Создание рекомбинантных антител против вируса клещевого энцефалита и изучение их свойств тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Николенко, Галина Николаевна

• Николенко, Галина Николаевна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Николенко, Галина Николаевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. РЕКОМБИНАНТНЫЕ АНТИТЕЛА.

1. Структура и свойства иммуноглобулинов.

2. Организация генов иммуноглобулинов.

3. Рекомбинантные антитела.

3.1. Химерные антитела.

3.2. Гуманизированные антитела.

3.3. Fab- и Fv-фрагменты антител.

3.4. Одноцепочечные антитела (scFv).

3.5. Гибридные молекулы рекомбинантных антител.

3.6. Изолированный VH-домен.

3.7. Производные гипервариабельных (CDR) петель.

4. Получение рекомбинантных антител in vitro.

4.1. Продукция фрагментов антител в клетках Е.coli.

4.2. Комбинаторные библиотеки генов иммуноглобулинов.

4.3. Экспрессия генов антител в клетках млекопитающих.

5. Перспективы применения рекомбинантных антител. 38 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 43 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 58 1. Конструирование гена одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита.

1.1 Клонирование генов вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей

МКАЕ6В.

1.2. Анализ первичной структуры Vh и Vk генов МКА Е6В.

1.3. Конструирование гена одноцепочечного антитела (scFv).

2. Получение и исследование мономерных одноцепочечных антител.

2.1. Конструирование плазмиды, обеспечивающей продукцию в клетках E.coli мономерных рекомбинантных антител.

2.2. Исследование особенностей продукции мономерных одноцепочечных антител в клетках Е. coli.

2.3. Оценка иммунохимических свойств мономерных рекомбинантных антител в составе клеточных лизатов.

3. Получение и исследование димерных одноцепочечных антител.

3.1. Конструирование плазмиды, обеспечивающей продукцию в клетках E.coli димерных рекомбинантных антител.

3.2. Исследование особенностей продукции димерных одноцепочечных антител в клетках Е. coli.

4. Очистка рекомбинантных антител против вируса КЭ. 93 4.1 Конструирование плазмид, обеспечивающих продукцию мономерной и димерной форм одноцепочечных антител с гистидиновым гексамером на С-конце. 94 4.2. Очистка рекомбинантных антител на никелевом сорбенте.

5. Исследование иммунохимических свойств очищенных мономерных и димерных рекомбинантных антител.

6. Определение констант диссоциации комплекса антиген-антитело для рекомбинантных антител и МКА Е6В. 105 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 109 ВЫВОДЫ 113 БЛАГОДАРНОСТИ 115 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений

АИА - антиидиотипические антитела а.о. - аминокислотные остатки

МКА - моноклональные антитела

ИФА - иммуноферментный анализ o.e. - оптические единицы

ПААГ - полиакриламидный гель

КЭ - клещевой энцефалит

ИПТГ -изопропил-Р-Б-тиогалактопиранозид

Ар - ампициллин colEI - участок инициации репликации

CDR - гипервариабельный участок вариабельного домена антитела

HBs-антиген - поверхностный антиген вируса гепатита В

HBs-эпитоп - основной нейтрализующий эпитоп HBs-антигена

ШУ - вирус иммунодефицита человека

FR - каркасный участок вариабельного домена антитела

PCR - полимеразная цепная реакция реЮ - пектатлиаза В scFv - одноцепочечные антитела

VH - вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина VL - вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Создание рекомбинантных антител против вируса клещевого энцефалита и изучение их свойств»

Актуальность проблемы. Вирус клещевого энцефалита (КЭ), представитель семейства Flaviviridae, переносимый клещами рода Ixodes и циркулирующий, в основном, в лесных зонах Сибири и Дальнего Востока, является высоко патогенным агентом, вызывающим тяжелую нейроинфекцию. Использование в настоящее время в терапии КЭ главным образом препаратов, получаемых из донорской крови, имеет ряд недостатков, включая острый дефицит этих препаратов, их высокую цену и возможный биологический риск, связанный с их применением, в том числе из-за возможности контаминации таких препаратов неидентифицированными вирусными агентами. Это создает необходимость поиска альтернативных терапевтических средств. Применение моноклональных антител для профилактики и терапии клещевого энцефалита остается крайне проблематичным. Поэтому особенно актуально создание искусственных антител для использования их в качестве лекарственных средств.

Одним из подходов, используемых в настоящее время для получения искусственных антител, является конструирование одноцепочечных антител (scFv), состоящих из вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, объединенных коротким пептидом в одну молекулу. Разработаны способы создания бивалентных молекул одноцепочечных антител, которые имеют большее сродство к антигену, чем моновалентные. Как правило, мономерные и димерные одноцепочечные антитела сохраняют специфичность и аффинность соответствующих им исходных моноклональных антител, а из-за своих небольших размеров легче проникают в ткани и вызывают значительно меньший неспецифический иммунный ответ, что позволяет рассчитывать на их использование в медицинской практике.

