Исследование биофизических параметров полимерных матриксов для их применения в качестве подложек биоинженерных кожных трансплантатов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Фильков Глеб Игоревич

• Фильков Глеб Игоревич
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Фильков Глеб Игоревич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. АНАЛИЗ СОВРЕМЕННОГО СОСТОЯНИЯ И ТЕНДЕНЦИЙ РАЗВИТИЯ ОБЛАСТИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1 Строение и функции кожи

1.1.1 Структурная организация эпидермиса как результат дифференцировки кератиноцитов

1.1.2. Особенности структурной организации дермо-эпидермального соединения

1.1.3 Строение и функции дермы

1.2 Эквиваленты кожи для создания раневых покрытий

1.2.1 Исторический обзор

1.2.2 3Б-модели кожи в терапии повреждений кожных покровов

1.2.3. Существующие коммерческие биомедицинские продукты на основе клеток и биоматериалов для терапии повреждений кожи

1.2.4. Направления по усовершенствованию биомедицинских продуктов на основе клеток и (или) биоматериалов для терапии повреждений кожи

1.3 Теоретическое обоснование выбора полимеров для изучения и использования в качестве подложки для создаваемого раневого покрытия

ГЛАВА 2. ПОИСК ОПТИМАЛЬНОГО МАТРИКСА НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ТРЕХСЛОЙНОГО РАНЕВОГО ПОКРЫТИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

2.1 Физико-химическая характеристика исследуемых полимерных матриксов

2.2 Оценка биодеградации полимерных матриксов in vitro

2.3 Оценка биодеградации полимерных матриксов in vivo

ГЛАВА 3. ОЦЕНКА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ И ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ФИБРОБЛАСТОВ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ НА ПОВЕРХНОСТИ ПОЛИМЕРНЫХ МАТРИКСОВ

3.1 Оценка жизнеспособности и пролиферативной активности фибробластов при культивировании на поверхности полимерных матриксов

3.2 Оценка жизнеспособности фибробластов при культивировании на поверхности полимерных матриксов

ГЛАВА 4. ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ПОЛУЧЕННЫХ БИОИНЖЕНЕРНЫХ КОЖНЫХ ТРАНСПЛАНТАТОВ В ЛЕЧЕНИИ МЕХАНИЧЕСКИХ И ТЕРМИЧЕСКИХ РАН

4.1. Разработка способа получения раневых покрытий и поиск оптимального качественного состава и эффективной концентрации клеточных популяций

4.2. Изучение возможности эффективного применения разработанного клеточного продукта для лечения механических травм кожи

4.3. Проведение пилотных испытаний раневого покрытия с целью ограниченной оценки безопасности и проверки эффективности по сравнению с существующими методами лечения

термических повреждений кожи

ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Благодарности

Список сокращений и условных обозначений

Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование биофизических параметров полимерных матриксов для их применения в качестве подложек биоинженерных кожных трансплантатов»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования

Разработка новых биоинженерных кожных трансплантатов является актуальной задачей для целого ряда областей современной медицины, требующей, в том числе, и фундаментальных исследований в области клеточно-молекулярной биологии. Подобные раневые покрытия применяют для терапии как острых повреждений кожных покровов, в первую очередь термических, так и в терапии хронических ран [22]. Помимо этого, кожные эквиваленты могут быть использованы для тестирования лекарственных препаратов и изучения механизмов биологических процессов в коже [111].

Раневое покрытие должно удовлетворять ряду условий, среди которых, в первую очередь, восстановление барьерной функции кожи, приживаемость и стимулирование регенеративных процессов, биосовместимость и отсутствие иммунного ответа, а также, максимальное восстановление первоначальной морфологии повреждённого участка кожи.

Первые методы культивирования кожи взрослых млекопитающих in vitro включали сепарацию кожи человека (эпидермиса от дермы), выделение и культивирование кератиноцитов [7], в том числе, с использованием фибробластов в качестве питающих слоев для генерации культур кератиноцитов человека [4, 53].

Согласно существующим на сегодняшний день представлениям, биоинженерный кожный трансплантат состоит из матрицы на основе биоразлагаемых полимеров и клеток, поэтому новые исследования сконцентрированы, в первую очередь, на оптимизации микроокружения клеток и клеточного состава раневых покрытий [54,55,3].

Кожный эквивалент может быть изготовлен в виде многослойных каркасов путем сочетания аддитивного производства (например, BD-биопечати) с электроспиннингом. Комбинируя эти два метода, можно получить биоматериал с постепенно изменяющейся пористостью, имитирующий наноструктуры внеклеточного матрикса [59]. В итоге модель будет представлять собой

трехслойный гидрогелевый биоматериал. Гидрогели являются высокогидратированным ассоциированным матриксом, который обладает высокой абсорбирующей способностью и может содержать 99% биологической жидкости [60]. Таким образом, гидрогелевые биоматериалы из природных полимеров (коллаген, фибрин, хитозан, гиалуроновая кислота) или их композиты с синтетическими материалами не только могли бы обеспечивать соответствующее увлажнение и снабжение кислородом места раны, но и были бы идеальны для инкапсуляции клеток и факторов роста, например, фактора роста кератиноцитов (KGF), эпидермального фактора роста (EGF) и фактора роста эндотелия сосудов (VEGF).

Клеточный состав раневого покрытия также может быть оптимизирован [61]. Помимо кератиноцитов и фибробластов, проводится усовершенствование биоинженерных кожных трансплантатов путём внедрения в их состав мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток, индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и эндотелиоцитов, в том числе, оверэкспрессирующих, например, ростовые факторы [57, 61]. Обогащенный таким образом гиподермальный слой обладает иммуномодулирующими свойствами и способствовать ускоренной регенерации и васкуляризации кожи.

Таким образом, выбор наиболее эффективных (с точки зрения культивирования клеточных культур) полимерных матриксов на основе их биофизических свойств, модификация клеточного состава и, в конечном счете, создание кожного трансплантата, обладающего большей эффективностью по сравнению с существующими, представляет собой актуальную задачу современной клеточной биофизики.

