Разработка подходов для переноса и реализации чужеродной генетической информации тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, доктор биологических наук Цымбаленко, Надежда Васильевна

• Цымбаленко, Надежда Васильевна
• доктор биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации доктор биологических наук Цымбаленко, Надежда Васильевна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 16 1.1. МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ ДНК ЖИВОТНЫХ КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ ОБЪЕКТ ДЛЯ СОЗДАНИЯ

ЧЕЛНОЧНЫХ ВЕКТОРОВ

1.1.1. СТРУКТУРА И ФУНКЦИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА

1.1.1.1. Организация мтДНК 16 % 1.1.1.2. Число молекул мтДНК в клетках животных. Феномен гетероплазмии

1.1.1.3. Наследование мтДНК

1.1.1.4. Организация мтДНК в клетке

1.1.1.5. Тонкая структура мтДНК

1.1.1.5.1. Структура Н-цепи мтДНК

1.1.1.5.2. Структура L-цепи мтДНК

1.1.1.5.3. Митохондриальный генетический код

1.1.1.6. Видовые особенности организации митохондриальных геномов

1.1.1.7. Репликация мтДНК животных

1.1.1.7.1. Инициация репликации Н-цепи мтДНК 2 8 1.1.1.7.1.1. Ферменты, принимающие участие в инициации

• репликации мтДНК

1.1.1.7.2. Инициация синтеза L-цепи мтДНК

1.1.1.7.3. Trans-активирующие факторы, принимающие участие в росте и созревании вновь синтезированных цепей ДНК

1.1.2. ЭКСПРЕССИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА 34 1.1.2.1. Транскрипция мтДНК

1.1.2.1.1. Ферменты и некоторые факторы, обеспечивающие транскрипцию мтДНК

1.1.2.1.2. Инициация транскрипции мтДНК

1.1.2.1.3. Процессинг первичного транскрипта мтДНК

1.1.2.1.4. Дифференциальная экспрессия митохондриальных генов

1.1.2.2. Биосинтез белков в митохондриях

1.1.2.2.1. Особенности трансляции в митохондриях

1.1.2.2.2. Митохондриальные факторы трансляции

1.1.2.3. Митохондриальные болезни 44 1.1.2.3.1. Создание моделей для изучения некоторых митохондриальных патологий 46 1. 2. СИСТЕМЫ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ ПЕРЕНОС И РЕАЛИЗАЦИЮ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ В

КЛЕТКАХ ЖИВОТНЫХ

1.2.1. ЧЕЛНОЧНЫЕ ВЕКТОРЫ

1.2.1.1. Векторы для межродового переноса ДНК у бактерий

1.2.1.2. Векторы для клонирования ДНК в системе бактерии-дрожжи

1.2.1.2.1. Векторы типа Yip

1.2.1.2.2. Векторы типа Yep

1.2.1.2.3. Векторы типа Yrp

1.2.1.2.4. Векторы типа Yep

1.2.1.2.5. Векторы типа YAC

1.2.1.3. Челночные векторы для системы клетки Е. coli - клетки животных

1.2.1.3.1. Репликон вируса SV

1.2.1.3.2. Репликон вируса папилломы быка (BPV)

1.2.1.3.3. Репликон вируса Эпштейна-Барр (EBV)

1.2.1.3.4. Векторы на основе ретровирусов

1.2.1.3.5. Аденовирусные векторы

1.2.2. ТРАНСФОРМАЦИЯ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК И СИСТЕМЫ ДОСТАВКИ ГЕНОВ

1.2.2.1. Основные методы трансформации животных клеток

1.2.2.1.1. Кальций фосфатный метод

1.2.2.1.2. Электропорация

1.2.2.1.3. Баллистическая трансфекция

1.2.2.1.4. Трансфекция с помощью вирусных векторов

1.2.2.1.5. Искусственные макромолекулярные системы трансфекции

1.2.2.2. Системы доставки чужеродной ДНК, используемые в генной терапии

1.2.2.3. Введение генов в половые клетки. Получение трансгенных животных

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ

ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ ДНК - ВОЗМОЖНЫЙ

ВЕКТОР ДЛЯ ПЕРЕНОСА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ

2.1.1. Материалы и методы

2.1.1.1. Материалы

2.1.1.2. Методы

2.1.1.2.1. Выделение митохондриальной ДНК из печени крысы

2.1.1.2.2. Мечение фрагментов ДНК изотопом

2.1.1.2.3. Трансформация клеток Sacharomyces cerevisiae 74 II. 1.2. Исследование активности митохондриального репликона в бактериальной системе при наличии плазмидного репликона

2.1.2.1. Конструирование рекомбинантных плазмид, содержащих фрагмент мтДНК крысы и ДНК плазмиды pBR

2.1.2.2. Трансформация клеток Е. coli polAl и ро1А6 ДНК pBR-MtB-A

2.1.2.3. Трансформация клеток Е. coli ро1А12 (ts-мутанты KS55)

ДНК pBR-MtB-A

2.1.2.4. Исследование сохранения вставки мтДНК крысы в клетках Е. coli штаммов polA, трансформированных

ДНК pBR-MtB-A

2.1.2. Изучение функционирования рекомбинантных плазмид на основе мтДНК в бактериальных клетках при отсутствии плазмидного репликона

2.1.3.1. Конструирование рекомбинантной ДНК рмтКС, содержащей фрагмент мтДНК крысы и бактериальный ген устойчивости к канамицину

2.1.3.2. Анализ структуры рекомбинантной плазмиды pmtKC

2.1.4. Перенос бактериальных генов устойчивости к антибиотикам рекомбинантными плазмидами на основе мтДНК крысы

2.1.5. Изучение экспрессии некоторых продуктов мтДНК при клонировании фрагментов мтДНК в клетках бактерий

2.1.5.1. Синтез полипептидных цепей цитохромоксидазы крысы в клетках Escherichia coli

2.1.5.2. Экспрессия гена апоцитохрома b крысы в клетках Escherichia coli ш 2.1.6. Создание векторов для низших эукариотов (дрожжей) на основе фрагментов мт ДНК крысы

2.1.6.1. Конструирование ДНК pYMt 1, содержащей фрагмент мтДНК крысы и дрожжевой ген 1еи

2.1.6.2. Функционирование ДНК pYMtl в дрожжевых клетках

2.1.6.3. Стабильность ДНК pYMt 1 в клетках дрожжей 114 2.2. ПЕРЕНОС ЧУЖЕРОДНОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ

ИНФОРМАЦИИ В КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

2.2.1. Перенос чужеродной ДНК в соматические клетки ивотных

2.2.1.1 Материалы и методы

2.2.1.1.1. Материалы

2.2.1.1.2. Методы 124 # 2.2.1.1.2.1. Трансформация ККМ методом кальций фосфатной преципитации и культивирование трансформированных клеток

2.2.1.1.2.2. Выявление ККМ, трансфецированных плазмидной ДНК

2.2.1.1.2.3. Обнаружение Т-антигена вируса SV40 в трансфецированных ККМ

2.2.1.1.2.4. Определение активности тимидинкиназы вируса герпеса в трансформированных ККМ

2.2.1.1.2.5. Определение тимидина в биологической пробе

2.2.1.1.2.6. Выявление клеточной и вирусной тимидинкиазы в клетках селезенки трансгенных мышей

2.2.1.2. Трансформация клеток костного мозга грызунов рекомбинантной плазмидой pBRSV

2.2.1.2.1. Эффективность трансформации ККМ плазмидной ДНК и стабильность трансформированных клеток

2.2.1.2.2. Исследование функциональной активности плазмидной

ДНК в трансформированных клетках

2.2.1.3. Доминантная селекция тимидином трансформированных клеток костного мозга животных

2.2.1.3.1. Выявление in vitro ККМ, содержащих ген тимидинкиназы вируса герпеса, при доминантной селекции тимидином

2.2.1.3.2. Выявление in vivo ККМ, содержащих ген тимидинкиназы вируса герпеса, при доминантной селекции тимидином

2.2.2. Перенос чужеродной генетической информации в половые клетки животных

2.2.2.1. Материалы и методы

2.2.2.1.1. Материалы

2.2.2.1.2. Методы

2.2.2.1.2.1. Трансфекция плазмидной ДНК в клетки спермиев

2.2.2.1.2.2. Получение меченых радиоизотопами ДНК плазмид

2.2.2.1.2.3. Получение трансгенных животных

2.2.2.1.2.4. Анализ сыворотки крови трансгенных крыс

2.2.2.1. Исследование возможности введения чужеродной

ДНК в половые клетки самцов мышей

2.2.2.1.1. Получение сперматозоидов и введение в них чужеродной ДНК

2.2.2.1.2. Введение в сперматозоиды плазмидной ДНК, адсорбированной на Са-Р - кристаллах.

2.2.2.1.3. Обсуждение полученных данных в свете возможности использования спермиев для целевой доставки чужеродных генов

2.2.2.2. Перенос генетической информации в яйцеклетку животных. Экспрессия гена а-1-антитрипсина (ААТ) человека у трансгенных крыс

2.2.2.2.1. Создание рекомбинантных ДНК, содержащих последовательности полноразмерной ААТ-кДНК человека

2.2.2.2.2. Экспрессия а-1-антитрипсина человека у трансгенных

2.2.2.2.3. Анализ потомства на содержание последовательностей кДНК ААТ человека

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка подходов для переноса и реализации чужеродной генетической информации»

Актуальность проблемы. В настоящее время трансгеноз (перенос и реализация генетической информации) превращается в стратегическое направление исследований, дающее ответы на множество фундаментальных вопросов. Трансгеноз представляет универсальный методический подход к исследованиям отдельных этапов сложных многостадийных процессов и их взаимосвязи. В настоящее время разрабатываются и совершенствуются методы, накапливается и систематизируется информация о работе основных молекулярно-генетических систем в организме (системы репликации, транскрипции и трансляции). Данные по изучению функционирования репликонов, промоторов, энхансеров, механизмов действия транскрипционных факторов, а также многих других механизмов реализации генетической информации создают фундамент разработки новых подходов для решения проблем биологии и медицины. Трансгеноз применяют в иммунологии, эмбриологии, нейрологии, при изучении механизмов кроветворения, в исследовании факторов, определяющих рост и дифференцировку мультипотентных стволовых клеток, и, наконец, при анализе механизмов канцерогенеза. Помимо решения фундаментальных медико-биологических проблем, с помощью трансгеноза пытаются создавать новые породы животных и растений, которые могут стать дополнителдьным источником получения фармакологических препаратов и пищевых продуктов. Развитие такого нового направления в медицине, как генная терапия, во многом зависит от достижений теоретических и экспериментальных исследований в области трансгеноза. Поэтому каждый научный факт, полученный при проведении исследований по изучению процессов передачи и реализации чужеродной генетической информации, ценен и будет востребован.

