Влияние олигопептида Р199 на функциональную активность дермальных фибробластов кожи человека в эксперименте in vitro тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.03, кандидат наук Кожина, Кристина Витальевна

• Кожина, Кристина Витальевна
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Кожина, Кристина Витальевна

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................6

Актуальность темы..................................................................................................6

Научная новизна.....................................................................................................10

Теоретическая и практическая значимость.........................................................11

Основные положения, выносимые на защиту.....................................................11

Апробация работы..................................................................................................12

Публикации по теме диссертации........................................................................13

Структура и объем диссертации...........................................................................13

Внедрение полученных результатов....................................................................13

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................14

1.1. Строение и функции кожи..............................................................................14

1.2. Старение кожи.................................................................................................17

1.2.1. Клеточное старение......................................................................................18

1.2.2. Окислительный стресс.................................................................................21

1.2.3. Хроническое воспаление.............................................................................23

1.2.4. Дезорганизация внеклеточного матрикса..................................................28

1.3. Регенерация фетальной и взрослой кожи.....................................................33

1.4. Препараты для подавления процессов старения и восстановления нормальной физиологии кожи..............................................................................40

1.5. Культура клеток как модель для исследования. Современное состояние проблемы получения и культивирования клеток человека и животных.........45

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.................................55

2.1. Выделение и культивирование фибробластов из дермы кожи человека.. 55

2.1.1. Получение ТО культуры дермальных фибробластов человека...............55

2.1.2. Контроль контаминации..............................................................................57

2.1.3. Криоконсервация клеток.............................................................................58

2.1.4. ЗО культивирование дермальных фибробластов человека.....................58

2.2. Исследование влияние р199 на функциональную активность дермальных фибробластах в условиях патофизиологического процесса..............................59

2.2.1. Моделирование процесса «заживления» после повреждения монослоя дермальных фибробластов путем миграции клеток...........................................59

2.2.2. Моделирование повреждения ткани на 30 культуре дермальных фибробластов человека..........................................................................................60

2.3. Методы гистологии, иммуноцитохимии и молекулярной биологии........61

2.3.1. Подсчет и анализ жизнеспособности монослойной культуры дермальных фибробластов человека....................................................................61

2.3.2. Фиксация ТО и 30 культуры дермальных фибробластов человека.......62

2.3.3. Морфологический анализ ТО культуры дермальных фибробластов.....63

2.3.4. Иммуноцитохимический анализ дермальных фибробластов человека. 63

2.3.5. Детекция провоспалительных белков методом иммуноблота................64

2.4. Статистический анализ...................................................................................65

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ..........................................................................................69

3.1. Получение штаммов дермальных фибробластов человека........................69

3.2. Характеристика ТО культуры дермальных фибробластов человека.........70

3.2.1. Контроль контаминации..............................................................................70

3.2.2. Морфологический анализ ТО культуры дермальных фибробластов.....72

3.2.3. Иммуноцитохимический анализ ТО культуры дермальных фибробластов..........................................................................................................75

3.3. Подбор разведения олигопептида р199 для последующих экспериментов на ТО культуре дермальных фибробластов человека........................................78

3.4. Исследование биоактивного эффекта олигопептида р199 на 20 культуру дермальных фибробластов....................................................................................85

3.5. Исследование влияния олигопептида р199 на миграционную активность фибробластов на модели повреждения монослоя в ТО культуре.....................94

3.6. Исследование биоактивного эффекта олигопептида р199 на 30 культуру дермальных фибробластов....................................................................................96

3.6.1. Исследование формирования сфероидов из дермальных фибробластов

разного пассажа......................................................................................................96

3.6.2. Исследование влияния р199 на экспрессию функциональных белков дермальных фибробластов человека в ЗО культуре...........................................98

3.7. Моделирование повреждения ткани в 30 культуре дермальных фибробластов человека........................................................................................105

3.8. Исследование содержания провоспалительных факторов в 30 культуре дермальных фибробластов человека..................................................................108

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ......................................................................................110

Заключение...........................................................................................................124

ВЫВОДЫ..................................................................................................................128

Список используемой литературы.........................................................................129

Список сокращений

2D - two-dimensional

3D - three-dimensional

a-SMA - гладкомышечный альфа-актин

EGF - эпидермальный фактор роста

FGF - фактор роста фибробластов

II-ip (ИЛ 1) - интерлейкин 1-бета

PCNA - ядерный антиген пролиферирующих клеток

TGF - трансформирующий ростовой фактор

TIMP 1 и 3 - тканевой ингибитор металлопротеиназы 1 и 3.

ВКМ - внеклеточный матрикс

микроРНК - малая некодирующая рибонуклеиновая кислота ММП (ММР) - металлопротеиназы

ММСК - мультипотентные мезенхимные стромальные клетки

ПГЕ - простагландин Е

УФ - ультрафиолет

УФА - ультрафиолет А типа

УФБ - ультрафиолет Б типа

УФО - ультрафиолетовое облучение

ФИО (TNF-a) - фактор некроза опухоли

ФЧ - фибробласты человека

ЦОГ - циклооксигеназа

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние олигопептида Р199 на функциональную активность дермальных фибробластов кожи человека в эксперименте in vitro»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы

Возрастные изменения организма человека начинаются с клеточного уровня,

когда клетки теряют свою функциональную активность, то есть способность к пролиферации, миграции, синтезу тканеспецифичных белков. Именно эти свойства клеток поддерживают нормальную физиологию всей ткани в целом (Heimo F.R. et al., 2013).

Наиболее видимые глазу изменения в первую очередь касаются кожи человека. Кожа является самым большим органом человека и участвует в дыхательной функции, терморегуляции, водно-солевом обмене, экскреторной, иммунной и рецепторной функциях организма, но основной функцией кожи является защита организма от внешних воздействий. Возрастные изменения приводят к потере кожей эластичности и снижению ее защитных свойств. В результате снижается способность кожи к репарации после повреждения, что приводит к возникновению гипертрофических и келоидных рубцов в процессе заживления ран. Вызывая боль, зуд и контрактуры, чрезмерные рубцы влияют на качество жизни пациента. К сожалению, на сегодняшний день терапевтические подходы к сокращению рубцевания не увенчались успехом (Xue М., Jackson C.J., 2015). Поэтому многие исследователи заинтересованы в поиске факторов, регулирующих безфиброзную репарацию.

Сравнительный анализ фетальной и постнатальной репарации выявил важные отличия, которые лежат в основе безрубцового заживления ран на ранних и средних сроках эмбрионального развития. К ним относят отсутствие воспаления, повышенную скорость миграции и высокий уровень пролиферации кератиноцитов и фибробластов, активный синтез цитокинов, таких как TGF-ß, IGF, bFGF и других, стимулирующих заживление (Heimo F.R. et al., 2013). Но особую роль исследователи отводят количеству и компонентному составу внеклеточного матрикса (ВКМ), который активно участвует в клеточных и

внеклеточных событиях, регулирующих формирование рубца (Xue М., Jackson C.J., 2015). Поэтому наиболее перспективным методом терапии гипертрофических и келоидных рубцов рассматривают коррекцию компонентного состава ВКМ.

Известно, что основным источником ВКМ в коже человека являются фибробласты (Montagna W., 2012). Сравнительный анализ групп фибробластов, выделенных из разных тканей или локализаций в пределах одной ткани, показал, что фибробласты отличаются по уровню экспрессии белков ВКМ. Тип белка, который они синтезируют, можно изменять за счет перемены микроокружения (Werner S. et al., 2007). Следовательно, с помощью прямого воздействия на фибробласты можно регулировать синтез определенных компонентов ВКМ. Например, безфиброзному заживлению ран может способствовать обогащение внеклеточного матрикса коллагеном III типа, эластином и фибронектином (Xue М., Jackson C.J., 2015).