В связи с вышеизложенным целью данной работы являлось исследование биофизических параметров полимерных матриксов для их применения в качестве подложек биоинженерных кожных трансплантатов.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие основные задачи:

1. Методом электроформования получить матриксы различного полимерного состава и исследовать их физические и химические свойства;

2. Разработать протокол культивирования кератиноцитов, фибробластов и мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (ММСК) в ко-культуре на поверхности полимерных матриксов и оценить их пролиферацию;

3. Исследовать in vitro цитотоксичность и биосовместимость полученных полимерных матриксов и морфологические свойства сформированных раневых покрытий;

4. In vivo определить эффективность и безопасность применения раневых покрытий при лечении механических травм и ожогов.

Научная новизна диссертационного исследования заключается в следующем:

1. Впервые показано, что в качестве матрикса раневого покрытия полидиоксанон (PDX), полученный методом электроспиннинга, является относительно мягким (модуль Юнга 37 ± 6 МПа) по сравнению с полилактидом (PLA) и полилактидом с желатином (9:1 по массе), выдерживает большее относительное удлинение (на уровне 137 ± 4%) и обладает максимальной прочностью по сравнению с полилактидом (PLA) и полилактидом с желатином. Кроме того, in vitro и in vivo продемонстрировано, что деградация матрикса из PDX, полученного методом электроспининга, происходит быстрее и в случае in vivo исследования за 30 дней составила 89 ± 16%, в то время как на этом же сроке PLA:gelatin плёнки деградировали на 30 ± 6%, а PLA - менее чем на 10 ± 6%.

2. Впервые проведено совместное культивирование кератиноцитов, фибробластов и мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток на подложке из PDX.

3. Впервые создано раневое покрытие при одновременном применении матрикса из полидиоксанона, кератиноцитов, фибробластов и мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток и показана его биологическая эффективность.

Теоретическая и практическая значимость.

Результаты данной работы являются важным шагом на пути создания многослойного биоинженерного кожного трансплантата. Полученные данные позволяют определить необходимые параметры для подбора подходящего полимерного матрикса и позволяют планировать дальнейшие исследования по созданию раневых покрытий.

Разработанные решения могут использоваться как для наработки раневых покрытий, так и для in vitro скрининга новых лекарственных средств для лечения заболеваний кожного покрова.

Результаты диссертации использованы при выполнении НИР «Исследования по созданию лаборатории клеточных культур для культивирования различных клеток (хондроцитов, фибробластов, кардиомиоцитов, кератиноцитов, стволовых и др.) для использования в интересах военной медицины», шифр «Репарация».

Положения, выносимые на защиту:

1. Матрикс из полидиаксанона, полученный методом электроспининга, обладает модулем Юнга 37 ± 6 Мпа, выдерживает относительное удлинение на уровне 137 ± 4%, биодеградирует за 30 дней на 89 ± 16%, на основании чего может быть сделан вывод, что данный полимер больше подходит для использования в качестве полимерной подложки при выращивании биоинженерного кожного трансплантата чем матриксы из PLA и PLA c желатином, за счет своей большей прочности, мягкости и скорости биодеградации.

2. Матриксы из полилактида, полилактида с желатином (9:1 по массе) и полидиоксанона не угнетают жизнеспособность клеток и не влияют на скорость пролиферации, поэтому могут быть использованы для получения биоинженерного кожного трансплантата.

3. Полученное раневое покрытие обладает анатомической организацией схожей с нативной кожей.

4. Подтверждена эффективность и ограниченно проверена безопасность применения раневых покрытий при лечении механических травм и ожогов на животных моделях.

Личный вклад автора. Автором лично проведен анализ современных раневых покрытий и их клинического применения, обработаны результаты и сформулированы выводы исследований, с непосредственным участием автора составлен дизайн экспериментов и проделана работа с клеточными культурами и полимерными матриксами.

Методы исследования. В работе использованы методы проточной цитометрии, иммуноокрашивания, флуоресцентной микроскопии, иммуногистохимии и методы статистического анализа. Объектами исследования выступали полимерные матриксы, полученные методом электроформования и раневые покрытия на их основе нанесением клеточных культур фибробластов, кератиноцитов и ММСК.

Апробация результатов исследования. Результаты, полученные в рамках работы над диссертацией, представлялись на защите 1 и 2 этапов НИР «Репарация», а также докладывались на конференциях: Всероссийская научная конференция МФТИ. Биологическая и медицинская физика (2020, Москва, Россия), Всероссийская научно-техническая конференция «Состояние и перспективы развития науки по направлению «Биотехнические системы и технологии» (2021, Анапа, Россия), XXXIV Международная зимняя молодёжная научная школа. Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии (2022, Москва, Россия), Круглый стол «Военная медицина в постгеномную эпоху: роль молекулярно-генетических и клеточных технологий в становлении нового технологического уклада» (2022, Москва, Россия).

Публикации. По тематике диссертации опубликовано 5 научных статей в международных изданиях, индексируемых в базе данных Scopus.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, обсуждения, выводов, списка сокращений и условных обозначений и списка литературы. Материал изложен на 127 страницах, включает 9 таблиц и 55 рисунков. Список использованной информации содержит 111 наименований.

ГЛАВА 1. АНАЛИЗ СОВРЕМЕННОГО СОСТОЯНИЯ И ТЕНДЕНЦИЙ РАЗВИТИЯ ОБЛАСТИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для создания искусственных органов необходимы, как минимум, две компоненты - клетки и внеклеточный матрикс.

Для имитации нативного внеклеточного матрикса в регенеративной медицине и тканевой инженерии используются как природные, так и синтетические материалы.

В данной работе была проведена работа по подбору синтетического матрикса, который можно было бы использовать для создания биоинженерного кожного трансплантата.

С целью понимания методики и требований к созданию раневых покрытий для восстановления кожного покрова важно рассмотреть строение и функции кожи человека, а также роль кожи в поддержании тканевого гомеостаза.

1.1 Строение и функции кожи

Кожа - самый крупный орган в организме человека, имеющий площадь поверхности примерно 1,8 м2 и составляющий около 16 % массы тела [6]. Важнейшей функцией кожи является барьерная - защита организма от ультрафиолетового облучения, химических веществ и патогенных микроорганизмов. Другие важные функции кожи включают выработку витамина D, терморегуляцию и контроль потери влаги [6]. Кожа состоит из трех слоев: гиподермы, дермы и эпидермиса каждый из которых имеет уникальную структуру

[7].