На протяжении нескольких последних десятилетий в Лаборатории биохимической генетики, а затем в Отделе молекулярной генетики, Института экспериментальной медицины РАМН проводились систематические исследования молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе ряда наследственных болезней человека (гепатолентикулярная дегенерация или болезнь Вильсона-Коновалова, муковисцидоз, недостаточность а-1-антитрипсина, семейная гиперхолестеринемия и др.). Общее развитие таких исследований потребовало разработки новых и совершенствования уже общепринятых методов для переноса генов и их экспрессии в клетках- или организмах-реципиентах. В связи с этим в конце 70-х годов руководитель лаборатории С.А. Нейфах, чл.-корр. АМН СССР, инициировал разработку новых векторных систем для клонирования и исследования генов животных и человека, а также систем доставки чужеродной генетической информации в соматические и половые клетки животных, обеспечивающих направленное полноценное функционирование переносимых генов. Клонирование генов животных и человека как тогда, так и теперь требует создания полифункциональных, челночных, векторов, способных обеспечивать репликацию рекомбинантных ДНК в организмах, принадлежащих к разным биологическим видам.

Многолетнее, с начала 60-х годов, изучение тонкой структуры митохондриальной ДНК (мтДНК) животных, ее физическое и функциональное картирование привели к идее создать челночные векторы на ее основе. Особенности природы мтДНК, ее структура и механизмы функционирования реально могли обеспечить эффективную амплификацию клонируемых генов в бактериях и, далее, адекватную реализацию встроенной генетической информации в клетках эукариотов. Последнее требовало подбора и разработки различных методов доставки чужеродной ДНК в соматические и половые клетки животных.

Цель работы. Исследование возможности создания челночных векторов на основе мтДНК животных для клонирования генов в клетках прокариотов и эукариотов, а также разработка и совершенствование методов доставки в различные клетки животных чужеродной генетической информации с целью ее полноценной реализации.

Для ее достижения были поставлены задачи исследования:

1. Создать генно-инженерные конструкции, содержащие различные последовательности мтДНК крысы, а также последовательности ДНК бактериальных плазмид и маркерные гены дрожжей, позволяющие проводить исследования их функционирования в системах прокариотов и низших эукариотов.

2. Исследовать способность митохондриального репликона обеспечивать репликацию рекомбинантной ДНК в клетках прокариотов: а) в присутствии плазмидных репликативных элементов в бактериальных клетках, дефектных по

ДНК-полимеразе I; б) при отсутствии в составе ДНК Ori плазмид, в) в клетках низших эукариотов - дрожжах.

3. Проверить возможность использования бактериальных маркеров устойчивости к антибиотикам для селекции клеток прокариотов, содержащих рекомбинантные ДНК с последовательностями мтДНК животных, а также ауксотрофных дрожжевых маркерных генов в случае функционирования исследуемых ДНК в клетках низших эукариотов.

4. Проанализировать структуру и определить локализацию изучаемых рекомбинантных ДНК, содержащих фрагменты мтДНК крысы, при их клонировании в исследуемых клетках бактерий и дрожжей.

5. Исследовать возможность экспрессии некоторых митохондриальных генов, входящих в состав изучаемых рекомбинантных ДНК, в бактериальных клетках.

6. Применить и совершенствовать метод трансформации клеток костного мозга (ККМ) плазмидными ДНК для разработки методов доставки чужеродных генов и изучения их экспрессии в клетках животных in vitro и in vivo.

7. Выяснить возможность введения чужеродной ДНК в половые клетки самцов с целью дальнейшей разработки спермий-опосредованной доставки исследуемых генов в клетки-мишени.

8. Используя метод микроинъекции ДНК в оплодотворенную яйцеклетку, как один из способов доставки чужеродных генов, получить трансгенных животных, в которых происходит экспрессия гена а-1-антитрипсина человека под контролем промоторных элементов гена металлотионеина мыши.

Основные положения, выносимые на защиту. 1. Природа, структурная и функциональная организация митохондриальной ДНК животных дают реальные предпосылки создания на ее основе челночных векторов для переноса чужеродной генетической информации: а) мтДНК крысы имеет ряд участков узнавания для эндонуклеаз рестрикции, что позволяет практически полностью клонировать ее последовательности в составе рекомбинантных плазмид, а, следовательно, позволяет вести направленный подбор необходимых фрагментов ДНК, содержащих определенные функциональные единицы; б) митохондриальный репликон животных способен обеспечивать репликацию рекомбинантных плазмид в бактериальных клетках в условиях, когда плазмидный репликон не функционирует или полностью отсутствует; в) репликативные элементы мтДНК крысы обеспечивают эффективную репликацию рекомбинантных ДНК в клетках низших эукариотов - дрожжах; г) маркерами для селекции клеток, трансформированых рекомбинантными ДНК, которые содержат фрагменты мтДНК животных, могут служить бактериальные гены устойчивости к антибиотикам, дрожжевые маркерные гены, а также продукты митохондиальных генов, входящие в состав используемых последовательностей мтДНК.

2. При трансформации клеток костного мозга методом Са-фосфатной преципитации ДНК отбор клеток-трансформантов можно производить в неселективных условиях, используя ДНК с однозначно детектируемыми маркерами или с применением метода доминантной селекции.

3. Чужеродная ДНК может быть инкорпорирована в половые клетки самцов, что дает возможность рассматривать спермии как средство доставки необходимых чужеродных генов в экспериментах по трансгенозу.

4. Методом инъекции ДНК в оплодотворенную яйцеклетку получены трансгенные животные, у которых в двух поколениях определялось наличие последовательностей кДНК а-1-антитрипсина человека и в первом поколении отмечена экспрессия исследуемого белка.

Научная новизна настоящей работы состоит в следующем:

1. Сконструированы и проанализированы рекомбинантные плазмидные ДНК, содержащие различные фрагменты мтДНК крысы, последовательности бактериальных плазмидных ДНК, а также последовательности дрожжевых маркерных генов.

2. Впервые показано, что митохондриальный репликон обеспечивает репликацию гибридных плазмид, содержащих фрагменты мтДНК крысы: а) в клетках прокариотов в условиях, когда плазмидный репликон не работает или отсутствует; б) в клетках низших эукариотов - дрожжах.

3. Установлено, что для селекции рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты мтДНК животных, обеспечивающие их репликацию, можно использовать: а) бактериальные гены устойчивости к различным антибиотикам; б) дрожжевые маркерные гены; в) гены митохондриальных полипептидов, входящие в клонированные последовательности мтДНК.

4. Обнаружено, что некоторые последовательности мтДНК крысы в процессе клонирования в бактериальных клетках элиминируются, в то время как большая

часть последовательностей этих ДНК успешно клонируется в составе бактериальных плазмид как под контролем собственных, так и плазмидных репликативных элементов.

5. Установлено, что рекомбинантная плазмида, содержащая участок инициации репликации мтДНК крысы, последовательности ДНК бактериальной плазмиды с Ori и генами устойчивости к антибиотикам, а также дрожжевой маркерный ген 1еи2, реплицируется в клетках дрожжей с эффективностью, сравнимой с репликацией дрожжевых плазмидных ДНК, содержащих дрожжевую 2 микронную ДНК.

6. Показано, что рекомбинантная плазмида, содержащая фрагмент мтДНК крысы и дрожжевой лейциновый ген встраивается в хромосому трансформированных дрожжевых клеток, не вызывая дестабилизацию и выщепления дрожжевого гена 1еи2 и сцепленных с ним маркеров 3-ей хромосомы.

7. Впервые при трансформации клеток костного мозга была использована методика Са-фосфатной преципитации ДНК и при этом в неселективных условиях получены стабильные результаты экспрессии вносимого Т-антигена вируса SV40

8. Предложен метод доминантной селекции трансформированных клеток костного мозга в присутствии тимидина.

9. Одновременно и независимо с аналогичными исследованиями в других лабораториях, показано, что чужеродная ДНК в соответствующих условиях инкорпорируется в клетки спермиев в постакросомальные части их головок.

10. Создана генно-инженерная конструкция, содержащая полноразмерную кДНК а-1-антитрипсина человека под контролем промотора мышиного гена металлотионеина.

11. Впервые были получены трансгенные крысы, в которых зафиксирована экспрессия гена а-1-антитрипсина человека под контролем промотора гена металлотионеина мыши.

Научно-практическое значение. Представленная работа носит в основном теоретический характер. Так, изучение возможности использования мтДНК крысы для создания челночных векторов выявило ряд фактов, касающихся репликации и экспрессии мтДНК в клетках бактерий и низших эукариотов. Митохондриальный репликон, используя ферментную систему бактерий и дрожжей, обеспечивает полноценную репликацию изучаемых рекомбинантных

ДНК и достаточную копийность таких гибридных молекул в исследуемых системах. Особенности репликации мтДНК животных, такие как наличие двух точек инициации репликации, расположенных в молекуле на значительном расстоянии друг от друга, требуют встраивания в рекомбинантные плазмиды примерно 2/3 митохондриального генома. А это, в свою очередь, обеспечивает транскрипцию значительной части митохондриальных генов, продукты которых могут служить маркерами при скриннинге трансформантов. Кроме того, эффективная репликация и транскрипция рекомбинантных плазмид на основе мтДНК животных позволяет использовать для отбора также бактериальные и дрожжевые маркеры. Всестороннее изучение структуры и функционирования рекомбинатых плазмид на основе мтДНК дает возможность разрабатывать эффективные челночные векторные системы для переноса чужеродной информации. Следует также отметить, что представленные структурные и функциональные особенности митохондриального генома и рекомбинантных ДНК на его основе могут быть использованы при создании моделей ряда митохондриальных болезней.

Значение данных, полученных в экспериментах с клетками костного мозга и трансгеннымих по а-1-антитрипсину человека животными определяется временем получения, а также их востребованностью на определенном этапе работ по переносу генетической информации и реализации ее в трансформированных клетках. Представленный нами метод отбора трансформантов по определению Т-антигенной активности ДНК с последовательностями ДНК вируса SV40, а также метод доминантной селекции тимидином может успешно применяться при анализе трансформантов в отсутствие у реципиентных клеток мутаций по какому-либо признаку.

