Использование методов молекулярной биологии и генной инженерии для конструирования вакцинных и диагностических препаратов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, доктор биологических наук Беклемишев, Анатолий Борисович

• Беклемишев, Анатолий Борисович
• доктор биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации доктор биологических наук Беклемишев, Анатолий Борисович

Введение

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Основные направления иммунопрофилактики инфекций.

1.2. Формирование новых направлений в иммунопрофилактике и диагностике инфекций в 70-х - 80-х годах

1.3. Современные направления в области вакцинологии

1.4. Молекулярные методы в диагностике инфекций

1.5. Структурные белки вируса осповакцины, локализация кодирующих их генов в вирусном геноме

1.5.1. Структурные белки вируса осповакцины.

1.5.2. Картирование генов в геноме вируса осповакцины.

1.6. Общая характеристика стафилококковых токсинов

1.7. Структура и биологические свойства стафилококкового энтеротоксина типа А (СЭА).

1.8. Использование моноклональных антител в изучении функционально значимых участков стафилококковых токсинов и создании диагностических тест-систем.

1.9. Биология и эпидемиология микобактерий туберкулезного комплекса.

1.10. Применение методов молекулярной биологии к эпидемиологии туберкулеза

1.11. Современные способы обнаружения микобактерий. Недостатки и преимущества.

1.12. Эпидемиология клещевого боррелиоза

1.13. Патогенез и клиника клещевого боррелиоза

1.14. Молекулярно-биологические характеристики спирохет В. burgdorferi sensu lato

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Материалы, приборы, оборудование

2.1.1. Реактивы.

2.1.2. Приборы и оборудование

2.1.3. Ферменты

2.1.4. Использованные в работе штаммы микроорганизмов

2.1.5. Векторные ДНК и рекомбинантные плазмиды, содержащие клонированные фрагменты ДНК

2.1.6. Животные

2.1.7. Клеточные линии

2.1.8. Сыворотки и антигены

2.1.9. Питательные и конденционированные среды

2.1.10. Буферные среды и системы

2.2. Молекулярно-биологические методы исследования

2.2.1. Методы работы с РНК

2.2.2. Методы выделения препаратов ДНК

2.2.3. Анализ и очистка ДНК методами гель-электрофореза

2.2.4. Амплификация ДНК и РНК в системе ПЦР или ОТ-ПЦР

2.2.5. Секвенирование ДНК

2.2.6. Филогенетический анализ геномных последовательностей

2.3. Иммунохимические методы исследовании

2.3.1. Иммунизация животных

2.3.2. Определение концентрации иммуноглобулинов

2.3.3. Получение 1дв и 1дМ

2.3.4. Получение Яс-фрагментов кролика

2.3.5. Приготовление СПА - сорбента

2.3.6. Иммуноферментный анализ

2.3.7. Радиоиммунный анализ (РИА)

2.3.8. Иммунохимический анализ продуктов бесклеточной трансляции

2.3.9. Иммуноблоттинг

2.4. Методы гибридомной технологии т

2.4.1. Приготовление иммуногенных форм токсичных антигенов

2.4.2. Иммунизация мышей для получения гибридом

2.4.3. Гибридизация клеток и клонирование гибридом

2.4.4. Культивирование гибридом

2.4.5. Криоконсервация и размораживание клеток

2.4.6. Выделение моноклональных антител (МКА)

2.4.7. Мечение МКА

2.4.8. Определение изотипов тяжелых цепей МКА

2.4.9. Определение константы связывания МКА с антигеном

2.5. Генно-инженерные методы

2.5.1. Методы работы с бактериями

2.5.2. Ферментативная обработка препаратов ДНК

2.5.3. Введение радиоактивной метки в ДНК

2.5.4. Клонирование ДНК в составе бактериальных векторов

2.5.5. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е.соН

2.6. Методы работы с белками

2.6.1. Выделение рекомбинантных белков

2.6.2. Определение концентрации растворимого белка

2.6.3. Анализ белков методом электрофореза в ПААГ

2.7. Специальные методы анализа

2.7.1. Инфицирование культур клеток вирусами

2.7.2. Культивирование и очистка вируса осповакцины и эктромелии

2.7.3. Культивирование и очистка вируса гриппа

2.7.4. Культивирование МЛиЬегси^э на твердой питательной среде

2.7.5. Фракционирование вирионных белков ВОВ и ВЭМ

2.7.6. Препаративный электрофорез белков ВОВ

2.7.7. Дегликозилирование белков

2.7.8. Выделение моноцитов из крови человека и индукция синтеза интерлейкина

2.7.9. Биологическое тестирование интерлейкина

2.7.10. Контроль пролиферации спленоцитов

2.7.11. Приготовление комплекса СЭА-lgG

2.7.12. Обработка IgG лизоцимом

2.7.13. Обработка IgM Кон А

2.7.14. Сбор клещей Ixodes persulcatus

2.7.15. Культивирование спирохет В.burgdorferi sensu lato

2.7.16. Генотипирование спирохет B.burgdorferi s.l.