1.1.1 Структурная организация эпидермиса как результат дифференцировки

кератиноцитов

Эпидермис представляет собой ороговевающий плоский эпителий толщиной около 0,1 мм, состоящий из нескольких типов клеток и четырех или пяти различных

слоев: рогового (stratum corneum); блестящего (stratum lucidum); зернистого (stratum granulosum); шиповатого (stratum spinosum) и базального (stratum basale). Большинство клеток эпидермиса - это кератиноциты. Они вырабатывают кератин, жесткий волокнистый белок, придающий эпидермису прочность, что обеспечивает его защитную функцию [6, 8]. Кератиноциты в эпидермисе запрограммированно гибнут, что приводит к ороговению и соответственно образованию ороговевшего слоя, а также кожного барьера, ногтей и волос. Кератин, накапливающийся в цитоплазме, в процессе дифференцировки клеток образует сложный каркас и по мере удаления клеточных органелл заполняет все внутриклеточное пространство клетки для обеспечения механической прочности [9]. Известно 37 функциональных генов кератина эпителия человека. Мутации в этих генах связаны с такими заболеваниями кожи, как буллезный эпидермолиз (кератины 5 и 14) и эпидермолитический гиперкератоз (кератины 1 и 10) [10]. Ороговение включает в себя три ключевых этапа: замещение внутриклеточных органелл и внутриклеточного содержимого компактным белковым веществом, сшивка белков на периферии клетки, с формированием ороговевшей клеточной оболочки, и образование многоклеточной, функциональной, но биологически мертвой структуры из корнеоцитов. Последний этап отличается от классических апоптотических и некротических путей гибели клеток, которые в основном направлены на удаление избыточных или поврежденных клеток [9].

Структуры эпидермиса и придатков кожи поддерживаются дифференцировкой кератиноцитов из пула стволовых клеток. Стволовые клетки эпидермиса располагаются в базальном слое эпидермиса и в специальных нишах волосяного фолликула [11]. При асимметричном делении пролиферирующие кератиноциты генерируют клетки, которые перестают делиться и начинают терминальную дифференцировку. Эти дочерние клетки перемещаются в верхние слои эпидермиса. Как только кератиноциты отделяются от базальной мембраны эпителия, они изменяют свой профиль экспрессии генов под контролем р63 и других транскрипционных факторов, а также сигнальных молекул, например, TGF-а, витамина А, эпидермального фактора роста (EGF) [10]. Вместо кератинов К5 и

К14, экспрессируемых всеми пролиферирующими кератиноцитами, дифференцирующиеся кератиноциты межфолликулярного эпидермиса экспрессируют кератины К1 и К10 [9].

Таким образом, эпидермис состоит из слоев различных стадий дифференцировки кератиноцитов, отличающихся морфологическими признаками и маркерами экспрессии (Рисунок 1) [9]. Самый нижний (базальный) слой состоит из одного ряда пролиферирующих цилиндрических кератиноцитов, соединенных между собой с помощью специальных клеточных контактов - десмосом. Эти клетки заякорены на базальной мембране, состоящей из компонентов внеклеточного матрикса, с помощью полудесмосом, представляющих собой проникающие в базальную мембрану цитоплазматические выросты базальных кератиноцитов. В составе базального слоя одна субпопуляция кератиноцитов постоянно делится, а другая находится в состоянии покоя. Постоянная пролиферация базальных кератиноцитов обеспечивает непрерывное обновление эпидермального покрова, а также регенерацию кожи при повреждениях [12]. Ещё одним типом клеток, входящих в состав базального слоя, являются меланоциты (от 5 до 10 % от популяции базальных клеток). В меланоцитах происходит выработка меланина (меланогенез), защищающего ДНК меланоцитов и кератиноцитов от ультрафиолетового облучения и обеспечивающего пигментацию кожи. Кератиноциты поглощают содержащие меланин меланосомы, продуцируемые меланоцитами [10]. Также в эпидермисе встречаются нейрорецепторные клетки Меркеля, связанные с нервными окончаниями, проникающими из дермы [12]. Базальные кератиноциты синтезируют антимикробные пептиды, что обеспечивает защитную функцию. Дочерние базальные клетки мигрируют вверх, образуя шиповатый слой клеток, внутри которого клетки также соединены между собой десмосомами [6].

Рисунок 1 - Строение эпидемиса кожи [13] Клетки шиповатого слоя, включающие от 3 до 8 слоев, уже не обладают способностью к пролиферации. Отличительными маркерами этого слоя эпидермиса являются кератины К1 и К10, а также каспаза-14 [9]. Выше расположен зернистый слой, состоящий из 1-2 рядов ромбовидных клеток (зернистых кератиноцитов). В цитоплазме кератиноцитов данного слоя присутствуют ламеллярные тельца с липидными везикулами (кератиносомы) и гранулы кератогиалина. При дальнейшей дифференцировке кератиносомы принимают участие в формировании билипидных прослоек между роговыми чешуйками [12]. Маркерами дифференцировки клеток в зернистом слое являются трансглутаминаза и инволюкрин [10]. Также в клетках зернистого слоя экспрессируются белки комплекса дифференцировки эпидермиса (ЕЭС) [9].

На участках кожи ладоней и подошв сверху над зернистым слоем располагается блестящий (элеидиновый) слой, который имеет вид бесструктурной преломляющей свет полоски, отделяющей зернистый слой от рогового [12].

Конечным результатом созревания кератиноцитов является формирование рогового слоя, который состоит из листов перекрывающихся нежизнеспособных ороговевших клеток без ядер (корнеоцитов). Предполагается, что активация филагрина, лорикрина и каспазы-14 играет определенную роль в терминальной

дифференцировке кератиноцитов [10]. При переходе от зернистого слоя к ороговевшему происходит каскад событий: каспаза-14 становится активной и способствует деградации филагрина, а кератины и другие белки сшиваются трансглутаминазами. В этот момент содержимое кератиносом (или пластинчатых гранул) вытесняется в межклеточное пространство, где они образуют многослойные липидные структуры, формирующие липидный барьер для предотвращения трансэпидермальной потери воды. Сами же ороговевшие оболочки корнеоцитов остаются плотно соединенными друг с другом через корнеодесмосомы, благодаря чему обеспечивается физический кожный барьер. По мере обновления эпидермиса корнеодесмосомы подвергаются протеолитической деградации внеклеточными ферментами, и корнеоциты слущиваются путём десквамации [9].