Несомненно теоретическое значение данных, впервые полученных при изучении инкорпорирования чужеродной ДНК в мужские половые клетки. Спермии могут быть трансфецированы чужеродной ДНК. Этот факт побудил исследователей в ряде зарубежных лабораторий приступить к разработке спермий-опосредованного переноса чужеродных генов в клетки зародышей и репродуктивного тракта.

Апробация работы. Основные результаты, вошедшие в настоящую работу, докладывались на: 6-й Конференции биохимиков прибалтийских республик, БССР и Ленинграда, Рига, 1981; 4-ом двустороннем (СССР-ФРГ) симпозиуме по структуре и транскрипции генома, Ереван, 1981; 2-ом Всесоюзном генетическом Съезде, Кишинев, 1982; Всесоюзном симпозиуме по применению достижений химии высокомолекулярных соединений в синтезе лекарственных препаратов, Рига, 1982; 2-ой Всесоюзной конференции "Рекомбинантные ДНК", Пущино-на-Оке, 1982; 5-ом Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов", Москва, 1983; 5-ом двустороннем симпозиуме (СССР-ФРГ) "Молекулярное разнообразие организации и экспрессии генома", Москва, 1983; Международном симпозиуме "Макромолекулы и функции клетки", Ереван, 1986; Всесоюзном Совещании "Биологии клетки в культуре", Москва, 1987; 9-ом Всесоюзном Симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра", Черноголовка, 1987;5-ом Всесоюзном Съезде генетиков и селекционеров, Москва, 1987; 2-ой Всесоюзной Конференции "Геном человека", Переславль-Залесский, 1991.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ ДНК ЖИВОТНЫХ КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ ОБЪЕКТ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ЧЕЛНОЧНЫХ ВЕКТОРОВ

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Цымбаленко, Надежда Васильевна

ВЫВОДЫ

1. МтДНК животных может быть использована при создании челночных векторов для клонирования генов в клетках прокариотов и низших эукуариотов -дрожжах: а) небольшие молекулярные размеры мтДНК, а также наличие физической карты по участкам узнавания эндонуклеаз рестрикции позволили сконструировать ряд рекомбинантных ДНК, содержащих в своем составе различные последовательности мтДНК крысы; б) митохондриальный репликон животных способен обеспечивать репликацию таких рекомбинантных ДНК в бактериальных клетках как при наличии, так и в отсутствие плазмидного Ori; в) митохондриальный репликон животных функционирует в клетках низших эукариот - дрожжах с эффективностью, сравнимой с работой дрожжевой 2микронной плазмиды; г) селекцию рекомбиантных плазмид, содержащих фрагменты мтДНК животных можно проводить с использованием бактериальных маркеров устойчивости к антибиотикам, дрожжевых маркеров ауксотрофности, а также по тестированию продуктов митохондриальных генов, последовательности которых входят в структуру используемых фрагментов мтДНК.

2. Для полноценной репликации рекомбинантных плазмид, направляемой митохондриальным репликоном, необходимо наличие точек инициации репликации обеих нитей мтДНК (Н- и L-нитей).

3. В клетках дрожжей митохондриальный репликон использует для своей работы белки, кодируемые хозяйской 2-микронной ДНК. На это указывает обнаруженный в работе факт, что репликация рекомбинантных ДНК на основе мтДНК крысы в штаммах дрожжей, содержащих 2-микронную ДНК приблизительно в 14 раз выше, чем в штаммах, не содержащих эту дрожжевую плазмиду.

4. Стабильность дрожжевых клеток, трансформированых рекомбинантными ДНК с фрагментами мтДНК животных, в неселективных условиях обеспечивается интеграцией исследуемых ДНК в хромосому дрожжей. Подобная селекция на стабильность клеток дрожжей, трансформированных плазмидами на основе мтДНК животных, может использоваться как метод для встраивания переносимых с помощью этих векторов генов в хромосому клетки-хозяина.

5. При отсутствии у реципиентных клеток животных мутаций по исследуемому признаку отбор трансформантов, содержащих ген "интереса", можно осуществлять в неселективных условиях: а) используя котрансформирующие плазмиды с хорошо тестируемыми маркерами, например, Т-антиген вируса SV40; б) применяя доминантную селекцию, например - отбор трансформантов с плазмидой, содержащей ген тимидинкиназы вируса герпеса, на средах с насыщающими концентрациями естественного метаболита - тимидина.

6. Зрелые мужские половые клетки в присутствии ДМСО способны поглощать плазмидную ДНК в виде Са-фосфатного преципитата. Инкорпорированная ДНК локализуется в постакросомальной части головки спермиев.

7. кДНК а-1-антитрипсина человека под контролем металлотионеинового промотора мыши в составе рекомбинантной плазмиды обеспечивает экспрессию а-1-антитрипсиновой к ДНК человека в органах крысы. Последовательности исследуемой кДНК обнаруживаются в двух поколениях трансгенных животных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследования, направленные на создание новых векторов для клонирования генов, а, следовательно, и совершенствование методов доставки и реализации клонируемой генетической информации (in vitro, in vivo и ex vivo) постоянно развиваются. В свете этого наши работы по изучению репликации мтДНК животных в бактериальных клетках и клетках простейших эукариотов -дрожжей, а также реализации переносимой с помощью мтДНК генетической информации представляют теоретический и практический интерес.

Нашей целью было исследование возможности использования мтДНК животных в качестве челночного вектора для переноса генетической информации. В разделе, посвященном обзору литературы, достаточно подробно описаны механизмы транскрипции, трансляции и репликации мтДНК животных, а также приводится информация о некоторых известных факторах, контролирующих данные процессы. Большинство имеющихся в литературе данных было получено при изучении клонируемых в составе бактериальных плазмид фрагментов мтДНК различных животных и человека.

Исследования клонируемых последовательностей мтДНК в прокариотических и эукариотических клетках, результаты которых изложены в экспериментальном разделе, являлись логическим продолжением наших работ по физическому и функциональному картированию мтДНК крысы [Казакова и др., 1978; Kazakova et al., 1980]. Следует отметить, что построенная нами физическая карта мтДНК крысы содержала информацию о расположении на молекуле ДНК участков узнавания четырех эндонуклеаз рестрикции: BamHl, EcoRI, Hpal и Xbal, что открывало возможности целенаправленного выбора для клонирования необходимого фрагмента мтДНК. Кроме того, был проведен детальный анализ по выяснению порядкарасположения на карте небольших по размерам фрагментов ДНК, получаемых при гидролизе мтДНК крысы ферментом EcoRI: G и Н. Наличие такой подробной физической карты позволило локализовать на ней последовательности генов митохондриальных 12S и 16S рибосомальных РНК, а также последовательности, кодирующие субъединицы митохондриального АТФ-синтетазного комплекса [Kazakova et al., 1980]. В данной работе при изучении экспрессии клонируемых в бактериальных клетках в составе рекомбинантных плазмид последовательностей мтДНК крысы, получаемых при гидролизе эндонуклеазой BamHl, нам удалось локализовать, хотя и не достаточно точно, гены, кодирующие митохондриальную цитохромоксидазу и апоцитохром Ь. Как уже отмечалось ранее, последовательность расположения генов на функциональной, т.е. транскрипционной карте мтДНК всех млекопитающих идентична. Этот факт позволил группе исследователей из Новосибирска и Киева идентифицировать, локализованные ими на карте мтДНК крысы девять индивидуальных поли-(А)-содержащих РНК [Pusyriov et al., 1983]. Полученные нами данные по расположению исследуемых генов совпадают с данными, опубликованными в литературе.

Исходя из экспериментальных данных, представленных в настоящей работе, можно заключить, что митохондриальный репликон способен инициировать и осуществлять репликацию рекомбинантных ДНК как в бактериальных клетках, так и в клетках дрожжей. Наличие точек инициации репликации (Н- и L-нитей) во фрагменте мтДНК рекомбинантной плазмиды pBRmtB-A, обеспечивает репликацию этой плазмиды в клетках Е. coli, мутантных по ДНК-полимеразе I, в которых репликон бактериальной плазмиды не функционирует. Это показано на трех штаммах Е. coli: polAl (нонсенс-мутация), ро1А6 (миссенс-мутация) и polA ts-мутантах. Репликация рекомбинантной ДНК, инициируемая митохондриальным Ori, осуществляется с помощью ферментативного аппарата бактериальной клетки. Причем, эффективность работы митохондриального репликона сравнима с репликоном плазмиды pBR322 в нормальных по ДНК-полимеразе I клетках Е. coli. Результаты наших экспериментов также указывают на то, что реплицирующиеся с митохондриального ориджина химерные ДНК сохраняют гены устойчивости к ампициллину, а также хлорамфениколу (Тп9, содержащий ген устойчивости к хлорамфениколу, встраивается во фрагмент мтДНК), обеспечивающие рост бактериальных клеток на селективных средах с этими антибиотиками.

В клетках бактерий митохондриальный репликон может обеспечивать репликацию рекомбинантной плазмидноЙ ДНК, которая не содержит бактериального репликона, что продемонстрировано на примере сконструированной нами ДНК pmtKC 1. Эта ДНК содержала примерно две трети генома мтДНК крысы, включая Ori обеих нитей ДНК, а также последовательности, кодирующие бактериальный ген устойчивости к канамицину. Эффективность репликации ДНК pmtKC 1 по сравнению с репликацией бактериальной плазмиды, на основе которой создавалась химера, ниже, что выражается в замедленном росте трансформантов на селективной среде с Km. Тем не менее, способность митохондриального репликона обеспечивать автономную репликацию плазмидной ДНК, в составе которой имеется селективный маркер, позволяющий осуществлять направленный отбор трансформированных бактериальных клеток, очевидна.