2.7.17. Оценка иммуногенности препаратов индивидуальных белков ВОВ и их комплексов

2.7.18. Испытания прототипов вакцины на животных

ГЛАВ А 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Создание молекулярно-биологической базы для исследований структурно-функциональной организации патогенных вирусов.

3.1.1. Метод бесклеточных белок-синтезирующих систем.

3.1.2. Метод синтеза кДНК в системе обратной транскрипции.

3.1.3. Выделение и анализ индивидуальных мРНК из клеток эукариот.

3.2. Исследование структурно-функциональной организации геномов вирусов гриппа и разработка прототипа противогриппозной молекулярной вакцины.

3.2.1. Получение образца субъединичной комбинированной противогриппозной вакцины. Анализ иммуногенной активности препарата.

3.2.2. Анализ первичной структуры гена гемагглютинина штамма А/Алма-Ата/1417/84.

3.3. Иммунохимическое изучение структурных белков вируса осповакцины и картирование генов белков р

3.3.1. Иммунохимическое изучение структурных белков вируса осповакцины

3.3.2. Картирование гена белка р11 сердцевины ВОВ

3.3.3 Выделение специфической мРНК, кодирующей белок р35 оболочки ВОВ и картирование гена белка р

3.4. Конструирование прототипа молекулярной противооспенной вакцины

3.4.1 Характеристика антигенных и протективных свойств комплексов белков вируса осповакцины.

3.4.2. Характеристика безвредности и реактогенности препаратов вакцины против оспы.

3.5. Изучение иммунологических свойств стафилококкового энтеротоксина А (СЭА)

3.6. Получение и анализ моноклональных антител (МКА) к стафилококковому энтеротоксину А (СЭА). Конструирование иммуноферментной тест-системы на основе МКА.

3.7. Получение моноклональных антител к стафилококковому альфа-токсину (CAT) методом иммунизации in vitro.

3.7.1 Свойства моноклональных антител к CAT

3.7.2. Разработка иммуноферментного метода определения CAT в крови больных с септическим процессом.

3.8. Разработка метода обнаружения вирусов гепатита В и С в биосубстратах методом ПЦР

3.8.1. Выбор праймеров и определение чувствительности метода анализа

3.8.2. Испытание разработанного метода детекции вирусов гепатита В и С на клинических образцах

3.9. Разработка способа дифференциального выявления геномных ДНК M.tuberculosis и M.bovis

3.9.1. Разработка метода дифференциальной детекции микобактерий туберкулёзного комплекса на основе двухраундовой ПЦР.

3.9.2. Разработка способа дифференциального выявления ДНК М.tuberculosis и М,bovis на основе многоцикловой однораундовой ПЦР.

3.9.3. Испытание разработанного способа выявления ДНК на клинических образцах, содержащих лекарственно-устойчивых возбудителей туберкулёза

3.10. Разработка иммуноферментного способа диагностики иксодового клещевого боррелиоза, основанного на рекомбинантных антигенах

3.10.1. Определение зараженности клещей, собранных на территории Сибири

3.10.2. Конструирование рекомбинантных штаммов E.coli, продуцирующих антигены OspC и фрагмент FlaB новосибирского изолята B.garinii NT

3.10.3. Разработка прототипов иммуноферментных тест-систем для диагностики начальных стадий Лайм-боррелиоза

3.10.4. Оптимизация наработки и выделения рекомбинантных антигенов из штаммов-продуцентов E.coli

3.11. Получение рекомбинантных штаммов E.coli, продуцирующих стафилококковый а-токсин

3.11.1. Анализ экспрессии структурной области генов а-токсина в клетках E.coli

3.11.2. Конструирование серии векторов для экспрессии в клетках E.coli

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Использование методов молекулярной биологии и генной инженерии для конструирования вакцинных и диагностических препаратов»

В настоящее время известно более тысячи видов вирусов - представителей более 20 семейств, патогенных для человека (Смородинцев, 1984). Не менее многочисленна группа болезнетворных микроорганизмов: патогенных и условнопатогенных бактерий, риккетсий, простейших паразитов, общее число которых достигает 3 тысяч. Благодаря широкому внедрению в вирусологические и микробиологические исследования современных методов молекулярной биологии и генетической инженерии в последние два десятилетия открыты новые возбудители инфекций: вирусы гепатита С (Marwick, 1984; Choo et al., 1989), ВИЧ (Broder, Gallo, 1984; Klatzm'ann et al., 1984; Montagnieret al., 1984; Ratner et al., 1985a), возбудитель болезни Лайма (Burgdorfer et al, 1982), вирус губчатой болезни коров и возбудитель вспыхнувшей в конце 2002 г. в КНР эпидемии тяжелой высококонтагиозной пневмонии (Ksiazek, et al., 2003 ).