Терминальная дифференцировка кератиноцитов в зрелые корнеоциты контролируется кальцием, гормональными факторами и темпами десквамации [14]. Основным регулятором дифференцировки кератиноцитов является кальциевый градиент. Концентрация внеклеточного кальция самая низкая в базальном слое и постепенно увеличивается до гранулярного слоя. Повышение внеклеточной концентрации кальция стимулирует образование межклеточных контактов и увеличение внутриклеточных концентраций свободного кальция через трансмембранный приток кальция, который впоследствии инициирует дифференцировку через стимуляцию кальциевого рецептора (CaR) [15]. Это имеет важное значение для техники культивирования кератиноцитов in vitro. Высокая концентрация кальция индуцирует дифференцировку, тогда как при низкой концентрации кальция кератиноциты поддерживают высокий уровень пролиферации [10, 15]. Е-кадгерин обеспечивает адгезивные соединения между клетками, что имеет решающее значение для дифференцировки кератиноцитов. 1,25-дигидроксивитамин D3 (витамин D3) также влияет на дифференцировку кератиноцитов, регулируя экспрессию генов и модулируя концентрацию кальция [10].

Таким образом, ороговение включает в себя значительные изменения внутриклеточной организации, образование ороговевшей оболочки и интеграцию мертвых клеток в надклеточную взаимосвязанную структуру. В зернистом эпидермальном слое происходит экспрессия супрабазальных кератинов К1, К2 и К10, что способствует развитию цитоскелета, а посттрансляционные модификации и взаимодействие с филагрином координируют образование кератиновых пучков [9]. Эти нити взаимодействуют с десмосомами так, что цитоскелеты соседних клеток, а позже и корнеоцитов, оказываются взаимосвязанными. Более 85 % белка в корнеоцитах приходится на долю кератинов [9,16]. Высокое содержание кератина достигается не только за счет активной продукции и стабилизации кератинов в процессе дифференцировки, но, вероятно, и за счет удаления других белков, которые первоначально находились либо в цитоплазме, либо в органеллах. На микроскопическом уровне ороговение связано с полным распадом субклеточных компартментов, включая ядро, митохондрии, эндоплазматический ретикулум и эндосомы [9].

1.1.2. Особенности структурной организации дермо-эпидермального соединения

Связь эпидермиса и дермы осуществляется с помощью специализированной структуры, состоящей из компонентов межклеточного матрикса - базальной мембраны. Эпидермис связан с базальной мембраной через полудесмосомы, а дерма - в основном через заякоривающие пучки из волокон на основе коллагена VII типа [17].

Базальная мембрана представляет собой сетчатую плоскую структуру, состоящую из белков внеклеточного матрикса [18]. Базальная мембрана обеспечивает механическую поддержку эпителия кожи и других покровных тканей. Базальные мембраны многофункциональны: они модулируют клеточное поведение, регулируют органогенез, способствуют восстановлению тканей, создают барьер для фильтрации и метастазирования опухолей, связывают факторы роста и участвуют в процессах роста сосудов (ангиогенезе) [18]. Компоненты

базальной мембраны синтезируются вышележащими эпителиальными или эндотелиальными клетками. Основными компонентами являются коллаген IV типа (Col IV), ламинин, нидоген и перлекан. Col IV составляет около 50 % всех компонентов базальной мембраны [19]. Ламинины - это семейство крупных внеклеточных матриксных гликопротеинов, обнаруженных исключительно в базальной мембране. Нидоген - это гликопротеин, составляющий 2-3% белков базальной мембраны. Перлекан - это протеогликан гепарансульфата (HSPG). Col IV и ламинин самособираются в две независимые супрамолекулярные сети, образуя морфологически различимую базальную мембрану (базальную пластинку). Эти две сети соединены нидогеном, который также взаимодействует с перлеканом и другими компонентами базальной мембраны, такими как Col XVIII и фибулины, чтобы стабилизировать сети в качестве матричного каркаса. Col IV образует густую сеть, которая прочно сшита и обеспечивает механическую стабильность базальной мембраны, в то время как сеть ламинина более лабильна и предоставляет сайты для связывания клеток. Перлекан может связываться с Col IV, а также с ламинином, что обеспечивает связь между этими двумя сетями [18].

1.1.3 Строение и функции дермы

Дерма обеспечивает питание, иннервацию и терморегуляторную функцию кожи. Она состоит из сосочкового и сетчатого слоев. Сосочковый слой образован рыхлой соединительной тканью, пронизанной капиллярной сетью, а сетчатый -плотной волокнистой соединительной тканью.

Фибробласты являются основными клетками дермы. Они обеспечивают синтез компонентов внеклеточного вещества, а также участвуют в регенеративных процессах при заживлении ран [12]. Характер взаимодействия между кератиноцитами эпидермиса и дермальными фибробластами в процессе заживления ран хорошо описан в литературе, согласно данным которой общепринятой считается концепция двойной паракринной сигнализации. Кератиноциты, вырабатывая IL-1 и TGFP, стимулируют экспрессию

фибробластами факторов роста и цитокинов, таких как фактор роста кератиноцитов (FGF-7 или KGF), GM-CSF и IL-6 [15]. В свою очередь, экспрессия этих факторов роста инициирует пролиферацию самих кератиноцитов. Кроме того, фибробласты могут приобрести миофибробластный фенотип, что важно для процесса заживления раны [20].

В состав дермы входят также иммунные клетки (тучные клетки, дендритные клетки, тканевые макрофаги, Т-лимфоциты, плазматические клетки и другие), которые обеспечивают защиту организма от патогенов при повреждении и участвуют в регенерации раны [6, 12].

В отличие от базальной мембраны, внеклеточный матрикс дермы формирует не плоские, а объёмные 3D-структуры, включающие коллагеновые и эластиновые волокна. Волокна из коллагена 1 -ого типа являются основными волокнами дермы, и обеспечивают её механическую прочность. Эластиновые волокна образуют тонкую сеть в дерме, которая обеспечивает растяжимость и упругость кожи. Помимо волокон, внеклеточный матрикс дермы содержит и другие биополимеры, включая гликозаминогликаны и протеогликаны, которые способствуют удержанию воды в тканях, а также являются опорой для адгезии населяющих дерму клеток [12].

Некоторые структуры возникают в дерме и распространяются в эпидермис, например, нервные окончания, потовые железы и волосяные фолликулы. Последние выстланы эпидермальными кератиноцитами и содержат мультипотентные стволовые клетки [10, 21]. При частичном повреждении дермы кератиноциты из этих придаточных структур могут мигрировать и делиться, способствуя регенерации эпидермиса.