Создание рекомбинантных антител против вируса КЭ в клетках Е.соН и исследование их иммунохимических свойств является первым этапом работы, без которого невозможно обойтись при создании лекарственных средств нового поколения против вируса КЭ. Данные о структуре гипервариабельных районов рекомбинантных антител к вирусу КЭ, созданных на основе уже исследованных МКА с рядом важных биологических свойств, таких как протективность и способность к нейтрализации инфекционной активности вирусных частиц, могут в дальнейшем стать основой для построения модели взаимодействия антител с вирусом и подбором потенциальных лигандов, перспективных для создания новых антивирусных лекарственных препаратов. Кроме того, по мере накопления таких данных появится возможность использовать их для исследования молекулярных основ протективности антител и их вируснейтрализующих свойств.

Цель работы. Целью данного исследования являлось создание рекомбинантных антител против вируса клещевого энцефалита и изучение их свойств.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

• Клонировать фрагменты кДНК, кодирующие вариабельные домены моноклонального антитела против вируса КЭ и сконструировать на их основе гены одноцепочечных антител.

• Создать бактериальные штаммы-продуценты рекомбинантных антител и исследовать особенности продукции одноцепочечных антител в клетках Е.соН.

• Получить очищенные препараты рекомбинантных антител и исследовать их иммунохимические свойства.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые были клонированы и секвенированы фрагменты кДНК, кодирующие вариабельные домены тяжелой (Vh) и легкой (Vk) цепей мышиного моноклонального антитела Е6В против поверхностного гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита. На основе клонированных Vh и Vk генов МКА Е6В был сконструирован ген, обеспечивающий экспрессию мономерных одноцепочечных антител. Впервые предложено введение в С-конец молекулы одноцепочечных антител двух остатков цистеина в составе линейного эпитопа поверхностного антигена вируса гепатита В (HBs-эпитопа), что обеспечило как формирование димерной формы рекомбинантных антител, так и возможность детекции продуктов экспрессии целевых генов одноцепочечных антител при помощи специфических МКА к HBs-эпитопу.

В результате проделанной работы получены бактериальные штаммы, эффективно продуцирующие мономерную и димерную формы одноцепочечных антител против вируса КЭ. Исследованы особенности продукции рекомбинантных антител в клетках E.coli. Показано сохранение у рекомбинантных антител идиотипа исходных МКА. Показана специфичность взаимодействия полученных рекомбинантных антител с вирусом КЭ и рекомбинантным белком Е вируса КЭ, и подтверждена идентичность эпитопа белка Е, распознаваемого рекомбинантными антителами и МКА Е6В. Показано, что мономерные одноцепочечные антитела имеют аффинность примерно в 5 раз ниже, чем МКА Е6В, в то время как димерные одноцепочечные антитела уступают в аффинности исходным МКА примерно в 2 раза. Таким образом, иммунохимические характеристики полученных рекомбинантных антител свидетельствуют о том, что они близки по своим иммунохимическим свойствам исходным МКА. Несомненным их достоинством является простота наработки и очистки, а также б возможность использования их в дальнейшем в качестве модели для исследования тонких белок-белковых взаимодействий.

Сконструированные в результате работы векторные плазмиды, обеспечивающие эффективную продукцию рекомбинантных антител, могут быть использованы для получения и селекции рекомбинантных антител различной специфичности.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. РЕКОМБИНАНТНЫЕ АНТИТЕЛА.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Николенко, Галина Николаевна

выводы

1. Впервые клонированы и секвенированы фрагменты кДНК, кодирующие вариабельные домены тяжелой (Vh) и легкой (Vk) цепей мышиного моноклонального антитела Е6В против поверхностного гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита. Сравнительный анализ первичной структуры клонированных генов позволил выделить в них каркасные и гипервариабельные районы, определить групповую принадлежность V-сегментов генов вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина.

2. На основе клонированных Vh и Vk генов МКА Е6В с использованием олигонуклеотидного коннектора, кодирующего линкерный пептид состава (Gly4Ser)3 и фрагмента ДНК, кодирующего лидерный пептид пектатлиазы В Erwinia carotovora сконструирован ген, обеспечивающий экспрессию мономерных одноцепочечных антител.

3. Впервые предложено введение в С-конец молекулы одноцепочечных антител двух остатков цистеина в составе линейного эпитопа поверхностного антигена вируса гепатита В. Показано, что это обеспечило как формирование димерной формы рекомбинантных антител, так и возможность детекции продуктов экспрессии целевых генов одноцепочечных антител при помощи специфических МКА к HBs-эпитопу.

4. Получены штаммы E.coli, продуцирующие мономерную и димерную формы одноцепочечных антител с уровенем продукции около 30% суммарного клеточного белка. Показано, что осуществляется процессинг как мономерных, так и димерных одноцепочечных антител, рекомбинантные антитела продуцируются в основном в растворимой форме, понижение температуры культивирования приводит к выходу целевых белков в культуральную жидкость.