В последние годы ведется активная разработка методик для прижизненного анализа возрастных изменений структурно-функциональных показателей кожи (эхогенности, толщины эпидермиса и дермы, микроциркуляции кожи, изменений на клеточном уровне), которые возможно диагностировать с помощью эхографии, лазерной доплеровской флоуметрии и конфокальной лазерной микроскопии (Золотенкова Г.В. и др., 2015, Султанов Д.В., Хугаева В.К.,2014).

Однако, несмотря на многочисленные исследования, состав ВКМ, способствующий заживлению кожи без образования рубца до конца не установлен. Это связано с тем, что проводить подобные исследования in vivo на пациентах представляется затруднительным, дорогостоящим и неприемлемым с этической точки зрения. Альтернативным методом исследования рассматривают культуры клеток. Именно in vitro можно изучать

функциональную активность клеток, подвергшихся внешнему воздействию и исследовать изменения таких важных показателей, как пролиферация и миграция клеток, профиль синтеза белков ВКМ (Woodley D.T., 2017).

В работах многих исследователей было показано, что дермальные фибробласты при культивировании сохраняют диплоидный кариотип, не проявляют онкогенных свойств и имеют ограниченную продолжительность жизни (Zhao Y. et al., 2008, Varani J. et al., 2006). При этом клетки претерпевают значительные изменения как при увеличении числа пассажей («модель старения Хейфлика») (Gragnani A. et al., 2014), так и при увеличении времени культивирования в пределах одного и того же пассажа («старение покоящихся клеток») (Zang R. et al., 2012). Данные изменения носят, в основном, негативный характер, что и позволяет использовать клеточные культуры дермальных фибробластов для моделирования старения клеток in vitro.

При длительном культивировании в монослое клетки теряют одно из важнейших свойств функциональной активности - эпителио-мезенхимную пластичность (Сабурина И.Н., Репин B.C., 2010; Yamaguchi Y., 2005). Для сохранения тканеспецифичных свойств клеток предпочтительнее использовать 3D культуру - сфероиды, которые по своим свойствам более полно повторяет нативную ткань по пространственной организации, плотности клеток на единицу объема и представляет собой динамичную систему с организованным клеточным поведением - необходимым условием полноценного морфогенеза. Поэтому проведение исследований по изучению функциональной активности клеток, выращенных как в монослое, так и в 3D культуре, представляется актуальным.

Показано, что добавление биологически активных факторов в культуральную среду может регулировать секреторную активность фибробластов. Исследования, проведенные JIo с соавторами, показали, что

сокультивирование фибробластов с мультипотентными мезенхимными стромальными клетками (ММСК) или добавление кондиционированной среды изменяет профиль синтеза белков ВКМ (Lo D.D. et al, 2012). К сожалению, вследствие того, что ММСК выделяют множество разных типов цитокинов, сложно определить и выявить ключевой фактор, регулирующий экспрессию того или иного компонента ВКМ. Поэтому в качестве внешнего воздействия, целесообразным будет использовать один синтетический фактор, потенциально влияющий на ВКМ.

Известно, что синтетические пептиды представляют собой соединения L-аминокислот и принимают участие во многих биологических процессах, включая регенерацию, пролиферацию и противовоспалительную реакцию организма (Коваленко A.A. и др., 2013, Хугаева В.К. и др, 2012, Zhang L. et al., 2009). Примером такого синтетического пептида является р199, который, как было показано в работах Петриковского и Юцковской, стимулирует пролиферацию фибробластов и увеличивает количество внеклеточного матрикса в коже человека (Юцковская Я.А., Данилова A.A., 2014; Петриковский Б.М., 2012). Также было показано, что инъекционное применение препарата, в состав которого входит р199, способствует коррекции атрофических рубцов (Стенько А. и др., 2016). Однако, отсутствие данных, каким образом олигопептид р199 оказывает действие на морфологию, пролиферацию, миграцию, формирование компонентов ВКМ и на регенерационные процессы, подчеркивает актуальность и целесообразность проведения данных исследований.

Цель исследования: изучить влияние олигопептида р199 на возрастные изменения и репарационную активность 2D и 3D культур дермальных фибробластов после повреждения в эксперименте in vitro. Задачи исследования:

1. Получить и охарактеризовать культуру дермальных фибробластов человека на ранних и поздних пассажах.

2. Изучить влияние олигопептида р199 на функциональную активность дермальных фибробластов в стандартных условиях 2D культивирования.

3. Исследовать влияние олигопептида р199 на формирование сфероидов из дермальных фибробластов на ранних и поздних пассажах.

4. Оценить влияние олигопептида р199 на белковосинтетическую функцию фибробластов кожи человека в 2D и 3D культуре.

5. Выявить и изучить репарационные эффекты олигопептида р199 в экспериментах с повреждением дермальных фибробластов 2D и 3D культур.

Научная новизна

Получена новая культура дермальных фибробластов кожи человека ФЧ-2, обладающих стабильными культуральными и морфологическими характеристиками и отражающих свойства «молодых» и «стареющих» клеток на 4 и 18 пассажах в стандартных условиях монослойного культивирования.

Впервые для исследования функциональной активности молодых и «стареющих» фибробластов кожи человека была применена 3D культура (клеточные сфероиды).

Впервые показано, что фибробласты на поздних пассажах (после 18 пассажа) теряют способность формировать сфероиды, а добавление синтетического олигопептида р199 в ростовую среду приводит к восстановлению сфероидообразования.

Впервые на 30 культуре «стареющих» фибробластов установлено, что олигопептид р199 запускает механизмы, приводящие к активации и индукции синтеза коллагена IV типа, что имеет фундаментальное значение в области исследования процессов старения и безфиброзной репарации.

Для анализа репарационных эффектов изучаемого олигопептида впервые была применена ЗО модель повреждения клеток с помощью микродиссекции наносекундным лазерным скальпелем, что позволило получить новые данные о стимулирующем влиянии олигопептида р199 на процессы регенерации клеточных сфероидов.

Теоретическая и практическая значимость

Разработанные 20 и 30 клеточные модели повреждения дермальных

фибробластов могут быть использованы для изучения механизмов регенерации и оценки эффективности новых стимуляторов кожной репарации.

Данные по индукции синтеза коллагена IV типа в 20 и 30 культуре «стареющих» фибробластов дермы человека с помощью олигопептида р199 имеют теоретическое значение для изучения активации генов, находящихся в неактивном состоянии, и могут быть использованы в разработке новых методов лечения повреждений кожи и коррекции процессов старения.

Данные о про-репарационных эффектах р199, приводящих к изменению синтеза белков внеклеточного матрикса и провоспалительных факторов, имеют теоретическое и практическое значение для исследований механизмов старения и безфиброзной репарации кожи.

Полученные данные свидетельствуют о том, что олигопептид р199 можно рекомендовать в качестве самостоятельного препарата как для борьбы с возрастными изменениями кожи, так и при ее повреждении. Основные положения, выносимые на защиту

1. Культура дермальных фибробластов человека после 18-20 пассажа формирует признаки «старения» кожи на уровне морфологии,

пролиферации, миграции, формирования внеклеточного матрикса и потенциала репарации повреждений.

2. В отличие от «молодых» культур (4 пассаж) фибробласты поздних пассажей (после 18 пассажа) теряют потенциал к формированию сфероидов.

3. Олигопептид р199 оказывает дозозависимый эффект на синтез тканеспецифичных белков, что свидетельствует о комплексном воздействии на функциональную активность дермальных фибробластов в 2D и 3D культуре.

4. Олигопептид р199 влияет на механизмы активации синтеза в дермальных фибробластах коллагена IV типа, экспрессия генов которого утрачивается с возрастом.

5. Олигопептид р199 оказывает стимулирующее влияние на репарацию клеточных сфероидов, частично поврежденных наносекундным лазерным скальпелем.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на следующих международных

конференциях:

• международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2016», (2016г, Москва)

• 12th International Congress of Cell Biology, (2016г, Прага)

• XVII конференция-школа с международным участием «Актуальные проблемы биологии развития», (2016г, Москва).

Публикации по теме диссертации

По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 5

работ в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, 1 статья в научно-практическом медицинском журнале и 3 тезисов докладов на международных конференциях.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и

методов исследования, изложения собственных результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, содержит 46 рисунков и 3 таблицы. Список литературы включает 135 источников.