1.2 Эквиваленты кожи для создания раневых покрытий 1.2.1 Исторический обзор

Впервые методы культивирования кожи взрослых млекопитающих in vitro были разработаны в 50-х годах прошлого века. Данные методы включали

отделение кожи человека (эпидермиса от дермы), выделение и культивирование кератиноцитов. Было установлено, что полученные из срезов эпидермиса суспензии клеток могут достаточно долго культивироваться после трипсинизации.

Следующим шагом в 1960-х были исследования изолированных кератиноцитов из кожи морских свинок. Исследования показали, что данные кератиноциты способны образовывать колонии даже без поддержки клеток дермы при посеве с высокой плотностью, тогда как при посеве с более низкой плотностью клетки имеют склонность к дифференцировке.

Большим прорывом в изучении свойств кератиноцитов стали исследования лаборатории Рейнвальда и Грина. В 1975 году ученые лаборатории использовали 3Т3 фибробласты в качестве питающих слоев для генерации культур кератиноцитов человека, выделенных из одного кератиноцита. Это позволило ученым культивировать большое количество клеток in vitro и открыло путь к лечению ожогов. Лаборатории Рейнвальда и Грина принадлежат и первые работы по изучению монослойных колоний кератиноцитов. Ученые установили, что однослойные культуры могут дифференцироваться и образовывать многослойные. Но, несмотря на преимущества однослойных культур - простоту и высокую воспроизводимость - в этих моделях не воспроизводятся многие особенности стратифицированного эпидермиса. Кератиноциты вынуждены адаптироваться к искусственным условиям, таким, как плоская поверхность и погруженная в питательную среду культура, что может влиять на экспрессию генов и клеточные функции. Поэтому для изучения межклеточных взаимодействий, регуляции дифференцировки, заживления ожогов, барьерной функции и взаимодействия кожи и микробиома рационально использовать 3D-модели кожи. Они более точно отражают архитектуру и функции живой кожи, а потому считаются стандартом для проведения исследований кожи in vitro и для получения раневых покрытий [7, 22].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Фильков Глеб Игоревич, 2023 год

Список литературы

1. Vig K. et al. Advances in skin regeneration using tissue engineering // International journal of molecular sciences. - 2017. - Т. 18. - №. 4. - С. 789.

2. Dixit S. et al. Immunological challenges associated with artificial skin grafts: available solutions and stem cells in future design of synthetic skin // Journal of biological engineering. - 2017. - Т. 11. - №. 1. - С. 1-23.

3. Przekora A. A Concise Review on Tissue Engineered Artificial Skin Grafts for Chronic Wound Treatment: Can We Reconstruct Functional Skin Tissue In Vitro? // Cells.

- 2020. - Т. 9. - №. 7. - С. 1622.

4. Wang Z. et al. Enhanced keratinocyte proliferation and migration in co-culture with fibroblasts // PloS one. - 2012. - Т. 7. - №. 7. - С. 40951.

5. Chen J. S., Wong V. W., Gurtner G. C. Therapeutic potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells for cutaneous wound healing // Frontiers in immunology.

- 2012. - Т. 3. - С. 192.

6. Baillis B. Dermatology: An illustrated colour text // Journal of the American Academy of Dermatology. - 2017. - Т. 76. - №. 6. - С. 227.

7. Randall M. J. et al. Advances in the Biofabrication of 3D Skin in vitro: Healthy and Pathological Models // Frontiers in bioengineering and biotechnology. - 2018. - Т. 6. - С. 154.

8. Marieb E. N. Essentials of Human Anatomy & Physiology Laboratory Manual. -Pearson/Benjamin Cummings, 2006.

9. Eckhart L. et al. Cell death by cornification // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. - 2013. - Т. 1833. - №. 12. - С. 3471-3480.

10. Ter Horst B. et al. Advances in keratinocyte delivery in burn wound care // Advanced drug delivery reviews. - 2018. - Т. 123. - С. 18-32.

11. Arwert E. N., Hoste E., Watt F. M. Epithelial stem cells, wound healing and cancer // Nature Reviews Cancer. - 2012. - Т. 12. - №. 3. - С. 170-180.

12. Дерматовенерология: учебник для студентов высших учебных заведений / В. В. Чеботарёв, О. Б. Тамразова, Н. В. Чеботарёва, А. В. Одинец. - 2013. - 584 с.

13. Бейлин А. К. и др. Реконструированный эпидермис человека in vitro-модель // Vestnik Dermatologii i Venerologii. - 2020. - Т. 97. - №. 2. - С. 24-34.

14. Draelos Z. D. (ed.). Cosmetic dermatology: products and procedures. - John Wiley & Sons, 2015.

15. Bikle D. D., Xie Z., Tu C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation // Expert review of endocrinology & metabolism. - 2012. - Т. 7. - №. 4. -С. 461-472.

16. Sun T. T., Green H. Keratin filaments of cultured human epidermal cells. Formation of intermolecular disulfide bonds during terminal differentiation // Journal of Biological Chemistry. - 1978. - Т. 253. - №. 6. - С. 2053-2060.

17. McMillan J. R., Akiyama M., Shimizu H. Epidermal basement membrane zone components: ultrastructural distribution and molecular interactions // Journal of dermatological science. - 2003. - Т. 31. - №. 3. - С. 169-177.

18. Mak K. M., Mei R. Basement membrane type IV collagen and laminin: an overview of their biology and value as fibrosis biomarkers of liver disease // The Anatomical Record. - 2017. - Т. 300. - №. 8. - С. 1371-1390.

19. LeBleu V. S., MacDonald B., Kalluri R. Structure and function of basement membranes // Experimental biology and medicine. - 2007. - Т. 232. - №. 9. - С. 11211129.

20. Werner S., Krieg T., Smola H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing // Journal of Investigative Dermatology. - 2007. - Т. 127. - №. 5. - С. 998-1008.

21. Levy V. et al. Epidermal stem cells arise from the hair follicle after wounding // The FASEB Journal. - 2007. - Т. 21. - №. 7. - С. 1358-1366.

22. Niehues H. et al. 3D skin models for 3R research: The potential of 3D reconstructed skin models to study skin barrier function // Experimental dermatology. -2018. - Т. 27. - №. 5. - С. 501-511.