5. Показано эффективное связывание рекомбинантных антител с антиидиотипическими антителами к исходным МКА Е6В против вируса КЭ, что подтверждает сохранение у рекомбинантных антител идиотипа МКА Е6В.

6. Показана специфичность взаимодействия полученных рекомбинантных антител с вирусом КЭ и рекомбинантным белком Е вируса КЭ в иммуноблоттинге и иммуноферментном анализе. Подтверждена идентичность эпитопа белка Е, распознаваемого рекомбинантными антителами и МКА Е6В методом конкурентного анализа.

7. Определены константы диссоциации комплекса антиген-антитело для мономерных, димерных одноцепочечных антител и МКА Е6В с использованием рекомбинантного белка Е вируса КЭ. Показано, что мономерные одноцепочечные антитела имеют аффинность примерно в 5 раз ниже, чем МКА Е6В, в то время как димерные одноцепочечные антитела уступают в аффинности исходным МКА примерно в 2 раза.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор считает приятным долгом поблагодарить своих научных руководителей Тикунову Нину Викторовну и Ильичева Александра Алексеевича за организацию работы и помощь в оформлении диссертации. Автор выражает глубокую признательность Протопоповой Елене Викторовне, Котёлкину Александру Тимофеевичу, Локтеву Валерию Борисовичу за обучение, консультации и техническую поддержку работы. Также автор благодарит Головина Сергея Яковлевича за помощь в работе, Орешкову Светлану Федоровну за финансовую поддержку, Кононову Галину Львовну за информационную поддержку, Деева Сергея Михайловича и Карпенко Ларису Ивановну за предоставленные для работы плазмиды, Порываеву Веру Александровну за моноклональные антитела, Коновалову Светлану Николаевну, Нетесову Нину Александровну, Рыжикова Александра Борисовича и Матвееву Веру Александровну за предоставленный антиген. Искреннюю благодарность автор выражает Матяш Ирине Викторовне, чье трудолюбие и аккуратность способствовали выполнению работы, а также сотрудникам НИИ биоинженерии за советы и научные дискуссии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проделанной работы из клеток мышиной гибридомы Е6В были изолированы, клонированы и секвенированы гены вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей МКА Е6В. Был проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей клонированных генов с имеющимися в банке данных, позволивщий определить каркасные и гипервариабельные районы вариабельных доменов и выявить принадлежность V-сегмента тяжелой цепи к семейству VH7183 III группы У-сегментов тяжелых цепей, а V-сегмента легкой цепи к III группе V-сегментов генов к цепей.

На основе клонированных Vh и Vk генов МКА Е6В был сконструирован ген одноцепочечного антитела с использованием олигонуклеотидного коннектора, кодирующего линкерный пептид состава (Gly4Ser)3 и фрагмента ДНК, кодирующего лидерный пептид пектатлиазы В Erwinia carotovora. Полученный ген был встроен в плазмидный вектор под транскрипционный контроль позднего промотора фЮ батериофага Т7. Клетки E.coli, трансформированные полученной плазмидой, были способны продуцировать мономерную форму одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита, уровень продукции был достаточно высок и составлял около 30% суммарного клеточного белка.

Исследование особенности экспрессии гена одноцепочечных антител показало, что в клетках Е. coli происходит процессинг целевого белка, приводящий к отщеплению лидерного пептида; одноцепочечные антитела продуцируются в растворимой форме; при снижении температуры культивирования наблюдается выход целевого белка в культуральную жидкость.

Высокий уровень экспрессии гена одноцепочечных антител в клетках E.coli позволил провести предварительную оценку иммунохимических свойств одноцепочечных антител в составе клеточных лизатов E.coli. Было показано, что одноцепочечные антитела эффективно взаимодействуют с поликлональными АИА, которые распознают идиотип МКА Е6В, и с рекомбинантным белком Е вируса КЭ. Таким образом, было подтверждено формирование одноцепочечными антителами идиотипа исходных МКА и способность одноцепочечных антител взаимодействовать с доменом Е2 гликопротеина Е вируса КЭ. Результаты этого этапа показали перспективность дальнейшей работы по созданию димерной формы одноцепочечных антител, которые по литературным данным имеют большее сродство к антигену, чем мономерные.

Для получения димерных антител в З'-конец сконструированного нами ранее гена одноцепочечного антитела был встроен фрагмент ДНК, кодирующий линейный эпитоп поверхностного антигена вируса гепатита В. Этот эпитоп содержит два остатка цистеина, которые при смыкании S-S мостиков между двумя молекулами мономерных антител могут обеспечить формирование димерной формы рекомбинантных антител. Следует отметить, что введение гибкого спейсера, содержащего остатки пролина, аланина, серина между рекомбинантным антителом и HBs-эпитопом позволило использовать этот эпитоп и в качестве маркера для детекции рекомбинантных антител при помощи специфических анти-HBs антител. Вышеописанная генетическая конструкция была использована для трансформации клеток E.coli и исследования особенностей продукции димерных одноцепочечных антител. Было показано, что одноцепочечные антитела действительно формируют димерные молекулы. Кроме того, все основные особенности продукции димерных рекомбинантных антител были аналогичны таковым мономерной формы рекомбинантных антител.