Внедрение полученных результатов

Банк клеток дермальных фибробластов, заложенный на хранение на раннем пассажном уровне, имеет практическое значение как источник клеток, обладающих стабильными культуральными морфологическими характеристиками. Результаты диссертационного исследования используют для оценки биологической активности, биобезопасности, цитотоксичности и биологической активности сертифицированных коммерческих косметических препаратов в Компании «ПремьерФарм».

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Строение и функции кожи

Кожа человека является самым большим его органом и защищает организм от широкого спектра внешних воздействий, начиная от ультрафиолетового излучения и механического повреждения, заканчивая защитой от проникновения патогенных микроорганизмов. Барьерная защита является основной, но отнюдь не единственной функцией данного органа. Кожа человека участвует одновременно во многих процессах [Цит. по Быкову В.Л., 2007]:

-дыхательная (способность кожи поглощать кислород и выделять углекислый газ);

- защитная (защищает организм от действия механических и химических факторов, ультрафиолетового излучения, проникновения микробов, потери и попадания извне воды);

-терморегуляторная (за счет излучения тепла и испарения пота);

- участие в водно-солевом обмене (связано с потоотделением);

- экскреторная (выведение с потом продуктов обмена, солей, лекарств);

- депонирование крови (в сосудах кожи может находиться до 1 л крови);

- эндокринная и метаболическая (синтез и накопление витамина О и некоторых гормонов);

- рецепторная (благодаря наличию многочисленных нервных окончаний);

- иммунная (захват, процессинг и транспорт антигенов с последующим развитием иммунной реакции)

В коже выделяют три основных слоя - эпидермис, дерма и гиподерма (подкожная жировая ткань) (Моп1а§па \У., 2012). Верхний слой эпидермис отделен от дермы базальной мембраной и представляет собой многослойный эпителий (рис.1). Так как основная популяция клеток способна синтезировать кератин, то называются эти клетки кератиноциты. Кроме кератиноцитов в

эпидермисе также присутствуют меланоциты и клетки Лангерганса (Быков В.Л., 2007). Меланоциты - клетки-производные нервного гребня, которые синтезируют меланин для защиты внутренних слоев кожи от солнечного ультрафиолетового излучения. Клетки Лангерганса мигрируют в кожу из костного мозга, где выполняют функции макрофагов, защищая кожу от проникновения патогенных микроорганизмов. Кератиноциты, расположенные на базальной мембране, имеют апикально-базальную поляризацию и способны к активному делению (Быков В.Л., 2007). Новообразованные кератиноциты дифференцируются и переходят в верхние слои эпидермиса, сначала в шиповатый, а затем в зернистый слой. В конце дифференцировки кератиноциты теряют ядро и превращаются в корнеоциты - безъядерные чешуйки, наполненные кератином. Корнеоциты составляют роговой слой эпидермиса, скрепленные особой группой липидов керамидами (церамидами), и отшелушиваются, достигнув поверхности кожи (Моп1а§па \У., 2012). Так, обычно в течение 2-4 недель, происходит обновление кожи. В зависимости от интенсивности механической нагрузки толщина кожи может варьировать на различных участках тела.

В эпидермисе нет кровеносных сосудов, поэтому питание клеток происходит за счет диффузии тканевой жидкости и плазмы крови из дермы (Моп1а§па \У., 2012). Дерма - внутренний слой кожи, который включает в себя волосяные фолликулы, потовые и сальные железы, нейро-рецепторные комплексы, мышечные клетки, кровеносные сосуды, окруженные большим количеством внеклеточного матрикса (рис.2). В дерме выделяют два слоя -сосочковый и сетчатый. Сосочковый слой вдаётся в эпидермис и формирует кожные сосочки. Эти сосочки создают особый неповторимый "рисунок" нашей кожи и особенно хорошо заметны на подушечках пальцев и подошвах ног. Именно сосочковый слой ответственен за "отпечатки пальцев". Сетчатый слой

состоит из внеклеточного матрикса и синтезирующих его клеток фибробластов. В состав внеклеточного матрикса входят два основных компонента: фибриллярная часть и аморфная компонента (Быков В.Л., 2007).

У Роговой СЛОИ ^ Зернистый спои

► Шипоб атъ!и СПОЙ

^ Б*}« г*><ый С псм

Рис.1. Строение эпидермиса кожи человека

Фибриллярная часть — это волокна коллагена, эластина, и ретикулина, создающие каркас кожи. Коллагеновые волокна переплетаются между собой, образуя упругую сеть. Эта сеть располагается почти на поверхности кожи под эпидермисом и составляет остов, который придаёт коже прочность и упругость. Аморфная компонента по своей структуре напоминает гель и состоит из полисахаридов. Наиболее известными из полисахаридов в составе кожи являются гиалуроновая кислота и хондроитин сульфат.

Именно компоненты внеклеточного матрикса как аморфные, так и фибриллярные создают кожу изнутри. Полисахариды не формируют волокон, но они заполняют все промежутки между соединительными клетками и

волокнами. Именно по ним и происходит внутритканевый транспорт всех веществ.

В итоге, именно состояние дермы (содержание воды в полисахаридном геле, целостность коллагеновых волокон и др.) определяет состояние эпидермиса и здоровый вид кожи (Мойа§па \У., 2012).

Рис.2. Строение кожи человека. На рисунке представлены отдельные слои кожи: эпидермис, дерма и гиподерма.

Гиподерма - подкожная основа (жировой слой), защищает наш организм от избыточного тепла и холода (позволяет нам задерживать тепло внутри нас), выполняя функцию термоизолятора, смягчает падение от ударов. Жировой слой кожи представляет собой депо для хранения жирорастворимых витаминов, а также железу, синтезирующую гормоны эстроген и лептин (Быков В.Л., 2007). 1.2. Старение кожи

Старение кожи представляет собой сложный процесс, обусловленный внешними - экзогенное старение, и внутренними - эндогенное или

хронологическое старение, стимулирующими факторами. Основным внешним воздействием является влияние ультрафиолетового излучения (УФ) типа А и Б, которое приводит к увеличению продукции активных форм кислорода (АФК), активирующих матричные металлопротеиназы (ММП) и подавляющих синтез нового коллагена. Экзогенное старение (фотостарение) кожи приводит к утолщению эпидермального слоя за счет накопления дезорганизованного коллагена и эластина, что сопровождается появлением глубоких морщин и пигментных пятен, пожелтением кожи, сухостью, телеангиэктазией, предопухолевыми поражениями, дряблостью кожи, атрофией, эластозом и актинической пурпурой (Makrantonaki Е., Zouboulis С.С., 2007). Эндогенное старение кожи приводит к утоныпению слоя эпидермиса и появлению мелких морщинок, вялости овала лица и появлению доброкачественных новообразований (Helfrich Y.R. et al., 2008). Внутренние факторы включают три основных процесса: 1) снижение пролиферативной активности клеток кожи; 2) снижение синтеза внеклеточного матрикса; 3) увеличение секреции металлопротеиназ, резорбирующих внеклеточный матрикс (Jenkins G., 2002). Причиной данных процессов могут быть: хроническое воспаление, клеточное старение, повреждение клеточной и митохондриальной ДНК, окислительный стресс, накопление хромосомных аберраций и точечных мутаций, а также изменение гормонального статуса организма (Makrantonaki Е., Zouboulis С.С., 2007).

1.2.1. Клеточное старение

Клеточное старение исторически рассматривали как необратимый механизм остановки клеточного цикла, который действует для защиты от образования опухолей, но последние открытия расширили его роль до участия в таких сложных биологических процессах, как развитие, репарация ткани, хронологическое старение и патофизиологические возрастные изменения.

Новые данные показывают, что клеточное старение представляет собой не статическую конечную точку, а ряд прогрессивных и фенотипически различных клеточных состояний, приобретенных после первоначальной остановки цикла в точке G1 и перехода клеток в стадию GO. Инициировать процесс клеточного старения могут как внутренние, так и внешние причины (рис.3).