Природное многообразие возбудителей инфекций требует наряду с проведением санитарно-гигиенических и противоэпидемических мер создания средств их специфической профилактики и диагностики. Значение иммунопрофилактики в снижении многих болезней и даже их искоренении (в случае натуральной оспы) общеизвестно. Ведущее место в борьбе с такими инфекциями как, полиомиелит, столбняк, корь, коклюш, дифтерия, туберкулёз и др. занимает вакцинация населения.

Все вакцины, независимо от способа их применения и назначения можно разделить на три больших класса: живые, инактивированные и искусственные (Воробьёв, 1980). В арсенале отечественной иммунопрофилактики фигурируют главным образом живые и инактивированные вакцины. Однако, значительный удельный вес живых вакцин (55%), являющихся наиболее эффективным видом защитных препаратов, порождает большую проблему безопасности вакцинаций (Воробьёв, 1975; Ляшенко, Воробьёв, 1982). Одним из перспективных направлений решения этой проблемы является создание молекулярных и искусственных (рекомбинантных и синтетических) вакцин. Широкие возможности для конструирования таких вакцин открылись в последние 25 лет благодаря развитию методов молекулярной биологии и биохимии белка, прогрессу в области генной инженерии и биотехнологии (Мертвецов, Беклемишев, Савич, 1987).

Вполне понятно, что реализация этих подходов требует больших усилий исследователей различных специальностей: вирусологов, микробиологов, молекулярных биологов, генных инженеров, биотехнологов и химиков. Особую важность и значение эти исследования приобрели в последние 20 лет ввиду изменения эпидемической ситуации в мире. С одной стороны, наблюдается значительное снижение, либо стабилизация ряда особо опасных инфекций, а с другой - появление и распространение ранее неизвестных инфекций (вирусные иммунодефициты и гепатиты, Лайм-боррелиоз, атипичная пневмония и др.). Растёт и заболеваемость туберкулезом, гриппом, госпитальными инфекциями, на уровень эпидемий вышли ВИЧ-инфекции и заболевания вирусными гепатитами. Ряд ведущих специалистов опасается мировой пандемии преодолевающих межвидовой барьер высоковирулентных вирусов гриппа птиц (Chen et al., 2003; Okazaki et al., 2000). Одно из ведущих мест среди возбудителей внутрибольничных инфекций продолжает занимать стафилококковая инфекция (Васильева, 1991). Пищевые отравления, вызываемые стафилококковыми энтеротоксинами, составляют большую часть пищевых отравлений бактериальной этиологии (Reiser et al.,1988; Постовит, 1987). Имевшие совсем недавно в США случаи заболеваний людей, вызванных вирусом оспы обезьян, свидетельствуют об определённой вероятности выхода из природы на «эпидемическую орбиту» высоковирулентных и контагиозных для человека мутант-ных вариантов покс-вирусов. Всё это с особой остротой ставит вопрос о необходимости разработки безопасных вакцин, высокоспецифичных и чувствительных диагностических тест-систем.

В диссертации представлены результаты многолетних исследований, направленных на создание нового поколения вакцин и диагностических препаратов с использованием методов молекулярной биологии, иммунологии, вирусологии и генетической инженерии. Выбор объектов исследований и основные задачи определялись как потребностью здравоохранения, так и специальными Государственными заказами. Работа выполнялась последовательно на базе НПО «Вектор» (п.Кольцово, НСО), Института молекулярной биологии и биохимии АН Каз ССР им. М.А. Айтхожина (г. Алма-Ата), НИБХ СО РАН (г.Новосибирск) и ГУ НИИ биохимии СО РАМН (г.Новосибирск).

Актуальность темы. Достижения в 80-х годах в области использования вируса осповакцины (ВОВ) в качестве эукариотического экспрессирующего вектора значительно стимулировали всестороннее исследование самого вируса осповакцины. Во-первых, представлял интерес поиск в геноме ВОВ мест, подходящих для встройки чужеродной генетической информации с целью создания поливалентных вакцин. Во-вторых, возник и вопрос о безопасности создаваемых рекомбинантных штаммов ВОВ. Никто не мог гарантировать, что при встройке чужеродной ДНК не появятся варианты высокопатогенного для человека рекомбинанта ВОВ. В третьих, не менее важной проблемой являлось установление роли собственных антигенов ортопоксвирусов в индукции иммунитета. В то время сведения такого рода были весьма ограничены. Всё это вместе взятое сдерживало практическое использование уже полученных рекомбинантных штаммов. Назрела острая необходимость выяснения роли отдельных структурных белков ВОВ в индукции иммунитета, установления их локализации в геноме и создания безопасной противооспен-ной вакцины.

По статистическим данным во время пандемии 1918-1919 гг погибло более 40 миллионов людей, а заболеваемость гриппом составила 500 млн человек. Смертность во время пандемий 1957 (вирус гриппа А подтипа Н2Ы2) и 1968 (НЗЫ2) г.г. была около 6 миллионов. Всё это обусловило повышенный интерес к возбудителю этого заболевания, как в научном плане, так и в плане создания эффективных противогриппозных вакцин нового поколения, которые могли бы прийти на смену живым и инактивированным цельновирионным.