Для дальнейшего исследования иммунохимических свойств рекомбинантных антител было необходимо получение их очищенного препарата. Для эффективной очистки рекомбинантных антител с помощью хелатной хроматографии на никелевом сорбенте были созданы генетические конструкции, в которых в 3'-конец гена одноцепочечных антител был встроен олигонуклеотидный коннектор, кодирующий 6 аминокислотных остатков гистидина. Это позволило осуществить эффективную очистку мономерных и димерных рекомбинантных антител на никелевом сорбенте и получить их в количествах, необходимых для исследования их иммунохимических свойств.

Специфичность и эффективное связывание одноцепочечных антител как с вирусом клещевого энцефалита, так и с рекомбинантным белком Е вируса КЭ были показаны в иммуноблоттинге и в иммуноферментном анализе. Кроме того, была показана конкуренция рекомбинантных антител и исходных МКА Е6В за связывание с рекомбинантным белком Е вируса КЭ и с вирусом КЭ. Это указывает на идентичность эпитопа белка Е, распознаваемого МКА Е6В и сконструированными нами рекомбинантными антителами.

Особый интерес представляет определение аффинности мономерных и димерных рекомбинантных антител в сравнении с исходными МКА. Для определения констант диссоциации комплекса антиген-антитело был использован метод конкурентного ИФА. В качестве антигена использовался рекомбинантный белок Е вируса КЭ. По экспериментальным данным с помощью программы программы МюгоМаЙ18с1епйз1;, версия 3.2, в соответствии с уравнением, описывающим процесс установления динамического равновесия комплекса антиген-антитело, были рассчитаны значения констант диссоциации. Результаты показали, что рекомбинантные мономерные антитела имеют аффинность примерно в 5 раз ниже, чем исходные МКА Е6В, в то время как димерные антитела уступают в аффинности исходным МКА примерно в 2 раза. Таким образом, иммунохимические характеристики полученных рекомбинантных антител свидетельствуют о том, что они близки по своим иммунохимическим свойствам исходным МКА. Несомненным их достоинством является простота наработки и очистки, а также возможность использования их в дальнейшем в качестве модели для исследования тонких белок-белковых взаимодействий.

Кроме того, сконструированная в результате проделанной работы векторная плазмида рТБШШб, обеспечивающая эффективную экспрессию димерных антител, может быть использована в дальнейших экспериментах по получению и селекции рекомбинантных антител.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Николенко, Галина Николаевна, 1999 год

1. Amit A.G., Mariuzza R.A., Phillips S.E., Poljak R.J. Three-dimensional structure of an antigen-antibody complex at 2.8 A resolution.// Science. 1996. v. 233. p.747-753.

2. Colman P.M., barer W.G., Varghese J.N., Baker A.T., Tulboch P.A., Air C.M., Webster R.G. Three-dimensional structure of a complex of antibody with influenza virus neuraminidase.// Nature. 1987.v. 326. p.358-363.

3. Padlan E.A., Silveston E.W., Sheriff S., Cohen G.H., Smith-GillS.J., Davies D.R. Structure of antibody- antigen complex: crystal structure of the My HEL-10 Fab- lisozime complex. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989.V. 86.p. 5938-5942.

4. Jones P.T., Dear P.H., Foote J., Neuberger M.S., Winter G. Replasing the complementary-determing region in a human antibody with those from a mouse. //Nature. 1986. v. 321. p. 522-525.

5. Goding J.W. Monoclonal antibodies:principles and practice:production and application of monoclonal antibodies in cell biology, biochemistry and immunology. Acad. Press. NY. 1986.2nd ed. 315 p.

6. Ройт А. Основы иммунологии. М."Мир". 1991. 327 с.

7. Manser Т., WysockyL.J., Margolies M.N., Gerter M.L. Evolution of antibody variable region structure during the immune response. // Imm. Reviews. 1997.V.96. p.141-162.

8. Honjo Т., Nakai S., Nishida Y., Kataoka Т., Yamavaki-Kataoka Y.,Takahashi N., Obata M.,Shimizu A., Yaoita Y.,Nikaido Т., Ishida N. Rearrangment of immunoglobulin genes during differentiation and evolution.// Imm. Reviews. 1981. v. 59. p. 33-67.

9. GoyenechaB., MilsteinC. Modifying the sequence of an immunoglobulin V-gene alters resulting pattern of hypermutation.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996.V. 93. p.13979-13984.

10. Hsu E. Canonical VH CDR1 nucleotide sequences are conserved in all jawed vertebrates. //Int. Immunol. 1996. v.8.p. 847-854.

11. Liu A.Y., Robinson R.R., Murray E.D., Chang J.C.P., Hellstrom I. Chimeric mouse-human IgGl antibody that can mediate lysis of cancer cells.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA.1987.V. 84. p. 3439-3443.