23. Oryan A., Alemzadeh E., Moshiri A. Burn wound healing: present concepts, treatment strategies and future directions // Journal of wound care. - 2017. - Т. 26. - №. 1. - С. 5-19.

24. Nicks B. A. et al. Acute wound management: revisiting the approach to assessment, irrigation, and closure considerations // International journal of emergency medicine. - 2010. - Т. 3. - №. 4. - С. 399-407.

25. Roshangar L. et al. Skin Burns: Review of Molecular Mechanisms and Therapeutic Approaches // Wounds: a compendium of clinical research and practice. - 2019.

- Т. 31. - №. 12. - С. 308-315.

26. Widjaja W., Tan J., Maitz P. K. M. Efficacy of dermal substitute on deep dermal to full thickness burn injury: a systematic review // ANZ journal of surgery. - 2017. - Т. 87.

- №. 6. - С. 446-452.

27. Dai C., Shih S., Khachemoune A. Skin substitutes for acute and chronic wound healing: an updated review // Journal of Dermatological Treatment. - 2020. - Т. 31. - №. 6.

- С. 639-648.

28. Chaudhari A. A. et al. Future prospects for scaffolding methods and biomaterials in skin tissue engineering: a review // International journal of molecular sciences. - 2016. -Т. 17. - №. 12. - С. 1974.

29. Мелешина А. В. и др. Тканеинженерные конструкты кожи и использование стволовых клеток для создания кожных эквивалентов (обзор) // Современные технологии в медицине. - 2017. - Т. 9. - №. 1.

30. Tavakoli S., Klar A. S. Bioengineered skin substitutes: Advances and future trends // Applied Sciences. - 2021. - Т. 11. - №. 4. - С. 1493.

31. Ojeh N. et al. Stem cells in skin regeneration, wound healing, and their clinical applications // International journal of molecular sciences. - 2015. - Т. 16. - №. 10. - С. 25476-25501.

32. Lin W. et al. Endowing iPSC-Derived MSCs with Angiogenic and Keratinogenic Differentiation Potential: A Promising Cell Source for Skin Tissue Engineering // BioMed research international. - 2018. - Т. 2018.

33. Boyce S. T., Lalley A. L. Tissue engineering of skin and regenerative medicine for wound care // Burns & trauma. - 2018. - Т. 6. - №. 1. - С. 4.

34. Harding K. G. et al. Efficacy and safety of the freeze-dried cultured human keratinocyte lysate, LyphoDerm™ 0.9%, in the treatment of hard-to-heal venous leg ulcers // Wound repair and regeneration. - 2005. - Т. 13. - №. 2. - С. 138-147.

35. Tenenhaus M., Rennekampff H. O. Current concepts in tissue engineering: Skin and wound // Plastic and reconstructive surgery. - 2016. - Т. 138. - №. 3S. - С. 42S-50S.

36. Gurtner G. C. et al. Wound repair and regeneration // Nature. - 2008. - Т. 453. -№. 7193. - С. 314.

37. Moustafa M. et al. Randomized, controlled, single-blind study on use of autologous keratinocytes on a transfer dressing to treat nonhealing diabetic ulcers. - 2007.

38. Andreassi L. et al. A new model of epidermal culture for the surgical treatment of vitiligo // International journal of dermatology. - 1998. - Т. 37. - №. 8. - С. 595-598.

39. Cui H., Chai Y., Yu Y. Progress in developing decellularized bioscaffolds for enhancing skin construction // Journal of Biomedical Materials Research Part A. - 2019. -Т. 107. - №. 8. - С. 1849-1859.

40. Nyame T. T. et al. Tissue-engineered skin substitutes // Plastic and reconstructive surgery. - 2015. - Т. 136. - №. 6. - С. 1379-1388.

41. Kamel R. A. et al. Tissue engineering of skin // Journal of the American College of Surgeons. - 2013. - Т. 217. - №. 3. - С. 533-555.

42. Rheinwald, J. G. Human epidermal keratinocyte cell culture and xenograft systems: Applications in the detection of potential chemical carcinogens and the study of epidermal transformation. Prog. Clin. Biol. Res. 1989. - V. 298. - P. 113-25.

43. Davis, J.S. Address of the president: The story of plastic surgery. Ann. Surg. 1941. - V. 113. - P. 641-56.

44. Still J. et al. The use of a collagen sponge/living cell composite material to treat donor sites in burn patients // Burns. - 2003. - Т. 29. - №. 8. - С. 837-841.

45. Vig K. et al. Advances in skin regeneration using tissue engineering // International journal of molecular sciences. - 2017. - Т. 18. - №. 4. - С. 789.

46. World's Largest Stem Cell Industry Blog. URL: https://bioinformant.com/.

47. Блинова М. И. и др. Клинический опыт заживления трофических язв с использованием клеточного продукта «Эквивалент дермальный ЭД» // Здоровье-основа человеческого потенциала: проблемы и пути их решения. - 2015. - Т. 10. -№.2.

48. Коцлова А. А. и др. Сравнительная оценка эффективности применения эквивалента дермального при нейропатической и нейроишемической формах синдрома диабетической стопы // Патология кровообращения и кардиохирургия. -2016. - Т. 20. - №. 3.

49. Опыт применения дермального эквивалента в лечении ожогов 3 степени / К.М. Крылов, Д.А. Козулин, А.В. Панов, М.И. Блинова // III съезд комбустиологов России: сб. тез. - М., 2010. - С. 174

50. Королева Т. А. и др. Оценка эффективности применения современных эквивалентов кожи в лечении детей с глубокими ожогами // Российский вестник детской хирургии, анестезиологии и реаниматологии. - 2014. - Т. 4. - №. 3.

51. Бутрин Я. Л., Чмырёв И. В. Сравнительная характеристика различных методов лечения глубоких ожогов лица // Вестник российской военно-медицинской академии. - 2017. - №. 3. - С. 56-62.

52. Шаблин Д. В. и др. Современные раневые покрытия в местном лечении ран различного генеза // Фундаментальные исследования. - 2013. - Т. 2. - №. 12.

53. Simmons P., McElroy T., Allen A. R. A Bibliometric Review of Artificial Extracellular Matrices Based on Tissue Engineering Technology Literature: 1990 through 2019 // Materials. - 2020. - Т. 13. - №. 13. - С. 2891.