Разные типы клеток способны к ограниченному числу делений, после которого они достигают предела Хейфлика и не могут под влиянием физиологических митогенов перейти на стадию клеточного цикла S1 - синтеза ДНК. Этот процесс обусловлен снижением теломеразной активности (Gragnani A. et al., 2014) и супрессией таких генов, контролирующих клеточный цикл и синтез ДНК, как протоонкоген c-Fos, генов белков с мотивом «спираль-петля-спираль» Id 1 и Id 2 и транскрипционных факторов семейства E2F (Jenkins G., 2002). При этом наблюдают повышенную экспрессию негативных регуляторов роста, включая ингибиторы циклин-зависимой протеинкиназы р21 и р16. Остальные изменения, наблюдаемые в фибробластах, касаются увеличения экспрессии IL-1 и нейрорегулина - цитокина, подобного эпидермальному фактору роста, который модулирует рост и дифференцировку (Zouboulis С.С., Makrantonaki Е., 2011).

Многие, но не все типы клеток в процессе старения приобретают устойчивость к определенным апоптотическим сигналам. Например, стареющие фибробласты человека могут противостоять индуцированному апоптозу, а эндотелиальные клетки - нет. При этом стареющие фибробласты человека резистентны к апоптозу, обусловленному отсутствием ростовых факторов и окислительным стрессом, но не к апоптозу, вызванному активацией рецептора смерти клеток Fas (Campisi J., di Fagagna F.A., 2007). Устойчивость к апоптозу может частично объяснить, почему стареющие клетки стабильны в культуре. И клеточное старение, и апоптоз считаются защитными механизмами организма

от образования опухолей. В настоящее время предполагается, что в качестве триггера между этими механизмами выступает белок-супрессор опухолей - р53. Однако сигнальные пути и факторы, влияющие на переход клеток в то или иное состояние, остаются малоизученными (Сатр1811, сЦ Л., 2007).

Стрессогениые факторы

Инактивация онкогена Дефицит опухолевых сунрессорпв I Ядрышковый стресс

Активация

Хронический мипнеиный Повреждение 1е.юмер Окислительный пресс Повреждение ДНК ^

■вы» супрессоров I Ядрышми I онкогена k I Эпигсг

......х ^ ^ ▼ Г i

г

Эпигенетический стресс Стресс веретена

^ Недостаток протсинкиначы BubR I

ATM/R

и и

О 11

(сою) (СРК4^б)

BRAF(V600E)

Л

Восстановление^ Остановка клеточного цикла

rfO Про воспалительные q факторы

О

Старение

PI3K сигнал Т PDH 1 (BRAF(V600E))

Рис.3. Общая схема индукторов клеточного старения и основных эффекторных сигнальных путей (по van Deursen J.M., 2014)

В процессе клеточного старения происходит накопление клетками кожи множества повреждений и репликативных ошибок в структуре ДНК. В результате, стареющие кератиноциты могут становиться устойчивыми к апоптозу, количество клеток Лангерганса снижается на 50% к 80 годам жизни, популяция меланоцитов снижается от 8 до 20% каждую декаду после 30 лет. Показано, что под влиянием накопленных ошибок ДНК, снижается пролиферативная и синтезирующая активность дермальных фибробластов (Fore J. et al., 2006).

1.2.2. Окислительный стресс

Как показано в многочисленных исследованиях, ведущую роль в патогенезе старения кожи играет окислительный стресс, который может быть обусловлен как внешними, так и внутренними факторами (рис.4). При эндогенном старении его развитие чаще всего связывают со снижением активности антиоксидантных ферментов, включая Си,2п-супероксиддисмутазу, каталазу и глутатионпероксидазу (Kohen R., Gati I., 2000). При экзогенном или фотостарении, увеличение продукции супероксида вызвано переносом электрона с нескольких УФ-абсорбирующих хромофоров, таких как НАДН, НАДФН, триптофан, рибофлавин или транс-уроканиновая кислота, на молекулярный кислород (Slominski А. et al., 2004, Rittie L., Fisher G.J., 2002). Супероксид под влиянием супероксиддисмутазы образует Н2О2, которая в присутствии переходных металлов, например, железа и меди, подвергается конверсии в высокореактивный гидроксил радикал. Эти соединения способны активировать некоторые сигнальные протеины, как Raf, протеин тирозин фосфаты (PTPs) и МЕКК1 (Rittie L., Fisher G.J., 2015).

В результате происходит повышение уровня активирующего протеина 1 (АР-1), стимулирующего активность матричных металлопротеиназ 1, 3 и 9

(ММР1, 3, 9), что приводит к разрушению внеклеточного матрикса кожи. В то же время АФК снижают содержание фактора TGF-02, отвечающего за синтез нового коллагена. Таким образом, в коже формируется дисбаланс внеклеточных белков (Helfrich Y.R. et al, 2008). В дополнение, воздействие УФ снижает синтез ростовых факторов и увеличивает экспрессию тромбоспондина-1 (TSP-1) -ингибитора ангиогенеза, что приводит к ухудшению кровоснабжения кожи и снижению репаративной активности клеток (КоЫ Е. et al., 2011). Во многих исследованиях показано, что окислительный стресс может быть причиной клеточного старения и хронического воспаления, так как свободные радикалы способны повреждать ДНК, липиды, белки клеток и внеклеточного матрикса (ВКМ) (Jenkins G., 2002).

Старение

снижение антиоксидантной защиты

УФ облучение

увеличение окислительного стресса

накопление мутаций ДНК

I

измененная структура генов

стимуляция трансдукционных сигнальных путей

1

измененная активность генов

модификация белков

1

белки с измененной структурой и функциями

I

ДИСРЕГУЛЯЦИЯ ДИСРЕГУЛЯЦИЯ

ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ГОМЕОСТАЗА ВНЕКЛЕТОЧНОГО ГОМЕОСТАЗ/»

Рис.4. Общая схема влияния окислительного стресса на эндогенные процессы (по Rittie L., Fisher G.J., 2002.)

1.2.3. Хроническое воспаление

Иммунная система кожи обеспечивает защиту от инфекций, развития раковых заболеваний, очищает ткань от поврежденных клеток, но под действием УФ-излучения иммунная система может активировать процесс старения кожи. В целом, при старении функция иммунной системы постепенно угнетается - за счет инволюции тимуса уменьшается количество наивных Т-клеток, причём в первую очередь это затрагивает популяцию CD8+ наивных клеток, и в меньшей степени - CD4+ клеток, снижается разнообразие Т-клеточных рецепторов, падает количество наивных B-клеток, и, как результат, снижается количество и афинность продуцируемых ими антител, что делает организм более уязвимым для различных инфекций (Castelo-Branco С., Soveral I., 2014; Rittie L., Fisher G.J., 2015; Sunderkötter С. et al., 1997). В коже с возрастом уменьшается количество и миграционная активность дендритных клеток плазмацитоидного и миелоидного происхождения (клетки Лангерганса), которые выполняют функцию антиген-презентирующих клеток (Castelo-Branco С., Soveral I., 2014), а действие УФ-излучения дополнительно стимулирует эти процессы (Bennett M.F. et al., 2008).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Кожина, Кристина Витальевна, 2017 год

Список используемой литературы

1. Авантажиато А., Палмьери А., Каринчи Ф., Пасин М., Бертуччи Дж. JI. Биостимуляция и биоревитализация: влияние различных препаратов на фибробласты кожи человека // Инъекционные методы в косметологии. -

2015. -№. 1. - С. 60-66.

2. Быков B.JI. Частная гистология (краткий обзорный курс): учебник / СПб.: Сотис, 2007. - 304 с.

3. Волкова Е., Берзагова JL, Григорьева А., Кожина К., Калиш К. Meso-Wharton PI99 - новый пептидсодержащий препарат для обновления клеточных структур кожи //Инъекционные методы в косметологии. -

2016. -№. 1. - С. 98-102.