Этот подход можно использовать при клонировании в бактериях необходимых последовательностей мтДНК животных и человека с целью их наработки для дальнейшего использования. Такие рекомбинантные ДНК, не содержащие "балласта" последовательностей бактериальных плазмид, предпочтительнее для переноса генов эукариотов. Например, при создании моделей некоторых митохондриальных патологий (см. обзор литературы). Исходя из известной первичной последовательности нуклеотидов мтДНК человека, а также локализации на ней ряда мутаций, связанных с указанными патологиями [Smeitink et al., 2001], видится возможным конструирование таких ДНК. Например, при наличии точечных мутаций в митохондриальных генах, кодирующих структуру: 1) белков (синдром Лея - T8993G/C, наследственная оптическая нейроретинопатия Лебера - G3460A, G11788A, Т14484С и A14495G и др.); 2) генов тРНК (синдром митохондриальной миопатии, энцефалопатии, молочного ацидоза и инсультоподобных эпизодов - A3243G); 3) генов рРНК (индуцированная аминогликозидом глухота A1555G), а также мутаций, вызванных делециями мтДНК (синдром Пирсона и др.) [Smeitink, 2001]. В случае митохондриальных патологий, связанных с нарушением синтеза или доставки продуктов ядерной ДНК с уже изученной структурой, необходимых в жизнеобеспечении митохондрий: 1) структурные дефекты ядерных участников OXPHOS (недостаточность компонентов комплекса I и II при синдроме Лея); 2) дефекты, связанные с взаимодействием ядерного и митохондриального геномов, взаимодействием комплексов OXPHOS; 3) дефекты гомеостаза и импорта продуктов ядерного синтеза в митохондрии, тоже возможно создание рекомбинантных мтДНК, с соответствующей заданной генетической информацией. Можно предположить, что введение таких ДНК в нативные митохондрии с использованием соотвествующих методов трансформации, позволит проводить изучение продуктов их экспрессии, а также, может быть, и разрабатывать стратегию коррекции данных патологий.

Отметим, что для введения ДНК в изолированные митохондрии теоретически применимы те же методы, что и при клеточной трансфекции. Известны работы, в которых описано введение чужеродной ДНК в жизнеспособные митохондрии in vitro с помощью липосом [Cudd, Nicolau, 1986] или с использованием механизма белкового импорта через наружную мембрану митохондрий [Vestweber, Schatz, 1989; Seibel et al., 1995]. Наиболее интересна и успешна работа по применению электропорации для введения в изолированные митохондрии мыши плазмидной ДНК [Collombet et al., 1996]. Показано, что введенная в митохондрии чужеродная ДНК реплицируется и экспрессируется. Содержание введенной плазмидной ДНК составляло 20% от всей внутримитохондриальной ДНК. Авторы этой работы высказывают оптимистичные надежды на развитие новых подходов в исследованиях митохондриальных патологий с применением трансформированных митохондрий.

Следует отметить факт экспрессии митохондриальных белков в бактериальных клетках, трансформированных плазмидами на основе мтДНК животных. В нашей работе это показано на примере синтеза полипептидных цепей цитохромоксидазы, а также апоцитохрома b крысы в клетках Е. coli. Бактериальный аппарат транскрипции и трансляции, как отмечалось нами в предыдущих разделах, обеспечивает синтез митохондриальных белковых продуктов, гены которых содержатся в рассматриваемых здесь рекомбинанатных плазмидных ДНК. Такие митохондриальные продукты, идентифицируемые с помощью специфических антител, могут служить своеобразными маркерами для митохондриальных последовательностей этих ДНК. Этот факт является немаловажным в свете возможности использования рекомбинантных плазмид на основе мтДНК в качестве челночных векторов в системе бактерии -митохондрии - клетки эукариотов.

Нами показано, что митохондриальный репликон млекопитающих обеспечивает репликацию рекомбинантной плазмидной ДНК с дрожжевым маркером 1еи2 в клетках низших эукариотов Saccharomyces cerevisiae. Эффективность работы Ori мтДНК крысы в клетках дрожжей, оцениваемая как количество трансформированных клеток, дающих колонии на селективной среде без лейцина, сравнима с таковой для дрожжевой плазмиды, несущей репликон 2-микронной ДНК. Однако стабильность рекомбинантной плазмиды pYMtl в неселективных условиях почти в 4 раза ниже, чем таковая для дрожжевой плазмиды pYDB219.

Исследование функционирования pYMtl в штаммах без 2-микронной ДНК (cir°) позволило получить дрожжевой клон, в котором стабильность клонированной плазмиды была очень высока. С помощью методики получения и изучения цитодуктантов каг-1-мутантов дрожжевых клеток было показано, что стабильность исследуемых трансформантов обусловлена интеграцией плазмидной ДНК в хромосому дрожжей. Как уже отмечалось, подобную селекцию на стабильность клеток дрожжей, трансформированых плазмидами на основе мтДНК животных, можно использовать как метод для встраивания переносимых с помощью этих векторов генов в хромосому клетки хозяина. В настоящее время, система дрожжевых клеток широко используется в молекулярно-генетических исследованиях для изучения различных биохимических и генетических процессов.

Таким образом, можно заключить, что полученные нами данные по изучению возможности использования мтДНК животных при создании челночных векторов для переноса и реализации чужеродной генетической информации в системе прокариоты - эукариоты имеют теоретическое и практическое значение:

1) митохондриальный репликон способен обеспечивать репликацию рекомбинантных плазмид в клетках бактерий;

2) встраивание в рекомбинантные плазмиды на основе мтДНК животных бактериальных генов устойчивости к антибиотикам позволяет вести направленный отбор трансформантов в бактериях;

3) маркерами на присутствие в клетках бактерий плазмидных ДНК с последовательностями мтДНК животных могут служить экспрессирущиеся гены мтДНК, продукты которых идентифицируются иммунологическими методами;

4) митохондриальный репликон животных обеспечивает автономную репликацию рекомбинантных плазмид в клетках простейших эукариотов - дрожжах, как в штаммах с 2-микронной дрожжевой плазмидой, так и в штаммах, где такая плазмида отсутствует;

5) отбор дрожжевых трансформантов можно производить с использованием традиционных дрожжевых маркеров, встроенных в плазмиды на основе мтДНК животных;

6) рекомбинантные плазмиды на основе мтДНК животных способны встраиваться в хромосомную ДНК дрожжей, обеспечивая перенос маркерного гена;

7) все вышеперечисленное указывает на возможность использования мтДНК животных, или ее соответствующих последоватеьностей, в работах по трансгенозу при исследованиях митохондриальных патологий, а также в молекулярно-генетических исследованиях в дрожжевой системе.

Как уже не раз отмечалось нами ранее, трансгеноз имеет своей основной конечной целью генную терапию различных болезней человека и животных. Одной из наиболее реальных мишеней для генной терапии являются гематопоэтические стволовые клетки, т.е. клетки, которые являются предшественниками зрелых клеток крови [Ogawa,1993; Orlic, Bodin, 1994]. Трансплантация костного мозга широко применяется в медицине, а костный мозг и есть одно из мест, где эти стволовые клетки существуют. Естественно, что прежде, чем использовать любую технологию на человеке, сначала ее детально изучают на экспериментальных животных. Эти эксперименты были начаты в восьмидесятых годах на мышах [Cline et al., 1980; Vtrcjla et al., 1980; Williams et al., 1985]. Развитие клинических исследований по использованию гематопоэтических стволовых клеток для переноса генов на протяжении последних 20 лет также базировалось на результатах многочисленных экспериментальных работ, проводимых на животных [Rosenberg et al., 1990; Anderson, 1992; Miller, 1992; Mulligan, 1993; Cai et.al, 1995; Blaese et al., 1995; Kirby, 1999; Halene, Kohn, 2000]. Совершенствовались методы получения обогащенных фракций ККМ и подбора метода введения необходимых генов в эти клетки.

Мы также использовали в своей работе ККМ лабораторных грызунов: мыши и хомяка. А для введения генетической информации в ККМ использовали традиционную для того времени технику кальций-фосфатной трансформации. Следует отметить, что речь шла о применении уже известного метода трансформации соматических клеток животных вирусной ДНК. Однако в наших экспериментах для трансформации были использованы ДНК бактериальных плазмид. Необходимо было исследовать эффективность трансформации соматических клеток животных плазмидными ДНК, провести анализ стабильности и функциональной активности рекомбинантных ДНК в этих клетках в неселективных условиях. Было показано, что последовательности ДНК вируса SV40, представленные в плазмидной ДНК pBRSV40 сохраняют свою функциональную активность при пролиферации in vivo трансфорсмированных in vitro ККМ животных в неселективных условиях.

Одним из ключевых факторов при анализе трансформантов является фактор наличия маркера, позволяющий отбирать трансформированные клетки. Мы уже отмечали, что долгое время чаще всего использовали бактериальные гены: неомицинтрансферазы [Williams et al., 1984], дигидрофолатредуктазы [Переверзев и др., 1986], гуанилфосфорибозилтрансферазы [Mulligan, Berg, 1980], обеспечивающие устойчивость немаркированных мутацией реципиентных клеток к антибиотику G418, метатрексату и микофеноловой кислоте, соответственно. Подобная селекция трансформированных гематопоэтических стволовых клеток из костного мозга была осуществлена на мышах [Dick et al., 1985; Eglitis et al., 1985; Bodin et al., 1993; Dunbar et al., 1996], собаках [Stead et al., 1988], кошках [Lothrop et al., 1991] и приматах [Kantoff et al., 1987]. Однако, эти вещества чужеродны животным клеткам и поэтому вредны для их жизнедеятельности. В самых ранних протоколах по генной терапии с применением трансплантируемых гематопоэтических стволовых клеток в качестве маркера также использовался ген NEO [Rill et all., 1992; 1997; Brenner et al., 1993; 1994; Stevard et al., 1998]

В нашей работе с ККМ мы исследовали возможность иного подхода для селекции трансформированных клеток. Поскольку в качестве маркерного гена мы использовали ген тимидинкиназы вируса герпеса, то было логично попробовать использовать для селекции ТК+- трансформантов введение в качестве ингибитора тимидина (dT). Тимидин является естественным субстратом клеточной ТК [Spandidos et al., 1982] и при избыточном введении отрицательно сказывается на росте клеток. Вирусная ТК не чувствительна к дТТФ, поэтому возможен отбор трансформированных клеток, содержащих ДНК с геном ТК вируса герпеса. Результаты исследований, проводимых in vitro и in vivo, показали, что при доминантной селекции тимидином возможен отбор трансформантов в отсутствие у реципиентных клеток мутаций по какому-либо признаку. Отметим, что в качестве позитивного маркера селекции трансформантов, которым у нас служил продукт гена ТК вируса простого герпеса, использовались и другие маркеры: мышиный сердечный антиген [Conneally et al., 1996], антиген CD24 человека [Pawliuk et al., 1997], рецептор фактора роста нервной ткани [Ruggieri et al., 1997], а также зеленый флуоресцирующий белок [Emmons et al., 1997]. Введение маркерного гена совместно с геном "интереса" позволяет направленно отбирать только трансформированные клетки, что, в свою очередь, обеспечивает увеличение эффективности переноса генов и длительности его экспрессии у реципиента. В связи с этим поиски новых путей селекции in vivo на уровне целого организма, как, например, доминантная селекция тимидином, приобретают все большую актуальность.

