein, that binds both immunoglobulin A and immunoglobulin G. J.Biol. Chem., 1994, 269, 13458-13464.

111. Suvorov A.N., Cleary P.P. and Ferrieri P. C5a peptidase gene from group B streptococci. Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci and Enterococci, 1991, P. 230-232.

112. Takashi S., Nagano Y., Nagano N., Hayashi O., Taguchi F. and Okuwaki Y.- Role of C5a-ase resístanse to opsonophagocytic killingc Infect.Immun.,1995,63,p 4764-4769.109

113. Thern A., Stenberg L., Dahlback B., Lindahl G. Immunoglobulin-binding surface proteins of Streptococcus pyogenes also bind human C4b-binding protein (C4BP), a regulatory component of the complement system. J.Immunol., 1994,152, 2342-2349.

114. Titi G, Mancuso G. and Tomasello F.- Cytokine appearance and effects of anti tumor necrosis factor alpha antibodies in a neonetal rat model of group B streptococcal infectionc Infect.Immun., 1993,61 ,p 227-235.

115. Verburgh C.A., Hendriks W.D., Ligthart J. and Berghout A.Necrotizing fsciitis caused by group A beta-hemolytic streptococcic Ned Tijdschr Geneeskd,1993,137,p 607-609.

116. Wood T.F., Potter M.A. and Jonasson 0.- Streptococcal toxic shock-like syndrome.The importance of surgical interventionc Ann Surg., 1993,217,p 109-114.

117. Yu C-E and Ferretti J. J.- Molecular epidemiologic analysis of the type A streptococcal exotoxin (Erythrogenic toxin) gene (speA) in clinical Streptococcal pyogenes strains1.fect.Immun., 1989,57,p 3715-3719.1108. БЛАГОДАРНОСТИ