54. Haque M. A. et al. Artificial extracellular matrix for embryonic stem cell cultures: a new frontier of nanobiomaterials // Science and Technology of Advanced Materials. -2010. - Т. 11. - №. 1. - С. 014106.

55. Moroni L. et al. Biofabrication: a guide to technology and terminology // Trends in biotechnology. - 2018. - Т. 36. - №. 4. - С. 384-402.

56. Sill T. J., Von Recum H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering // Biomaterials. - 2008. - Т. 29. - №. 13. - С. 1989-2006.

57. Timaeva O. et al. Synthesis and physico-chemical properties of poly (N-vinyl pyrrolidone)-based hydrogels with titania nanoparticles // Journal of Materials Science. -2020. - Т. 55. - №. 7. - С. 3005-3021.

58. Abaci H. E. et al. Human skin constructs with spatially controlled vasculature using primary and iPSC-derived endothelial cells // Advanced healthcare materials. - 2016.

- Т. 5. - №. 14. - С. 1800-1807.

59. Baltazar T. et al. Three dimensional bioprinting of a vascularized and perfusable skin graft using human keratinocytes, fibroblasts, pericytes, and endothelial cells // Tissue Engineering Part A. - 2020. - Т. 26. - №. 5-6. - С. 227-238.

60. Bartholomew A. et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo // Experimental hematology. - 2002. - Т. 30.

- №. 1. - С. 42-48.

61. Moravej A. et al. Mesenchymal stem cells increase skin graft survival time and up-regulate PD-L1 expression in splenocytes of mice // Immunology letters. - 2017. - Т. 182. - С. 39-49.

62. Nie X. et al. Innovative strategies for tissue engineered skin based on multiple growth factors gene transfection // Medical hypotheses. - 2009. - Т. 73. - №. 4. - С. 516518.

63. Evans S. M. et al. Oxygen levels in normal and previously irradiated human skin as assessed by EF5 binding // Journal of Investigative Dermatology. - 2006. - Т. 126. - №. 12. - С. 2596-2606.

64. Mieremet A. et al. Human skin equivalents cultured under hypoxia display enhanced epidermal morphogenesis and lipid barrier formation // Scientific reports. - 2019.

- Т. 9. - №. 1. - С. 1-12.

65. Weidemann A., Johnson R. S. Biology of HIF-1 a // Cell Death & Differentiation. - 2008. - Т. 15. - №. 4. - С. 621-627.

66. Smith J. R., Lamprou D. A. Polymer coatings for biomedical applications: a review // Transactions of the IMF. - 2014. - Т. 92. - №. 1. - С. 9-19.

67. Богданов С. Б. и др. ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ РАНЕВОГО ПОКРЫТИЯ" ХИТОПРАН" ПРИ ЛЕЧЕНИИ ПАЦИЕНТА С КОМБИНИРОВАННОЙ ТРАВМОЙ // Ортопедия, травматология и восстановительная хирургия детского возраста. - 2020.

- Т. 8. - №. 3.

68. Бубнова Н. А. и др. Опыт применения препарата коллост в лечении инфицированных ран различной этиологии в условиях гнойно-септического отделения городской больницы // Здоровье-основа человеческого потенциала: проблемы и пути их решения. - 2015. - Т. 10. - №. 2.

69. Lanza R. et al. Principles of tissue engineering, Elsevier, 2020,5th edition, 1602P.

70. Lim L. T., Auras R., Rubino M. Processing technologies for poly (lactic acid) // Progress in polymer science. - 2008. - Т. 33. - №. 8. - С. 820-852.

71. Murariu M., Dubois P. PLA composites: From production to properties // Advanced drug delivery reviews. - 2016. - Т. 107. - С. 17-46.

72. Farah S., Anderson D. G., Langer R. Physical and mechanical properties of PLA, and their functions in widespread applications—A comprehensive review // Advanced drug delivery reviews. - 2016. - Т. 107. - С. 367-392.

73. Castilla-Cortázar I. et al. Hydrolytic and enzymatic degradation of a poly (e-caprolactone) network // Polymer Degradation and Stability. - 2012. - Т. 97. - №. 8. - С. 1241-1248.

74. Lam C. X. F. et al. Evaluation of polycaprolactone scaffold degradation for 6 months in vitro and in vivo // Journal of Biomedical Materials Research Part A: An Official Journal of The Society for Biomaterials, The Japanese Society for Biomaterials, and The Australian Society for Biomaterials and the Korean Society for Biomaterials. - 2009. - Т. 90. - №. 3. - С. 906-919.

75. Bonartsev A. P. et al. Application of polyhydroxyalkanoates in medicine and the biological activity of natural poly (3-hydroxybutyrate) // Acta Naturae (англоязычная версия). - 2019. - Т. 11. - №. 2 (41).

76. Mauri G. et al. Biodegradable biliary stent implantation in the treatment of benign bilioplastic-refractory biliary strictures: preliminary experience // European radiology. -2013. - Т. 23. - №. 12. - С. 3304-3310.

77. Norouzi M. et al. Advances in skin regeneration: application of electrospun scaffolds // Advanced healthcare materials. - 2015. - Т. 4. - №. 8. - С. 1114-1133.

78. Kurpinski K. T. et al. The effect of fiber alignment and heparin coating on cell infiltration into nanofibrous PLLA scaffolds // Biomaterials. - 2010. - T. 31. - №. 13. - C. 3536-3542.

79. Ma Z. et al. Grafting of gelatin on electrospun poly (caprolactone) nanofibers to improve endothelial cell spreading and proliferation and to control cell orientation // Tissue engineering. - 2005. - T. 11. - №. 7-8. - C. 1149-1158.

80. Grover C. N. et al. The interplay between physical and chemical properties of protein films affects their bioactivity // Journal of Biomedical Materials Research Part A. -2012. - T. 100. - №. 9. - C. 2401-2411.

81. Sajkiewicz P., Kolbuk D. Electrospinning of gelatin for tissue engineering-molecular conformation as one of the overlooked problems // Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. - 2014. - T. 25. - №. 18. - C. 2009-2022.

82. Bhattarai S. R. et al. Novel biodegradable electrospun membrane: scaffold for tissue engineering // Biomaterials. - 2004. - T. 25. - №. 13. - C. 2595-2602.