Таким образом, осуществленные нами исследования по трансформации ККМ животных чужеродным генетическим материалом проводились адекватными поставленным задачам методами, которые являлись общепринятыми для времени их проведения. Применение метода трансфекции ККМ плазмидными ДНК и отработка способов селекции трансформантов позволили:

1. осуществить трансформацию ККМ мыши и хомяка плазмидной ДНК pBRBSV, ранее для этих целей не применявшейся;

2. выявить экспрессию Т-антигена вируса SV40 как в суспензии клеток, так и в пролиферирующих гематопоэтических клетках в селезенки мыши;

3. методом ретрансформации показать, что плазмидная ДНК pBRBSV находится в трансформированных клетках в цитоплазме, сохраняя бактериальный ген устойчивости к ампициллину;

4. с помошью эндонуклеазы BamHl выявить структурные изменения в исследуемой молекуле ДНК, выделенной из клеток колоний трансформантов;

5. показать возможность осуществления доминантной селекции трансформированных плазмидной ДНК с геном ТК вируса герпеса ККМ в присутствии тимидина, т.е. осуществить селекцию трансформантов в отсутствие у реципиентных клеток мутаций по гену ТК.

Применение ККМ, как основного источника гематопоэтических клеток, для целенаправленной доставки генов, с самых первых исследований [Williams et al., 1984; Dick et al., 1985 и др.] до наших дней, когда имеется целый ряд разработанных клинических протоколов [Karlsson, 1997; Kohn et al., 1998(a,b)], является одним из самых перспективных направлений развития генной терапии, или, если говорить более шире, трансгеноза. Использование же трансформированных половых клеток самцов для доставки чужеродной генетической информации вызывает много вопросов. Тем не менее, вот уже на протяжении более десяти лет в ряде лабораторий проводятся исследования по введению чужеродной ДНК в сперматозоиды и по использованию трансформированных сперматозоидов для доставки генов в клетки мишени.

Идея использовать клетки спермиев для внедрения экзогенной ДНК в яйцеклетку во время оплодотворения была бы блестящей, если бы только мы были уверены, что это можно сделать" - такими словами начинается наиболее полный на данный момент обзор исследований по спермий-опосредованному переносу ДНК [Gandolfi, 2000].

Этот простой, эффективный и применимый для всех видов, использующих спермии для оплодотворения, метод переноса генетического материала пока что дает нестабильные по предсказуемости результаты [Maione et al., 1998]. Несомненно, что еще требуется детальное изучение как процесса введения ДНК в клетки спермиев, включая топографию распределения этой ДНК в данных клетках, так и процедуры доставки полученных генов в реципиентные клетки. Однако, определенные результаты в этой области уже достигнуты. В связи с тем, что наши исследования по изучению трансфекции чужеродной ДНК в спермии были одними из первых, при обсуждении результатов в экспериментальном разделе диссертации были рассмотрены данные, полученные в многочисленных работах, посвященных затронутой проблеме.

Как показано нашими исследованиями и работами других авторов зрелые спермии способны включать чужеродную ДНК. Экзогенная ДНК локализуется в постакросомальном и экваториальном районах головки спермия [Camaioni et al., 1992; Lavitrano et al., 1992] и 15-20% инкорпорированной ДНК интернализуется ядром спермия [Francolini et al., 1993]. Это указывает на то, что довольно большое количество чужой ДНК может быть внесено в клетку-мишень путем механического контакта последней с трансформированным спермием [Lavitrano et al., 1997].

Природа создала механизм, контролирующий внедрение в половые клетки самцов случайной ДНК, включающий ряд факторов, находящихся в семенной жидкости [Zani et al., 1995], на поверхности и внутри самих спермиев [Lavitrano et al., 1997; Zoragi, Spadaeora, 1997]. Изучение всех участников процессов связывания-интернализации или связывания-элиминации экзогенной ДНК спермиями в большой степени явилось следствием, вытекающим из факта возможности инкорпорирования ДНК в половые клетки самцов.

Таким образом, исследования по введению экзогенной ДНК в клетки спермиев, осуществленные нами одновременно и независимо с подобными работами в других лабораториях, явились одними из первых в этом направлении. Полученные нами результаты находятся в соответствии с литературными данными :

1. плазмидная ДНК может быть инкорпорирована в клетки спермиев в присутствие ДМСО;

2. экзогенная ДНК проникает только в зрелые спермии;

3. проникновение экзогенной ДНК в спермий осуществляется в постакросомальной части головки.

Трансгенные животные, полученные с помощью разных способов внесения чужеродной генетической информации, являются прекрасным объектом для изучения регуляции генной экспрессии и разработки подходов в реализации генной терапии и в решении целого ряда вопросов в медицине и сельском хозяйстве. Об этом не раз упоминалось выше. Одним из традиционных способов получения таких животных является введение ДНК в оплодотворенные яйцеклетки.

Интересы развития исследований по изучению наследственной недостаточности а-1-антитрипсина у человека, проводимых в Отделе молекулярной генетики [Страхова и др., 1993; Должанская и др., 1994], а также наличие налаженной методики введения ДНК в оплодотворенные яйцеклетки животных [Вайсман, Дыбан, 1990] послужили основой для экспериментов по получению ААТ-трансгенных крыс. В результате этих исследований были получены два поколения крыс, у которых фиксировалось присутствие последовательностей кДНК ААТ человека. В первом поколении трасгенных животных была выявлена экспрессия ААТ человека. Как уже отмечалось выше, ко времени проведения наших исследований, в литературе имелись немногочисленные данные по изучению человеческого гена ААТ в трансгенных моделях: картирование промоторной области гена ААТ [Sifers et al., 1987], а также изучение механизмов внутриклеточной аккумуляции в гепатоцитах мутантного ААТ [Dycaico et al., 1988]. Анализ экспрессии гена ААТ человека под контролем промотора металлотионеина мыши в трансгенной животной модели представлял определенный интерес. Исследования такого рода имеют не только теоретическое значение, но также необходимы для разработки рациональных методов терапии основного проявления дефицита ААТ - первичной эмфиземы легких, которые должны базироваться на заместительных введениях рекомбинантного ААТ или на трансфекции соматических клеток-мишеней генно-инженерными конструкциями, обеспечивающими эффективную экспрессию ААТ.

Таким образом, исходя из полученных нами экспериментальных данных, можно заключить следующее:

1. Создана рекомбинантная ДНК рАТ-МТ, обеспечивапющая экспрессию полноразмерной кДНК а-1-антитрипсина человека под контролем промоторных элементов гена металлотионеина-1 мыши.

2. Путем микроинъекции ДНК рАТ-МТ в оплодотворенные яйцеклетки крыс получены трансгенные животные, содержащие в геноме последовательности а-1-антитрипсин-кДНК человека.

3. При последующих скрещиваниях от трансгенного самца было получено потомство второго поколения, у которого с высокой частотой (9 из 22 животных) выявлены интегрированные в хромосомную ДНК копии а-1-антитрипсин-кДНК человека.

4. В сыворотке крови трансгенных крыс методом иммуноблотинга обнаружен белок с антигенной специфичностью а-1-антитрипсина человека.

В экспериментальном разделе при обсуждении данных, полученных при анализе трансгенных по ААТ человека животных, изложены результаты работ, появившихся в литературе в последующие после наших исследований годы. Эти работы подтвердили правильность наших рассуждений о направлении предпринятых нами исследований, связанных ААТ.

В разделе "Введение", обосновывая актуальность предпринятых нами исследований по переносу и реализации чужеродной генетической информации, отмечено, что необходимость их диктуется общим развитием изучения молекулярных основ наследственных болезней человека, проводимых на протяжении нескольких десятилетий в Отделе молекулярной генетики Института экспериментальной медицины. В некотором смысле, данную работу можно охарактеризовать как ретроспективную попытку обобщения части этих исследований, направленных на разработку новых векторов для переноса генов, а также освоение методов доставки чужеродной ДНК в соматические и половые клетки животных с целью реализации перенесенной генетической информации. Всесторонние исследования генетической системы митохондрий, проводимые под руководством С.А.Нейфаха, послужили основой для работ, осуществляемых в Отделе молекулярной генетики в настоящее время. Эти работы направлены на разработку подходов для создания животных моделей митохондриальных болезней человека методом переноса митохондрий человека в бластоцисты мышей [Vasilyev et al., 1999; Vasilyev et al., 2001]. Наряду с этими исследованиями разрабатываются новые методы доставки генов в животные клетки мишени, например трансфекция с помощью лактоферина человека, как способа рецептор-опосредованного эндоцитоза ДНК, обеспечивающая адресную доставку генетической информации [Синогеева и др., 2000]. Кроме того, в 2002 году на базе Отдела молекулярной генетики НИИЭМ РАМН создана Лаборатория мультипотентных эмбриональных стволовых клеток, направление исследований которой предполагает использование всего многообразия разрабатываемых ранее методов переноса и реализации чужеродной генетической информации в клетки животных.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Цымбаленко, Надежда Васильевна, 2002 год

1. Баранов А.Н., Киселев А.В., Иващенко Т.Э., Кащеева Т.К., Баранов B.C. Особенности трансфекции и экспрессии кДНК гена дистрофина человека, доставленного в мышцы мышей mdx с помощью синтетических микросфер MF2. Генетика. 1999, 1: 22-27.

2. Баранов B.C. Генная терапия медицина будущего. Соросовский образовательный журнал. 1999, 3: 1-6.

3. Баранов B.C., Баранов А.Н. Генная терапия моногенных наследственных болезней. Миодистроаия Дюшенна. Вопр. Мед. Хим.2000,3:279-293.

4. Богданенко Е.В., Свиридов Ю.В., Московцев А.А., Жданов Р.И. Невирусный перенос генов in vivo в генной терапии. Вопр. Мед. Хим. 2000, 3: 226-245.

5. Брода П. (под ред. А.А. Баева), Плазмиды, Москва, "Мир", 1982.

6. Вайсман Б.Л., Дыбан А.П. Возможности использования достижений генной инженерии млекопитающих для разработки методов генной терапии. Биополимеры и клетка, 1990, 6: 3-12.

