Реконструкция зачатка волосяного фолликула человека в культуре с использованием постнатальных клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат наук Калабушева, Екатерина Павловна

• Калабушева, Екатерина Павловна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Калабушева, Екатерина Павловна

Цели и задачи исследования...................................................................................7

Научная новизна и значимость работы.................................................................8

Методология исследования...................................................................................10

Положения, выносимые на защиту......................................................................11

Степень достоверности и апробация результатов..............................................11

Личный вклад автора.............................................................................................12

Э.Обзор литературных данных................................................................................13

3.1 Волосяной фолликул.......................................................................................13

3.2 Клетки дермальной папиллы в контексте дермы........................................20

3.3 Особенности клеток дермальной папиллы....................................................26

3.4 Моделирование фолликулярных взаимодействий в культуре....................32

4.Материалы и методы.............................................................................................36

4.1. Клеточные культуры....................................................................................36

4.1.1 Первичные клеточные культуры человека..........................................36

4.1.1.1 Выделение и культивирование клеток дермальной папиллы................36

4.1.1.2 Выделение и культивирование кератиноцитов.....................................36

4.1.1.3 Выделение и культивирование дермальных фибробластов..................37

4.1.1.4 Культивирование фибробластов легкого...............................................37

4.1.2 Первичная культура клеток мыши.........................................................37

4.1.2.1Выделение и культивирование клеток дермальной папиллы вибрисс мыши........................................................................................................................ 38

4.1.2.2Выделение и культивирование дермальных фибробластов мыши........38

4.1.3 Культивирование стабильных клеточных линий...................................38

4.1.3.1Культивирование Мер...............................................................................38

4.1.3.2 Культивирование ИПСК...........................................................................39

4.2. Лентивирусная трансфекция.......................................................................39

4.3. Совместное культивирование.....................................................................39

4.3.1 Кокультивирование клеток кератиноцитов с клетками дермальной папиллы или дермальными фибробластами на пластике.................................39

4.3.2 Кокультивирование кератиноцитов и клеток дермальной папиллы в системе Тгат'№е11.................................................................................................39

4.3.3 Получение агрегатов.................................................................................40

4.3.4 Совместное культивирование клеток линии Ме£7 с клетками дермальной папиллы или дермальными фибробластами..................................40

4.4. Культивирование с добавлением факторов роста, цитокинов и специализированного матрикса............................................................................41

4.5. Культивирование в гелеобразных матриксах............................................42

4.5.1 Культивирование в коллагеновом геле...................................................42

4.5.2 Культивирование в гиалуроновой кислоте.............................................42

4.5.3 Культивирование в гидрогеле..................................................................42

4.6. Культивирование клеток в провоспалительных условиях.......................42

4.7. Дифференцировка плюрипотентных клеток в направлении дермальной папиллы ................................................................................................................... 43

4.8. Определение активности щелочной фосфатазы........................................43

4.9. Иммунохимическое окрашивание..............................................................44

4.10. Выделение РНК, обратная транскрипция и ПЦР в реальном времени 47

4.11. Обработка фотографий и статистика......................................................49

5.Результаты и обсуждение......................................................................................50

5.1 Совместное культивирование клеток дермальной папиллы и кератиноцитов в двумерных условиях................................................................50

5.2 Совместное культивирование клеток дермальной папиллы и кератиноцитов в трехмерной системе.................................................................. 53

5.3 Миграция клеток дермальной папиллы в контексте взаимодействия с кератиноцитами ...................................................................................................... 60

5.4 Совместное культивирование Mcf7 и клеток дермы...................................63

4

5.5 Экспрессия специфических маркеров в смешанных агрегатах..................65

5.6 Влияние индуцирующих свойств клеток дермальной папиллы на формирование смешанных агрегатов..................................................................67

5.7 Сохранение индуцирующих свойств клеток дермальной папиллы...........69

5.8 Культивирование смешанных агрегатов в гелеобразном субстрате.........76

5.9 Определение способности клеток дермальной папиллы и дермальных фибробластов к активации в провоспалительных условиях.............................79

5.10 Получение клеток дермальной папиллы из плюрипотентных клеток.....84

6. Заключение............................................................................................................88

7.Вывод ы....................................................................................................................93

8.Список используемых сокращений......................................................................94

9. Список цитируемой литературы..........................................................................95

2.Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Реконструкция зачатка волосяного фолликула человека в культуре с использованием постнатальных клеток»

Актуальность темы исследования

Реконструкция тканевых и органных эквивалентов имеет немаловажное значение для изучения процессов дифференцировки, регенерации и взаимодействия между разными клеточными типами. Кроме того, получение гетеротипических органных моделей in vitro имеет большой потенциал в тканевой инженерии, для заместительной терапии, в моделировании заболеваний, токсикологических исследованиях, разработке лекарственных препаратов. В контексте последних открытий современной науки и медицины этот подход становится все более актуальным, однако он значительно ограничен в клеточных источниках: большая часть модельных систем разработана для клеток с высоким потенциалом дифференцировки -эмбриональных или фетальных. Для человека доступ к данным клеточным источникам затруднен. Подобные проблемы возникают при реконструкции зачатков эпителио-мезенхимных органов, таких как волосяные фолликулы, зубы, молочные железы и др. Реконструкция волосяного фолликула в культуре является наиболее перспективным направлением для подобных исследований, поскольку волосяной фолликул обладает высоким регенеративным потенциалом благодаря мезенхимному компоненту - дермальной папилле -обладающей малодифференцированным статусом и высокой паракринной активностью. Волосяной фолликул подвергается ступенчатому циклу физиологической регенерации, в ходе которого теряет, а затем восстанавливает больше половины своей структуры. Основной принцип реконструкции волосяного фолликула в культуре основан на комбинировании клеток дермальной папиллы, способных индуцировать новообразование волосяных фолликулов, и пластичных эпидермальных кератиноцитов. Исследование морфогенетического потенциала постнатальных клеток кожи и определение путей управления процессами регенерации в культуре предоставит знания об архитектуре и физиологии тканей человека, с одной стороны, и определит

будущие подходы к развитию тканевой инженерии, с другой.

6

Цели и задачи исследования

Целью исследования является определение потенциала постнатальных клеток человека к регенерации волосяного фолликула in vitro. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить условия, необходимые для инициации фолликулогенеза в культуре.

2. Охарактеризовать полученные органоиды в соответствии со стадией регенерации волосяного фолликула.

3. Определить влияние индуцирующих способностей клеток дермальной папиллы на фолликулогенез в культуре.

4. Исследовать влияние паракринных факторов и компонентов внеклеточного матрикса на формирование органоидов для определения путей регуляции морфогенеза волосяного фолликула in vitro.

5. Исследовать влияние провоспалительных факторов - TGFP и гипоксии - на клетки дермальной папиллы и дермальных фибробластов человека и мыши.

6. Определить возможность получения пациент-специфических клеток дермальной папиллы методом дифференцировки из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК).

Научная новизна и значимость работы

Впервые проведено исследование, доказывающее возможность инициации фолликулогенеза в культуре постнатальных клеток человека. Предыдущие исследования, затрагивающие проблематику регенерации волосяных фолликулов из постнатальных клеток, изучали ее либо посредством трансплантаций культивированных кератиноцитов и клеток дермальной папиллы животным с иммунодефицитом [Zheng et al, 2005, 2010], либо постулировали ограниченность морфогенетического потенциала постнатальных совместных культур [Havlickova et al, 2004, 2008]. Данный постулат возникает из-за недостатка исследований механизмов взаимодействия клеток дермальной папиллы и постнатальных кератиноцитов в культуре. Исследователи редко обращают внимание на эпителио-мезенхимные взаимодействия при регенерации волосяного фолликула in vitro, ограничиваясь морфологическими подтверждениями (структура развивающегося волосяного фолликула, продукция стержня волоса), полученными методами гистологического окрашивания. Это касается исследований по реконструкции волосяного фолликула из эмбриональных клеток мыши [Qiao et al, 2008, Ihara et al, 1991, Kageyama et al, 2017] и по получению химерных эквивалентов кожи, состоящих из клеток человека и грызунов [Qi et al, 2008, Sriwiriyanont et al, 2012, 2013]. В данной работе впервые показано, что в трехмерных условиях культивирования клетки дермальной папиллы и кератиноциты инициируют регенерацию волосяного фолликула посредством индукции анагена, что типично для неофолликулогенеза посредством индукции трансплантацией постнатальной дермальной папиллы. Активируются характерный для регенерации волосяного фолликула каскад WNT/ркатенин, повышается экспрессия маркеров фолликулярных кератиноцитов: P-кадгерина, цитокератинов 6, 75, 35, 32 и трихогиалина. По специфическому паттерну экспрессии маркеров финальная стадия развития трехмерной совместной культуры клеток дермальной папиллы и кератиноцитов соответствует зачатку волосяного фолликула. Причины

8

остановки развития трехмерных модельных систем также не были ранее изучены. Исследования в этой области косвенно указывают на низкие индуцирующие свойства постнатальных клеток дермальной папиллы [1паша1ви е1 а1, 1998, Higgiпs е1 а1, 2010, ОИуаша, е1 а1, 2012, Яепё1 е1 а1, 2008, Ло1 е1 а1, 2012, К^Ышо1о е1 а1, 2000], тем не менее, конкретных причин, как и молекулярных основ индуцирующих свойств клеток дермальной папиллы, не найдено. Данное исследование впервые показывает ключевую роль клеток дермальной папиллы в самоорганизации зачатка волосяного фолликула в культуре и демонстрирует, что снижение индуцирующих свойств клеток дермальной папиллы приводит к потере их агрегирующей способности в трехмерных условиях. В ходе работы было выявлено, что гиалуроновая кислота может компенсировать проблемы самоорганизации. Это свидетельствует об управляемости процессами морфогенеза зачатка волосяного фолликула в культуре.

Возможность получения зачатка волосяного фолликула в культуре определяет подходы к изучению механизмов регенерации волосяного фолликула т л>гл>о. Для анализа субстанций, влияющих на цикл волосяного фолликула, оптимальным объектом исследования является культура эксплантов, которая весьма трудоемка в анализе данных и способе культивирования [Ьа^ап е1 а1, 2015]. Некоторые исследователи концентрируются на влиянии профолликулярных веществ на продление времени культивирования клеток дермальной папиллы с сохранением их индуцирующих свойств [Яепё1 е1 а1, 2008, Aoi е1 а1, 2012, К^Ышо1:о е1 а1, 2000]. Тем не менее, результаты, полученные в исследованиях, произведенных с использованием культуры клеток дермальной папиллы, сложно экстраполировать на волосяной фолликул в целом. В последних исследованиях в качестве альтернативы использовали кожу, полученную из абортивного материала [Наге1 е1 а1, 2015]. Подобные работы трудновоспроизводимы ввиду сложности доступа к абортивным тканям и этических проблем.

9

Моделированный в данном исследовании зачаток продемонстрировал характеристики, типичные для регенерирующего волосяного фолликула, по ответу на внешние стимулы. Прослежена корреляция между механизмами формирования агрегата, пролиферацией и индуцирующими свойствами клеток дермальной папиллы. При этом факторы, поддерживающие клетки дермальной папиллы в культуре, но in vivo стимулирующие фазу покоя или деградации волосяного фолликула, не оказывали положительного воздействия на агрегаты. Это косвенно подтверждает, что клетки внутри зачатка взаимодействуют и отвечают на внешние сигналы как единый орган, единая модельная система, в будущем пригодная для исследований механизмов регенерации волосяного фолликула.

В 2016г работа была поддержана грантом РНФ (Проект No16-14-00204). Методология исследования

В работе использовали постнатальные клетки кожи человека: клетки дермальной папиллы и эпидермальные кератиноциты. На культуре этих клеток исследовали разные модели совместного культивирования с целью оценки маркеров фолликулогенеза методами иммуногистохимии и количественного ПЦР анализа. В качестве контроля использовали фибробласты легкого. Отдельные механизмы эпителио-мезенхимных взаимодействий были исследованы на совместных культурах клеток дермальной папиллы, дермальных фибробластов и клеток линии Mcf7. Анализ физиологической активности постнатальных клеток проводили в сравнении с клетками дермальной папиллы и дермальными фибробластами мыши в провоспалительных условиях. Оптимизировали протокол получения клеток дермальной папиллы из ИПСК.

Положения, выносимые на защиту

1. Постнатальные клетки дермальной папиллы и кератиноциты способны к инициации фолликулогенеза и формированию зачатка волосяного фолликула.

2. Для инициации фолликулогенеза необходим непосредственный контакт между клетками дермальной папиллы и кератиноцитами, нарушение этого контакта препятствует регенерации волосяного фолликула в культуре.

3. Клетки дермальной папиллы регулируют процессы самоорганизации зачатка волосяного фолликула в культуре. Снижение их индуцирующих свойств и возрастные изменения именно этой популяции клеток препятствует дальнейшему развитию волосяного фолликула.

4. Альтернативным источником получения аутологичных клеток дермальной папиллы является дифференцировка из ИПСК.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность обеспечена использованием современных методов и оборудования. Каждый эксперимент проводили со всеми надлежащими техническими и биологическими повторами. Данные, полученные в экспериментах, обрабатывали с использованием соответствующих статистических методов.

Результаты исследования представлены на конференциях:

• Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» в 2010г,

• Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2011»,

• 15й международной школе-конференции молодых ученых "Биология XXI века" в 2011г,

• На международной конференции «Epigenetic control of skin development and regeneration. First International symposium» в Брэдфорде, Великобритания, в 2011г,

• Международном молодежном научном форуме «Ломоносов-2013»,

• Международной конференции «Cell Technology Week» в Киеве, Украина, в 2013г,

• Конференции «Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии:устойчивость и вариабельность» в 2015г,

• Международной конференции «17th Meeting of the European Hair Research Society» в Тбилиси, Грузия, в 2016г,

• На конференции «Актуальные проблемы биологии развития» в 2016 и 2017гг,

• На международной конференции «47th annual meeting of European Society for Dermatological Research» в Зальцбурге, Австрия, в 2017г,

• На «III национальном конгрессе по регенеративной медицине» в 2017г,

• А также на школах молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН в 2010, 2012, 2013 и 2014 гг.

Личный вклад автора

Личным вкладом автора является тщательный анализ данных литературы, на основе которой было спроектировано исследование и подобраны подходящие методы. Автором были выделены все исследуемые культуры клеток кожи человека и мыши, разработаны методы совместного культивирования и получены результаты с использованием количественного ПЦР анализа в реальном времени и данных иммуногистохимии. Полученные данные были проанализированы автором и представлены на всероссийских и международных конференциях, а также опубликованы в рецензируемых журналах.