Актуальными были и остаются и проблемы диагностики опасных для человека инфекций таких как вирусные гепатиты В и С, туберкулёз, клещевой иксодовый боррелиоз, госпитальные инфекции, а также пищевые токсикоин-фекции.

Цель исследования: разработать молекулярно-биологические основы для создания прототипов противооспенной и противогриппозной субъединичных вакцин, специфичных и чувствительных методов экспресс-диагностики вирусных гепатитов В и С, туберкулёза, клещевого иксодового боррелиоза, стафилококкового сепсиса. Задачи исследования:

1. Создать методическую базу для конструирования молекулярных вакцин и диагностикумов, включающую применение и совершенствование мо-лекулярно-биологических и генно-инженерных методов, конструирование специальных векторов для экспрессии генов в клетках Е.соН.

2. Исследовать физико-химические, антигенные и иммуногенные (протек-тивные) свойства белков вирусов гриппа и осповакцины и разработать эффективные способы их выделения и очистки.

3. Картировать на геноме отдельные гены, кодирующие иммуногенные белки вирусов осповакцины.

4. Сконструировать на основе очищенных протективных антигенов прототипы молекулярных вакцин для специфической профилактики инфекций, вызываемых вирусами гриппа и натуральной оспы.

5. Получить рекомбинантные формы стафилококкового а-токсина для создания на его основе иммуноферментной тест-системы для диагностики стафилококковых сепсисов, а также, в перспективе, иммунизирующих препаратов для получения противостафилококковой гипериммунной донорской лечебной плазмы.

6. Исследовать иммунобиологические свойства стафилококкового энтеро-токсина А, получить моноклональные антитела к нему и сконструировать на их основе прототип высокоспецифичной иммуноферментной тест-системы.

7. Сконструировать прототип иммуноферментной тест-системы для диагностики иксодового клещевого боррелиоза на основе рекомбинантных антигенов возбудителя.

8. Разработать высокоспецифичные и чувствительные способы обнаружения возбудителей туберкулёза, гепатитов В и С и иксодового клещевого боррелиоза в биосубстратах на основе использования методов полиме-разной цепной реакции и обратной транскрипции.

Научная новизна работы.

1. Установлены первичные структуры З'-концевой области генома вируса энцефаломиокардита мышей, полноразмерных ДНК-копий мРНКпроопио-меланокортина человека, быка и крысы, а также фрагментов генома трёх штаммов вируса гриппа. Выявлено, что гемагглютинин одного из штаммов (А/Алма-Ата/1417/84) имеет 96,12% гомологии с гемагглютинином возбудителя пандемии гриппа 1918-1919.

2. Показано, что белки оболочки вириона ВОВ р12, р19, р20, р35 и р42 являются ранне-поздними, поскольку их синтез в инфицированных клетках наблюдается в условиях ингибирования репликации вирусной ДНК.

3. Установлено, что белок оболочки вируса осповакцины р20 является ди-мером белка р12, а предшественником гликопротеина р35 оболочки вириона является полипептид с молекулярной массой 27 кДа. Предшественники белков оболочки ВОВ р12 и р42, а также белка сердцевины р11 не отличаются по электрофоретической подвижности от зрелых белков вириона.

4. Методом гибридизационной селекции мРНК на фрагментах геномной ДНК ВОВ с последующим иммунохимическим анализом продуктов ее бесклеточной трансляции показано, что расположенный на стыке НтсИП Е- и Р-фрагментов ген кодирует сердцевинный поздний белок р11.

6. Впервые проведено иммуноаффинное выделение специфической мРНК, кодирующей белок р35 оболочки вириона ВОВ. Показано, что кДНК, синтезированная на мРНК специфически гибридизуется с геном 26К из левого Hindlll A-SalGI-фрагмента вирусной ДНК.

7. Обнаружен новый вид функциональной активности стафилококкового энтеротоксина А, характеризующийся способностью этого токсина индуцировать в условиях in vitro продукцию ИЛ-1 моноцитами периферической крови человека. Токсин проявляет выраженную ИЛ-1-индуцирующую активность в диапазоне концентраций от 100 пг/мл до 100 нг/мл.

8. Впервые обнаружено свойство стафилококкового энтеротоксина А неспецифически связываться с Fc-фрагментом иммуноглобулинов различных животных и определена локализация на нём участка связывания Fc-фрагмента. Эффективность связывания токсина с IgM намного ниже, чем с IgG.

9. Впервые при использовании метода иммунизации in vitro получены гибридомы, секретирующие моноклональные антитела lgM-кпасса против стафилококкового а-токсина.

10. В начале желтушного периода у больных вирусным гепатитом В с большим постоянством, наряду с HBs- и НВе-антигенами, в слюне выявляется и ДНК HBV; в период ранней реконвалесценции у 59,4% больных вирусным гепатитом В в слюне продолжает выявляться НВеАд при отрицательных результатах индикации ДНК HBV, обусловленных, по-видимому, ее низкой концентрацией в исследуемом биосубстрате. Эти данные свидетельствуют в пользу возможной длительной персистенции вируса в слюнных железах и потенциальной эпидемической значимости реконвалесцен-тов, как источников естественной передачи инфекции для контактирующих с ними лиц.