4. Золотенкова Г.В., Ткаченко С.Б., Пиголкин Ю.И. Современные неинвазивные методы оценки возрастных изменений кожи // Судебно-медицинская экспертиза, 2015.-Т.58,№1,-С.26-30

5. Коваленко A.A., Хугаева В.К., Харнас С.С., Полунин Г.В. Влияние пептидного лимфостимулятора на заживление энтероанастамоза конец в конец при резекции тонкой кишки крысы после обтурации (экспериментальное исследование) // Вестник лимфологии, 2013. - №3. -С.19.

6. Колокольцова Т.Д. Создание аттестованных коллекций и банков культур клеток для научных исследований, производства препаратов, диагностики и лечения, дис. ... док. биол. наук. - Щёлково. - 2008. - 296с.

7. Колокольцова Т.Д., Сабурина И.Н. Патологические аспекты микоплазменной контаминации клеточных культур // Патогенез. - 2013. -Т. 11. -№. 3. - С. 29-31.

8. Колокольцова Т.Д., Сабурина И.Н., Рыбаков A.C. Культура клеток как уникальная модель для исследования в современной биологии и медицине //Патогенез.-2014.-Т. 11. -№. 2. - С. 17-25.

9. Колосов Н.Г., Ефремов А.В, Колокольцова Т.Д, и др. Опыт культивирования фибробластов пригодных для лечения ран различной этиологии // Вестник трансплантологии и биоискусственных органов. -2003. -№3. - С. 57-59.

Ю.Петриковский Б. Клеточное обновление кожи как результат пептидной регуляции активности собственных стволовых клеток // Эстетическая медицина. - 2012. - № 2. - С. 283-293.

П.Репин B.C., Сабурина И.Н., Кошелева Н.В., Горкун A.A., Зурина И.М., Кубатиев A.A. 3D технология сборки и поддержания одиночных дормантных микросфер из 2000 соматических клеток человека с их вторичной репаративной активацией in vitro // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2014. - № 3. - С. 161-169.

12.Сабурина И.Н., Колокольцова Т.Д., Кошелева Н.В., Зурина И.М., Горкун A.A., Орлов A.A., Ольховцев А.Н., Юдин Д. А. Исследование цитотоксичности стоматологических имплантов EasyFastS (Ti) и EasyKon (Zr02) in vitro // Новое в стоматологии. - 2014. - №1. - С. 48-52.

13.Сабурина И.Н., Репин B.C. ЗО-культивирование: от отдельных клеток к регенерационной ткани (к вопросу о феномене эпителио-мезенхимальной пластичности) // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2010. -Т.5. -№2. -С. 75-86.

14.Смирнова И.О. Функциональная морфология старения кожи // Успехи геронтологии. - 2004. - Т. 13. - С. 44-51.

15.Стенько А., Волкова Е., Чайковская Е., Шматова А., Кожина К., Берзегова JL, Григорьева А., Калиш К. Применение инъекционного пептидного

препарата в комплексной коррекции атрофических рубцов //KOSMETIC International. - 2016. - №1. - С. 24-28.

16.Султанов Д.В., Хугаева В.К. Метод прижизненного изучения микроциркуляции легких у крыс с помощью модифицированной камеры. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2014. -Т.58, № 3. - С. 102-104.

17.Хугаева В.К., Султанов Д.В. Лимфостимулирующая активность препаратов, применяемых при патологии легких. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - Т. 154, № 4. - С. 427429.

18.Юцковская Я. А., Данилова А. А. Терапия кожи с признаками хронологического старения препаратом Meso-WhartonP199. Клинический пример // Пластическая хирургия и косметология. - 2014. - №3. - С. 337496.

19.Abreu-Velez A.M., Howard M.S. Collagen IV in normal skin and in pathological processes // North American journal of medical sciences. - 2012. -T. 4. - №. l.-C. 1.

20.Aoki S., Toda S., Ando Т., Sugihara H. Bone marrow stromal cells, preadipocytes, and dermal fibroblasts promote epidermal regeneration in their distinctive fashions // Molecular biology of the cell. - 2004. - V. 15. - №. 10. -P. 4647-4657.

21.Arno A.I., Amini-Nik S., Blit P.H., Al-Shehab M., Belo C., Herer E., Tien C.H., Jeschke M.G. Human Wharton's jelly mesenchymal stem cells promote skin wound healing through paracrine signaling // Stem cell research & therapy. -2014. -V. 5. - №. 1. - P. 1.

22.Astashkina A., Mann B., Grainger D.W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity // Pharmacology & therapeutics. - 2012. - V. 134. - №. 1. - P. 82-106.

23.Augustin C., Frei V., Perrier E., Hue A., Damour O. An in vitro selection of new cosmetic active compounds: From screening tests on monolayered fibroblast culture to efficiency study on 3-D dermal equivalent // J. Appl. Cosmetol. - 1997. -V. 15. - P. 1-12.

24.Barker J., Griffiths C.E.M., Nickoloff B.J., Mitra R.S., Dixit V.M. Keratinocytes as initiators of inflammation // The Lancet. - 1991. - V. 337. -№8735. - P. 211-214.

25.Bennett M.F., Robinson M.K., Baron E.D., Cooper K.D. Skin immune systems and inflammation: protector of the skin or promoter of aging? // Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings. - 2008. - V. 13. - №. 1. -P. 15-19.

26.Bosset S., Bonnet-Duquennoy M., Barre P., Chalon A., Kurfurst R., Bonte F., Schnebert S., le Varlet B., Nicolas J.F. Photoageing shows histological features of chronic skin inflammation without clinical and molecular abnormalities // British Journal of Dermatology. - 2003. - V. 149. - №. 4. - P. 826-835.

27.Braga V. Spatial integration of E-cadherin adhesion, signalling and the epithelial cytoskeleton // Current Opinion in Cell Biology. - 2016. - V. 42. - P. 138-145.

28.Bullard K. M., Longaker M. T., Lorenz H. P. Fetal wound healing: current biology // World journal of surgery. - 2003. - V. 27. - №. 1. - P. 54-61.

29.Campisi J., di Fagagna F.A. Cellular senescence: when bad things happen to good cells // Nature reviews Molecular cell biology. - 2007. - V. 8. - №. 9. -P. 729-740.

30.Castelo-Branco C., Soveral I. The immune system and aging: a review // Gynecological Endocrinology. - 2014. - V. 30. - №. 1. - P. 16-22.

31. Cheng W., Yan-hua R., Fang-gang N., Guo-an Z. The content and ratio of type I and III collagen in skin differ with age and injury //African Journal of Biotechnology. -2011. -V. 10. -№. 13. - P. 2524-2529.

32.Chung J.H., Eun H.C. Angiogenesis in skin aging and photoaging // The Journal of dermatology. - 2007. - V. 34. - №. 9. - P. 593-600.

33.Chung J.H., Seo J.Y., Lee M.K., Eun H.C., Lee J.H., Kang S., Fisher G.J., Voorhees J.J. Ultraviolet modulation of human macrophage metalloelastase in human skin in vivo // Journal of Investigative Dermatology. - 2002. - V. 119,-№. 2. - P. 507-512.

34.Coolen N.A., Schouten K.C., Middelkoop E., Ulrich M.M. Comparison between human fetal and adult skin //Archives of dermatological research. -2010. - V. 302. - №. 1. - P. 47-55.

35.Cristofalo V.J., Allen R.G., Pignolo R.P., Martin B.M., Beck J.C. Relationship between donor age and the replicative lifespan of human cells in culture: a réévaluation // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1998. - V. 95.-№ 18.-P. 10614-10619.

36.Cristofalo V.J., Volker C., Allen R.G. Use of the fibroblast model in the study of cellular senescence // Aging Methods and Protocols. - 2000. - P. 23-52.

37.Desmoulière A., Chaponnier C., Gabbiani G. Tissue repair, contraction, and the myofibroblast // Wound repair and regeneration. - 2005. - V. 13. - №. 1. - P. 7-12.