7. Власова И.Е., Нечаева М.В., Власов В.В. Системы доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих. Усп. соврем, биол. 1994, 6: 715-724.

8. Гайцхоки B.C., Киселев О.И. Митохондриальная система биосинтеза белка. Усп. биол. хим. 1977, 18: 71-91.

9. Гаузе Г.Г. Митохондриальная ДНК. М. Наука, 1977, 288.

10. Гловер Д. Новое в клонировании ДНК. Методы. Москва, Мир, 1989.

11. Гормон К. Высокоэффективный перенос генов в клетки млекопитающих в кн.: "Клонирование ДНК. Методы", под ред. Гловера Д.М., "Мир", 1988, с.409-463.

12. Туликова О.М., Зайцева Г.Н. Рибосомы митохондрий. Успехи Совр. Биол. 1984, 2Ж 208-224.

13. Должанская Н.Б., Шварцман A.JL, Гайцхоки B.C. Экспрессия гена а-1-антитрипсина человека в гетерологичных клетках млекопитающих. Бюл. Эксп. Биол. Мед. 1994, 2: 166-168.

14. Жданов Р.И., Семенова Н.В., Арчаков А.И. Реальности и надежды генной терапии. Вопр. Мед. Хим. 2000, 3: 197-206.

15. Дебабов В.Г. ДНК-вакцинация и генотерапия на основе транзиентной экспрессиии нуклеиновых кислот в соматических клетках человека и животных. Мол. Биол. 1997, 2: 209-215.

16. Жданов Р.И., Сомов А.Н., Вирясов С.Н. Невирусные системы доставки генов для генной и иммуно-терапии. В "Разработка рекомбинантных иммуномоделирующих препаратов для генной и иммунотерапии". Науч. обзоры. Оболенск, 1996, с.37-51.

17. Зеленин А.В., Кайгородов В.А., Прасолов B.C. Генная терапия сегодня и завтра. Мол. Биол. 1998, 2: 219-228.

18. Иомантас Ю.В., Рабинович П.М., Бандрин С.В., Демьянова Н.Т., Козлов Ю.И., Степанов А.И. Двурепликонные векторные молекулы ДНК для бактериальных систем Escherichia coli Bacillus subtilis. Докл. Акад. Наук СССР. 1979, 244: 993-996.

19. Казакова Т.Б., Бабич С.Г., Мельникова М.П., Цымбаленко Н.В., Брага Э.А., Носиков В.В., Нейфах С.А. Локализация участков узнавания рестриктаз BamHl, Hpal, EcoRI на митохондриальной ДНК печени крысы. Докл. АН СССР. 1978, 3: 736-741.

20. Казакова Т.Б., Вербина И.А., Шатов В.А. Способ определения тимидина в биологической пробе. Авторское свидетельство на изобретение №1364990 А1, 1988.

21. Казакова Т.Б., Мельникова М.П., Свердлов Е.Д. Выделение и характеристика фрагментов ДНК, связанных с белком митохондриальных мембран. Мол. Биол. 1977, 5: 1023- 1037.

22. Калинин В.JI. Введение в молекулярную вирусологию. Санкт-Петербург, Изд-во СПбГТУ, 2002, 302с.

23. Колесников В.А., Зеленина И.А. Семенова М.Л., Шафеи Р.А., Зеленин А.В. Баллистическая трансфекция клеток млекопитающих in vivo. Онтогенез. 1995, 26: 467-480.

24. Колесников В.А., Титомиров А.В., Зеленин А.В. Генетическая трансформация клеток животных в культуре с помощью высокоскоростного механического пробоя. Докл. АН СССР. 1988, 305Ж 1265-1267.

25. Кузнецов А.В., Кузнецова И.В. Связывание экзогенной ДНК pK31acZ сперматозоидами кроликов, ее перенос в ооциты и экспрессия в зародышах. Онтогенезю 1995, 26: 300-309.

26. Минченко А.Г. Гормональный контроль экспрессии участка митохондриального генома в животных клетках. Проблемы эндокринологии. 1981, 6: 74-79.

27. Минченко А.Г. Гормональный контроль экспрессии митохондриальных генов при некоторых формах экспериментальной эндокринной патологии. Дис. д.б.н., Киев, 1985, 375 стр.

28. Минченко А.Г., Дударева Н.А. Митохондриальный геном. Новосибирск, "Наука", 1990.

29. Митрофанова Е.Э., Бахвалова Е.Н., Добрикова Е.Ю., Рар В.А., Морозова О.В. Генная иммунизация против вируса клещевого энцефалита. Мол. Биол. 1997, 3: 403-406.

30. Обухова Л.Х., Киселева Е.В., Боровков А.Ю. Экстрахромосомные ДНК в клетках мозга и печени нормальных крыс. Биополимеры и клетка. 1988, 3: 145-150.

31. Переверзев А.Е., Титомиров А.В., Степаньян Л.И. и др. Селекция in vivo колонийобразующих клеток костного мозга мышей, трансформированных плазмидой, содержащей бактериальный ген дегидрофолатредуктазы. Докл. АН СССР, 1986. 1: 233-235.

32. Подобед О.В., Жданов Р.И. Генный перенос с помошью невирусных векторов на основе поликатионов и гидрофобных поликатионов в целях генной терапии. Вопр. Биол. Мед. Фарм. Хим. 1999, 4: 7-15.

33. Прасолов B.C., Иванов Д.С. Ретровирусные векторы в генной терапии. Вопросы Мед. Химии. 2000, 3: 207-225.

34. Прасолов B.C., Чумаков П.М. Антисмысловая РНК р53 подавляет пролиферацию нормальных и трансфорсмированных клеток. Мол. Биол. 1988,21:1678-1687.

35. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии. Санкт-Петербург, Издательство СПбГТУ, 1999.

36. Скрябин К.Г., Томарев С.И., Гаузе Г.Г., Баев А.А. Клонирование митохондриальной ДНК крысы с использованием вектора с различающимися липкими концами. Докл. АН СССР. 1978, 5: 1220-1223.

37. Страхова М.И., Шварцман А.Л., Тодорова М.Т., Орлова Е.А., Гайцхоки B.C. Экспрессия гена а-1-антитрипсина человека в клетках Escherichia coli. Мол. Биол. 1993, 27, 5: 1014-1022.

38. Щелкунов С.Н., в кн. "Клонирование генов", Новосибирск, "Наука", 1986, с.225.

39. Форни JI. Флуоресцирующие антитела и их применение при анализе антигенов лимфоидных клеток. В кн.: Методы исследований в иммунологии. Москва. Мир. 1981, с. 164-179.

40. Adams W.J. Jr, Kalf G.F. DNA polymerase isolated from the mitochondrial chromosome appears to be identical to DNA polymerase-gamma. Biochem.Biophys.Res.Commun. 1980, 95, 4:21875-84.

41. Aloni Y., Attardi G. Symmetrical in vivo transcription of mitochondrial DNA in HeLa cells. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1971, 68:1757-1761.

42. Anderson W.F. Human gene therapy. Science. 1992, 256: 808-813.

43. Anderson S., de Bruijn M.H., Coulson A.R., Eperon I.C., Sanger F., Young I.G. Complete sequence of bovine mitochondrial DNA. Conserved features of the mammalian mitochondrial genome. J.Mol.Biol. 1982, 156, 4:683-717

44. Ankel-Simons F., Cummins J.M. Misconceptions about mitochondria and mammalian fertilization: implications for theories on human evolution. Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1996, 93, 24:13859-63.

45. Araya A, Amthauer R, Leon G, Krauskopf M. Cloning, physical mapping and genome organization of mitochondrial DNA from Cyprinus carpio oocytes. Mol. Gen. Genet. 1984, 1: 43-52.

46. Arezzo F. Sea urchin sperm as a vector of foreign genetic information. Cell. Biol. Int. Rep. 1989, 13: 391-404.

47. Attardi G. Organization and expression of the mammalien genome: a lesson in economy. Trends Biochem. Sci. 1981, 6, 3: 86-89.

48. Attardi G., Cantatore P., Chomyn A., Mariottini P. Doolittle R.F. Mitochondrial genes. N.Y. Cold Spring Harbor, 1982, 51-71.

49. Attardi G., Chomyn A., Doolittle R.F., Mariottini P., Ragan C.I. Seven unidentified reading frames of human mitochondrial DNA encode subunits of the respiratory chain NADH dehydrogenase. Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. 1986, 51 Pt 1:103-14.

50. Bachiller D., Schellander K., Peli J., Ruther U. Liposome-mediated DNA uptake by sperm cells. Mol.Reprod. Dev. 1991, 30: 194-200.

51. Baer R.J, Dubin D.T. Methylated regions of hamster mitochondrial ribosomal RNA: structural and functional correlates. Nucleic Acids Res. 1981, 2: 323337.

52. Barat M., Mignotte B. A DNA binding protein from Xenopus laevis oocyte mitochondria. Chromosoma. 1981,82, 4:583-93.

53. Bauer H.M., Ting Y., Greer C.E., Chambers J.C., Tashiro C.J., Chimetra J., Reingold A., Manos M.M. Genital human papillomavirus infection in female univercity students as determined by a PCR based method. J. Am. Med. Assoc., 1991,265:472-477.

54. Beggs J.D. Transformation of yeast by a replicating hybrid plasmid. Nature. 1978,275,5676:104-9.

55. Bellve A.R., O'Brien D.A. The mammalian spermatozoon: structure and temporal assembly. In mechanism and control of animal fertilization. (J.F. Hartmann, ed.), N.Y., Academic, 1983, pp. 56-137.

56. Bender M.A, Palmer T.D, Gelinas R.E, Miller A.D. Evidence that the packaging signal of Moloney murine leukemia virus extends into the gag region. J. Virol. 1987, 5: 1639-1646.

57. Berns K.I., Giraud C. Adenoassociated virus vectors in gene therapy. Berlin, Heidelberg, 1996.

58. Berthier F, Renaud M, Alziari S, Durand R. RNA mapping on Drosophila mitochondrial DNA: precursors and template strands. Nucleic Acids Res. 1986, 11:4519-4533.

59. Bestwick R.K, Moffett G.L, Mathews C.K. Selective expansion of mitochondrial nucleoside triphosphate pools in antimetabolite-treated HeLa cells. J. Biol. Chem. 1982, 16: 9300-9304.

60. Bett A.J, Prevec L, Graham F.L. Packaging capacity and stability of human adenovirus type 5 vectors. J. Virol. 1993,10: 5911-5921.