11. Иксодовые клещи Ixodes persulcatus, распространенные на территории Алтая, Новосибирской и Томской областей, заражены только двумя генови-дами Borrelia burgdorferi s.l.: B.garinii и B.afzelir, уровень зараженности клещей спирохетами, определявшийся в период с 1999 по 2003 г.г., колебался в пределах 10-40% в зависимости от года наблюдения и ареала распространения.

12. Определены нуклеотидные последовательности кодирующих областей генов ospC и flaB десяти сибирских изолятов Borrelia burgdorferi s.l. и методами компьютерного анализа выявлены потенциальные антигенные детерминанты соответствующих белков.

13. На основе сравнения первичных структур липопротеидов OspC, выведенных из нуклеотидных последовательностей соответствующих генов, установлены филогенетические связи сибирских изолятов боррелий с другими представителями этого вида спирохет.

Практическая значимость работы:

1. Разработан оригинальный и простой способ разделения белков оболочки и сердцевины вируса гриппа, а также щадящий метод разделения гемагг-лютинина и нейраминидазы, который может быть использован как в научных исследованиях, так и в конструировании молекулярных противогриппозных вакцин.

2. Получен образец комбинированной молекулярной вакцины против двух серотипов вируса гриппа (H1N1 и H3N2), обладающий выраженной протективной активностью, который после проведения полных доклинических и клинических испытаний может быть использован для иммунопрофилактики гриппа.

3. Разработан новый эффективный способ получения моноспецифических антисывороток, включающий в себя как модифицированный метод препаративного электрофореза белков, так и особую схему иммунизации животных. Разработанная технология может быть использована в научных исследованиях. Получена коллекция специфических антисывороток ко всем мажорным белкам оболочки вириона, а также к некоторым белкам его сердцевины.

4. Прототип противооспенной вакцины, сконструированной на основе белков оболочки вируса осповакцины, по данным доклинических испытаний может применяться в качестве превакцины.

5. Иммуноферментная тест-система для определения стафилококкового энтеротоксина А может использоваться в пищевой промышленности, санитарно-эпидемиологической службе и клинике токсикоинфекций.

6. Разработан высокочувствительный и специфичный метод дифференциального выявления микобактерий туберкулезного комплекса, исключающий получение ложноположительных результатов анализа у недавно вакцинированных BCG людей и животных. Метод может быть применен в практическом здравоохранении для быстрой диагностики туберкулеза и контроля над эффективностью противотуберкулёзной терапии.

7. Разработан прототип иммуноферментной тест-системы для выявления начальных стадий заболевания иксодовым клещевым боррелиозом, который может быть использован в практическом здравоохранении.

8. Разработаны способы выявления геномных нуклеиновых кислот возбудителей гепатитов В, С и иксодового клещевого боррелиоза, которые могут быть использованы в эпидемиологических и диагностических исследованиях.

9. Предложен оптимальный метод выделения ДНК микобактерий, являющийся быстрым, простым в исполнении и обеспечивающим наибольший выход ДНК. Метод может быть использован в эпидемиологических исследованиях и в ДНК-диагностике туберкулёза.

10. На основе исходной плазмиды plL-2/21 (SU1761805 А1 ) сконструирована серия экспрессирующих векторов, обеспечивающих эффективную индуцируемую экспрессию встраиваемых генов под контролем регуляторной области гена recA Proteus mirabilis.

11. Разработана технология получения рекомбинантных белков в клетках E.coli с использованием сконструированных в данной работе векторов.

12. Получены рекомбинантные штаммы E.coli, обеспечивающие сверхсинтез стафилококкового а-токсина. Рекомбинантный токсин можно использовать как для разработки ингибиторной иммуноферментной тест-системы диагностики стафилококковых сепсисов, так и для получения иммунизирующего препарата в производстве лечебной противостафилококковой гипериммунной сыворотки.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный и усовершенствованный комплекс молекулярно-биологических и иммунохимических методов, обеспечивает решение задач, связанных с конструированием молекулярных вакцин, созданием диагностических тест-систем, исследованием первичных структур РНК- и ДНК-содержащих геномов возбудителей инфекций и картированием генов специфических антигенов.

2. Прототипы молекулярных вакцин (противооспенной и противогриппозной), обеспечивают индукцию защитного иммунного ответа у вакцинируемых животных.

3. Белки оболочки вириона ВОВ р12, р19, р20, р35 и р42 являются ранне -поздними, причём белок р20 является димером белка р12, а предшественником гликопротеина р35 оболочки вириона является полипептид с мол. массой 27 кДа,

4. Ген, кодирующий сердцевинный белок вириона р11 локализован на стыке Hindlll Е- и F-фрагментов геномной ДНК.

5. Разработана высокоспецифичная иммуноферментная тест-система определения стафилококкового энтеротоксина А в пищевых продуктах.