83. Mahjour S. B. et al. Improved cell infiltration of electrospun nanofiber mats for layered tissue constructs // Journal of Biomedical Materials Research Part A. - 2016. - T. 104. - №. 6. - C. 1479-1488.

84. Bagrov D. et al. Wetting of electrospun nylon-11 fibers and mats // RSC Advances. - 2021. - T. 11. - №. 19. - C. 11373-11379.

85. Szewczyk P. K. et al. Roughness and fiber fraction dominated wetting of electrospun fiber-based porous meshes // Polymers. - 2019. - T. 11. - №. 1. - C. 34.

86. Chummun I., Bhaw-Luximon A., Jhurry D. Modulating matrix-multicellular response using polysucrose-blended with poly-L-lactide or polydioxanone in electrospun scaffolds for skin tissue regeneration // Journal of Biomedical Materials Research Part A. -2018. - T. 106. - №. 12. - C. 3275-3291.

87. Pavlova E. R. et al. Tuning the properties of electrospun polylactide mats by ethanol treatment // Materials & Design. - 2019. - T. 181. - C. 108061.

88. Kouhi M. et al. Preparation and characterization of biohybrid poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) based nanofibrous scaffolds // AIP Conference Proceedings. - AIP Publishing LLC, 2018. - T. 1920. - №. 1. - C. 020014.

89. Reis R. L., San Román J. (ed.). Biodegradable systems in tissue engineering and regenerative medicine. - CRC press, 2004.

90. Farrar D. Modelling of the degradation process for bioresorbable polymers // Degradation rate of bioresorbable materials. - Woodhead Publishing, 2008. -C. 183-206.

91. Banerjee A., Chatterjee K., Madras G. Enzymatic degradation of polymers: a brief review // Materials Science and Technology. - 2014. - T. 30. - №. 5. - C. 567-573.

92. Purkis P. E. et al. Antibody markers of basal cells in complex epithelia // Journal of cell science. - 1990. - T. 97. - №. 1. - C. 39-50.

93. Stark H. J. et al. Organotypic keratinocyte cocultures in defined medium with regular epidermal morphogenesis and differentiation // Journal of Investigative Dermatology. - 1999. - T. 112. - №. 5. - C. 681-691.

94. Nischt R. et al. Lack of nidogen-1 and-2 prevents basement membrane assembly in skin-organotypic coculture //Journal of Investigative Dermatology. - 2007. - T. 127. -№. 3. - C. 545-554.

95. Ikuta S. et al. Mouse epidermal keratinocytes in three-dimensional organotypic coculture with dermal fibroblasts form a stratified sheet resembling skin // Bioscience, biotechnology, and biochemistry. - 2006. - C. 0610050121-0610050121.

96. El Ghalbzouri A., Lamme E., Ponec M. Crucial role of fibroblasts in regulating epidermal morphogenesis // Cell and tissue research. - 2002. - T. 310. - №. 2. - C. 189199.

97. Scharffetter-Kochanek K. et al. Migration of a human keratinocyte cell line (HACAT) to interstitial collagen type I is mediated by the a2ß1-integrin receptor // Journal of investigative dermatology. - 1992. - T. 98. - №. 1. - C. 3-11.

98. Russo B., Brembilla N. C., Chizzolini C. Interplay between keratinocytes and fibroblasts: A systematic review providing a new angle for understanding skin fibrotic disorders // Frontiers in immunology. - 2020. - T. 11. - C. 648.

99. Wang S. et al. Platelet-derived growth factor receptor beta identifies mesenchymal stem cells with enhanced engraftment to tissue injury and pro-angiogenic property // Cellular and molecular life sciences. - 2018. - T. 75. - №. 3. - C. 547-561.

100. Regmi S. et al. Mesenchymal stem cell therapy for the treatment of inflammatory diseases: challenges, opportunities, and future perspectives // European journal of cell biology. - 2019. - T. 98. - №. 5-8. - C. 151041.

101. Petrova E. S. Differentiation potential of mesenchymal stem cells and stimulation of nerve regeneration // Russian Journal of Developmental Biology. - 2018. - T. 49. - №. 4. - C. 193-205.

102. Ozturk S., Karagoz H. Experimental stem cell therapies on burn wound: do source, dose, timing and method matter? // Burns. - 2015. - T. 41. - №. 6. - C. 1133-1139.

103. Egana J. T. et al. Use of human mesenchymal cells to improve vascularization in a mouse model for scaffold-based dermal regeneration //Tissue Engineering Part A. - 2009.

- T. 15. - №. 5. - C. 1191-1200.

104. Konop M. et al. The role of allogenic keratin-derived dressing in wound healing in a mouse model //Wound Repair and Regeneration. - 2017. - T. 25. - №. 1. - C. 62-74.

105. Liu J. et al. Full-thickness wound healing using 3D bioprinted gelatin-alginate scaffolds in mice: A histopathological study // Int J Clin Exp Pathol. - 2016 - T.9. -№.11. -C. 11197-11205.

106. Ng K. W., Hutmacher D. W. Reduced contraction of skin equivalent engineered using cell sheets cultured in 3D matrices //Biomaterials. - 2006. - T. 27. - №. 26. - C. 45914598.

107. Hüging M. et al. The effect of wound dressings on a bio-engineered human dermo-epidermal skin substitute in a rat model //Journal of Burn Care & Research. - 2017.

- T. 38. - №. 6. - C. 354-364.

108. Erdag G. et al. FGF-7 expression enhances the performance of bioengineered skin //Molecular Therapy. - 2004. - T. 10. - №. 1. - C. 76-85.

109. Nuutila K. et al. Human wound-healing research: issues and perspectives for studies using wide-scale analytic platforms //Advances in wound care. - 2014. - T. 3. - №. 3. - C. 264-271.

110. Isenberg J. S. et al. Blockade of thrombospondin-1-CD47 interactions prevents necrosis of full thickness skin grafts //Annals of surgery. - 2008. - T. 247. - №2. 1. - C. 180.

111. Ellen H.van den Bogaard, Geuranne S.Tjabringa, Irma Joosten, MiekeVonk-Bergers, Esthervan Rijssen, Henk J.Tijssen, Mirthe Erkens, Joost Schalkwijk, Hans J.P.M. Koenen. Crosstalk between Keratinocytes and T Cells in a 3D Microenvironment: A Model to Study Inflammatory Skin Diseases. Journal of Investigative Dermatology. Volume 134, Issue 3, March 2014, Pages 719-727