38.Doi H., Kitajima Y., Luo L., Yan C., Tateishi S., Ono Y., Urata Y., Goto S., Mori R., Masuzaki H., Shimokawa I., Hirano A., Li T-S. Potency of umbilical cord blood-and Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells for scarless wound healing // Scientific reports. - 2015. - V. 6. - P. 18844-18844.

39.Edmondson R., Broglie J.J., Adcock A.F., Yang L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors // Assay and drug development technologies. - 2014. - V. 12. - №.

4. - P. 207-218.

40.Eming S.A., Martin P., Tomic-Canic M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation // Sci. Transí. Med. - 2014. - V. 6. - № 265. - P. 265sr6-265sr6.

41.Fisher G.J., Shao Y., He T., Qin Z., Perry D., Voorhees J.J., Quan T. Reduction of fibroblast size/mechanical force down-regulates TGF-p type II receptor: implications for human skin aging // Aging cell. - 2016. - V. 15. - №. 1. - P. 67-76.

42.Fore J. A review of skin and the effects of aging on skin structure and function // Ostomy/wound management. - 2006. - V. 52. - №. 9. - P. 24-35.

43.Futagami A., Ishizaki M., Fukuda Y., Kawana S., Yamanaka N. Wound healing involves induction of cyclooxygenase-2 expression in rat skin // Lab. Invest. -2002. - V. 82. - № 11. - P. 1503-13.

44.Gilchrest B.A., Soter NA., Stoff J.S., Mihm M.C. The human sunburn reaction: histologic and biochemical studies // Journal of the American Academy of Dermatology. - 1981. - V. 5. -№. 4. - P. 411-422.

45.Goodwin T.J., McCarthy M., Cohrs R.J., Kaufer B.B. 3D tissue-like assemblies: A novel approach to investigate virus-cell interactions // Methods. -2015. -V. 90. - P. 76-84.

46.Gragnani A., Mac Cornick S., Chominski V., de Noronha S.M.R., de Noronha,

5.A.A.C., Ferreira L.M. Review of major theories of skin aging // Advances in Aging Research. - 2014. - V. 3. - P. 265-284

47.Grimbaldeston M.A., Simpson A., Finlay-Jones J.J., Hart P.H. The effect of ultraviolet radiation exposure on the prevalence of mast cells in human skin // British Journal of Dermatology. - 2003. - V. 148. - №. 2. - P. 300-306.

48.Gurtner G.C., Werner S., Barrandon Y., Longaker M.T. Wound repair and regeneration // Nature. - 2008. - V. 453. - №. 7193. - P. 314-321.

49.Hantash B.M., Zhao L., Knowles J.A., Lorenz H.P. Adult and fetal wound healing // Frontiers in Bioscience. - 2008. - V. 13. - P. 51-61.

50.Hase T., Shinta K., Murase T., Tokimitsu I., Hattori M., Takimoto R., Tsuboi R., Ogawa H. Histological increase in inflammatory infiltrate in sun-exposed skin of female subjects: the possible involvement of matrix metalloproteinase-1 produced by inflammatory infiltrate on collagen degradation // British Journal of Dermatology. - 2000. - V. 142. - №. 2. - P. 267-273.

51.Helfrich Y.R., Sachs D.L., Voorhees J.J. Overview of skin aging and photoaging // Dermatology Nursing. - 2008. - V. 20. - №. 3. - P. 177.

52.Helmo F.R., Machado J.R, Guimaraes C.S.D.O., Teixeira V.D.P.A., Reis M.A.D., Correa R.R.M. Fetal wound healing biomarkers // Disease markers. -

2013. - V. 35. - №. 6. - P. 939-944.

53.Hickman J.A., Graeser R., de Hoogt R., Vidic S., Brito C., Gutekunst M., van der Kuip H. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: capturing tumor complexity in vitro/ex vivo // Biotechnol. J. -

2014. - V. 9. - №. 9. - P. 1115-1128.

54.Hruza L.L., Pentland A.P. Mechanisms of UV-induced inflammation // Journal of Investigative Dermatology. - 1993. -V. 100. -№. 1. -P. 35-41.

55. Jenkins G. Molecular mechanisms of skin ageing // Mechanisms of ageing and development. - 2002. - V. 123. -№. 7. - P. 801-810.

56.Kamolz L.P., Keck M., Kasper C. Wharton's jelly mesenchymal stem cells promote wound healing and tissue regeneration // Stem cell research & therapy. -2014. -V. 5. - №. 3. - P. 62.

57.Keese C.R., Wegener J., Walker S.R., Giaever I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2004. - V. 101. - №. 6. - P. 1554-1559.

58.Kenny H. A., Lai-Nag M., White E.A., Shen M., Chiang C.Y., Mitra A.K., Zhang Y., Curtis M., Schryver E.M., Bettis S., Jadhav A. Quantitative high throughput screening using a primary human three-dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy // Nature communications. - 2015. - V. 6.

59.Khoshnoodi J., Pedchenko V., Hudson B. G. Mammalian collagen IV // Microscopy research and technique. - 2008. - V. 71. - №. 5. - P. 357-370.

60.Kim M.J., Shin K.S., Jeon J.H., Lee D.R., Shim S.H., Kim J.K., Cha D.H., Yoon T.K., Kim G.J. Human chorionic-plate-derived mesenchymal stem cells and Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: a comparative analysis of their potential as placenta-derived stem cells // Cell and tissue research. - 2011. -V. 346. -№. 1. - P. 53.

61.Kock A., Schwarz T., Kirnbauer R., Urbanski A., Perry P., Ansel J.C., Luger T.A. Human keratinocytes are a source for tumor necrosis factor alpha: evidence for synthesis and release upon stimulation with endotoxin or ultraviolet light // The Journal of experimental medicine. - 1990. - V. 172. -№. 6.-P. 1609-1614.

62.Kohen R., Gati I. Skin low molecular weight antioxidants and their role in aging and in oxidative stress // Toxicology. - 2000. - V. 148. - №. 2. - P. 149157.

63.Kohl E., Steinbauer J., Landthaler M., Szeimies R.M. Skin ageing // Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. - 2011. - V. 25. -№. 8. - P. 873-884.

64.Kosheleva N.V., Ilina I.V., Kozhina K.V., Zurina I.M., Roskova A.E., Gorkun A.A., Ovchinnikov A.V., Agranat M.B., Morozov S.G., Saburina, I. N. Cellular model based on laser microsurgery of cell spheroids to study the repair process // Russian Journal of Developmental Biology. - 2017. - V. 48. - №. 1. - P. 5664.

65.Kosheleva N.V., Ilina I.V., Zurina I.M., Roskova A.E., Gorkun A.A., Ovchinnikov A.V., Agranat M.B., Saburina I.N. Laser-based technique for controlled damage of mesenchymal cell spheroids: a first step in studying reparation in vitro // Biology Open. - 2016. - V. 5. - № 7. - P. 993-1000.

66.Kubatiev A.A., Zurina I.M, Kosheleva N.V., Gorkun A.A., Saburina I.N, Repin V.S. From 2D cell phenotypes to 3D live high-content imaging: new ways to windows // Journal of Cytology & Histology. - 2015. - V. 6. - № 6. -P. 378

67.Kuhn K. Basement membrane (type IV) collagen // Matrix Biology. - 1995. -V. 14. -№. 6. - P. 439-445.

68.Larson B.J., Longaker M.T., Lorenz H.P. Scarless fetal wound healing: a basic science review //Plastic and reconstructive surgery. - 2010. - V. 126. - №. 4. -P. 1172.

69.Lebonvallet N, Jeanmaire C., Danoux L., Sibille P., Pauly G., Misery L. The evolution and use of skin explants: potential and limitations for dermatological research // European Journal of Dermatology. - 2010. - V. 20. - №. 6. - P. 671-684.

70.Li X., Talts U., Talts J.F., Arman E., Ekblom P., Lonai P. Akt/PKB regulates laminin and collagen IV isotypes of the basement membrane // Proceedings of

the National Academy of Sciences. - 2001. - V. 98. - №. 25. - P. 1441614421.