6. Разработанные методы выявления геномных нуклеиновых кислот возбудителей туберкулёза, гепатитов В, С и иксодового клещевого боррелио-за, характеризуются высокой чувствительностью, специфичностью и простотой исполнения.

7. Слюнные железы больных вирусным гепатитом В, как в начале желтушного периода, так и в стадии реконвалесценции, могут служить местом персистенции вируса, а сами больные могут являться потенциальными источниками естественной передачи инфекции для контактирующих с ними лиц

8. Способ иммуноферментного выявления в крови пациентов антител к двум антигенам (OspC и FlaB) Borrelia garinii NT 29 позволяет диагностировать начальные стадии заболевания иксодовым клещевым боррелио-зом

9. Спирохеты комплекса Borrelia burgdorferi s.l., циркулирующие в популяциях иксодовых клещей Ixodes persulcatus, распространенных на территории Сибири, представлены только двумя геновидами: Borrelia garinii и Borrelia afzelii,- и составляют отдельную группу, родственную изолятам боррелий, выделенных в Японии и Корее. Заражённость взрослых клещей колеблется в пределах 10-40% в зависимости от года наблюдения и ареала распространения.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Беклемишев, Анатолий Борисович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В разделе 3.1. представлены результаты наших ранних исследований по совершенствованию и применению ряда молекулярно-биологических методов: метода бесклеточного синтеза белка, метода обратной транскрипции РНК и клонирования кДНК, методов иммуноаффинного выделения специфических полирибосом и белков и др. Комплекс этих методов был использован в наших последующих работах, направленных на изучение структурно-функциональной организации геномов патогенных вирусов, картирование их генов, кодирующих протективные антигены, иммунохимиче-ское исследование антигенов патогенных микроорганизмов и создание прототипов молекулярных вакцин и диагностических препаратов.

В процессе выполнения работ по конструированию молекулярной противогриппозной вакцины были разработаны оригинальные простые и эффективные способы выделения и очистки структурных белков вирионов вируса гриппа. На основе гликопротеидов оболочки двух штаммов вируса гриппа был получен образец комбинированной субъединичной вакцины и в экспериментах на животных получены предварительные результаты по изучению иммуногенной активности препарата. Используя этот подход, на основе поверхностных антигенов ВГ и нуклеокапсидного белка, полученных из различных подтипов вируса, циркулировавших в период эпидемий/пандемий можно сконструировать комбинированные молекулярные вакцины с широким спектром действия. Вполне понятно, что такая вакцина является дорогой и может быть использована главным образом для вакцинации научного и медицинского персонала, связанного по роду своей деятельности с гриппозной инфекцией, а также в качестве превакцины для иммунодефицитных лиц. Следующим шагом в этом направлении может быть химический синтез олигопептидов, содержащих основные антигенные детерминанты белков-иммуногенов различных серотипов ВГ и, в случае достижения положительного эффекта при применении такой уже синтетической вакцины, перспективным направлением становится создание с помощью генно-инженерных методов микробиологического продуцента для промышленного производства комбинированной молекулярной вакцины.

Большой раздел исследований посвящен структурнофункциональному изучению вируса осповакцины и созданию прототипа противооспенной вакцины. Вирус осповакцины является одним из наиболее сложно устроенных вирусов эукариот. Исследование его генетического аппарата требует применения комплекса самых тонких и сложных биохимических и молекулярно-биологических методов. Как уже отмечалось выше, получение сколь-нибудь значимых и имеющих практическое применение результатов в этой области возможно лишь при проведении широкомасштабных работ достаточно большими группами исследователей. В представленной работе как раз и ставилась задача создания необходимой научной и экспериментально-методической основы для осуществления таких работ по картированию генов структурных белков вируса осповакцины.

Поставленная задача решалась проведением, в первую очередь, комплексного анализа достаточно обширного круга белков оболочки внутриклеточной формы вириона ВОВ. В связи с этим работа была начата с усовершенствования и стандартизации процедуры выделения вирусного препарата. Разработанный модифицированный способ очистки вирионов отличается высокой стабильностью и воспроизводимостью получаемых при этом результатов в отношении их белкового состава. Способ позволяет эффективно проводить наработку больших количеств вируса (более 100 мг) и, таким образом, осуществлять значительные циклы исследований на одном вирусном препарате. Помимо этой работы, очищенный таким способом вирус был использован для выделения препаративных количеств белков оболочки вириона, а также его фракций, растворимых в ЫР40 и ЛСН, с целью изучения их иммуногенных свойств.

Проведенный электрофоретический анализ вирионных белков ВОВ позволил выявить у них ряд неописанных ранее особенностей, в частности, связанных с их способностью агрегировать в условиях электрофореза, и некоторые другие.

Большое значение на первом этапе работы имела разработка высокоэффективного и достаточно универсального способа получения моноспецифических антисывороток, позволившего получить их коллекцию ко всем основным белкам оболочки вириона, а также к некоторым вирусным белкам, полученным с помощью бактериальных продуцентов.