З.Обзор литературных данных

3.1 Волосяной фолликул

Волосяным фолликулом называют кожный дериват, продуцирующий волосяной стержень. Волосяной покров обеспечивает температурную регуляцию, защиту от повреждений, сенсорную и тактильную функции. Немаловажное значение для всех млекопитающих имеет линька - выпадение старых волосяных стержней и рост новообразованных. Процесс линьки обеспечивается циклом волосяного фолликула, процессом физиологической регенерации, в ходе которой волосяной фолликул останавливает рост волосяного стержня и деградирует, теряя большую часть тканей и структуры, что сменяется стадией сначала покоя, а затем роста: регенерацией фолликула и продуцированием нового волосяного стержня.

Волосяной фолликул состоит из эпителиальных и мезенхимных компонентов. Эпителиальный компартмент можно условно разделить на две части: стабильную и циклирующую (Рис. 1). К стабильной относится верхняя часть волосяного фолликула - воронка и перешеек, к циклирующей можно отнести нижнюю часть, волосяную луковицу, которая подвергается преобразованию после каждой фазы деградации. Граница между воронкой и перешейком находится на уровне сальной железы. Примерно в этой же области прикрепляется мышца, поднимающая волос, а также располагается пул эпителиальных стволовых клеток - балдж. Волосяная луковица состоит из пролиферирующих клеток матрикса волоса и пигментных клеток -меланоцитов. Во время каждой фазы роста стволовые клетки мигрируют из области балдж по направлению к дермальной папилле, восстанавливая популяцию клеток матрикса [Ио е1 а1, 2002]. Пролиферируя, клетки волосяной луковицы поднимаются вверх, прекращают деление и дифференцируются в направлении стержня волоса или внутреннего корневого влагалища. Их окружает наружное корневое влагалище, образованное прогениторными

клетками [Cotsarelis, 2006, Legue, Nicolas, 2005]. Стержень волоса состоит из 3х слоев: кутикулы, кортекса и медуллы. Кутикула стержня волоса контактирует с кутикулой внутреннего корневого влагалища, позволяя стержню продвигаться вверх по мере роста и удерживая его в фолликуле.

медулла кортекс волоса кутикула волоса

кутикула внутреннего корневого влагалища

слой Гексли

слой Генле

наружное корневое влагалище

базальная мембрана меланоциты со еденнтельнотканная оболочка

клетки матрикса

базальная мембрана дермальная папилла

Рисунок 1. Строение волосяного фолликула. А) Макроструктура волосяного фолликула. Б) Структура волосяной луковицы. Егёо^ап, 2017, с модификациями

ТИП I медулла Тип II

Рисунок 2. Экспрессия цитокератинов в волосяной луковице. Langbein et al, 2010., с

модификациями

Между собой эпителиальные слои волосяного фолликула отличаются не только морфологически, но и по экспрессии промежуточных филаментов -цитокератинов. Цитокератины по своей структуре делят на 2 типа: к типу I относят кислые цитокератины, к типу II - основные. Кератины формируют гетеротипические комплексы и продуцируются парно в каждом специфическом слое эпителия. Их экспрессия является признаком дифференцировки в определенный тип эпителиальных клеток. В интерфолликулярном эпидермисе наблюдается четкая стратификация: в базальном слое экспрессируются цитокератины 5 и 14, для шиповатого характерны 1 и 10 [Moll et al, 2008]. В волосяном фолликуле также наблюдается высокоспецифичная экспрессия цитокератинов в каждом слое [Langbein et al, 2010] (Рис. 2). Наиболее часто используемыми для определения дифференцированных кератиноцитов волосяного фолликула являются кератины 6 и 75.

Развитие волосяного

фолликула начинается с реципрокного взаимодействия

развивающегося эпидермиса и подлежащей мезенхимы (Рис.3). Мышь имеет 3 генерации волосяных фолликулов. На Е14.5 формируются первые плакоды остевых волосяных фолликулов, которые составляют всего 1-5% от шерстяного покрова взрослой мыши. Данные волосяные фолликулы наиболее крупные, стержни, которые они продуцируют, самые длинные. К Е16.5 протекает вторая волна образования плакод, которые в

Рисунок 3. Схема морфогенеза и цикла волосяного фолликула. Schneider et al, 2009, с модификациями

будущем формируют шиловидные и пуховые волосяные фолликулы, которые составляют примерно 20% всех волосяных фолликулов. Финальная волна формирования плакод приходится на E18.5, которые развиваются в зиг-заг волосяные фолликулы, которые составляют основную массу волосяных фолликулов [Schlake, 2007]. Процесс формирования волосяных фоллкиулов у человека все еще изучен недостаточно хорошо ввиду проблематичности доступа к эмбриональному материалу. На 12-14 неделе эмбрионального развития человека наблюдаются сформированные плакоды волосяных фолликулов [Gay et al, 2015].

Основными регуляторами развития являются члены семейств WNT, EDA, FGF и BMP, которые продуцируются в строгом порядке различными компартментами развивающегося волосяного фолликула.

К настоящему времени остается открытым вопрос источника первичного сигнала, инициирующего формирование волосяных фолликулов. В постнатальном организме млекопитающего индуцирующим компонентом, отвечающим за регионализацию кожи, является дерма, в эмбриогенезе ее роль является спорной. Первые исследования, затрагивающие вопрос индуцирующего сигнала, основывались на рекомбинации дермы и эпидермиса кожи на разных сроках развития и с разных частей тела [Kollar 1970, Dhouailly 1973]. На основании таких экспериментов возникла классическая гипотеза инициации развития волосяного фолликула, в которой первичный сигнал исходит из дермы к недифференцированному эпидермису, что приводит к формированию плакоды [Millar, 2002, Hardy, 1992]. При этом для этой гипотезы к настоящему моменту все еще не найдены обоснования молекулярных механизмов. Альтернативная гипотеза предполагает, что инициирующий сигнал исходит из эпидермиса. WNT сигналлинг является первым детектируемым в эпидермисе [Chen et al, 2012]. Секретируемые белки WNT предположительно вызывают дермальный ответ [Zhang et al, 2009, Chen et

al, 2012], который приводит к возникновению иллюзорного «первичного дермального стимула», необходимого для индукции волосяного фолликула [Millar, 2002, Hardy, 1992, Schneider et al, 2009]. Закладка волосяных фолликулов и формирование плакод подчиняется диффузной модели Тьюринга, что говорит о четкой детерминации в эпидермисе [Sick et al, 2006, Stark et al, 2007, Maini et al, 2006]. Сформированная плакода стимулирует подлежащие фибробласты к формированию дермального конденсата, предшественника дермальной папиллы. Конденсат взаимодействует с эпителиальной плакодой, приводя к пролиферации и росту зачатка [Millar, 2002].

Известны каскады, обеспечивающие конденсацию фибробластов и поддержание дальнейшего развития волосяного фолликула, тем не менее, единственного эпителиального сигнала, стимулирующего формирование волосяного фолликула, также не обнаружено. Решающий и главнейший стимул инициации морфогенеза будет найден с накоплением данных.

WNT является ключевым каскадом в инициации волосяного фолликула [Alonso, Fuchs, 2003, Amerongen, Nusse, 2009]. Отсутствие LEF1, транскрипционного фактора каскада WNT/ßкатенин, приводит к рудиментарному формированию молочных желез, зубов и волосяных фолликулов [Genderen et al, 1994]. Некоторые исследования показывают, что оверэкспрессия LEF1 в эпидермисе приводит к скученности волосяных фолликулов и формированию эктопических фолликулов в других эпителиальных тканях [Zhou et al, 1995]. Трансгенные мыши с экспрессией репортерных белков, активирующихся посредством сигналлинга WNT, позволили подробнее изучить паттерн закладки волосяных фолликулов [Zhang et al, 2009, Gupta, Fuchs 1999]. Было показано, что формирование волосяных фолликулов посредством белков WNT определяется не только эпидермисом, но и дермой: дермальные клетки, окружающие волосяной фолликул, синтезируют DKK1, ингибитор WNT сигналлинга [Sick et al, 2006, Reddy et al, 2001,

Monaghan et al, 1999]. DKK4 синтезируется плакодами первичных волосяных фолликулов и вместе с белками BMP участвует в закладке вторичных и третичных волосяных фолликулов [Cui et al, 2010].

WNT сигналлинг активирует EDA/EDAR каскад в эпидермисе. EDA является лигандом семейства TNF, который стимулирует активацию NF-kB [Headon, Overbeek, 1999, Mikkola et al, 1999, Schmidt-Ullrich et al, 2001]. Лиганд EDA синтезируется повсеместно в эпидермисе, в то время как рецептор EDAR специфичен только для плакод [Laurikkala et al, 2002, Zhang et al, 2009]. Это позволяет предположить, что каскад EDA/EDAR/NF-kB скорее направлен на дальнейшую дифференцировку эпидермиса, чем дермы, и отвечает за спецификацию плакоды. EDA запускает экспрессию WNT10b в плакоде [Zhang et al, 2009] и DKK4 в дерме [Bazzi et al, 2007, Cui et al, 2010, Schmidt-Ullrich et al, 2006]. Исследования трансгенных мышей с нокаутом EDA показывают, что его мишенями являются дермальные BMP4/7 и эпидермальные ингибиторы BMP сигналлинга [Mou et al, 2006].

BMP сигналлинг имеет скорее ингибирующую роль в развитии волосяного фолликула. BMP рецептор BMPR1a и BMP2 экспрессируются в эпидермальной части развивающегося волосяного фолликула. BMP4 характерен для дермального конденсата [Bitgood, McMahon 1995]. NOGGIN, ингибитор BMP сигналлинга, экспрессируется в том же компартменте; баланс между активирующими и ингибирующими сигналами регулируют дальнейшую дифференцировку эпидермиса на этой стадии развития [Botchkarev et al, 1999]. Ингибирование BMP сигналлинга посредством оверэкспрессия NOGGIN приводит к формированию избыточных плакод [Plikus et al, 2004], в то же время нокаут NOGGIN тормозит развитие волосяных фолликулов [Botchkarev et al, 1999, Botchkarev et al, 2002].

Помимо WNT, BMP и EDA каскадов значительную роль играет FGF

сигналлинг. FGF20 активируется WNT и EDA сигналлингом, отвечает за

18

регуляцию конденсации фибробластов и формирования дермальной папиллы [Huh et al, 2013].

Клетки плакоды пролиферируют и дифференцируются, за счет чего зачаток волосяного фолликула удлиняется и проникает глубже в дерму. Углубление эпителиального зачатка происходит за счет смены экспрессии молекул межклеточных контактов. E-кадгерин в эпидермисе замещается на P-кадгерин [Samuelov et al, 2012]. Также в этот процесс у человека вовлечен CD 133, который позволяет заместить E-кадгерин [Gay et al, 2015]. На этой стадии наиболее важными являются члены семейств SHH и PDGF. SHH впервые экспрессируется в развивающейся плакоде, затем его экспрессия поддерживается в растущей волосяной луковице [Bitgood, McMahon, 1995]. Рецептор SHH Patched экспрессируется и в дерме, и в эпидермисе [Karlsson et al, 1999]. Нокаут SHH приводит к остановке развития волосяного фолликула на стадии зачатка [Jacques et al, 1998, Chiang et al, 1999], причем только нокаут сигналлинга SHH в дерме, но не эпидермисе, приводит к фенотипу, соответствующему полному нокауту SHH, что говорит о высокой важности дермального сигналлинга. В таких фолликулах снижается экспрессия дермальных факторов: WNT5a и PDGFRa [Reddy et al, 2001, Karlsson et al, 1999].

PDGFRa экспрессируется повсеместно в дерме до формирования плакод, позже его экспрессия ограничивается дермальным конденсатом и дермальной папиллой [Karlsson et al, 1999].

Как только волосяной фолликул формируется целиком, он вступает в цикл физиологической регенерации. Цикл состоит из 3 стадий: анаген, стадия роста, катаген, стадия деградации, и телоген, стадия покоя. В течение катагена нижняя часть волосяного фолликула подвергается апоптозу, структура луковицы упрощается до эпителиального тяжа, соединяющего область балдж и

дермальную папиллу. Ключевым фактором инициации катагена является FGF5.

19

Мутация в гене FGF5, ангора, приводит к росту чрезвычайно длинных волосяных стержней [Hébert et al, 1994]. К другим факторам, поддерживающим переход к катагену, являются TGFßl, интерлекин 1ß, нейротрофины NT-3, NT-4 и BDNF, BMP2/4 и TNFa [Stenn, Paus, 2001]. Рецептор витамина D3 также является важнейшим регулятором перехода к стадии деградации. Он взаимодействует с репрессором транскрипции Hairless и рецептором ретиноевой кислоты. У мышей, имеющих мутации в этих регуляторных белках, разрушается эпителиальная часть волосяного фолликула и разрывается контакт с дермальной папиллой [Bikle et al, 2006, Panteleyev et al, 1998, Palmer et al, 2008]. Далее следует стадия телогена. Телоген можно разделить на 2 фазы по чувствительности к стимулам перехода к анагену [Plikus et al, 2008]. Нечувствительная фаза характеризуется высоким содержанием ВМР2/4, в то время как к началу компетентной фазы их количество снижается. Снижение BMP2/4 замещается растущей экспрессией WNT. Активность WNT сигналлинга возрастает к началу анагена [Paus, Foitzik, 2004].

В течение фазы телогена расстояние между областью балдж и дермальной папиллой значительно сокращается. По мере накопления активирующих стимулов, клетки балдж начинают пролиферировать и формировать транзиторные клетки, которые мигрируют в сторону дермальной папиллы, где впоследствии будет сформирован пул прогениторных клеток матрикса. За счет их пролиферации и дифференцировки волосяного фолликула увеличивается в размерах, дермальная папилла удаляется от области балдж, восстанавливается структура волосяного фолликула.

3.2 Клетки дермальной папиллы в контексте дермы

Дерма - соединительнотканная часть кожи, располагающаяся под эпидермисом, от которого отделяется базальной мембраной. Дерма состоит из двух слоев: папиллярного и ретикулярного. Важнейшей функцией дермы

является регуляция процессов дифференцировки и пролиферации кератиноцитов.

Папиллярный слой располагается ближе к поверхности шириной 300-400 мкм в зависимости от возраста и расположения в организме. В верхней части он организован в тяжи, которые называют сосочками дермы, в которые вплетаются нервные окончания и сосуды микрососудистого русла, необходимые для питания и иннервации эпителия [Афанасьев, 1999]. Именно папиллярный слой определяет рисунок кожи человека [Mine et al, 2008].

Ретикулярный слой более толстый, состоит из плотной волокнистой неоформленной соединительной ткани [Быков, 2007]. Ретикулярный слой содержит крупные пучки коллагеновых волокон, организующих плотную сеть, строение которой определяется функциональной нагрузкой [Афанасьев, 1999, Montagna, Carlisle 1979]. В процессе старения ретикулярный слой увеличивается в толщину и замещает истончающийся папиллярный слой [Mine et al, 2008].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Калабушева, Екатерина Павловна, 2018 год

Использовали схему

эксперимента, указанную выше.