71.Liang C.C., Park A.Y., Guan J.L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro // Nature protocols. -2007. - V. 2. - №. 2. - P. 329-333.

72.Lin R.Z., Chang H.Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research // Biotechnology journal. - 2008. - V. 3.-№. 9-10.-P. 1172-1184.

73.Lo D.D., Zimmermann A.S., Nauta A., Longaker M.T., Lorenz H.P. Scarless fetal skin wound healing update // Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. - 2012. - V. 96. - №. 3. - P. 237-247.

74.Maillard E., Sencier M.C., Langlois A., Bietiger W., Krafft M.P., Pinge, M., Sigris S. Extracellular matrix proteins involved in pseudoislets formation // Islets. - 2009. - V. 1. - №. 3. - P. 232-241.

75.Makrantonaki E., Zouboulis C.C. Molecular mechanisms of skin aging // Annals of the New York Academy of Sciences. - 2007. - V. 1119. - №. 1. - P. 40-50.

76.Mansilla E., Marin G.H., Sturla F., Drago H.E., Gil M.A., Salas E., Gardiner M.C., Piccinelli G., Bossi S., Salas E., Petrelli L., Iorio G., Ramos C.A., Soratti C. Human mesenchymal stem cells are tolerized by mice and improve skin and spinal cord injuries // Transplantation proceedings. - 2005. - V. 37. - №. 1. -P. 292-294.

77.Massague J. How cells read TGF-P signals // Nature reviews Molecular cell biology. - 2000. - V. 1. -№. 3. - P. 169-178.

78.Matsumura Y., Ananthaswamy H.N. Toxic effects of ultraviolet radiation on the skin // Toxicology and applied pharmacology. - 2004. - V. 195. - №. 3. -P. 298-308.

79.Mehta R.C., Fitzpatrick R.E. Endogenous growth factors as cosmeceuticals // Dermatologic therapy. - 2007. - V. 20. - №. 5. - P. 350-359.

80.Montagna W. The structure and function of skin / Elsevier, 2012. - 448p.

81.Moon J.H., Kwak S.S., Park G., Jung H.Y., Yoon B.S., Park J., Ryu K.S., Choi S.C., Maeng I., Kim B., Jun E.K., Kim S., Kim A., Oh S., Kim H., Kim K.D., You S. Isolation and characterization of multipotent human keloid-derived mesenchymal-like stem cells // Stem cells and development. - 2008. - V. 17. -№. 4. - P. 713-724.

82.Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // Journal of immunological methods. - 1983. - V. 65. - №. 1-2. - P. 55-63.

83,Okazaki M., Yoshimura K., Suzuki Y., Harii K. Effects of subepithelial fibroblasts on epithelial differentiation in human skin and oral mucosa: heterotypically recombined organotypic culture model // Plastic and reconstructive surgery. - 2003. - V. 112. - №. 3. - P. 784-792.

84.01czyk P., Mencner L., Komosinska-Vassev K. The role of the extracellular matrix components in cutaneous wound healing // BioMed research international. - 2014. - V. 2014. - e747584.

85,Oryan A., Alemzadeh E. Effects of insulin on wound healing: A review of animal and human evidences // Life Sciences. - 2017. - № 17. - P. 30071.

86.0'toole E. A. Extracellular matrix and keratinocyte migration // Clinical and experimental dermatology. - 2001. - V. 26. - №. 6. - P. 525-530.

87.Pastar I., Stojadinovic O., Yin N.C., Ramirez H., Nusbaum A.G., Sawaya A., Patel S., Khalid L., Isseroff R., Tomic-Canic M. Epithelialization in wound healing: a comprehensive review // Advances in wound care. - 2014. - V. 3. -№. 7. - P. 445-464.

88.Petrikovsky B.M., Agaronin I.F. Therapeutic preparations containing Wharton's jelly/Патент CHIAUS2011/0002883A1 от 06.01.2011

89.Peng X., Cuff L.E., Lawton C.D., DeMali K.A. Vinculin regulates cell-surface E-cadherin expression by binding to P-catenin // J Cell Sci. - 2010. - V. 123. -№. 4. - P. 567-577.

90.Peura M., Bizik J., Salmenpera P., Noro A., Korhonen M., Patila Т., Vento A., Vaheri A., Alitalo R., Vuola J., Harjula A., Kankuri E. Bone marrow mesenchymal stem cells undergo nemosis and induce keratinocyte wound healing utilizing the HGF/c-Met/PI3K pathway // Wound repair and regeneration. - 2009. - V. 17. - №. 4. - P. 569-577.

91 .Pillai S., Oresajo C., Hayward J. Ultraviolet radiation and skin aging: roles of reactive oxygen species, inflammation and protease activation, and strategies for prevention of inflammation-induced matrix degradation-a review // International journal of cosmetic science. - 2005. - V. 27. - №. 1. - P. 17-34.

92.Ramata-Stunda A., Boroduskis M., Vorobjeva V., Ancans J. Cell and tissue culture-based in vitro test systems for evaluation of natural skin care product ingredients // Environmental and Experimental Biology. - 2013 - №. 11 - P. 159-177

93.Rattan S.I.S. Aging of skin cells in culture // Textbook of Aging Skin. -Springer Berlin Heidelberg, 2010. - P. 487-492

94.Repin V.S., Saburina I.N., Kosheleva N.V., Gorkun A.A., Zurina I.M., Kubatiev A.A. 3D-technology of the formation and maintenance of single dormant microspheres from 2000 human somatic cells and their reactivation in vitro // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2014. - V. 158. -Issue 1. - P. 137-144.

95.Rijken F., Kiekens R.C., van den Worm E., Lee P.L., van Weelden H., Bruijnzeel P.L. Pathophysiology of photoaging of human skin: focus on

neutrophils // Photochemical & Photobiological Sciences. - 2006. - V. 5. - №. 2.-P. 184-189.

96.Rijken F., Kiekens R.C.M., Bruijnzeel P.L.B. Skin-infiltrating neutrophils following exposure to solar-simulated radiation could play an important role in photoageing of human skin // British Journal of Dermatology. - 2005. - V. 152. -№. 2. - P. 321-328.

97.Rittie L., Fisher G. J. UV-light-induced signal cascades and skin aging //Ageing research reviews. - 2002. - V. 1. - №. 4. - P. 705-720.

98.Rittie L., Fisher G.J. Natural and sun-induced aging of human skin // Cold spring harbor perspectives in medicine. - 2015. - V. 5. - №. 1. - P. a015370.

99.Rodriguez L. G., Wu X., Guan J. L. Wound-healing assay // Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. - 2005. - P. 23-29.

100. Salmenpera P., Kankuri E., Bizik J., Siren V., Virtanen I., Takahashi S., Leiss M., Fassler R., Vaheri A. Formation and activation of fibroblast spheroids depend on fibronectin-integrin interaction // Experimental cell research. -2008. -V. 314. -№. 19. - P. 3444-3452

101. Scharffetter-Kochanek K., Brenneisen P., Wenk J., Herrmann G., Ma W., Kuhr L., Meewes C., Wlaschek M. Photoaging of the skin from phenotype to mechanisms // Experimental Gerontology. - 2000. - V. 35. - №. 3. - P. 307316.

102. Seet W.T., Maarof M., Anuar K.K., Chua K.H., Irfan A.W.A., Ng M.H., Aminuddin B.S., Ruszymah B.H.I. Shelf-Life Evaluation of Bilayered Human Skin Equivalent, MyDerm™ // PLoS ONE. - 2012. - V. 7. - №. 8. - P. e40978.

103.Seo J.Y., Kim E.K., Lee S.H., Park K.C., Kim K.H., Eun H.C., Chung J.H Enhanced expression of cylooxygenase-2 by UV in aged human skin in vivo //

Mechanisms of ageing and development. - 2003. - V. 124. - №. 8. - P. 903910.