С помощью полученных в этой работе антисывороток был проведен иммунохимический анализ белков вириона и продуктов бесклеточной трансляции вирусспецифической мРНК. Более детально были изучены антигенные свойства белка р35 оболочки вириона, что оказалось весьма существенным для последующей интерпретации результатов по картированию его гена, а также по определению его иммуногенных свойств. Были выявлены антигенные гомологии между некоторыми белками оболочки ВОВ, изучена динамика накопления белков вириона в инфицированных клетках, проведена идентификация в продуктах бесклеточной трансляции вирусспецифической мРНК полипептидов-предшественников ряда структурных белков ВОВ.

Таким образом, осуществленные на первом этапе данной работы методические разработки, а также проведенный комплексный анализ структурных белков ВОВ послужили необходимой основой для картирования их генов с использованием различных методических подходов.

Методом гибридизационной селекции вирусной мРНК было показано, что продуктом картированного ранее на стыке Hindlll Е- F-фрагментов ДНК ВОВ гена является строго сердцевинный белок р11, а не оболочечный, как это предполагалось. Установление этого факта является весьма ценной информацией, поскольку оно предотвращает проведение некоторых заведомо нецелесообразных экспериментов, основанных на имевшихся ошибочных данных.

Успешное проведение иммунохимического выделения специфической мРНК вируса осповакцины дало принципиально новую возможность для картирования генов его структурных белков.

Полученные в этой работе результаты дают возможность продолжить исследования как структурных белков вируса осповакцины, так и организации их генов в вирусном геноме.

Прежде всего, представляет интерес дальнейшее изучение антигенных свойств основных оболочечных белков ВОВ с помощью моноспецифических антисывороток, а также исследование роли каждого из них в процессе мофогенеза вириона в инфицированных клетках методами иммунной электронной микроскопии.

Полученные антисыворотки могут быть использованы также в изучении других имеющих народно-хозяйственное значение поксвирусов и, конечно, в продолжении картирования генов стуктурных белков ВОВ. С другой стороны, уже полученные результаты по локализации ряда вирусных генов предоставляют возможность для использования их в качестве мест встройки чужеродной генетической информации, а также более глубокого изучения природы кодируемых ими белков.

Таким образом, настоящая работа внесла свой вклад в структурно-функциональное изучение генома ВОВ и открыла перспективу для дальнейших исследований в этой области.

Специальное внимание в работе было уделено иммунобиологическому изучению стафилококкового энтеротоксина А (СЭА). СЭА, как и другие энтеротоксины особенно в последнее время приковывает внимание специалистов различных областей медицины и биологии: клиницистов и иммунологов, бактериологов и молекулярных биологов. Это связано прежде всего с большим разнообразием биологических свойств СЭА. Являясь высокотоксичным агентом, он, в то же время, обладает выраженными иммуномодули-рующими свойствами - может стимулировать или супрессировать иммунитет. В настоящее время существует мнение, что его различные иммунологические и токсические эффекты определяются различными эпитопами молекулы СЭА, Помимо фундаментальных аспектов исследования антигенной структуры СЭА и молекулярных механизмов его взаимо-действия с клетками-мишенями существует постоянный практический интерес к СЭА. Это прежде всего проблема индикации СЭА в пищевых продуктах, культуре стафилококка и клиническом материале от больных с пищевой интоксикацией. Вторая, более новая, прикладная - использование СЭА или его фрагментов в качестве избирательных иммуномодуляторов и даже неспецифических противоопухолевых препаратов.

В связи с этим наша работа была посвящена исследованию некоторых ранее неизвестных свойств СЭА, имеющих отношение к механизму его воздействия на иммунную систему, а также получению и характеристике моноклональных антител к СЭА и их использованию для конструирования тест-системы и эпитопного анализа СЭА. Было, в частности, установлено, что СЭА действительно является индуктором синтеза ИЛ-1 в моноцитах крови человека в диапазоне концентраций от 100 пг/мл до 100 нг/мл, хотя и уступает известному индуктору ИЛ-1 сальмонелезному липосахариду, содержащемуся в фармакологическом препарате - пирогенале. Впервые была обнаружена способность СЭА неспецифически связываться с Рс-фрагментами иммуноглобулинов животных, причём в связывании СЭА участвуют углеводные компоненты Яс-участка 1дО и 1дМ.

Из опытов по конкуренции СЭА с СПА за связывание 1дв можно заключить, что участки 1дО, ответственные за связывание с этими белками, находятся в одной области Рс-фрагмента и либо идентичны друг другу, либо расположены очень близко и стерически экранируются при связывании с соответствующим лигандом. Причем СПА-связывающий сайт 1дО обладает большим аффинитетом к лиганду, чем сайт, связывающий СЭА. Возможно также, что СПА имеет больше сайтов связывания с 1дС, чем с СЭА. Так, по литературным данным, СПА имеет 5 сайтов связывания с 1дО (Мокв е1 а1., 1986). В наших экспериментах комплекс 1дС-СЭА состоял из двух молекул 1дв и одной молекулы СЭА.