После 3 суток культивирования

при помощи окрашивания на

пан-цитокератин, обнаружили,

что при совместном

культивировании

кератиноцитов и клеток

дермальной папиллы,

кератиноциты формировали

отдельные островки, в то время

как на поверхности

фибробластов кератиноциты Рисунок 13. Совместное культивирование клеток

кератиноцитов с клетками дермальной папиллы распространялись с тенденцией или дермальными фибробластами. Масштабный

отрезок 200 мкм. Флуоресцентная микроскопия. ф°рмир°ваТЪ пласт (Рис. 13).

Вероятно, клетки дермальной папиллы ускоряли процессы дифференциации и гибели коммитированных кератиноцитов, в отличие от фибробластов, которые поддерживают рост подобной культуры

5.4 Совместное культивирование Mcf7 и клеток дермы

Врастание мезенхимных клеток в эпителиальный пласт возможно только в патологических ситуациях в организме при формировании опухолей. Рак-ассоциированные фибробласты мигрируют в область формирования опухоли, вызывая ее метастазирование (Рис.14). Метастазирование обусловлено эпителио-мезенхимным переходом клеток опухоли, для которого требуется непосредственный контакт между опухолевыми клетками и фибробластами [Knuchel et al, 2015]. С целью поиска общих черт между поведением рак-ассоциированных фибробластов и клеток дермальной папиллы сравнили поведение клеток Mcf7 при совместном культивировании с клетками дермальной папиллы или дермальными фибробластами.

Рисунок 14. Стимуляция роста опухоли посредством миграции рак-ассоциированных фибробластов. Schauer et al, 2011, с модификациями

Mcf7 - это линия клеток аденокарциномы молочной железы. Агрегаты,

сформированные клетками Mcf7, помещали на поверхность конфлуэнтного

63

монослоя клеток дермальной папиллы или дермальных фибробластов и оценивали экспрессию транскрипционного фактора Snail, регулирующего эпителио-мезенхимный переход. Клетки дермальной папиллы увеличивали экспрессию Snail в агрегатах Mcf7 по сравнению с эффектом, оказанным дермальными фибробластами, или с контролем (Рис. 15).

Рисунок 15. Совместное культивирование агрегатов Mcj7 с клетками дермальной папиллы или дермальными фибробластами. Масштабный отрезок 100мкм. Флуоресцентная микроскопия.

Вероятно, клетки Ые17, как и опухолевые клетки в организме, находятся в метастабильном состоянии на грани эпителио-мезенхимного перехода. Однако, сигналлинг, стимулирующий дифференцировку эпидермальных кератиноцитов, данные клетки воспринимали как стимул к эпителио-мезенхимному переходу, а не к поддержанию эпителиального состояния.

Как при взаимодействии клеток дермальной папиллы с кератиноцитами, так и при их взаимодействии с клетками Mcf7,ключевую роль оказывал непосредственный контакт. Для осуществления такого типа взаимодействия сигнальные молекулы должны быть либо поверхностными, либо компонентами внеклеточного матрикса, заякоренными на мембране. Компоненты матрикса в этом случае являются более предпочтительными кандидатами, поскольку клетки дермальной папиллы продуцируют высокоспецифический набор этих молекул. Некоторые из них обладают значительными сигнальными свойствами, например R-спондин, агрекан и другие [Richardson et al, 2008]. Учитывая важность специфического матрикса для самоорганизации этих клеток в агрегаты, можно предположить, что именно ему отводится ключевая роль в механизмах неофолликулогенеза посредством индукции клеток дермальной папиллы.

5.5 Экспрессия специфических маркеров в смешанных агрегатах

Провели тщательный анализ экспрессии специфических маркеров клеток дермальной папиллы и кератиноцитов в смешанных агрегатах методом иммуногистохимии (Рис.16). Клетки дермальной папиллы экспрессировали специфические компоненты внеклеточного матрикса версикан и ламинин V. Не наблюдалось маркеров интерфолликулярного дифференцированного эпидермиса: лорикрина, кератина 1 и 10. Следовательно, в агрегатах интерфолликулярные кератиноциты меняли направление дифференцировки с ороговевающего многослойного эпидермиса на фолликулярный тип.

Внешний слой трабекулы кератиноцитов был положителен по кератинам 5 и 6. Паттерн экспрессии этих кератинов был близок к подобному в регенерирующем волосяном фолликуле, где кератин 6 находится в слое, который в большей степени прилежит к дермальной папилле, в то время как кератин 5 характерен для внешнего слоя регенерата [Higgins et al, 2013].

Экспрессия этих цитокератинов свидетельствует о высокой специализации клеток в структуре агрегата.

Версикан

• т ш

Кератин 1

Кератин 6

г- Г е . -

Кератин 5

»у

Кератин 10 1*1

СБ44 о

А к '9 А

> • т м»

Рисунок 16. Анализ экспрессии маркеров волосяного фолликула в смешанных агрегатах. Конфокальная микроскопия. Масштабный отрезок 100мкм. Ядра докрашены Т0Т03 и

омдз.

Клетки дермальной папиллы и кератиноциты были позитивны по маркеру СЭ44 - рецептору гиалуроновой кислоты. На поверхности клеток дермальной папиллы обнаружили особые образования - микровилли, которые были СЭ44

положительны. Наличие подобных образований свидетельствовало о формировании микровезикул - особого вида сигналлинга между клетками.

5.6 Влияние индуцирующих свойств клеток дермальной папиллы на формирование смешанных агрегатов

Индуцирующими свойствами клеток дермальной папиллы называют их способность стимулировать формирование новообразованных волосяных фолликулов после трансплантации под эпидермис. В культуре индуцирующие свойства клеток дермальной папиллы снижаются при пассировании, что также сопряжено со снижением экспрессии специфических маркеров [Home et al., 1986; Lichti et al., 1993; Weinberg et al., 1993]. Использовали клетки 1 и 12 пассажей для получения смешанных агрегатов, чтобы исследовать влияние индуцирующих свойств на их формирование и морфологию, предварительно подтвердив значительное снижение синтеза специфических маркеров, версикана и щелочной фосфатазы, в культуре клеток дермальной папиллы к 12 пассажу (Рис.17).

Использование клеток дермальной папиллы 12 пассажа приводило к уменьшению размеров агрегатов (Рис. 18, а, в). При этом разница в размерах была обусловлена механизмами формирования агрегатов: крупные агрегаты получались при формировании одного агрегата на одну висячую каплю, в то время как клетки 12 пассажа формировали 5-6 мелких агрегатов. С уменьшением размеров наблюдалось значительное падение пролиферации как у клеток дермальной папиллы, так и у кератиноцитов (Рис.18,б). Различий в экспрессии специфических маркеров не было обнаружено.

На первый взгляд, снижение количества пролиферирующих клеток в агрегатах могло являться следствием меньшего количества клеток в агрегате в целом. Тем не менее, в то время как размер агрегатов снижался примерно в 3 раза при использовании клеток дермальной папиллы поздних пассажей,

уровень пролиферации падал более чем в 10 раз. Поскольку определение уровня пролиферации производили в расчете на агрегат, уменьшение количества К167 положительных клеток можно считать независимым процессом.

Уменьшение размера агрегатов также подтверждало, что сам процесс их формирования регулировался именно клетками дермальной папиллы, а не эпидермальными кератиноцитами, и зависел от их индуцирующих свойств.

версикан щелочная фосфатаза

Рисунок 17. Экспрессия специфических маркеров клеток дермальной папиллы пассажа 1 (верхний ряд) и пассажа 12 (нижний ряд). Масштабный отрезок для окраски на версикан -200 мкм, для окраски на щелочную фосфатазу - 500 мкм. При окраске на версикан ядра докрашены БЛПФлуоресцентная и световая микроскопия.

Рисунок 18. Получение смешанных агрегатов с использованием клеток дермальной папиллы позднего пассажа. а) Размер агрегатов, полученных из клеток дермальной папиллы 1 и 12 пассажей, б) Количество пролиферирующих клеток на 1 агрегат .ДП - клетки дермальной папиллы, КЦ - кератиноциты. * - статистически значимое значение при р<0,05, MannWhitney test,. в)агрегаты, полученные с использованием клеток дермальной папиллы пассажей 1 и 12. Масштабный отрезок 500^м. Световая микроскопия.

5.7 Сохранение индуцирующих свойств клеток дермальной папиллы

Существует несколько подходов к продлению срока культивирования клеток дермальной папиллы с сохранением их идентичности. Добавление факторов роста, цитокинов, специфических матриксов позволяет продлить

время культивирования без потери экспрессии специфических маркеров, с сохранением агрегирующих способностей и индуцирующих свойств.

На основании данных научной литературы были выбраны для анализа следующие факторы: BMP6, витамин D3, FGF20, вальпроевая кислота, WNT3a, WNT5a и DKK1. WNT каскад является ключевым в морфогенезе и регенерации волосяного фолликула. WNT3a показал положительный результат на клетках дермальной папиллы [Kishimoto et al, 2000] за счет активации канонического каскада WNT/ркатенин. WNT5a и вальпроевая кислота показывали положительную динамику в подобных исследованиях за счет инициации неканонического WNT каскада [Kishimoto et al, 2000, Jo et al, 2013, Lee et al, 2012]. DKK1 использовали в качестве ингибитора пути WNT.

Цикл регенерации волосяного фолликула регулируется не только членами суперсемейства WNT, но и TGFp. Среди них наилучшие результаты были получены при использовании BMP6 [Rendl et al, 2008] и витамина D3, который активирует сигналлинг TGFP2 [Aoi et al, 2012]. FGF20 в эмбриогенезе стимулирует конденсацию фибробластов и формирование дермальной папиллы [Huh et al, 2013], его влияние на постнатальные клетки не изучено.

При монослойном культивировании клеток дермальной папиллы было отмечено повышение экспрессии щелочной фосфатазы и версикана под воздействием BMP6, витамина D3 и вальпроевой кислоты (Рис.19).

версикан Щелочная фосфатаза версикан Щелочная фосфатаза

Рисунок 19. Влияние факторов паракринного сигналлинга и их аналогов на экспрессию специфических маркеров клеток дермальной папиллы. Масштабный отрезок для окраски на версикан - 200мкм, для окраски на щелочную фосфатазу - 500 мкм. При окраске на версикан ядра докрашены БЛПФлуоресцентная и световая микроскопия.

Исследовали влияние компонентов внеклеточного матрикса дермальной папиллы на экспрессию специфических маркеров. Были выбраны компоненты, присутствующие в волосяном фолликуле in vivo. Использовали несколько протеогликанов: агрекан, бигликан, фибронектин, и хондроитин сульфат. Также оценивали влияние гиалуроновой кислоты и коллагена I, присутствующих в коже повсеместно. В качестве компонентов базальной мембраны использовали матригель. Ни один из исследуемых компонентов матрикса в значительной степени не увеличивал экспрессию специфических маркеров (Рис.20).

Рисунок 20. Влияние компонентов внеклеточного матрикса и их аналогов на экспрессию специфических маркеров клеток дермальной папиллы. Масштабный отрезок для окраски на версикан - 200мкм, для окраски на щелочную фосфатазу - 500мкм. При окраске на версикан ядра докрашены БЛПФлуоресцентная и световая микроскопия.

Поскольку поддержание необходимого уровня пролиферации клеток дермальной папиллы было важно для формирования полноценных агрегатов, анализировали влияние факторов паракринного сигналлинга и компонентов внеклеточного матрикса на пролиферацию (Рис. 21).

Рисунок 21. Влияние факторов паракринного сигналлинга (а) и компонентов внеклеточного матрикса на пролиферацию клеток дермальной папиллы в культуре. * -статистически значимое значение прир<0,05, Mann-Whitney test.

Несмотря на то, что BMP6, витамин D3 и вальпроевая кислота сохраняли фенотип клеток дермальной папиллы в течение долгого времени, ни один из исследуемых факторов не повышал уровень пролиферации. Более того, вальпроевая кислота значительно подавляла этот процесс. В то же время компоненты ВКМ агрекан, бигликан, фибронектин и гиалуронан в значительной степени стимулировали пролиферацию.

Исследовали влияние факторов паракринного сигналлинга и компонентов матрикса на формирование агрегатов (Рис. 22). Их действие на агрегаты отличалось от такового на монослойной культуре. Факторы паракринного сигналлинга не оказывали влияния на размеры агрегатов. Вальпроевая кислота, FGF20 и DKK1 значительно подавляли пролиферацию, и для остальных факторов наблюдалась подобная тенденция. Таким образом, в результате эпителио-мезенхимных взаимодействий агрегат отвечает на воздействие внешнего сигналлинга комплексно. Большинство факторов, поддерживающих клетки дермальной папиллы в культуре, в цикле волосяного фолликула продуцируются на стадии деградации или покоя. Вероятно, с этим было сопряжено торможение развития агрегатов (Рис. 22,а). Добавление большей части исследуемых компонентов внеклеточного матрикса препятствовало формированию полноценных агрегатов. Хондроитин сульфат не блокировал этот процесс, но не оказывал стимулирующего воздействия на формирование агрегатов. Гиалуронан оказывал значительное стимулирующее влияние, под его воздействием наблюдалось повышение пролиферации и увеличение размеров агрегатов более чем в 3 раза (Рис. 22,б). Субстрат играет значительную роль в процессах самоорганизации органоидов. Важны его физические качества, такие как плотность и вязкость, и возможность рецепторного взаимодействия и адгезии к такому субстрату [Cerchiari et al, 2015, Lou, Leung, 2017]. Учитывая, что гиалуроновая кислота не оказывала влияние на индуцирующие свойства клеток дермальной папиллы, вероятно, значительный положительный эффект опосредован стимуляцией процессов самосборки агрегатов.

74

Рисунок 22. Получение смешанных агрегатов в присутствии факторов паракринного сигналлинга и компонентов внеклеточного матрикса. А) Влияние факторов паракринного сигналлинга на пролиферацию клеток внутри агрегатов, б) влияние гиалуроновой кислоты на пролиферацию клеток внутри агрегатов (слева) и размер агрегатов (справа). ДП -клетки дермальной папиллы, КЦ - кератиноциты. * - статистически значимое значение при р<0,05, Mann-Whitney test. в) агрегаты, полученные при добавлении гиалуроновой кислоты. Масштабный отрезок - 500 мкм. Световая микроскопия.

5.8 Культивирование смешанных агрегатов в гелеобразном субстрате

Смешанные агрегаты культивировали в течение 14 суток, но не обнаруживали признаков дальнейших морфогенетических процессов. Причиной остановки развития зачатка волосяного фолликула могло служить отсутствие специфического матрикса, в который клетки могли заякориться и продолжить рост. Коллагеновый субстрат является одним из наиболее известных носителей, пригодных для формирования искусственных эквивалентов кожи, поэтому его использовали в качестве гелевого компонента для культивирования агрегатов (Рис.23).