61. Bhat K.S., Bhat N.K., Kulkarni G.R., Iyengar A., Avadhani N.G. Expression of the cytochrome b-URF6-URF5 region of the mouse mitochondrial genome. Biochemistry. 1985,24,21:5818-25.

62. Bibb M.J., van Etten R.A., Wright K., Walberg M., Clayton D. Sequence and gene organization of mouse mitochondrial DNA. Cell. 1981, 26: 167-180.

63. Blaese R.M., Culver K.W., Miller A.D. T lymphocyte-directed gene therapy for ADA-SCID: initial trial results after 4 years. Science. 1995, 270: 475-480.

64. Bogenhagen D.F. Interaction of mtTFB and mtRNA polymerase at core promoters for transcription of Xenopus laevis mtDNA. J. Biol. Chem. 1996, 20: 12036-12041.

65. Bogenhagen D.F, Yoza B.K. Accurate in vitro transcription of Xenopus laevis mitochondrial DNA from two bidirectional promoters. Mol. Cell. Biol. 1986a, 7: 2543-50.

66. Bogenhagen D.F, Yoza B.K, Cairns S.S. Identification of initiation sites for transcription of Xenopus laevis mitochondrial DNA. J. Biol. Chem. 1986b, 18: 8488-8494.

67. Borst P, Grivell L.A. One gene's intron is another gene's exon. Nature. 1981, 5797: 439-440.

68. Boyko W.L., Ganschow R.E., Rapid identification of E.coli transformed by pBR322 carrying inserts at the PstI site. Anal. Biochem. 1982, 122: 85-88.

69. Bradley T.R., Metcaff D. The growth of mouse bone-marrow cells in vitro. Austr. J. Biol. Med. 1966, 44: 287-299.

70. Brackett B.G., Baranska W., Sawichi W., Koprowski H. Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and its transfer to ova trough fertilization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1971, 68: 353-357.

71. Brahms J.G, Dargouge O, Brahms S, Ohara Y, Vagner V. Activation and inhibition of transcription by supercoiling. J. Mol. Biol. 1985, 4: 455-465.

72. Brenner M.K., Krance R., Heslop H.E. Holliday M.S. Assesment of the efficacy of purging by using gene marked autologous marrow transplantation for children with AML in first complete remission. Hum. Gene Ther. 1994, 5: 481-499.

73. Bridges E., Petterson U. Nuclear organization of adenovirus DNA biogenesis. Experim.Cell Res. 1996, 229: 233-239.

74. Brinster R.L., Palmiter R.D. Introduction of genes into the germ line of animals. Harvey Lect. 1984, 80, 1-38.

75. Broach J.R, Strathern J.N, Hicks J.B. Transformation in yeast: development of a hybrid cloning vector and isolation of the CAN1 gene. Gene. 1979, 1: 121133.

76. BruggemannM. Human antibody expression in transgenic mice. Arch. Immunol. Ther. Exp., 2001, 49, 3: 203-208.

77. Bueler H. Adeno-associated viral vectors for gene transfer and gene therapy. Biol. Chem. 1999, 380: 613-622.

78. Burke D.T, Carle G.F, Olson M.V. Cloning of large segments of exogenous DNA into yeast by means of artificial chromosome vectors. Science. 1987, 4803: 806-812.

79. Burnette W.N. "Western blotting". Eletroforetic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiografic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal. Biochem. 1981, 112, 195-199.

80. Cabrera M., Chan P.J., Kalugdan Т.Н., King A. Transfection of the inner cell mass and lack of a unique DNA sequence affecting the uptake of exogenous DNA by sperm as shown by dideoxy sequancing analogues. J., Assist., Reprod., Genet. 1997, 14: 120-124.

81. Cai Q., Rubin J.Т., Lotze M.T. Genetocally marking human cells results of the first clinical gene transfer studies. Cancer Gene Ther. 1995, 2: 125-136.

82. Callen J.C, Tourte M, Deimebouy N, Mounolou J.C. Changes in D-loop frequency and superhelicity among the mitochondrial DNA molecules in relation to organelle biogenesis in oocytes of Xenopus laevis. Exp. Cell. Res. 1983, 1: 115-125.

83. Camaioni A., Russo M.A., Odorisio Т., Gandolfi F., Fazio V.M., Siracusa G. Uptake of exogenous DNA by mammalian spermatozoa specific localization of DNA on sperm heads. J. Reprod. Fertil. 1992. 96: 203-212.

84. Carrodeguas J.A, Yun S, Shadel G.S, Clayton D.A, Bogenhagen DF. Functional conservation of yeast mtTFB despite extensive sequence divergence. Gene Expr. 1996, 4:219-230.

85. Castora F.J, Kelly W.G. ATP inhibits nuclear and mitochondrial type I topoisomerases from human leukemia cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986, 6: 1680-1684.

86. Castora F J, Simpson M.V. Search for a DNA gyrase in mammalian mitochondria. J. Biol. Chem. 1979, 22: 11193-11195.

87. Cavazzana-Calvo M., Bagnis С., Mannoni P., Fisher A. Peripheral blood stem cell and gene therapy. Bui. Clin. Haemat. 1999, 1/2: 129- 138

88. Chan P.J. Sperm-mediated DNA transfer to cells of the uterus and embryo. Mol.Reprod.Develop. 2000, 56: 316-318.

89. Chan P. J., Seraj I.M., Kalugdan Т.Н., King A. Blastocyst exhibit preferential uptake of DNA fragments from the E6-E7 conserved region of the human papillomavirus. Gynecol. Oncol. 1995, 58: 194-197.

90. Chan P.J., Seraj I.M., Kalugdan Т.Н., King A. Evidance for ease of transmission of human papillomovirus DNA from sperm to cells of the uterus and embryo. J. Assist., Repro. Genet. 1996,13.: 516-519.

91. Chang A.C.Y., Lansman R.A., Clayton D.A., Cohen S.N. Studies of mouse mitochondrial DNA in E.coli; structure and function of the eucaryotic chimeric plasmids. Cell. 1975, 2: 231-236.

92. Chang D.D, Clayton D.A. Precise identification of individual promoters for transcription of each strand of human mitochondrial DNA. Cell. 1984, 3: 635643.

93. Chang D.D, Hixson J.E, Clayton D.A. Minor transcription initiation events indicate that both human mitochondrial promoters function bidirectionally. Mol. Cell. Biol. 1986, 1: 294-301.

94. Chang D.D, Clayton D.A. Identification of primary transcriptional start sites of mouse mitochondrial DNA: accurate in vitro initiation of both heavy- and light-strand transcripts. Mol. Cell. Biol. 1986, 5: 1446-1453

95. Chinnery P.F., Turnbull D.M. Mitochondrial DNA and disease. Lancet. 1999, 354, 1:117-21.

96. Chomyn A., Cleeter M.W., Ragan C.I., Riley M., Doolittle R.F., Attardi G. URF6, last unidentified reading frame of human mtDNA, codes for an NADH dehydrogenase subunit.Science. 1986, 234, 4776:614-8.

97. Christianson T, Rabinowitz M. Identification of multiple transcriptional initiation sites on the yeast mitochondrial genome by in vitro capping with guanylyltransferase. J. Biol. Chem. 1983, 22: 14025-14033.

98. Clarke L., Carbon J. Functional expression of cloned yeast DNA in Escherichia coli: specific complementation of argininosuccinate lyase (argH) mutations. J.Mol.Biol. 1978, 120, 4:517-32.

99. Clayton D.A. Replication of animal mitochondrial DNA.Cell. 1982, 28, 4:693-705.

100. Clayton D.A. Replication and transcription of vertebrate mitochondrial DNA.

101. Annu. Rev. Cell. Biol. 1991, 7: 453-478.

102. Clayton D.A., Vinograd J. Circular dimer and catenate forms of mitochondrial DNA in human leukaemic leucocynes. Nature. 1967, 210: 24769-24775.

103. Cline M.J., Stang H., Mercola K., Morse L., Ruprecht G., Browne J., Salser W. Gene transfer in intact animals. Nature. 1980, 284: 422-425.

104. Coffing J.M., Hughes S.H., Varmus H.E. (eds.). Retroviruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997.

105. Collombet J.-M., Wheeler V.C., Vogel F., Coutelle C. Introduction of plasmid DNA into isolated mitochondria by electroporation. J. Biol. Chem. 1997, 8: 5342-5347.

106. Conde J., Fink G.R. A mutant of Saccharomyces cerevisiae defective for ♦ nuclear fusion. Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1976, 73, 10:3651-5.

107. Conneally E., Bardy P., Eaves C.J. Rapid and efficiant selection of human hepatopoietic cells expressing muring heatstable antigen as an indicator of retroviralmediated gene transfer. Blood. 1996, 87: 456-464.

108. Cote J, Ruiz-Carrillo A. Primers for mitochondrial DNA replication generated by endonuclease G. Science. 1993, 5122: 765-769.

109. Cristou P., McCabe D.E., Martinell B.J., Swain W.F. Soybean genetic engeneering commercial production of transgenic plants. Trends Biotrchnol. 1990,8: 145-151.

110. Crystal R.G., Brantly M.L., Hubbard R.C. et al. The alpha-1-antitrypsin gene and its mutatins. Clinical cjnsequences and strategies for theory. Chest., 1989, 95, 1: 196-208.

111. Cudd A, Nicolau C. Interaction of intravenously injected liposomes with mouse liver mitochondria. A fluorescence and electron microscopy study. Biochim. Biophys. Acta. 1986, 2: 201-214.

112. Culver K.W. Gene therapy. A Handbook for Physiciance, Mary Ann Liebert Inc. Publishers, 1994.

113. Curgy J.J. The mitoribosomes. Biol. Cell. 1985, J: 1-38.

114. Curth U, Urbanke C, Greipel J, Gerberding H, Tiranti V, Zeviani M. Single-stranded-DNA-binding proteins from human mitochondria and Escherichia coli have analogous physicochemical properties. Eur. J. Biochem. 1994, J: 435-443.

115. Dairaghi DJ, Shadel GS, Clayton DA. Addition of a 29 residue carboxyl-terminal tail converts a simple HMG box-containing protein into a transcriptional activator. J. Mol. Biol. 1995, I : 11-28.

116. Davis B. Gel electrophoresis. Disc electrophoresis. Method and application to human serum proteins. Ann. N. Y., Acad. Sci. 1964, Hi, 404-427.

117. Davis A.F., Clayton D.A. In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells. J.Cell Biol. 1996, 135, 883-893.