Проведенный нами подробный иммунохимический анализ природы связывания СЭА с Рс-фрагментом иммуноглобулина наводит на мысль об аналогии с СПА, а также со стрептококковым протеином С, которые хорошо известны как высокоаффинные Рс-связывающие реагенты. В связи с этим можно предположить, что СЭА, попадая в организм животного, связывается с неспецифическими иммуноглобулинами хозяина в области Рс-фрагментов и тем самым экранируется ими, и ускользает от иммунологического контроля иммунной системы.

Учитывая исследовательские и прикладные возможности моноклональ-ных антител (МКА), специальное внимание в работе было уделено получению методом гибридомной технологии стабильных клеточных линий, продуцирующих высокоспецифичные МКА к энтеротоксину А стафилококка, изучению некоторых их свойств и разработке иммуноферментной тест-системы определения СЭА.

Получение МКА к СЭА представляет собой трудоемкий процесс, сопряженный со значительными трудностями ввиду его токсичности и слабой иммуногенности. Кроме того, как было показано (Platsoucas et al., 1986), СЭА обладает стимулирующим действием по отношению к Т-супрес-сорам. В связи с этим, схема иммунизации и форма предъявления антигена, по-видимому, имела важное значение в технологии получения МКА к СЭА.

Сравнение различных схем иммунизации позволило выбрать наиблее оптимальную для высокотоксичных белков. В результате работы была получена гибридома, продуцирующая моноклональное антитело E9D11 IgGi изотипа, которое проявило высокую специфичность к СЭА и не реагировало с СЭВ, СЭС^, C3D, CAT, хотя серологический анализ различных типов СЭ показывает существование общих эпитопов у разных пар и имеются идентичные эпитопы для пар СЭА-СЭЕ и СЭВ-СЭС (Езепчук, 1985, Thompson et al., 1985). Это антитело обладало не только высокой специфичностью, но и достаточно высокой аффинностью (Ка=1,34х108 М) к СЭА что делает его весьма перспективным для создания диагностических тест-систем. Было отмечено, что максимальное значение Ка достигает 10^ М-1,а низкие значения Ка= 105-М~1 (Егоров, Диков, 1982).

Эксперименты по разработке различных постановочных вариантов иммуноферментной тест-системы для выявления СЭА на основе МКА E9D11 показали возможность получения чувствительных тестов, пригодных для определения СЭА в нанограммовых количествах. Причем большей чувствительностью обладала тест-система на основе реакции ингибирова-ния ИФА (10 нг/мл), чем "сэндвич-ИФА" (150 нг/мл).

В перспективе планируется апробировать сконструированные тест-системы выявления СЭА для практического использования в пищевой промышленности. Следует подчеркнуть, что весьма перспективным для конструирования иммуноферментных тест-систем для выявления стафилококковых эетеротоксинов являются МКА, подобные 4С6, поскольку они специфичны к общим для всех СЭ антигенным детерминантам.

Три раздела исследований посвящены разработке методов диагностики вирусных (HBV и HCV) и бактериальных инфекций с использованием двух подходов: один основан на обнаружении геномных нуклеиновых кислот возбудителей инфекций методами ПЦР или ОТ-ПЦР, другой - на выявлении антител в крови к антигенам, полученным генно-инженерными методами.

Разработанный метод обнаружения геномных нуклеиновых кислот вирусов гепатиов В и С с использованием однопробирочной «гнездовой» ПЦР обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Использование этого метода значительно снижает риск перекрёстной контаминации ампликонами, которая имеет место в случае применения двух-раундовой ПЦР. Кроме того, этот метод, как и методы ПЦР-детекции патогенных микобактерий и возбудителей клещевого боррелиоза может быть трансформирован в формат, пригодный для проведения ПЦР в реальном времени. Применение в разработанных способах ПЦР-детекции внутреннего положительного контроля (ДНК ВК) прохождения ПЦР позволяет регистрировать возможные случаи ингибирования Тая-полимеразы в анализируемых образцах и, следовательно, отслеживать ложноотрицательные результаты анализа.

Методы диагностики, основанные на ПЦР, в силу своей дороговизны, конечно, не могут использоваться в массовых анализах, но являются незаменимыми для осуществления контроля за прохождением курса лечения, могут быть использованы в качестве подтверждающего диагностического теста, а также для выявления вирусов в банках донорской крови и в препаратах, получаемых из крови.

Разработанный в данной работе способ диагностики начальных стадий клещевого боррелиоза, основанный на иммуноферментном анализе, имеет удовлетворительную специфичность и чувствительность. Однако, несомненно, требуется его дальнейшее совершенствование. Реальный путь к этому - введение в тест-систему большего числа различных специфических антигенов боррелий. Кроме того, заманчивым представляется создание стриппового варианта тест-системы с использованием ранних и поздних антигенов, который позволит как-то судить о стадии заболевания ИКБ.

377