а 1 сутки 3 сутки

Рисунок 23. Культивирование смешанных агрегатов в коллагеновом геле. А) внешний вид агрегатов сразу после помещения в коллагеновый гель (масштабный отрезок 500 мкм) и на 3 сутки культивирования (масштабный отрезок 500 мкм). Световая и флуоресцентная микроскопия, б) экспрессия версикана мигрирующими клетками дермальной папиллы. Масштабный отрезок 200 цм. Флуоресцентная микроскопия.

Агрегаты помещали в коллагеновый гель перед его застыванием. На третьи сутки культивирования агрегатов наблюдалась активная миграция клеток дермальной папиллы из агрегата, что выявлялось по экспрессии ЯБР (Рис. 23, а). Увеличения эпителиальной части не наблюдалось. При окраске геля на специфический маркер клеток дермальной папиллы версикан было обнаружено, что по мере миграции клетки теряют его экспрессию (Рис. 23, б). Следовательно, коллагеновый гель способствовал выходу клеток дермальной папиллы из трехмерного состояния, что нарушало эпителио-мезенхимные взаимодействия в агрегате.

Так как гиалуроновая кислота стимулировала формирование агрегатов, были использованы матриксы на основе гиалуронового геля. В качестве более плотного субстрата был использован гидрогель, в качестве полужидкого - 0,1% гель гиалуроновой кислоты. В гиалуроновой кислоте культивировали как сформированные агрегаты, так и суспензию клеток, с целью оценки возможности формирования и длительного культивирования агрегатов в отсутствии стимулирующего фактора гравитации (Рис. 24).

3 суток

10 суток

20 суток

30 суток

40 суток

о

си И

2 я £

= ¡" Й

О О и

с. =; и

5 I Ё

О сЗ

я е-

о о

& з

ч 5

•М

Ч ! ** * V V ч5

ЩтШ Ш «И?

Рисунок 24. Культивирование агрегатов в гелеобразных субстратах на основе гиалуроновой кислоты. Флуоресцентная и световая микроскопия. Масштабный отрезок 200 мкм

Гели на основе гиалуроновой кислоты препятствовали миграции клеток дермальной папиллы в толщу, что поддерживало эпителио-мезенхимные взаимодействия в агрегатах. Тем не менее, ни в одном из исследуемых условий к 40 суткам не было обнаружено признаков последующего морфогенеза.

Разительно отличалась динамика соотношения клеток дермальной папиллы и кератиноцитов в агрегатах с увеличением времени культивирования. В плотном геле клетки дермальной папиллы обрастали эпителиальную часть по поверхности агрегата, в то время как в более жидком геле количество клеток значительно снижалось. В агрегатах, культивируемых в полужидком геле, на 40 сутки клетки дермальной папиллы практически исчезали. Интересно, что при использовании клеточной суспензии происходило формирование агрегатов с хорошо узнаваемой морфологией. В системе «висячая капля» клетки адгезировали под воздействием гравитации, в гиалуроновом геле гравитация не являлась главной действующей силой. При этом срок культивирования у таких агрегатов был значительно дольше, чем у тех, которые были помещены в гель уже в сформированном состоянии. Вероятно, решающим фактором являлось наличие гиалуронана в момент сборки агрегата. Однако, в отличие от аналогов, полученных в системе «висячая капля», такие агрегаты были значительно меньшего размера. Разница между плотным и полужидким гелями объяснялась различиями в адгезивных свойствах. Гидрогель содержит небольшое количество коллагена I типа, что, вероятно, стимулировало процесс миграции, в отличие от полужидкого геля гиалуроновой кислоты. Результаты эксперимента с коллагеновым гелем показали, что миграция клеток дермальной папиллы пагубно сказывается на эпителио-мезенхимных отношениях внутри агрегатов. Следовательно, более предпочтительным оказывается гиалуроновый матрикс, причем его добавление желательно до формирования агрегатов. Вероятно, для созревания такого фолликула его лучше трансплантировать в состоянии зачатка.

5.9 Определение способности клеток дермальной папиллы и дермальных фибробластов к активации в провоспалительных условиях

Снижение морфогенетического потенциала клеток дермальной папиллы может быть сопряжено с возрастом доноров кожи. Органоиды, продуцирующие волосяной стержень, успешно формируются из эмбриональных клеток [Qiao et al, 2008, Ihara et al, 1991, Kageyama et al, 2017], следовательно, одной из причин задержки развития агрегатов на стадии зачатка волосяного фолликула может быть утрата способности клеток дермальной папиллы поддерживать необходимый пролиферативный уровень или отвечать на внешние стимулы. Одним из характерных признаков физиологической активности клеток дермы является их активация в провоспалительных условиях [Simpson et al, 2009, 2010, Midgley et al, 2014]. Активация фибробластов - процесс, приводящий к формированию миофибробластов, клеток, отвечающих за контракцию раны и синтез интерстициальных коллагенов, необходимых для формирования рубца. Интересно, что снижение способностей к активации у фибробластов от возрастных доноров связано со снижением сигналлинга и продукции гиалуронана [Simpson et al, 2009, 2010, Midgley et al, 2014]. Поскольку исследования поведения клеток дермальной папиллы в гипоксии ранее не проводились, в качестве дополнительной исследуемой группы взяли дермальные фибробласты для нормализации результатов. Исследовали поведение клеток дермальной папиллы и дермальных фибробластов в провоспалительных условиях: в гипоксии (1% кислорода) и под воздействием TGFpi. Иммуногистохимический анализ не выявил увеличения экспрессии маркеров миофибробластов, гладкомышечного актина (aSMA) и SM22a (Рис.25).

Рисунок 25. Экспрессия маркеров миофибробластов у клеток дермальной папиллы и дермальных фибробластов в провоспалительных условиях. Масштабный отрезок для окраски аБМЛ - 100 мкм, для окраски БМ22а - 200 мкм. Флуоресцентная микроскопия.

Далее был исследован ответ клеток на экспериментальные условия на экспрессию факторов, индуцируемых гипоксией (ИТ 1, НШ2), коллагена I типа и гладкомышечного актина методом количественного ПЦР анализа. Отличий между экспериментальными группами обнаружено не было (Рис. 26).

Рисунок 26. Экспрессия факторов, индуцируемых гипоксией, и маркеров миофибробластов у клеток дермальной папиллы и дермальных фибробластов в провоспалительных условиях. Ось ординат - экспрессия, нормализованная на GAPDH. * - статистически значимое значение прир<0,05, Mann-Whitney test.

Из данных литературы известно, что клетки дермальной папиллы мыши обладают большим морфогенетическим потенциалом в сравнении с клетками человека ^ et al, 2008, Sriwiriyanont et al, 2012, 2013]. Поместили клетки дермальной папиллы и дермальные фибробласты мыши в аналогичные условия. TGFp стимулировал распластывание клеток и формирование фибрилл гладкомышечного актина и SM22. Гипоксия в значительной степени усиливала этот процесс. Ответ дермальных фибробластов на провоспалительное воздействие был значительно более выраженным по сравнению с клетками дермальной папиллы (Рис. 27).

Рисунок 27. Экспрессия маркеров миофибробластов у клеток дермальной папиллы и дермальных фибробластов мыши в провоспалительных условиях. Масштабный отрезок 100 мкм. Флуоресцентная микроскопия.

В результате количественного ПЦР анализа (Рис.28) было показано возрастание экспрессии обоих факторов, индуцируемых гипоксией, в дермальных фибробластах. Для клеток дермальной папиллы было характерно повышение экспрессии HIF2, в то время как синтез HIF1 снижался. Вероятно, преобладание HIF2 в гипоксии объясняется происхождением клеток дермальной папиллы из нервного гребня: для большинства дериватов этой структуры специфична регуляция этим фактором. TGFß стимулировал

экспрессию HIF1 в нормоксии у дермальных фибробластов, что соотносится с данными литературы [McMahon et al, 2006], однако подавлял синтез HIF1 и HIF2 при низком содержании кислорода. В сочетании с растущей экспрессией коллагена и гладкомышечного актина можно предположить, что TGFß стимулирует их дифференцировку в миофибробласты. Падение экспрессии специфического маркера монослойной культуры клеток дермальной папиллы, гладкомышечного актина, в сочетании с повышением синтеза коллагена свидетельствует о дифференцировке в направлении дермальных фибробластов под воздействием TGFß нормальных условиях. Гипоксия, вероятно, также индуцирует аналогичную дифференцировку, поскольку под воздействием TGFß клетки дермальной папиллы демонстрируют поведение, типичное для фибробластов.

Рисунок 28. Экспрессия факторов, индуцируемых гипоксией, и маркеров миофибробластов у клеток дермальной папиллы и дермальных фибробластов мыши в провоспалительных

условиях. Ось ординат - экспрессия, нормализованная на GAPDH.

статистически

значимое значение прир<0,05, Mann-Whitney test.

Таким образом, клетки кожи мыши отвечали на провоспалительное воздействие дифференцировкой в миофибробласты в отличие от клеток человека. Активация фибробластов регулируется транскрипционными факторами HIF1 и HIF2, активность которых значительно снижена у дермальных клеток человека. Недавние исследования показали, что фибробласты дермы юных доноров (средний возраст 25 лет) способны реагировать на провоспалительное воздействие повышением синтеза HIF1 [Zhao et al, 2017]. Следовательно, снижение синтеза этих факторов у клеток человека является именно возрастным изменением. Данные транскрипционные факторы регулируют морфогенетические, регенеративные и многие другие важнейшие процессы. Отсутствие их экспрессии может являться причиной остановки развития зачатка волосяного развития в культуре.

Прослеживается корреляция между высоким морфогенетическим потенциалом клеток мыши [Qi et al, 2008, Sriwiriyanont et al, 2012, 2013] и их ответом на условия воспаления. Отсутствие способности к активации у клеток человека в сочетании с остановкой развития зачатка волосяного фолликула свидетельствует о значительных изменениях в физиологической активности клеток. Вероятно, клетки дермальной папиллы не способны реагировать не только на провоспалительные агенты, но и на остальные морфогенетические факторы, которые потенциально исходят от кератиноцитов при формировании агрегата. Стоит отметить, что подобные нарушения влияют на развитие агрегатов, но не на ранние процессы инициации фолликулогенеза, которыми управляют клетки дермальной папиллы в смешанных агрегатах.

5.10 Получение клеток дермальной папиллы из плюрипотентных клеток

Избежать проблем возрастных изменений клеток дермальной папиллы и сохранить возможность использования аутологичного материала можно дифференцировки клеток из ИПСК.

Клетки дермальной папиллы человека волосистой части головы в эмбриогенезе образуются из нервного гребня, на этом основан протокол получения клеток дермальной папиллы из плюрипотентных. ИПСК культивировали на неадгезивном субстрате, в результате чего формировались нейросферы. После помещения нейросфер на сорбированный матригель формировались нейральные розетки, из которых происходила миграция клеток нервного гребня (Рис.29).

Рисунок 29. Получение клеток нервного гребня из ИПСК. А) схема рабочего протокола. Бщрт et а1, 2010, с модификациями. Б) морфология культуры ИПСК, нейросфер и клеток нервного гребя. Световая микроскопия. Увеличение 100х

Проанализировали экспрессию специфических маркеров плюрипотентных клеток (Рис. 30, а), нейроэпителия (Рис. 30, б) и нервного гребня (Рис. 30, в) на разных стадиях дифференцировки методом количественного ПЦР анализа.

Экспрессия маркеров плюрипотентности значительно снижается уже на этапе формирования нейросфер, за исключением БОХ2, который регулирует формирование нервной ткани в эмбриогенезе. Его отчасти можно отнести к нейроэпителиальным маркерам, как РАХ6 и К-кадгерин. К нейроэпителиальным стадиям относятся нейросферы и нейральные розетки, на

которые и приходится повышение синтеза специфических маркеров. Маркеры нервного гребня начинают проявляться на стадии нейральных розеток, когда наступает активная миграция нейральных прогениторных клеток (SOX10, ITGA4, PAX7). Таким образом, подтвердили, что получили культуру клеток нервного гребня.

Рисунок 30. Экспрессия маркеров плюрипотентности (а), нейроэпителия (б) и нервного гребня (в) на разных стадиях дифференцировки клеток нервного гребня. Ось ординат -экспрессия, нормализованная на GAPDH. * - статистически значимое значение при р<0,05, Mann-Whitney test.

К настоящему моменту остаются неизвестными механизмы дифференцировки клеток дермальной папиллы из клеток нервного гребня. Опубликованный протокол [Gnedeva et al, 2015] предполагает подбор определенного вида сыворотки для последующей дифференцировки. Это

является значительным недостатком данного подхода. Затруднения вызывает коммитированность полученной культуры к дифференцировке в нейральном направлении. Мы оптимизировали протокол, заменив оригинальный состав дифференцирующей среды на Neural Induction Kit. Этот компонент является частью коммерческой двухступенчатой системы по дифференцировке нейральных клеток. Его применяют для поддержания прогениторного статуса клеток, позволяя продлить время культивирования, избегая терминальной дифференцировки. При использовании такого подхода все три исследуемых сыворотки продемонстрировали сходные результаты. Спустя 3 недели дифференцировки наблюдалось повышение экспрессии специфических маркеров фибробластов и клеток дермальной папиллы (Рис.31). Таким образом, модификация получения клеток нервного гребня избавила от затруднений при получении клеток дермальной папиллы. Это позволит в дальнейшем продолжить исследования в контексте применения клеток дермальной папиллы.

Рисунок 31. Получение клеток дермальной папиллы из клеток нервного гребня. Масштабный отрезок 100 мкм

6. Заключение

Реконструкция волосяного фолликула в культуре необходима как с прикладной, так и с фундаментальной точки зрения. Развитие методов регенеративной медицины сейчас направлено на поиск подходов к заместительной терапии аутологичными эквивалентами тканей и органов. В случае волосяного фолликула целью является коррекция проблем алопеций. Самой распространенным видом алопеции является андрогенная алопеция, от которой страдает более половины мужчин старше 50 лет и около 40% женщин старше 70 лет [Norwood 1975, 2001]. Некоторые виды алопеций имеют аутоимунные причины появления, они часто проявляются у детей и подростков, что может приводить к психологическим заболеваниям [Castelo-Soccio, 2014, Qi, Garza, 2014].