104.Shephard P., Martin G., Smola-Hess S., Brunner G., Krieg T., Smola H. Myofibroblast differentiation is induced in keratinocyte-fibroblast co-cultures and is antagonistically regulated by endogenous transforming growth factor-p and interleukin-1 // The American journal of pathology. - 2004. - V. 164. - №. 6.-P. 2055-2066.

105.Slominski A., Tobin D.J., Shibahara S., Wortsman J. Melanin pigmentation in mammalian skin and its hormonal regulation // Physiological reviews. - 2004. -V. 84. -№. 4. - P. 1155-1228. 106.Smith W.L., Meade E.A., Dwitt D.L. Pharmacology of Prostaglandin Endoperoxide Synthase Isozymes-1 and-2a // Annals of the New York Academy of Sciences. - 1994. -V. 714. -№. 1. - P. 136-142. 107.Sobolewski K., Malkowski A., Bankowski E., Jaworski S. Wharton's jelly as a reservoir of peptide growth factors // Placenta. - 2005. - V. 26. - №. 10. - P. 747-752.

108.Sorrell J.M., Baber M.A., Caplan A.I. Site-matched papillary and reticular human dermal fibroblasts differ in their release of specific growth factors/cytokines and in their interaction with keratinocytes // Journal of cellular physiology. - 2004. - V. 200. - №. 1. - P. 134-145. 109.Sorrell J.M., Caplan A.I. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep //

Journal of cell science. - 2004. - V. 117. - №. 5. - P. 667-675. llO.Sunderkotter C., Kalden H., Luger T.A. Aging and the skin immune system //

Archives of dermatology. - 1997. -V. 133. -№. 10. - P. 1256-1262. lll.Svobodova A., Walterova D., Vostalova J. Ultraviolet light induced alteration to the skin // Biomedical Papers-Palacky University in Olomouc. - 2006. - V. 150. -№. 1. - P. 25.

112.Takahashi M., Eda A., Fukushima T., Hohjoh H. Reduction of type IV collagen by upregulated miR-29 in normal elderly mouse and klotho-deficient, senescence-model mouse // PloS one. - 2012. - V. 7. - №. 11. - P. e48974.

113.Takeda K., Gosiewska A., Peterkofsky B. Similar, but not identical, modulation of expression of extracellular matrix components during in vitro and in vivo aging of human skin fibroblasts // Journal of cellular physiology. -1992. - V. 153. - №. 3. - P. 450-459.

114.Takii T., Yamamoto Y., Chiba T., Abe C., Belisle J.T, Brennan P.J., Onozaki K. Simple fibroblast-based assay for screening of new antimicrobial drugs against Mycobacterium tuberculosis // Antimicrob Agents Chemother. - 2002. - V. 46. - №. 8. - P. 2533-2539.

115.Tanaka K., Asamitsu K., Uranishi H., Iddamalgoda A., Ito K., Kojima H., Okamoto T. Protecting skin photoaging by NF-kB inhibitor // Current drug metabolism.-2010.-V. ll.-№. 5.-P. 431-435.

llö.Tanaka K., Hasegawa J., Asamitsu K., Okamoto T. Prevention of the ultraviolet B-mediated skin photoaging by a nuclear factor kB inhibitor, parthenolide // Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. -2005. -V. 315. -№. 2. - P. 624-630.

117.Thomas W.A., Boscher C., Chu Y.S., Cuvelier D., Martinez-Rico C., Seddiki R., Heysch J., Ladoux B., Thiery J.P., Mege R.-M., Dufour S. a-Catenin and vinculin cooperate to promote high E-cadherin-based adhesion strength // Journal of Biological Chemistry. - 2013. - V. 288. - №. 7. - P. 4957-4969.

118.Tigges J., Krutmann J., Fritsche E., Haendeler J., Schaal H., Fischer J.W., Kalfalah F., Reinke F., Reifenberger G, Stühler K, Ventura N, Gundermann S, Boukamp P, Boege F. The hallmarks of fibroblast ageing // Mechanisms of ageing and development. - 2014. - V. 138. - P. 26-44.

119.Tracy L.E., Minasian R.A., Caterson E.J. Extracellular matrix and dermal fibroblast function in the healing wound // Adv. Wound Care (New Rochelle). - 2016. - V. 5. - № 3. - P. 119-136

120. van Deursen J. M. The role of senescent cells in ageing // Nature. - 2014. - V. 509. -№. 7501. - P. 439-446

121.Van Pham P., Dang L.T., Dinh U.T., Truong H.T., Huynh B.N, Van Le D., Phan N.K. In vitro evaluation of the effects of human umbilical cord extracts on human fibroblasts, keratinocytes, and melanocytes // In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. - 2014. - V. 50. - №. 4. - P. 321-330.

122.Varani J., Dame M.K., Rittie L., Fligiel S.E., Kang S., Fisher G.J., Voorhees J.J. Decreased collagen production in chronologically aged skin: roles of age-dependent alteration in fibroblast function and defective mechanical stimulation // The American journal of pathology. - 2006. - V. 168. - №. 6. - P. 18611868.

123.Vázquez F., Palacios S., Alemañ N, Guerrero F. Changes of the basement membrane and type IV collagen in human skin during aging // Maturitas. -1996. - V. 25. - №. 3. - P. 209-215.

124.Verrecchia F., Mauviel A. Transforming growth factor-beta signaling through the Smad pathway: role in extracellular matrix gene expression and regulation // J. Invest. Dermatol. - 2002. - V. 118. - № 2. - P. 211-215.

125.Werner S., Krieg T., Smola H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing // Journal of Investigative Dermatology. - 2007. - V. 127. - №. 5. - P. 998-1008.

126.Wilgus T.A. Regenerative healing in fetal skin: a review of the literature // Ostomy/wound management. - 2007. - V. 53. - №. 6. - P. 16-31

127.Woodley D.T. Distinct Fibroblasts in the Papillary and Reticular Dermis: Implications for Wound Healing // Dermatologic clinics. - 2017. - V. 35. - №. l.-P. 95-100.

128.Xue M., Jackson C.J. Extracellular matrix reorganization during wound healing and its impact on abnormal scarring // Advances in wound care. - 2015. -V. 4. - №. 3. - P. 119-136.

129.Yamaguchi Y., Hearing V.J., Itami S., Yoshikawa K., Katayama I. Mesenchymal-epithelial interactions in the skin: aiming for site-specific tissue regeneration // Journal of dermatological science. - 2005. - V. 40. - №. l.-P. 1-9.

130.Yates C.C., Hebda P., Wells A. Skin wound healing and scarring: fetal wounds and regenerative restitution // Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. - 2012. - V. 96. - №. 4. - P. 325-333.

131.Yurchenko N.D., Kolokoltsova T.D et al. The selection of conditions for isolation of viable human skin cells // Biotechnology. - 1997. - V. 11-12. - P. 37-41.

132.Zang R., Li D., Tang I.-C., Wang J., Yang S.-T. Cell-based assays in high-throughputs for drug discovery // International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. - 2012. - V. 1. - №. 1. - P. 31.

133.Zhang L., Falla T.J. Cosmeceuticals and peptides // Clinics in dermatology. -2009. - V. 27. - №. 5. - P. 485-494.

134.Zhao Y., Wang J., Yan X., Li D., Xu J. Preliminary survival studies on autologous cultured skin fibroblasts transplantation by injection //Cell transplantation. - 2008. - V. 17. - №. 7. - P. 775-783

135.Zouboulis C.C., Makrantonaki E. Clinical aspects and molecular diagnostics of skin aging // Clinics in dermatology. - 2011. - V. 29. - №. l.-P. 3-14.

Выражаю особую благодарность!

Морозову Сергею Георгиевичу Скуратовской Ларисе Николаевна Кожевниковой Любови Михайловне Палъцыну Александру Александровичу Сабуриной Ирине Николаевне Волковой Елене Николаевне Колоколъцовой Тамаре Дмитриевне Дубовой Татьяне Клеониковне Ткаченко Сергею Борисовичу Горкун Анастасии Алексеевне Кошелевой Настасье Владимировне Зуриной Ирине Михайловне