12. Wilson A.I., Rini J.M., Fremont D.H., Fieser G.G., Stura E.A. X-ray crystallographic analysis of free and antigen-complexed Fab fragments to investigate structural basis of immune recognition.// Meth. in Enzymol.l991.v.203. p.153-176.

13. Reichmann L., Clark M., Waldman H., Winter G. Reshaping human antibody for therapy.//Nature. 1988. v.332. p. 323-327.

14. Queen C., Schneider W.P., Selick H.E., Landolfi N.F., Duncan J.F., Avdalovic N.M., Levitt M., Junghans R.F., Waldmann T.A. A humaniezed antibody that binds to the interleukin 2 receptor. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 10029-33.

15. Co M.S., Deschavps M., Whilley R.J., Queen C. Humanized antibodies for antiviral therapy. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 2869-73.

16. GlockshuberR., MaliaM., Pfitzinger I., PluckthunA. A comparison of strategies to stabilize immunoglobulin Fv- fragment.// Biochemistry. 199l.v. 29. p. 1362

17. Huston J.S., Mudgett- Hunter M., NaiM.S., McCartney J., Warren F., HaberE., Opperman H. Protein engineering of single- chain Fv analogs and fusion proneins.//Meth. Enzymology. 1990. v. 203. p.46-89.

18. BirdR.E.,Hardman K.D., Jacobson J.W., Jonson S., Kaufman B.M.,Lee S.-M., Lee T., Pope S.H.,Riovdan G.S., WhitlowM., Single- chain antigen-binding protein.// Science. 1988. v. 242. p. 423-426.

19. Batra J.K., FitzGerald D.F., Gately M., Chaudhary V.K., Pastan I. Anti-Tac(Fv)-PE40, a single chain antibody Pseudomonas fusion protein directed at interleukin 2 receptor bearing cells. // J. Biol. Chem. 1990. V.265. p. 15198-202.

20. Alfthan K., Takkinen K., Sizmann D., Soderlund H., Terri T.T. Properties of a single-chain antibody containing different linker peptides.// Protein Engineering 1995. v.8 p.725-731.

21. Solar I., Gershoni J.M. Linker modification introduces useful molecular instability in a single chain antibody// Protein Engineering .1995. v. 8. p. 717-723.

22. Tang Y., Jiang N., Parakh C., Hilvert D. Selection of linkers for a catalytic single-chain antibody using phage display technology//J. Biol. Chem. 1996. v. 271. p. 15682-15686.

23. Kipriyanov S.M., Dubel S., BreitlingF., KontermannR.E., Little M. Recombinant single-chain Fv fragments carrying C-terminal cysteine residues: production of bivalent and bioninylated miniantibodies.// Mol. Immunol. 1994.V. 31.p.l047-1058.

24. Dekruif J.M, Logtenberg T. Leucine zipper dimerized bivalent and bispecific scFv antibodies from semi-synthetic antibody phage display library.//J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 7630-7635.

25. Kipriyanov S.M., Breitling F.,Little M.,Dubel S. Single-chain antibody strepnavidin fusion: tetrameric bifunctional scFv-complexes with biotin binding activity and enchanced affinity to antigen.// Hum. Antibod. Hybridomas ,1995.v.6.p93-101.

26. Chaudhary V.K., Queen C., Junghans R.P., Waldmann T.A., FitzGerald D.J., Pastan I. A recombinant immunotoxin consisting of two antibody variable domains fused to Pseudomonas exotoxin. // Nature. 1989.V. 339. p. 394-397.

27. Chaudhary V.K., BatraJ.K., GalloM.G., Willingham M.C., Fitz Gerald D.J., Pastanl. A Rapid method of cloning funcnional variable-regionantibody genes in E.coli as single-chain immunotoxins. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1990.v.87.p. 1066-1070.

28. Chaudhary V.K., Gallo M.G., FitzGerald D.J., Pastan I. A recombinant single-chain immunotoxin composed of anti-Tac variable regions and a truncated diphtheria toxin. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1990 .v. 87.p. 9491-9494.

29. Brinkmann U., Pai L.H., FitzGerald D.J., Willingham M., Pastan I. B3(Fv)-PE38KDEL, a single-chain immunotoxin that causes complete regression of a human carcinoma in mice. //ProcNatlAcadSc USA. 1991. v. 88. p. 8616-8620.

30. Kohl J., Ruker F., Himmler G., Razazzi E., Katinger H. Cloning and expression of an HTV-1 specific single-chain Fv region fused to Escherichia coli alkaline phosphatase. //Ann. NY. Acad. Sei. 1991. v. 646. p. 106-114.

31. Ward E.S., Gussow D.H., Griffits A.D., Jones P.T., Winter G. Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli.//Nature. 1989. V. 341. P. 544-546.

32. Jang Y.J., Lecerf J.M., Stollar B.D. Heavy chain dominance in the binding of DNA by a lupus mouse monoclonal autoantibody // Mol. Immunol. 1996 .v. 33. p. 197-210.