Множество исследовательских групп сосредоточено на разработке гетеротипических органоидов, развивающихся в волосяной фолликул после трансплантации подкожно [Qiao et al, 2008, Ihara et al, 1991, Kageyama et al, 2017]. Результаты их исследований впечатляют, однако такие исследования ограничены применением клеток эмбрионов мыши. Для создания аутологичных зачатков волосяного фолликула человека такие методы не пригодны ввиду отсутствия источников эмбриональных клеток. С подобными трудностями сталкиваются исследователи, занимающиеся разработкой зачатков зуба в культуре [Oshima et al, 2011, Ikeda et al, 2009, Ono et al, 2017]. После нескольких неудачных результатов при реконструкции зачатка волосяного фолликула из постнатальных клеток исследователи ограничили область применения этих органоидов анализом и тестированием лекарственных средств [Havlickova 2004,2009]. Исследователи не ставили перед собой задачу поиска причин потери морфогенетического потенциала постнатальных клеток, поэтому применение клеток взрослого человека в исследованиях или

клинических практиках в настоящий момент ограниченно ввиду отсутствия научной базы. Целью данной работы было восполнение этого пробела.

В данной работе впервые показано, что постнатальные клетки кожи человека способны к инициации регенерации волосяного фолликула в культуре. Более того, гетеротипические органоиды успешно проходят несколько стадий развития: кератиноциты в смешанных агрегатах экспрессируют маркеры, типичные для как для эпителиальной плакоды, так и регенерирующего волосяного фолликула (Рис. 32).

* Л •

% * ДО» Яр ♦ /......

Lef 1

Г'». ' '

Р Cadherin

Д -

» .

»•. -Г

-ч*

Кератпнб

V Кератпн 5

Higgins et al, 2013

Сау е1 а1, 2015

Рисунок 32. Сравнение морфологии смешанных агрегатов с данными литературы. а) экспрессия маркеров плакоды, справа - развивающийся волосяной фолликул человека (Gay et а1, 2015), б) Экспрессия маркеров регенерирующего волосяного фолликула. Справа - новообразование волосяного фолликула после трансплантации агрегата дермальной папиллы под эпидермис (Higgins et а1, 2013).

Зачаток волосяного фолликула на модели смешенного агрегата формируется путем самоорганизации. Самоорганизация типична для клеточных

89

культур различных трубчатых органов, например, слюнных и молочных желез [Cerchiari et al, 2015, Lou, Leung, 2017]. Хотя эпидермальные кератиноциты способны к формированию структур, напоминающих эпителиальную часть волосяного фолликула [Chermnykh et al, 2010], мезенхимному компартменту всегда отводили управляющую роль в этих процессах, однако детали регуляции неогенеза волосяного фолликула не были ясны. В ходе работы было установлено, что клетки дермальной папиллы регулируют размер сформированного зачатка и уровень пролиферации клеток. Прослеживается четкая зависимость между данными параметрами агрегатов и индуцирующими свойствами клеток дермальной папиллы. Эксперименты по совместному культивированию кератиноцитов, Mcf7 и клеток дермальной папиллы косвенно указывают на природу индуцирующего сигнала: вероятно, клетки дермальной папиллы регулируют сборку агрегатов посредством молекул внеклеточного матрикса.

Снижение индуцирующих свойств клеток дермальной папиллы, приводящее к потере способности формировать полноценные агрегаты, можно компенсировать добавлением гиалуроновой кислоты. Гиалуроновая кислота также является компонентом внеклеточного матрикса волосяного фолликула. В течение морфогенеза дермальный конденсат экспрессирует рецептор гиалуронана CD44, при этом зрелая дермальная папилла прекращает его синтез [Underhill, 1993]. В смешанных агрегатах клетки дермальной папиллы были положительны по этому маркеру, что также подтверждает морфогенетические процессы, происходящие в органоидах. С другой стороны, это объясняет успешность применения гиалуроновых субстратов при долговременном культивировании агрегатов. Вероятно, они более близки по составу и свойствам матриксу эмбриональной кожи, что способствует регенерации волосяного фолликула [Agren et al, 1997].

Стоит отметить, что клетки внутри смешанных агрегатов реагируют комплексно, как органоид. На это косвенно указывают результаты тестирования факторов, поддерживающих идентичность клеток дермальной папиллы при монослойном культивировании. ВМР6, витамин D3 и вальпроевая кислота увеличивают индуцирующие свойства и экспрессию специфических маркеров клеток дермальной папиллы. При культивировании агрегатов в присутствии данных факторов ожидаемым эффектом было увеличение размера агрегатов и клеточной пролиферации. Однако BMP6 и витамин D3 в течение цикла волосяного фолликула оказывают тормозящий эффект на регенерацию этого органа. Смешанные агрегаты реагировали подобно волосяному фолликулу, поэтому положительных изменений отмечено не было.

После прохождения нескольких стадий развития рост агрегатов останавливался. Исследование реакции клеток дермальной папиллы на воспалительные агенты показало одну из возможных причин этой остановки. Клетки дермы взрослого человека оказались не способны к ответу на внешние стимулы, вероятно, поэтому они не могут поддерживать эпителио-мезенхимные взаимодействия с кератиноцитами агрегата. Можно предположить, что для развития волосяного фолликула в культуре клеткам дермальной папиллы необходимо два уровня сигналлинга. Первый -поверхностный, необходимый для регуляции процессов самоорганизации, второй - рецепторный, важный для взаимодействия с эпидермальными кератиноцитами. Клетки дермальной папиллы постнатальной кожи человека сохраняют первый тип, но теряют второй.

Кандидатами на управление второй ступенью сигналлинга являются транскрипционные факторы HIF1 и HIF2. Роль этих факторов в формировании органотипических трехмерных культур не изучена, но данные, полученные с использованием линий раковых клеток, показывают, что сигналлинг этих факторов стимулирует рост и пролиферацию опухолевых сфероидов [Hubert et

al, 2016, Xue, Shah, 2013]. Изучение функций этих транскрипционных факторов может решить проблему невозможности реконструкции эпителио-мезенхимных органоидов из постнатальных клеток.

С другой стороны, подобных осложнений можно избежать путем использования клеток, полученных из ИПСК. Модернизированный протокол получения клеток дермальной папиллы сделал этот способ более воспроизводимым и доступным. В случае успешной реконструкции волосяного фолликула с использованием ИПСК этот метод можно будет применить и на других органных эквивалентах, что позволит использовать аутологичный материал в регенеративной медицине и фундаментальных исследованиях.

7.Выводы

1. Для инициации фолликулогенеза в культуре постнатальных клеток необходим непосредственный контакт между эпидермальными кератиноцитами и клетками дермальной папиллы. Органоиды формируются путем самоорганизации, нарушение этого процесса останавливает развитие агрегатов.

2. В трехмерных условиях культивирования постнатальные кератиноциты и клетки дермальной папиллы человека формируют органоиды, морфологически соответствующие зачатку волосяного фолликула.

3. Клетки дермальной папиллы регулируют процессы самоорганизации при формировании зачатка волосяного фолликула. С уменьшением индуцирующих свойств клеток дермальной папиллы нарушаются процессы образования агрегатов и снижается уровень пролиферации клеток.

4. Гиалуроновая кислота, как внеклеточный матрикс, способствует процессам самоорганизации при формировании органоидов. Увеличиваются размеры органоидов, время их культивирования, а также повышается интенсивность пролиферации клеток.

5. Клетки дермальной папиллы и дермальные фибробласты постнатальной кожи человека не реагируют на провоспалительное микроокружение, в то время как дермальные фибробласты мыши дифференцируются в миофибробласты под воздействием гипоксии и TGFp. Впервые показано, что клетки дермальной папиллы мыши дифференцируются в направлении дермальных фибробластов в исследуемых условиях.

6. Модифицирован протокол получения клеток дермальной папиллы из ИПСК. Поддержание прогениторного статуса клеток нервного гребня снижает вероятность дифференцировки в нейральном направлении и способствует дифференцировке в направлении клеток дермальной папиллы.

8.Список используемых сокращений

1. МСК - мезенхимные стромальные клетки.

2. ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка.

3. ИПСК - индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.

4. PBS - Phosphate buffered saline, фосфатный солевой буфер.

5. PFA - paraformaldehyde, параформальдегид.

6. RFP - Red Fluorescent Protein, красный флуоресцентный белок.

7. BMP - Bone Morphogenetic Protein, белок морфогенеза кости.

8. FGF - Fibroblasts Growth Factor, фактор роста фибробластов.

9. DKK - Dickkopf, диккопф.

10. TGFp - Transforming growth factor beta, трансформирующий фактор роста бета.

11. aSMA -Alpha Smooth Muscle Actin,альфа гладкомышечный актин.

12. HIF - Hypoxia Inducible Factor, фактор, индуцируемый гипоксией.

13. PDGF - Platelet-Derived Growth Factor, тромбоцитарный фактор

роста.

14. BDNF - Brain-Derived Neurotrophic Factor, нейротропный фактор

роста.

15. EGF - Epidermal Growth Factor, эпидермальный фактор роста.

16. ДП -дермальная папилла.

17. КЦ - эпидермальные кератиноциты.

18. ТСНН - трихогиалин

9. Список цитируемой литературы

1. Афанасьев, Ю.И. Гистология / Ю.И. Афанасьев, Н.А. Юрина, Б.В. Алешин, Я.А. Винников, Г.С. Катинас, Е.Ф. Котовский, А.И. Радостина, В.Э. Торбек, Ю.С. Ченцов-М.:Медицина, 2002.-744 С.

2. Быков, В.Л. Частная гистология человека / В.Л. Быков - СПб.:Сотис, 2007. - 520 С.

3. Киселева, Е.В. Сравнение дифференцировочных потенций фибробластоподобных клеток стромы костного мозга, жировой ткани, волосяного сосочка и фибробластов дермы человека / Е.В. Киселева, Э.С. Чермных, Е.А. Воротеляк, А.И. Воложин, А.В. Васильев, В.В. Терских. // Цитология. - 2009 - Т.51 - С.12-19.

4. Agren, U.M. Developmentally programmed expression of hyaluronan in human skin and its appendages / U.M. Agren, M. Tammi, M. Ryynänen, R. J. Tammi // Invest Dermatol. - 1997 - V. 109 - P. 219-224.

5. Almeida, H. Human scalp dermal papilla and fibrous sheath cells have a different expression profile of matrix metalloproteinases in vitro when compared to scalp dermal fibroblasts / H. Almeida, P. Zigrino, F. Müller, T. Krieg, B. Korge, C. Mauch // Arch Dermatol Res. - 2005 - V. 297 - P.121-126.

6. Alonso, L. Stem cells in the skin: waste not, Wnt not / L. Alonso, E. Fuchs // Genes Dev. - 2003 - V. 17 - P.1189-1200.

7. Amerongen, R. Towards an integrated view of Wnt signaling in development / R. Amerongen, R. Nusse // Development. - 2009 - V. 136 - P. 3205-3214.

8. Aoi, N.1a,25-dihydroxyvitamin D3 modulates the hair-inductive capacity of dermal papilla cells: therapeutic potential for hair regeneration / N. Aoi, K. Inoue, T. Chikanishi, R. Fujiki, H. Yamamoto, H. Kato, H. Eto, K. Doi, S. Itami, S. Kato, K. Yoshimura // Stem Cells Translational Medicine. - 2012 - V.1 - P. 615-626.

9. Armstrong, M.T. Growth factor modulation of the extracellular matrix / M.T. Armstrong, P.B. Armstrong // Exp Cell Res. - 2003 - V. 288 - P. 235-245.

10. Barry, F. Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow: differentiation-dependent gene expression of matrix components / F. Barry, R.E. Boynton, B. Liu, J.M. Murphy // Exp Cell Res. - 2001 - V. 268 - P. 189-200.

11. Bayreuther, K.. Human skin fibroblasts in vitro differentiate along a terminal cell lineage / K. Bayreuther, H.P. Rodemann, R. Hommel, K. Dittmann, M. Albiez, P.I. Francz // Proc Natl Acad Sci. - 1988 - V. 85 - P. 5112-5116.

12. Bazzi, H. The Wnt inhibitor, Dickkopf 4, is induced by canonical Wnt signaling during ectodermal appendage morphogenesis/ H. Bazzi, K.A. Fantauzzo, G.D. Richardson, C.A. Jahoda, A.M. Christiano // Dev Biol. - 2007 - V. 305. - P. 498-507.

13. Bikle, D.D. Development and progression of alopecia in the vitamin D receptor null mouse / D.D. Bikle, H. Elalieh, S. Chang, Z. Xie, J.P. Sundberg J // Cell Physiol. - 2006 - V. 207 - P. 340-353.

14. Bin, S. BMP-7 attenuates TGF-ß1-induced fibroblast-like differentiation of rat dermal papilla cells / S. Bin, H.D. Li, Y.B. Xu, S.H. Qi, T.Z. Li, X.S. Liu, J.M. Tang, J.L. Xie // Wound Repair Regen. - 2013 - V. 21 - P. 275-281.

15. Bitgood, M.J. Hedgehog and Bmp genes are coexpressed at many diverse sites of cell-cell interaction in the mouse embryo / M.J. Bitgood, A.P. McMahon // Dev Biol. - 1995 - V. 172 - P.126-138.

16. Bobis, S. Mesenchymal stem cells: characteristics and clinical applications / S. Bobis, D. Jarocha, M. Majka // Folia Histochem Cytobiol. - 2006 - V.44 - P.215-230.

17. Botchkarev, V.A. Noggin is a mesenchymally derived stimulator of hair-follicle induction / V.A. Botchkarev, N.V. Botchkareva, W. Roth, M. Nakamura, L.H. Chen, W. Herzog, G. Lindner, J.A. McMahon, C. Peters, R. Lauster, A.P. McMahon, R. Paus // Nat Cell Biol. - 1999 - V. 1 - P.158-164.

18. Botchkarev, V.A. Modulation of BMP signaling by noggin is required for induction of the secondary (nontylotrich) hair follicles / V.A. Botchkarev, N.V.

Botchkareva, A.A. Sharov, K. Funa, O. Huber, B.A. Gilchrest // J Invest Dermatol. -2002 - V. 118 - P. 3-10.

19. Botchkarev, V.A. Molecular control of epithelial-mesenchymal interactions during hair follicle cycling / V.A. Botchkarev, J. Kishimoto // J Investig Dermatol Symp Proc - 2003 - V.8 - P.46-55.

20. Bratka-Robia, C.B. Primary cell culture and morphological characterization of canine dermal papilla cells and dermal fibroblasts / C.B. Bratka-Robia, G. Mitteregger, A. Aichinger, M. Egerbacher, M. Helmreich, E. Bamberg // Vet Dermatol - 2002 - V. 13 - P. 1-6.

21. Castelo-Soccio, L. Diagnosis and management of alopecia in children / L. Castelo-Soccio // Pediatr Clin North Am. - 2014 - V. 61 - P. 427-442.

22. Cerchiari, A.E. A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity / A.E. Cerchiari, J.C. Garbe, N.Y. Jee, M.E. Todhunter, K.E. Broaders, D.M. Peehl, T.A. Desai, M.A. LaBarge, M. Thomson, Z.J. Gartner // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2015 - V. 112 - P. 2287-2292.

23. Chan, C.C. A Two-Stepped Culture Method for Efficient Production of Trichogenic Keratinocytes / C.C. Chan, S.M. Fan, W.H. Wang, Y.F. Mu, S.J. Lin // Tissue Eng Part C Methods - 2015 - V. 21 - P. 1070-1079.

24. Chen, D. Dermal beta-catenin activity in response to epidermal Wnt ligands is required for fibroblast proliferation and hair follicle initiation / D. Chen, A. Jarrell, C. Guo, R. Lang, R. Atit // Development. - 2012- V. 139- P.1522-1533.

25. Chermnykh, E.S. Dermal papilla cells induce keratinocyte tubulogenesis in culture / E.S. Chermnykh, E.A. Vorotelyak, K.Y. Gnedeva, M.V. Moldaver, Y.E. Yegorov, A.V. Vasiliev, V.V. Terskikh // Histochem Cell Biol. - 2010 - V. 133 - P. 567-576.

26. Chiang, C. Essential role for Sonic hedgehog during hair follicle morphogenesis / C. Chiang, R.Z. Swan, M. Grachtchouk, M. Bolinger, Y. Litingtung, E.K. Robertson, M.K. Cooper, W. Gaffield, H. Westphal, P.A. Beachy, A.A. Dlugosz // Dev Biol. - 1999 - V. 205 - P.1-9.

27. Clavel, C.Sox2 in the dermal papilla niche controls hair growth by fine-tuning BMP signaling in differentiating hair shaft progenitors / C. Clavel, L. Grisanti, R. Zemla, A. Rezza, R. Barros, R. Sennett, A.R. Mazloom, C.Y. Chung, X. Cai, C.L. Cai, L. Pevny, S. Nicolis, A. Ma'ayan, M. Rendl // Dev Cell. - 2012 - V. 23 - P. 981-994.

28. Cotsarelis, G. Epithelial stem cells: a folliculocentric view / G. Cotsarelis // J. Invest Dermatol. - 2006 - V. 126 - P. 1459-1468.

29. Cui, C.Y. Dkk4 and Eda regulate distinctive developmental mechanisms for subtypes of mouse hair / C.Y. Cui, M. Kunisada, Y. Piao, V. Childress, M.S. Ko, D. Schlessinger // PloS one. - 2010 - V. 5 - P. 10009.

30. Dhouailly, D. Dermo-epidermal interactions between birds and mammals: differentiation of cutaneous appendages / D. Dhouailly // J Embryol Exp Morph. -1973 - V.30 - P. 1-18.

31. Driskell, R.R. Hair follicle dermal papilla cells at a glance / R.R. Driskell, C. Clavel, M. Rendl, F.M. Watt // J Cell Sci. - 2011 - V. 124 - P. 1179-1182.

32. Driskell, R.R. Sox2-positive dermal papilla cells specify hair follicle type in mammalian epidermis / R.R. Driskell, A. Giangreco, K.B. Jensen, K.W. Mulder, F.M. Watt // Development. - 2009 - V. 136 - P. 2815-2823.

33. Driskell, R.R. Clonal growth of dermal papilla cells in hydrogels reveals intrinsic differences between Sox2-positive and -negative cells in vitro and in vivo / R.R. Driskell, V.R. Juneja, J.T. Connelly, K. Kretzschmar, D.W. Tan, F.M. Watt // J Invest Dermatol. - 2012 - V. 132 - P. 1084-1093.

34. Driskell, R.R. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair / R.R. Driskell, B.M. Lichtenberger, E. Hoste, K. Kretzschmar, B.D. Simons, M. Charalambous., S.R. Ferron, Y. Herault, G. Pavlovic, A.C. Ferguson-Smith, F.M. Watt // Nature. - 2013 - V. 504 - P. 277-281.

35. Driskell, R.R. Understanding fibroblast heterogeneity in the skin / R.R. Driskell, F.M. Watt // Trends Cell Biol. - 2015 - V. 25 - P. 92-99.

36. Enshell-Seijffers, D. The serine protease Corin is a novel modifier of the Agouti pathway / D. Enshell-Seijffers, C. Lindon, B.A. Morgan // Development. -2008 - V. 135 - P. 217-225.

37. Erdogan, B. Anatomy and Physiology of Hair / B. Erdogan - InTech, 2017. -373P.

38. Fassina, L. Use of a gelatin cryogel as biomaterial scaffold in the differentiation process of human bone marrow stromal cells / L. Fassina, E. Saino, L. Visai., M.A. Avanzini., M.G. Cusella De Angelis, F. Benazzo, S. Van Vlierberghe, P. Dubruel, G. Magenes // Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. - 2010 - V. 2010 - P. 247-250.

39. Feng, M. Versican targeting by RNA interference suppresses aggregative growth of dermal papilla cells / M. Feng, G. Yang, J.Wu // Clin Exp Dermatol. -2011 - V. 36 - P. 77-84.

40. Fernandes, K.J. A dermal niche for multipotent adult skin derived precursor cells / K.J. Fernandes, I.A. McKenzie, P. Mill, K.M. Smith, M. Akhavan, F. Barnabe-Heider, J. Biernaskie, A. Junek, N.R. Kobayashi, J.G. Toma, D.R. Kaplan, P.A. Labosky, V. Rafuse, C.C. Hui, F.D. Miller // Nat Cell Biol. - 2004 - V. 6 - P. 10821093.

41. Gao, F. Hyaluronan oligosaccharides promote excisional wound healing through enhanced angiogenesis / F. Gao, Y. Liu, Y. He, C. Yang, Y. Wang, X. Shi, G. Wei // Matrix Biol. - 2010 - V. 29 - P. 107-116.

42. Gao, J. Laminin-511 is an epithelial message promoting dermal papilla development and function during early hair morphogenesis / J. Gao, M.C. DeRouen, C.H. Chen, M. Nguyen, N.T. Nguyen, H. Ido, K. Harada, K. Sekiguchi, B.A. Morgan, J.H. Miner, A.E. Oro, M.P. Marinkovich // Genes Dev. - 2008 - V.22 -P.2111-2124

43. Gay, D.L. CD133 expression correlates with membrane beta-catenin and E-cadherin loss from human hair follicle placodes during morphogenesis / D.L. Gay,

C.C. Yang, M.V. Plikus, M. Ito, C. Rivera, E. Treffeisen, L. Doherty, M. Spata, S.E. Millar, G. Cotsarelis // J Invest Dermatol. - 2015 - V. 135 - P. 45-55.

44. Genderen, C. Development of several organs that require inductive epithelialmesenchymal interactions is impaired in LEF-1-deficient mice / C. Genderen, R.M. Okamura, I. Fariñas, R.G. Quo, T.G. Parslow, L. Bruhn R. // Grosschedl. Genes Dev. - 1994 - V. 8 - P. 1-14.

45. Gnedeva, K. Derivation of hair-inducing cell from human pluripotent stem cells / K. Gnedeva, E. Vorotelyak, F. Cimadamore, G. Cattarossi, E. Giusto, V.V. Terskikh, A.V. Terskikh // PLoS One. - 2015 - V. 10 - P. :e0116892.

46. Gupta, R. Multiple roles for activated LEF/TCF transcription complexes during hair follicle development and differentiation / R. Gupta, E. Fuchs // Development -1999 - V. 126 - P. 4557-4568.

47. Hakenjos, L.TGF-ß1-mediated alterations of rat lung fibroblast differentiation resulting in the radiation-induced fibrotic response / L. Hakenjos, M. Bamberg, H.P. Rodemann // Int J Radiat Biol. - 2000 - V. 76 - P. 503-509.

48. Handjiski, B.K. Alkaline phosphatase activity and localization during the murine hair cycle / B.K. Handjiski, S. Eichmuller, U. Hofmann, B.M. Czarnetzki, R. Paus // Br J Dermatol. - 1994 - V.131 - P.303-310.

49. Hardy, M.H. The secret life of the hair follicle / M.H. Hardy // Trends Genet. -1992 - V.8 - P.55-61.

50. Harel, S. Pharmacologic inhibition of JAK-STAT signaling promotes hair growth / S. Harel, C.A. Higgins, J.E. Cerise, Z. Dai, J.C. Chen, R. Clynes, A.M. Christiano // Sci Adv - 2015 - V. 1 - P. e1500973.

51. Hasebe, Y. Analysis of cell characterization using cell surface markers in the dermis / Y. Hasebe, S. Hasegawa, N. Hashimoto, M. Toyoda, K. Matsumoto, A. Umezawa, A. Yagami, K. Matsunaga, H. Mizutani, S. Nakata, H. Akamatsu // J Dermatol Sci. - 2011 - V. 62 - P. 98-106.

52. Havlickova, B. Towards optimization of an organotypic assay system that

imitates human hair follicle-like epithelial-mesenchymal interactions / B. Havlickova,

100

T. Biro, A. Mescalchin, P. Arenberger, R. Paus // Br J Dermatol. - 2004 - V. 151 -P. 753-765.

53. Havlickova ,B. A human folliculoid microsphere assay for exploring epithelialmesenchymal interactions in the human hair follicle / B. Havlickova, T. Biro, A. Mescalchin, M. Tschirschmann, H. Mollenkopf, A. Bettermann, P. Pertile, R. Lauster, E. Bodo, R. Paus // J Invest Dermatol. - 2009 - V.129 - P. 972-983.

54. Headon, D.J.Involvement of a novel Tnf receptor homologue in hair follicle induction / D.J. Headon, P.A. Overbeek // Nat Genet. - 1999 - V. 22 - P.370-374.

55. Hébert, J.M. FGF5 as a regulator of the hair growth cycle: evidence from targeted and spontaneous mutations / J.M. Hébert, T. Rosenquist, J. Götz, G.R. Martin // Cell. - 1994 - V.78 - P.1017-1025.

56. Heit, I. Involvement of protein kinase C-delta in contact-dependent inhibition of growth in human and murine fibroblasts / I. Heit, R.J. Wieser, T. Herget, D. Faust, M. Borchert-Stuhlträger, F. Oesch, C .Dietrich // Oncogene. - 2001 - V.20 - P.5143-54.

57. Herskind, C. Differentiation state of skin fibroblast cultures versus risk of subcutaneous fibrosis after radiotherapy / C. Herskind, S.M. Bentzen, J. Overgaard, M. Overgaard, M. Bamberg, H.P .Rodemann // Radiother Oncol. - 1998 - V. 47 - P. 263-269.

58. Higgins, C. A. Microenvironmental reprogramming by three-dimensional culture enables dermal papilla cells to induce de novo human hair-follicle growth / C. A. Higgins, J. C. Chen, J. E. Cerise, C. A. Jahoda, A. M. Christiano // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2013 - V. 110 - P. 19679-19688.

59. Higgins, C.A. Modelling the hair follicle dermal papilla using spheroid cell cultures / C.A. Higgins, G.D. Richardson, D. Ferdinando, G.E. Westgate, C.A. Jahoda // Exp Dermatol. - 2010 - V. 19 - P. 546-548.

60. Horne, K. A. Whisker growth induced by implantation of cultured vibrissa dermal papilla cells in the adult rat / K. A. Horne, C. A. Jahoda, R. F. Oliver // J Embryol Exp Morphol. - 1986 - V. 97 - P.111-124.

101

61. Hubert, C.G. A Three-Dimensional Organoid Culture System Derived from Human Glioblastomas Recapitulates the Hypoxic Gradients and Cancer Stem Cell Heterogeneity of Tumors Found In Vivo / C.G. Hubert, M. Rivera, L.C. Spangler, Q. Wu, S.C. Mack, B.C. Prager, M. Couce, R.E. McLendon, A.E. Sloan, J.N. Rich // Cancer Res - 2016 - V. 76 - P. 2465-2477.

62. Huelsken, J. beta-Catenin controls hair follicle morphogenesis and stem cell differentiation in the skin / J. Huelsken, R. Vogel, B. Erdmann, G. Cotsarelis, W.Birchmeier // Cell. - 2001 - V.105 - P. 533-545.

63. Huh, S.H. Fgf20 governs formation of primary and secondary dermal condensations in developing hair follicles / S.H. Huh, K. Narhi, P.H. Lindfors, O. Haara, L. Yang, D.M. Ornitz, M.L. Mikkola // Genes Dev. - 2013 - V. 27 - P. 450458.

64. Ihara, S. Formation of hair follicles from a single-cell suspension of embryonic rat skin by a two-step procedure in vitro / S. Ihara, M. Watanabe, E. Nagao, N.Shioya // Cell Tissue Res. - 1991 - V. 266 - P. 65-73.

65. Iida, M. Hair cycle-dependent changes of alkaline phosphatase activity in the mesenchyme and epithelium in mouse vibrissa follicles / M. Iida, S. Ihara, T. Matsuzaki // Dev Growth Differ. - 2007 - V.49 - P.185-195.

66. Ikeda, E. Fully functional bioengineered tooth replacement as an organ replacement therapy / E. Ikeda, R. Morita, K. Nakao, K. Ishida, T. Nakamura, T. Takano-Yamamoto, M. Ogawa, M. Mizuno, S. Kasugai, T. Tsuji // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2009 - V. 106 - P. 13475-13480.

67. Inamatsu, M. Establishment of rat dermal papilla cell lines that sustain the potency to induce hair follicles from afollicular skin / M. Inamatsu, T. Matsuzaki, H. Iwanari, K. Yoshizato // The Journal of Investigative Dermatology. - 1998 - V. 111 - P. 767-775.

68. Inamatsu, M. Embryonic dermal condensation and adult dermal papilla induce hair follicles in adult glabrous epidermis through different mechanisms / M.

Inamatsu, T. Tochio, A. Makabe, T. Endo, S. Oomizu, E. Kobayashi, K/ Yoshizato // Dev Growth Differ. - 2006 - V. 48 - P. 73-86.

69. Ito, M. Label-retaining cells in the bulge region are directed to cell death after plucking, followed by healing from the surviving hair germ / M. Ito, K. Kizawa, M. Toyoda, M. Morohashi // J Invest Dermatol. - 2002 - V. 119 - P.1310-1316.

70. Ito, Y. Isolation of murine hair-inducing cells using the cell surface marker prominin-1/CD133 / Y. Ito, T.S. Hamazaki, K. Ohnuma, K. Tamaki, M. Asashima, H. Okochi // J Invest Dermatol. - 2007 - V. 127 - P.1052-1060.

71. Jacques, B. Sonic hedgehog signaling is essential for hair development / B. Jacques, H.R. Dassule, I. Karavanova, V.A. Botchkarev, J. Li, P.S. Danielian, J.A. McMahon, P.M. Lewis, R. Paus, A.P. McMahon // Curr Biol. - 1998 - V. 8 - P.1-12.

72. Jahoda, C. A.Vibrissa dermal papilla cell aggregative behaviour in vivo and in vitro / C. A. Jahoda, R. F. Oliver // J Embryol Exp Morphol. - 1984 - V.79 - P.211-224.