33. Williams W.V.,Hoss D.a., Kieber-Emmons Т., Cohen J.A., Myers J.N., Weiner D.B., Greene M.I. Development of biologically active peptides based on antibody structure.// Proc. Natl. Acad. Sei. USA.1989. v.86. p. 5537-5541.

34. Kabat E.A., Wu T.T., Perry H.M., Gottesmann K.S., Foeller C., Washington D.C. Sequences of proteins of immunological interest.// VS Department of health and human services, Washington, 5th Ed. 1991.

35. Skerra A, Pluckthun A. Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli.// Science. 1988. V. 240. P. 1038-1041

36. Better M., Chang C.P., Robinson R.R., Horwitz A.H. Escherichia coli secretion af an active chimeric antibody fragment.// Science. 1988.V. 240. p.1041-1043.

37. Francisco J.A., Campbell R., Iverson B.L., Georgiou G. Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing afunctional antibody fragment on the external surface.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 10444-10448.

38. Jiang W., Bonnert T.P., Venugopal K., Gould E.A. A single chain antibody fragment expressed in bacteria neutralizes tick-borne flaviviruses. // Virology. 1994. V. 200. P. 21-28.

39. Gotter S., Haas C., Kipriyanov S.M., Dubel S., Breitling F., Khazaie K., Schirmachen V., Little M. A single-chain antibody for tumor cells infected with Newcastle disease virus. // Tumor Targeting. 1995. V. 1. P. 107-114.

40. Glockshuber R., Nalia M., Pfitzinger I., Pluckthun A. A comparison of strategies to Stabilize immunoglobulin Fv-fragment.// Biochemistry. 1990. V. 29. P. 1362-1365.

41. Whitlou M., Filpula D. Single-chain Fv proteins and their fusion proteins.// Methods Companion Methods Enzymol. 1991. V. 2. P. 97-103.

42. Kipriyanov S.M., Dubel S., Breitling F., Kontermann R.E., Heymann S., Little M. Bacterial expression and refolding of single-chain Fv fragments with C-terminal cysteines.// Cell Biophisics. 1995. V. 26. P. 187-204.

43. Knappik A., Krebber C., Pluckthun A. The effect of folding catalysts on the in vivo folding process of different antibody fragment expressed in Escherichia coli.//Bio/Thecnology. 1993. V. 11. P. 77-82.

44. Bowden G.A., Georgiou G. Folding and aggregation of (3-lactamase in the periplasmic space of Escherichia coli.// J. Biol.Chem.1990. v. 265. P. 1676016765.

45. Huse W. D., Lakshmi S., Iverson S.A., Kang A.S., Alting-Mees M., Burton D.R., Benkovic S.J., Lerner R.A. Generation of a large combinatorial library of the immunoglobulin repertoir in phage lamda.// Science. 1989. V. 246. p. 1275-1281.

46. Caton A.J., Koprowski H. Influenza virus hemagglutinin-specific antibodies isolated from a combinatorial expression library are closely related to the immune response of the donor.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 6450

47. Persson M.A., Caothien R.H., Burton D.R. Generation of diverse high-affinity human monoclonal antibodies by repertoire cloning.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 2432-.

48. McCafferty J.A., Griffits D., WinterG., ChiswellD.J. Phage antibody filamentous phage displaing antibody variable domains.// Nature. 1990. V. 348. P.552.

49. Barbas III C.F., Lerner R.A. Combinatorial immunoglobulin library on the surface of phage (Phabs): rapid selection of an antigen specific Fabs.// A companion to Meth in Enzimology 1991. V.2 p. 119-124.

50. Breitling F., Dubel S., Seehaus T., Klewinghaus I., Little M. A surface expression vector for antibody screening. // Gene. 1991 v. 104.p. 147-53.

51. Waterhouse P., Griffits A.D., Johnson K.S., Winter G. Combinatorial infection and in vivo recombination: a strategy for making large phage antibody repertoires.//Nucl. Acids. Res. 1993. V. 21. P. 2265-2266.

52. Tsurushita N., Fu H., Warren C. Phage display vectors for in vivo recombination of immunoglobulin heavy and light chain genes to make large combinatorial libraries.// Gene. 1996 v. 172 P. 59-63.

53. Hawkins R.E., Russel S.J., Winter G. Selection of phage antibodies by binding affinity. Mimicking affinity maturation.// J. Mol. Biol. 1992. V. 226. P. 889-896.

54. Gram H., Marconi L.A., Barbas III C.F., Collet T.A., Lerner R.A., Kang A.S. In vitro selection and affinity maturation of antibodies from a naive combinatorial library.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 35763580.

55. Low N.M., Holliger P.H., Winter G. Mimicking somatic hupermutation: affinity maturation of antibodies displaed on bacteriophage using a bacterial mutator strain.// J. Mol. Biol. 1996. V. 260. P. 359-368.

56. Yelton D.R., Rosok M.J., Cruz G., Gosand W.L., Bajorath J., Helistrom I., Helistrom K.E., Huse W.D., Glasser S.M. Affinity maturation of the BR96 anti-carcinoma antibody by codon- based mutagenesis.// J. Immunol. 1995. V. 155. P. 1994-2004.