73. Jahoda, C.A. Induction of hair growth by implantation of cultured dermal papilla cells / C.A. Jahoda, K.A. Horne, R.F. Oliver // Nature. - 1984 - V. 311 - P. 560-562.

74. Jahoda, C.A. Dermal-epidermal interactions--follicle-derived cell populations in the study of hair-growth mechanisms / C.A. Jahoda, A.J. Reynolds // J Invest Dermatol. - 1993 - V. 101 - P. 33S-38S.

75. Jahoda, C.A. Smooth muscle alpha-actin is a marker for hair follicle dermis in vivo and in vitro/ C.A. Jahoda, A.J. Reynolds, C. Chaponnier, J.C. Forester, G. Gabbiani // J Cell Sci. - 1991 - V.99 - P. 627-636.

76. Jinno, H. Convergent genesis of an adult neural crest-like dermal stem cell from distinct developmental origins / H. Jinno, O. Morozova, K.L. Jones, J.A. Biernaskie, M. Paris, R. Hosokawa, M.A. Rudnicki, Y. Chai, F. Rossi, M.A. Marra, F.D. Miller // Stem Cells. - 2010 - V. 28 - P. 2027-2040.

77. Jo, S. J.Valproic acid promotes human hair growth in vitro culture model / S.J. Jo, S.J. Choi, S.Y. Yoon, J.Y. Lee, W.S. Park, P.J. Park, K.H. Kim, H.C. Eun, O. Kwon // Journal of Dermatological Science. - 2013 - V.72 - P. 16-24.

78. Kageyama, T. Spontaneous hair follicle germ (HFG) formation in vitro, enabling the large-scale production of HFGs for regenerative medicine / T. Kageyama, C. Yoshimura, D. Myasnikova, K. Kataoka, T. Nittami, S. Maruo Fukuda // J. Biomaterials - 2017 - V.154 - P.291-300.

79. Karlsson, L. Roles for PDGF-A and sonic hedgehog in development of mesenchymal components of the hair follicle / L. Karlsson, C. Bondjers, C. Betsholtz // Development - 1999 - V. 126 - P. 2611-2621.

80. Kaushal, G.S. Fate of Prominin-1 Expressing Dermal Papilla Cells during Homeostasis, Wound Healing and Wnt Activation / G.S. Kaushal, E. Rognoni, B.M. Lichtenberger, R.R. Driskell, K. Kretzschmar, E. Hoste, F.M. Watt // J Invest Dermatol. - 2015 - V. 135 - P. 2926-2934.

81. Kishimoto, J. Wnt signaling maintains the hair inducing activity of the dermal papilla / J. Kishimoto, R. E. Burgeson, B. A. Morgan // Genes & Development. -2000 - V. 14 - P. 1181-1185.

82. Kishimoto, J. Selective activation of the versican promoter by epithelialmesenchymal interactions during hair follicle development / J. Kishimoto, R. Ehama, L. Wu, S. Jiang, N. Jiang, R.E. Burgeson // Proc Natl Acad Sci. - 1999 - V. 96 - P. 7336-7341.

83. Knuchel, S. Fibroblast surface-associated FGF-2 promotes contact-dependent colorectal cancer cell migration and invasion through FGFR-SRC signaling and integrin avß5-mediated adhesion / S. Knuchel, P. Anderle, P. Werfelli, E Diamantis, C. Rüegg // Oncotarget. - 2015 - V. 6 - P. 14300-14317.

84. Kollar, E. J. The induction of hair follicles by embryonic dermal papillae / E. J Kollar // J Invest Dermatol. - 1970 - V. 55 - P.374-378.

85. Langan, E.A. Human hair follicle organ culture: theory, application and perspectives / E.A. Langan, M.P. Philpott, J.E. Kloepper, R. Paus // Exp Dermatol. -2015 - V. 24 - P. 903-911.

86. Langbein, L.The keratins of the human beard hair medulla: the riddle in the middle / L. Langbein, H. Yoshida, S. Praetzel-Wunder, D.A. Parry, J. Schweizer // J Invest Dermatol. - 2010 - V. 130 - P. 55-73.

87. Lau, W.B. The R-spondin protein family / W.B. Lau, B. Snel, H.C. Clevers // Genome Biol. - 2012 - V. 13 - P. 242.

88. Laurikkala, J. Regulation of hair follicle development by the TNF signal ectodysplasin and its receptor Edar / J. Laurikkala, J. Pispa, H.S. Jung, P. Nieminen, M. Mikkola, X. Wang, U. Saarialho-Kere, J. Galceran, R. Grosschedl, I. Thesleff // Development. - 2002 - V.129 - P.2541-2553.

89. Lee, S. H. Valproic acid induces hair regeneration in murine model and activates alkaline phosphatase activity in human dermal papilla cells / S.H. Lee, J. Yoon, S.H. Shin, M. Zahoor, H.J. Kim, P.J. Park, W.S. Park, S. Min, H.Y. Kim, K.Y. Choi // PLoS One. - 2012 - V. 7 - P. e34152.

90. Legue, E. Hair follicle renewal: organization of stem cells in the matrix and the role of stereotyped lineages and behaviors / E. Legue, J.F. Nicolas // Development. -2005 - V. 132 - P. 4143-4154.

91. Leiros, G.J. Dermal papilla cells improve the wound healing process and generate hair bud-like structures in grafted skin substitutes using hair follicle stem cells / G.J. Leiros, A.G. Kusinsky, H. Drago, S. Bossi Sturla, M.L. Castellanos, I.Y. Stella, M.E. Balana // Stem Cells Transl Med. - 2014 - V. 3 - P. 1209-1219.

92. Lichtenberger, B.M. Epidermal ß-catenin activation remodels the dermis via paracrine signalling to distinct fibroblast lineages / B.M. Lichtenberger, M. Mastrogiannaki, F.M. Watt // Nat Commun - 2016 - V. 7 - P. 10537.

93. Lichti, U. In vivo regulation of murine hair growth: insights from grafting defined cell populations onto nude mice / U. Lichti, W.C. Weinberg, L. Goodman, S.

Ledbetter, T.Dooley, D. Morgan, S.H. Yuspa // J Invest Dermatol. - 1993 - V. 101 -P.124S-129S

94. Linnemann, J.R. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells / J.R. Linnemann, H. Miura, L.K. Meixner, M. Irmler, U.J.Kloos, B. Hirschi, H.S. Bartsch, S. Sass, J. Beckers, F.J. Theis, C. Gabka, K. Sotlar, C.H. Scheel // Development. - 2015 - V. 142 - P. 3239-3251.

95. Lo Celso, C. Transient activation of ß-catenin signalling in adult mouse epidermis is sufficient to induce new hair follicles but continuous activation is required to maintain hair follicle tumours / C. Lo Celso, D. Prowse, F. Watt // Development - 2004 - V. 131 - P. 1787-1799.

96. Lou, Y.R. Next generation organoids for biomedical research and applications / Y.R. Lou, A.W. Leung // Biotechnol Adv - 2017 - in print.

97. Maini, P.K. Developmental biology. The Turing model comes of molecular age / P.K. Maini, R.E. Baker, C.M. Chuong // Science. - 2006 - V.314 - P.1397-1398.

98. Mammone, T. Apoptotic cell death increases with senescence in normal human dermal fibroblast cultures / T. Mammone, D. Gan, R. Foyouzi-Youssefi // Cell Biol Int. - 2006 - V. 30 - P. 903-909.

99. McMahon, S.. Transforming growth factor beta1 induces hypoxia-inducible factor-1 stabilization through selective inhibition of PHD2 expression / S. McMahon, M. Charbonneau, S. Grandmont, D.E. Richard, C.M. Dubois // J Biol Chem. - 2006 - V. 281 - P. 24171-24181.

100. Miao, Y. Effects of extracellular matrix on the growth characteristics of human dermal papillae cells in vitro / Y. Miao, Z.X. Fan, L.J. Du, Y.S. Su, Y.B. Sun, W. Jiang, Z.Q. Hu // Clin Exp Dermatol. - 2016 - V. 41 - P. 792-797.

101. Midgley, A.C. MicroRNA-7 inhibition rescues age-associated loss of epidermal growth factor receptor and hyaluronan-dependent differentiation in fibroblasts / A.C. Midgley, T. Bowen, A.O. Phillips, R. Steadman // Aging Cell. -2014 - V. 13 - P. 235-244..

102. Mikkola, M. Ectodysplasin, a protein required for epithelial morphogenesis, is a novel TNF homologue and promotes cell-matrix adhesion / M.L.Mikkola, J. Pispa, M. Pekkanen, L. Paulin, P. Nieminen, J. Kere, I. Thesleff // Mech Dev. - 1999 -V.88 - P. 1-14.

103. Millar, S.E. Molecular mechanisms regulating hair follicle development / S.E. Millar // J Invest Dermatol. - 2002 - V.118 - P. 216-225.

104. Mine, S. Aging Alters Functioally Human Dermal Papillary Fibroblasts but Not Reticular Fibroblasts: A New View of Skin Morphogenesis and Aging / S. Mine, N. Fortunel, H. Pageon, D. Asselineau // PLoS ONE. - 2008 - V. 3 - P. e4066.

105. Moll, R.. The human keratins: biology and pathology / R. Moll, M. Divo, L. Langbein. Histochem Cell Biol. - 2008 - V. 129 - P. 705-733.

106. Monaghan, A.P. Dickkopf genes are coordinately expressed in mesodermal lineages / A.P. Monaghan, P. Kioschis, W. Wu, A. Zuniga, D. Bock, A. Poustka, H. Delius, C. Niehrs // Mech Dev. - 1999 - V. 87 - P. 45-56.

107. Montagna, W. Structural changes in aging human skin / W. Montagna, K. Carlisle // J Invest Dermatol. - 1979 - V. 73 - P. 47-53.

108. Mou, C. Generation of the primary hair follicle pattern / C. Mou, B. Jackson, P. Schneider, P.A. Overbeek, D.J. Headon // Proc Natl Acad Sci. 2006. V.103.P.9075-9080.

109. Norwood, O.T. Incidence of female androgenetic alopecia (female pattern alopecia) / O.T. Norwood // Dermatol Surg. - 2001 - V.27 - P. 53-54.

110. Norwood, O.T. Male pattern baldness: Classification and incidence / O.T. Norwood // South Med J. - 1975 - V. 68 - P. 1359-1365.

111. Ohtola. J. beta-Catenin has sequential roles in the survival and specification of ventral dermis / J. Ohtola, J. Myers, B. Akhtar-Zaidi, D. Zuzindlak, P. Sandesara, K. Yeh, S. Mackem, R. Atit // Development. - 2008 - V. 135 - P. 2321-2329.

112. Ohyama, M. Restoration of the intrinsic properties of human dermal papilla in

vitro / M. Ohyama, T. Kobayashi, T. Sasaki, A. Shimizu, M. Amagai // Journal of

Cell Science. - 2012 - V. 125 - P. 4114-4125

107

113. Ono, M. Practical whole-tooth restoration utilizing autologous bioengineered tooth germ transplantation in a postnatal canine model / M. Ono, M. Oshima, M. Ogawa, W. Sonoyama, E.S. Hara, Y. Oida, S. Shinkawa, R. Nakajima, A. Mine, S. Hayano, S. Fukumoto, S. Kasugai, A. Yamaguchi, T. Tsuji, T. Kuboki // Sci Rep. -2017 - V. 7 - P. 44522.

114. Oshima, M.Functional tooth regeneration using a bioengineered tooth unit as a mature organ replacement regenerative therapy / M. Oshima, M. Mizuno, A.Imamura, M. Ogawa, M. Yasukawa, H. Yamazaki, R. Morita, E. Ikeda, K. Nakao, T. Takano-Yamamoto, S. Kasugai, M. Saito, T. Tsuji // PLoS One. - 2011 - V. 6 -P. e21531

115. Palmer, H.G. The vitamin D receptor is required for mouse hair cycle progression but not for maintenance of the epidermal stem cell compartment / H.G. Palmer, D. Martinez, G. Carmeliet, F.M. Watt. J. Invest Dermatol. - 2008 - V. 128 -P. 2113-2117.

116. Panteleyev, A.A. Towards defining the pathogenesis of the hairless phenotype / A.A. Panteleyev, D.V. Van, T. Rosenbach, S. Muller-Rover, V.E. Sokolov, R. J. Paus // Invest. Dermatol. - 1998 - V. 110 - P. 902-907.

117. Pastar, I. Epithelialization in Wound Healing: A Comprehensive Review / I. Pastar, O. Stojadinovic, N.C. Yin, H. Ramirez, A.G. Nusbaum, A. Sawaya, S.B. Patel, L. Khalid, R.R. Isseroff, M. Tomic-Canic // Adv Wound Care.- 2014 - V. 3 -P. 445-464.

118. Paus, R. In search of the ''hair cycle clock'': a guided tour / R. Paus, K. Foitzik // Differentiation. - 2004 - V.72 - P. 489-511.

119. Plikus, M. Morpho-Regulation of Ectodermal Organs / M. Plikus, W.P. Wang, J. Liu, X. Wang, T.X. Jiang, C.M. Chuong // Am J Pathol. - 2004 - V.164 - P.1099-1114.

120. Plikus, M.V. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration / M.V. Plikus, J.A. Mayer, R.E. Baker, P.K. Maini, R. Maxson, C.M. Chuong // Nature. - 2008 - V. 451 - P. 340-344.

108

121. Pradhan, S. Lumen formation in three-dimensional cultures of salivary acinar cells / S. Pradhan, C. Liu, C. Zhang, X. Jia, M.C. Farach-Carson, R.L. Witt // Otolaryngol Head Neck Surg. - 2010 - V.142 - P.191-195.

122. Qi, J. An overview of alopecias / J. Qi, L.A. Garza // Cold Spring Harb Perspect Med. - 2014 - V. 4 - P. a013615.

123. Qi, S.H. Experimental study on repairing of nude mice skin defects with composite skin consisting of xenogeneic dermis and epidermal stem cells and hair follicle dermal papilla cells / S.H. Qi, P. Liu, J.L. Xie, B. Shu, Y.B. Xu, C.N. Ke, X.S. Liu, T.Z. Li // Burns - 2008 - V. 34 - P. 385-392.

124. Qiao, J. Hair morphogenesis in vitro: formation of hair structures suitable for implantation / J. Qiao, A. Turetsky, P. Kemp, J. Teumer // Regen Med - 2008 - V. 3

- P. 683-692.

125. Quan, T. Role of Age-Associated Alterations of the Dermal Extracellular Matrix Microenvironment in Human Skin Aging: A Mini-Review / T. Quan, G.J. Fisher // Gerontology. - 2015 - V. 61 - P. 427-434.

126. Rahmani, W. Hair follicle dermal stem cells regenerate the dermal sheath, repopulate the dermal papilla, and modulate hair type / W. Rahmani, S. Abbasi, A. Hagner, E. Raharjo, R. Kumar, A. Hotta., S. Magness, D. Metzger., J. Biernaskie // Dev Cell. - 2014 - V. 31 - P. 543-558.

127. Reddy, S. Characterization of Wnt gene expression in developing and postnatal hair follicles and identification of Wnt5a as a target of Sonic hedgehog in hair follicle morphogenesis / S. Reddy, T. Andl, A. Bagasra, M.M. Lu, D.J. Epstein, E.E. Morrisey, S.E. Millar // Mech Dev. - 2001 - V. 107 - P. 1-14.

128. Rendl, M. BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle-inductive properties / M. Rendl, L. Polak, E. Fuchs // Genes & Development.

- 2008 - V. 22 - P. 543-557.

129. Richardson, G.D. Dynamic expression of Syndecan-1 during hair follicle morphogenesis / G.D. Richardson, K.A. Fantauzzo, H. Bazzi, A. Maatta, C.A. Jahoda // Gene Expr Patterns. - 2009 - V. 9 - P. 454-460.

109

130. Rinn, J.L. Anatomic demarcation by positional variation in fibroblast gene expression programs / J.L. Rinn, C. Bondre, H.B. Gladstone, P.O. Brown, H.Y. Chang // PLoS Genet. - 2006 - V. 2 - P. e119.

131. Rinn, J.L. dermal HOX transcriptional program regulates site-specific epidermal fate / J.L. Rinn, J.K. Wang, N. Allen, S.A. Brugmann, A.J. Mikels, H. Liu, T.W. Ridky, H.S. Stadler, R. Nusse, J.A. Helms, H.Y. Chang // Genes Dev. - 2008 -V. 22 - P. 303-307.

132. Rodemann, H.P. Differential degradation of intracellular proteins in human skin fibroblasts of mitotic and mitomycin-C (MMC)-induced postmitotic differentiation states in vitro / H.P. Rodemann // Differentiation. - 1989 - V. 42 - P. 37-43.

133. Roh, C. Dermal papilla-induced hair differentiation of adult epithelial stem cells from human skin / C. Roh, Q. Tao, S. Lyle // Physiol Genomics. - 2004 - V. 19 - P. 207-217.

134. Samuelov, L. P-cadherin regulates human hair growth and cycling via canonical Wnt signaling and transforming growth factor-ß2 / L. Samuelov, E. Sprecher, D. Tsuruta, T. Biro, J. Kloepper, R. Paus // J Invest Dermatol. - 2012 -V.132 - P. 2332-2341.

135. Schauer, I.G. Cancer-associated fibroblasts and their putative role in potentiating the initiation and development of epithelial ovarian cancer // I.G. Schauer, A.K. Sood, S. Mok, J. Liu // Neoplasia. - 2011 - V.13 - P. 393-405.

136. Schlake, T. Determination of hair structure and shape / T. Schlake // Semin Cell Dev Biol. - 2007 - V.18 - P.267-273.

137. Schmidt-Ullrich, R. Molecular principles of hair follicle induction and morphogenesis / R. Schmidt-Ullrich, R. Paus // Bioessays. - 2005 - V. 27 - P. 247261.

138. Schmidt-Ullrich R. Requirement of NF-kappaB/Rel for the development of hair follicles and other epidermal appendices / R. Schmidt-Ullrich, T. Aebischer, J.

Hulsken, W. Birchmeier, U. Klemm, C. Scheidereit // Development. - 2001 - V. 128 - P. 3843-3853.

139. Schmidt-Ullrich, R. NF-kappaB transmits Eda A1/EdaR signalling to activate Shh and cyclin D1 expression, and controls postinitiation hair placode down growth / R. Schmidt-Ullrich, D.J. Tobin, D. Lenhard, P. Schneider, R. Paus, C. Scheidereit // Development. - 2006 - V. 133 - P.1045-1057.

140. Schneider, M.R. The hair follicle as a dynamic miniorgan / M.R Schneider, R. Schmidt-Ullrich, R. Paus // Curr Biol. - 2009 - V.19 - P.132-142.

141. Shiraha, H. Aging fibroblasts present reduced epidermal growth factor (EGF) responsiveness due to preferential loss of EGF receptors / H. Shiraha, K. Gupta, K. Drabik, A. Wells // J Biol Chem. - 2000 - V. 275 - P. 19343-19351.

142. Sick, S. WNT and DKK determine hair follicle spacing through a reaction-diffusion mechanism / S. Sick, S. Reinker, J. Timmer, T.Schlake // Science. - 2006 -V.314 - P.1447-1450.

143. Simpson, R.M. Age-related changes in pericellular hyaluronan organization leads to impaired dermal fibroblast to myofibroblast differentiation / R.M. Simpson, S. Meran, D. Thomas, P. Stephens, T. Bowen, R. Steadman, A. Phillips // Am J Pathol. - 2009 - V. 175 - P. 1915-1928.

144. Simpson R.M. Aging fibroblasts resist phenotypic maturation because of impaired hyaluronan-dependent CD44/epidermal growth factor receptor signaling / R.M. Simpson, A. Wells, D. Thomas, P. Stephens, R. Steadman, A. Phillips // Am J Pathol. - 2010 - V. 176 - P. 1215-1228.

145. Soma, T. Hair cycle-specific expression of versican in human hair follicles / T Soma, M. Tajima, J.Kishimoto // J Dermatol Sci. - 2005 - V. 39 - P. 147-154.

146. Sorrell, J.M. Site-matched papillary and reticular human dermal fibroblasts differ in their release of specific growth factors/cytokines and in their interaction with keratinocytes / J.M. Sorrell, M.A. Baber, A.I.Caplan // J Cell Physiol. - 2004 - V. 200 - P. 134-145.

147. Sriwiriyanont P. Morphogenesis of chimeric hair follicles in engineered skin substitutes with human keratinocytes and murine dermal papilla cells / P. Sriwiriyanont, K.A. Lynch, E.A. Maier, J.M. Hahn, D.M. Supp, S.T. Boyce // Exp Dermatol. - 2012 - V. 21 - P. 783-785.

148. Sriwiriyanont, P. Characterization of hair follicle development in engineered skin substitutes / P. Sriwiriyanont, K.A. Lynch, K.L. McFarland, D.M. Supp, S.T. Boyce // PLoS One. - 2013 - V. 17 - P. e65664.

149. Stark, J. Hairy math: insights into hair-follicle spacing and orientation / J. Stark T. Andl, S.E. Millar // Cell. - 2007 - V.128 - P.17-20.

150. Stenn, K.S. Controls of hair follicle cycling / K.S. Stenn, R. Paus.Physiol Rev.

- 2001 - V. 81 - P. 449-494.

151. Sutherland, J. Contact guidance in human dermal fibroblasts is modulated by population pressure / J. Sutherland, M. Denyer, S. Britland // J Anat. - 2005 - V.206

- P.581-587.

152. Takagi, R. Bioengineering a 3D integumentary organ system from iPS cells using an in vivo transplantation model / R. Takagi, J. Ishimaru, A. Sugawara, K.E. Toyoshima, K. Ishida, M. Ogawa, K. Sakakibara, K. Asakawa, A. Kashiwakura, M. Oshima, R. Minamide, A. Sato, T. Yoshitake, A. Takeda, H. Egusa., T. Tsuji // Sci Adv. - 2016 - V. 2 - P. e1500887.

153. Thangapazham, R.L. A model system to analyse the ability of human keratinocytes to form hair follicles / R.L. Thangapazham, P. Klover, S. Li, J.A. Wang, L. Sperling., T.N. Darling // Exp Dermatol. - 2014 - V. 23 - P. 443-446.

154. Tran, T.H. Role of canonical Wnt signaling/ß-catenin via Dermo1 in cranial dermal cell development / T.H. Tran, A. Jarrell, G.E. Zentner, A. Welsh, I. Brownell, P.C. Scacheri, R. Atit // Development. - 2010 - V. 137 - P. 3973-3984.

155. Tsai, S.Y. Oct4 and klf4 reprogram dermal papilla cells into induced pluripotent stem cells / S.Y. Tsai, C. Clavel, S. Kim, Y.S. Ang, L. Grisanti, D.F. Lee, K. Kelley, M. Rendl // STEM CELLS. - 2010 - V. 28 - P. 221-228.

156. Tsang, K.Y. The developmental roles of the extracellular matrix: beyond structure to regulation / K.Y. Tsang, M.C. Cheung, D. Chan, K.S. Cheah // Cell Tissue Res. - 2010 - V. 339 - P. 93-110.

157. Turinetto, V. Senescence in Human Mesenchymal Stem Cells: Functional Changes and Implications in Stem Cell-Based Therapy / V. Turinetto, E Vitale, C. Giachino // Int J Mol Sci. - 2016 - V.19 - P.E1164.

158. Underhill, C.B. Hyaluronan is inversely correlated with the expression of CD44 in the dermal condensation of the embryonic hair follicle / C.B. Underhill // J Invest Dermatol. - 1993 - V. 101 - P. 820-826.

159. Vag, J. Morphological and functional differentiation of HSG cells: role of extracellular matrix and trpc 1 / J. Vag, E.M. Byrne, D.H. Hughes, M. Hoffman, I. Ambudkar, P. Maguire, B.C. O'Connell // J Cell Physiol. - 2007 - V.212 - P.416-423.

160. Veraitch, O. Induction of hair follicle dermal papilla cell properties in human induced pluripotent stem cell-derived multipotent LNGFR(+)THY-1(+) mesenchymal cells / O. Veraitch, Y. Mabuchi, Y. Matsuzaki, T. Sasaki, H. Okuno, A. Tsukashima, M. Amagai, H. Okano, M. Ohyama // Sci Rep. - 2017 - V. 21 - P. 7:42777.

161. Waldera, D.M. Characterization of Skin Aging-Associated Secreted Proteins (SAASP) Produced by Dermal Fibroblasts Isolated from Intrinsically Aged Human Skin / D.M. Waldera, F. Kalfalah, K. Safferling, P. Boukamp, G. Poschmann, E. Volpi, C. Götz-Rösch, F. Bernerd, L. Haag, U. Huebenthal, E. Fritsche, F. Boege, N. Grabe, J. Tigges, K. Stühler, J. Krutmann // J Invest Dermatol. 2015. V. 135. P. 19541968

162. Weinberg, W.C. Reconstitution of hair follicle development in vivo: determination of follicle formation, hair growth, and hair quality by dermal cells / W.C. Weinberg, L.V. Goodman, C. George, D.L. Morgan, S. Ledbetter, S.H. Yuspa, U. Lichti // J Invest Dermatol. - 1993 - V.100 - P.229-236.

163. Wieser, R.J. Growth control in mammalian cells by cell-cell contacts / R.J. Wieser, D. Renauer, A. Schäfer, R. Heck, R. Engel, S. Schütz., F. Oesch // Environ Health Perspect. - 1990 - V.88 - P.251-253.

164. Xue, X.In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors / X. Xue., Y.M. Shah // J Vis Exp. - 2013 - V.17 - P. e50210.

165. Yamaguchi, Y. Dickkopf 1 (DKK1) regulates skin pigmentation and thickness by affecting Wnt/ß-catenin signaling in keratinocytes / Y. Yamaguchi, T. Passeron, T. Hoashi, H. Watabe, F. Rouzaud, K. Yasumoto, T. Hara, C. Tohyama, I. Katayama, T. Miki, V. Hearing // J FASEB J. - 2008 - V. 22 - P. 1009-1020.

166. Yang, C.C.Review of hair follicle dermal cells/ C.C. Yang, G.J. Cotsarelis // Dermatol Sci. - 2010 - V. 57 - P. 2-11.

167. Yen, C.M. High-throughput reconstitution of epithelial-mesenchymal interaction in folliculoid microtissues by biomaterial-facilitated self-assembly of dissociated heterotypic adult cells / C.M. Yen, C.C. Chan, S.J. Lin // Biomaterials. -2010 - V. 31 - P. 4341-4352.

168. Young, T.H. The enhancement of dermal papilla cell aggregation by extracellular matrix proteins through effects on cell-substratum adhesivity and cell motility / T.H. Young, H.R. Tu, C.C. Chan, Y.C. Huang, M.H. Yen, N.C. Cheng, H.C. Chiu, S.J. Lin // Biomaterials. - 2009 - V. 30 - P. 5031-5040.

169. Zhang, Y. Activation of beta-catenin signaling programs embryonic epidermis to hair follicle fate / Y. Zhang, T. Andl, S.H. Yang, M. Teta, F. Liu, J.T. Seykora, J.W. Tobias, S. Piccolo, R. Schmidt-Ullrich, A. Nagy, M.M. Taketo, A.A. Dlugosz, S.E. Millar. Development. - 2008 - V.135 - P.2161-2172.

170. Zhang, Y.Reciprocal requirements for EDA/EDAR/NF-kappaB and Wnt/beta-catenin signaling pathways in hair follicle induction / Y. Zhang, P. Tomann, T. Andl, N.M. Gallant, J. Huelsken, B. Jerchow, W. Birchmeier, R. Paus, S. Piccolo, M.L. Mikkola, E.E. Morrisey, P.A. Overbeek, C. Scheidereit, S.E. Millar, R. SchmidtUllrich // Dev Cell. - 2009 - V.17 - P.49-61.

171. Zhao, B. Hypoxia drives the transition of human dermal fibroblasts to a myofibroblast-like phenotype via the TGF-ß1/Smad3 pathway / B. Zhao, H. Guan, J.Q. Liu, Z. Zheng., Q. Zhou, J. Zhang, L.L. Su, D.H. Hu // Int J Mol Med. - 2017 -V. 39 - P. 153-159

172. Zheng, Y. Organogenesis from dissociated cells: generation of mature cycling hair follicles from skin-derived cells / Y. Zheng, X. Du, W. Wang, M. Boucher, S. Parimoo, K. Stenn // The Journal of Investigative Dermatology. - 2005 - V. 124 - P. 867-876.

173. Zheng, Y. Mature hair follicles generated from dissociated cells: a universal mechanism of folliculoneogenesis / Y. Zheng, A. Nace, W. Chen, K. Watkins, L. Sergott, Y. Homan, J.L. Vandeberg, M. Breen, K. Stenn // Developmental Dynamics. - 2010 - V. 239 - P. 2619-2626.

174. Zhou, P. Lymphoid enhancer factor 1 directs hair follicle patterning and epithelial cell fate / P, Zhou, C. Byrne, J. Jacobs, E. Fuchs // Genes Dev. - 1995 - V. 9 - P.700-713.

175. Zuk, P.A.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells / P.A. Zuk, M. Zhu, P. Ashjian, D.A. De Ugarte, J.I. Huang, H. Mizuno, Z.C. Alfonso, J.K. Fraser, P. Benhaim, M.H.Hedrick // Mol Biol Cell. - 2002 - V.13 - P.4.