57. Marks J.D., Hoogenboom H.R., Bonnert T.P., McCafferty J., Griffits A.D., Winter G. By-passing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayd on phage.//Mol. Biol. 1991. V. 222. P. 581-597.

58. Better M., Hortwitz A.H. Expression of engineered antibodies and antibody fragments in microorganisms.// Meth. Enzymol. 1989. V. 178. P. 476-496.

59. Horwitz A.H., Chang P., Better M., Hellstrom K.E., Robinson R.R. Secretion of functional antibody and Fab fragment from yeast cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 8678-82.

60. Ridder R., Schmitz R., Legay F., Gram H. Generation of rabbit monoclonal antibody fragments from a combinatorial phage display library and their production in the yeast Pichia pastoris.// Biotechnology. 1995. V. 13. P.255-260.

61. Hasemann C.A., Capra J.D. High-level production of a functional immunoglobulin heterodimer in a baculovirus expression system. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 3942-6.

62. Hiatt A. Cafferkey R., Bowdish K. Production of antibodies in transgenic plants. //Nature. 1989. V. 342. P. 76-78.

63. Bruyns A.M., DeJaeger G., DeNeve M., DeWilde C., VanMontagu M., Depicker A. Bacterial and plant-produced scFv proteins have similar antigen-binding properties.//FEB S Lett. 1006. V. 386. P. 5-10.

64. Ridder R., Geisse S., Kleuser B., Kanallek P., Gram H. A COS: cell-based system for rapid production and quantification of scFv::IgGk antibody fragments.// Gene 1995. V.166. p.273-276.

65. DeSutter K., Feys V., Vande Voorde A., Fiers W. Production of functionally active murine and murine::human dimeric F(ab')2 fragments in COS-1 cells.//Gene. 1992. V. 113. P. 223-230.

66. Carter P., Presta L., gorman C.M., Ridway J.B.B., Henner D., Wong W.C.T., Rowland A.M., Koch C., Carver M., Shepard H.M. Humanizationof an anti-pl 85HER2 antibody for human cancer therapy. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 4285-9.

67. Deyev S.M., Lieber A., Radko B.V., Polanovsky O.L. Expression of immunoglobulin genes tandem in eucariotic cells under control of T7 bacteriophage RNA polymerase.// Appl.Biochem and Biothechnol. 1994. Y. 47. P. 143-155.

68. Mulligan R.C., Berg P.J. Expression of a bacterial gene in mammalian cells. // Science 1980. V. 209. P. 1422-1427.

69. Weissenhorn W., Weiss E., Schwirzke M., Kahnze В., Weidle U.H. Chimerization of antibodies by isolation of rearranged genomic variable regions by the polymerase chain reaction. // Gene 1991. V. 106. P. 273-7.

70. Кирней Д.Ф. (Kearney J.F.) Гибридомы и моноклональные антитела, в кн. Иммунология под ред. У. М. Пола "Мир". 1989.

71. Froesch B.A., Stahel R.A., Zangemeister Wittke U. Preparation and functional evaluation of new doxorubicin immunoconjugates containing an acid-sensitive linker on small-cell lung cancer cells. // Cancer Immunol. Immunother. 1996 v. 42. p. 55-63.

72. Battelli M.G., Polito L., Bolognesi A., Lafleur L., Fradet Y., Stupe F. Toxicity of ribosome-inactivating proteins-containing immunotoxins to a human bladder carcinoma cell line. // Int. J. Cancer. 1996. V. 65(4) p. 48590.

73. Bolognesi A., Tazzari P.L., Olivieri F., Polito L., Falini B., Stirpe F. Induction of apoptosis by ribosome-inactivating proteins and related immunotoxins.// IntJ.Cancer. 1996 v. 68. P. 349-55.

74. French R.R., Bell A.J., Hamblin T.J., Tutt A.L., Glennie M.J. Response of B-cell lymphoma to a combination of bispecific antibodies and saporin. // Leuk. Res. 1996 v. 20.p. 607-17.

75. Becker J.C., Pancook J.D., Gillies S.D., Mendelsohn J., Reisfeld R.A. Eradication of human hepatic and pulmonary melanoma metastases in SCID mice by antibody-interleukin 2 fusion proteins.// Proc-Natl-Acad-Sci-U-S-A. 1996 v. 93. P. 2702-7.

76. Ghetie M.A., Podar E.M., Gordon B.E., Pantazis P., Uhr J.W., Vitetta

77. E.S. Combination immunotoxin treatment and chemotherapy in SCID mice with advanced, disseminated Daudi lymphoma. // Int J. Cancer. 1996 v. 68.p. 93-96.

78. Do well R.I., Springer C.J., Davies D.H., Hadley E.M., Burke P.J., Boyle

79. F.T., Melton R.G., Connors T.A., Blakey D.C., Mauger A.B. New mustard prodrugs for antibody-directed enzyme prodrug therapy: alternatives to the amide link.// J. Med. Chem. 1996 v. 39(5). P. 1100-5.

80. Wentworth P., Datta A., Blakey D., Boyle T., Partridge L.J., Blackburn

81. G.M. Toward antibody-directed "abzyme" prodrug therapy, ADAPT: carbamate prodrug activation by a catalytic antibody and its in vitro application to human tumor cell killing.: // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996 v. 93. P. 799-803.

82. Isaacs J.D., Hazleman B.L., Chakravarty K., Grant J.W., Hale G., Waldmann H. Monoclonal antibody therapy of diffuse cutaneous scleroderma with CAMPATH-IH. // J. Rheumatol. 1996 v. 23. P. 11031106.

83. Moreau T., Coles A., Wing M., Isaacs J., Hale G., Waldmann H., Compston A. Transient increase in symptoms associated with cytokine release in patients with multiple sclerosis. // Brain. 1996. v. 119 p. 225-237.

84. Barnett B.B., Smee D.F., Malek S.M., Sidwell R.W. Selective cytotoxicity of ricin A chain immunotoxins towards murine cytomegalovirus-infected cells. // Antimicrob. Agents Chemother. 1996. V. 40. 470-2.

85. Froehler B.C., Ny P.G. and Mattencci M.D. Synthesis of DNA via deoxynucleoside H-phosphonate intermediates. // Nucl. Acids. Res. 1986. v.14. p.5399-5407.

86. Bolivar F., Rodrigues R.L., Green P.J., Betlach M.C. Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system. //Gene. 1977. V.2.P.95.

87. Тикунова Н.В., Головин С.Я., Микрюков Н.Н., Хрипин Ю.Л., Черненко В.Ю., Иванов В.Г., Ильичев А.А., Петренко В.А. Синтез, клонирование и определение первичной структуры кДНК 1-антитрипсина человека. //Биоорг.химия. 1991. Т.17 С.1694-1697.

88. Petrov N.A., Karginov V.A., Mikriukov N.N., Serpinski O.I., Kravchenko V.V. Complete nucleotide sequence of the bacteriophage X DNA region containing gene Q and promotor PR> // FEBS Lett. 1981. V.133. N. 2 p.316-320.

89. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование. -М., 1984.

90. Maxam A.M. and Gilbert W. Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages.// Methods Enzymol.1980. v.65. p.499-527.

91. Laemmly U.K. Cleavage of structural proteins during the assemly of the head of bacteriophage T4.// Nature. 1970.V.227. N 5259. P.680-685.

92. Vesterberg O. Staining of protein zones after isoelectric focusing in polyacrilamid gels.//Biochim. Biophys. Acta. 1971. v. 243. P.345-348.

93. Марстон Ф.А.О. (Marston F.A.O.). Выделение эукариотических пептидов, продуцируемых в клетках E.coli. В кн. Новое в клонировании ДНК. Методы. Под ред. Д.Гловера. М. «Мир». 1989. 367с.

94. Towbin Н., Gordon J. Immunoblotting and dot immunobinding current status and outlook. //J. Immunol. Meth. 1984. Vol. 72. P.313-340.

95. Friguet В., Chaffote A.F., Djavadi-Ohaniance L., Goldberg M.F. Measurement of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzime-linked immunosorbent assay.// J. Immunol. Methods. 1985 v.77. p. 305-319.

96. Протопопова E. В., Хусаинова А. Д., Коновалова С. Н., Локтев В. Б. Получение и изучение свойств антиидиотипических антител, несущих на своей поверхности гемагглютинирующие паратопы вируса клещевого энцефалита // Вопр. вирусол. 1996. № 2. С. 50-53.

97. Tsehanovskaya N., Matveev L., Rubin S. et al. Epitope analysis of tickborne encephalitis (TBE) complex viruses using monoclonal antibodies to envelope glycoprotein of TBE virus (persulcatus subtype) // Virus Res. 1993. Vol. 30. P. 290-295.

98. Протопопова E. В., Коновалова С. H., Локтев В. Б. Выделение клеточного рецептора для вируса клещевого энцефалита при помощи антиидиотипических антител. // Вопр. вирусол. 1997. N 6. С. 264-268.

99. Barbas C.F., Burton D.R. Cold Spring Harbor laboratory courses on Monoclonal antibodies from combinatorial libraries. 1994. 54 p.

100. Tutter A., Riblet R. Conservation of immunoglodulin variable-region gene family indicates a specific, noncoding function.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 7460-7464.

101. Bernard O., Gough N. Nucleotide sequence of immunoglobulin heavy chain joining segments between translocated VH and ц constant region genes.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. USA. 1980. v.77. p.3630-3634.

102. Weigert M., Gatmaitan L., Loh E., Schilling J., Hood L.E. Rearrangement of genetic information may produce immunoglobulin diversity. //Nature. 1978. v. 276. p. 785-790.

103. Golomb H., Chamberlin M. Characterisation of T7-specific ribonucleic acid polymerase.// J.Biol.Chem. 1974. V. 249. P. 2858-2863.