118. Dauglas S., Zauner S., Fraunholtz M., Beaton M., Pering S., Deng L-T., Wu X., Reith M., Covalier-Smith Т., Maier U-G. The highly reduced genome of an enslaved algal nucleas. Nature, 2001, 410: 1091-1096.

119. DeFrancisco L., Attardi G. In situ photochemical crosslinking of HeLa cell mitochondrial DNA by a psoralen derivative reveals a protected region near the origin of replication. Nucleic Acids Res. 1981, 9, 22:6017-30.

120. DeMayo F.J., Tsai S.Y. Targeted gene regulation and gene ablation. Trends Endocrinol. Metab. 2001,12, 8: 348-353.

121. DeVico D.C.The expanding clinical spectrum of mitochondrial diseases. Brain Dev. 1993, 15: 1-22.

122. DeVries H., Kroon A.M. Biogenesis mitochondria: Transcription, transletion and genetic aspect, N.Y., 1974, pp/357-365.

123. De Zamaroczy M., Bernardi G. Sequence organization of the mitochondrial genome of yeast-a review. Gene. 1985, 37, 1-3:1-17.

124. Doda J.N., Wright C.T., Clayton D.A. Elongation of displacement-loop strands in human and mouse mitochondrial DNA is arrested near specific template sequences. Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1981, 78, 10:6116-20.

125. Doersen S., Guerrier-Takada C., Altman S., Attardi G. Characterization of an RnaseP activity from HeLa cell mitochondria. Comparison with the cytosol RnaseP activity. J. Biol. Chem. 1985, 10: 5942-5950.

126. Dubin D.T, Hsu Chen C.C. The З'-terminal region of mosquito mitochondrial small ribosomal subunit RNA: sequence and localization of methylated residues. Plasmid. 1983, 3: 307-320.

127. Duguet M, Lavenot C, Harper F, Mirambeau G, De Recondo AM. DNA topoisomerases from rat liver: physiological variations. Nucleic Acids Res. 1983,4 :1059-1075.

128. Epler J.L., Shugart L.R., Barue H.W. N-formylmethionyl transfer ribonucleic acid in mitochondria from neurospora. Biochemistry. 1970, 9: 3575-3579.

129. Esko J.D., Raetz C.R. Replica plating and in situ enzymatic assay of animal cell colonies established on filter paper Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978, 75: 1190-1193.

130. Fadic R., Johns D.R. Clinical spectrum of mitochondrial diseases. Seminars in Neurol. 1996, 16: 11-20.

131. Fairfield F.R, Bauer W.R, Simpson M.V. Mitochondria contain a distinct DNA topoisomerase. J. Biol. Chem. 1979, 19: 9352-9354.

132. Feagin J.E, Jasmer D.P, Stuart K. Apocytochrome b and other mitochondrial DNA sequences are differentially expressed during the life cycle of Trypanosoma brucei. Nucleic. Acids Res. 1985, 12: 4577-4596.

133. Feagin J.E, Stuart K. Differential expression of mitochondrial genes between life cycle stages of Trypanosoma brucei. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985, 10: 3380-3384.

134. Feigner J.H., Kumar R., Sridhar C.N. Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations. J. Biol. Chem. 1994, 269: 2556- 2561.

135. Fisher R.P, Lisowsky T, Breen G.A, Clayton D.A. A rapid, efficient method for purifying DNA-binding proteins. Denaturation-renaturation chromatography of human and yeast mitochondrial extracts. J. Biol. Chem. 1991, 14:153-60.

136. Fisher R.P, Topper J.N, Clayton D.A. Promoter selection in humanmitochondria involves binding of a transcription factor to orientation-independent upstream regulatory elements. Cell. 1987, 2: 247-258.

137. Fitzpatric-McElliott S. Gene transfer to tumor-infiltrating lympocytes and other mammalian somatic cells by micro-particle bombardment. Bio.Technology. 1992, 10: 1036-1040.

138. Fouillard L. Physical method for gene transfer: an alternative to viruses. Hematol. Cell. Ther. 1996, 38: 214-216.

139. Francolini M., Lavitrano M., Lamia C.L., French D., Frati L., Cotelli F., Spadafora C. Evidence for nuclear internalization of exogenous DNA into mammalian sperm cells. Mol. Reprod. Dev. 1993, 34: 133-139.

140. Fujii H., Shimada Т., Goto Y., Okazaki T. Cloning of the mitochondrial genome of Rana catesbeiana and the nucleotide sequences of the ND2 and fiveл tRNA genes. J.Biochem (Tokyo). 1988, 103, 3:474-81.

141. Fukamachi S, Bartoov B, Freeman K.B. Synthesis of ribonucleic acid by isolated rat liver mitochondria. Biochem. J. 1972, 2: 299-309

142. Gadaleta M.N, Greco M, Del Prete G, Saccone C. On the effect of inhibitors of transcription and translation on RNA and protein synthesis by isolated rat liver mitochondria.Arch. Biochem. Biophys. 1976, 1: 238-245.

143. Gandolfi F. Sperm mediated transgenesis. Theriogenology. 2000, 53: 127137.

144. Gannon M. Molecular genetic analysis of diabetes in mice. Trends Genet., 2001, 17, 10: S23-28.

145. Gellefors P., Nelson B.D. Biogenesis of the cytochrome bcl complex in isolated rat hepatocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981, 99: 170-175.

146. Gene therapy protocols. Ed. Robins P.D. Totowa; New Jercey. Humana Press INC. 1997,403р.

147. Gerbaud C, Fournier P, Blanc H, Aigle M, Heslot H, Guerineau M. High frequency of yeast transformation by plasmids carrying part or entire 2-micron yeast plasmid. Gene. 1979, 3: 233-253.

148. Geuskens M, Hardt N, Pedrali-Noy G, Spadari S. An autoradiographic demonstration of nuclear DNA replication by DNA polymerase alpha and of mitochondrial DNA synthesis by DNA polymerase gamma. Nucleic. Acids Res. 1981, 7: 1599-1613.

149. Giles R.E., Blanc H., Cann H.M., Wallace D.C. Maternal inheritance of human mitochondrial DNA. Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1980, 77, 11:6715-9.

150. Glikin G.C, Blangy D. In vitro transcription by Xenopus oocytes RNA polymerase III requires a DNA topoisomerase II activity. EMBO J. 1986, \ : 151-155.

151. Goebel W. Replication of the DNA of the colicenogenic factor El (ColEl) at the restrictive temperature in a DNA replication mutant thermosensitive for DNA polymerase III. Nature New Biol. 1972, 72: 67-76.

152. Gorman J.A., Dove W.F., Warren N. Isolation of Physarum DNA segments that support autonomous replication in yeast. Mol.Gen.Genet. 1981, 183, 2:306-13.

153. Graham F.L. Adenoviraus vectors for gene expression and gene therapy. Transfus Sci. 1996, 17: 15-27.

154. Greenberg B.D., Newbold J.E., Sugino A. Intraspeciflc nucleotide sequence variability surrounding the origin of replication in human mitochondrial DNA. Gene. 1983,21, 1-2:33-49.

155. Grohmann K., Amairic F., Crews S., Attardi G. Failure to detect "cap" structures in mitochondrial DNA-coded poly(A)-containing RNA from HeLa cells. Nucleic Acids Res. 1978, 5, 3:637-51.

156. Gruenbaum F., Revel E., Yarns S., Fainsod A. Sperm cells as vectors for the generation of transgenic chickens. J. Cell. Bochen. 1991, (Suppl.15): E., 194.

157. Gugneja S., Vibasius C.M., Scurpula R.C. Nuclear respiratory factors 1 and 2 utilize similar glutamine-containing clusters of hydrophobyc residues to activate transcription. Mol. Cell. Biol. 1996,16: 5708-5716.

158. Habrova V., Takae M., Navratil J., Macha J., Ceskova N., Jonak J. Association of Rous sarcoma virus DNA with Xenopus laevis spermatozoa and its transfer to ova through fertilization. Mol. Reprod. Dev. 1996,44: 332-342

159. Haima P, Bron S, Venema G. The effect of restriction on shotgun cloning and plasmid stability in Bacillus subtilis Marburg. Mol. Gen. Genet. 1987, 2: 335342.

160. Haima P, Bron S, Venema G. Novel plasmid marker rescue transformation system for molecular cloning in Bacillus subtilis enabling direct selection of recombinants. Mol. Gen. Genet. 1990,2: 185-191.

161. Hakem R., Мак TW. Animal models of tumor-supressor genes. Annu Rev Genet., 2001, 35: 209-241.

162. Halene S., Kohn D. Gene therapy using hematopoietic Stem Cells: Sisyphus approaches the crest. Hum. Gene Ther. 2000, Ц: 1259-1267.

163. Hall R.M., Nagley P., Linnane A.W. Biogenesis of mitochondria. XLII. Genetic analysis of the control of cellular mitochondrial DNA levels in Saccharomyces cerevisiae. Mol.Gen.Genet. 1976, 145. 2:169-75.

164. Hanenberg H., Xiao X.L., Dilloo D., Hashino K., Kato I., Williams D.A. Colocalization of retrovirus and target cells on specific fibronectin fragments increases genetic transduction on mammalian cells. Nature Me. 1996, 2: 876882.

165. Hatefi Y. The mitochondrial electron transport and oxidative phosporylation system. Annu. Rev. Biochem. 1985, 54: 1015-1069.

166. Hauzen H., Villiers G.-M. Human papillomaviruses. Ann. Rev. Microbiol., 1991,48: 427-447.

167. Hayashi J.I., Yonekawa H., Gotoh O., Watanabe J., Tagashira Y. Strictly maternal inheritance of rat mitochondrial DNA. Biochem.Biophys.Res.Commun. 1978, 83, 3:1032-8.

168. Hehman G.L, Hauswirth W.W. DNA helicase from mammalian mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992, 18: 8562-8566.

169. Helinski D.P., Clewell D.B. Circular DNA. Ann. Rev. Bochem. 40: 855-934.

170. Herman E.H., Jordan W., Ardalan В., Zaharko D.S., Bolten B.J., Cooney D.A. Toxicologic effects of a high dose of thymidine in mice.

171. Toxicol.Appl.Pharmacol. 1980, 56, 3:443-446.

172. Herrlich P., Ponta H., Richter D., Pfennig-Yeh M., Hirsch-Kauffmann M., Schweiger M. Gene expression in mitochondria and bacteria. Mol.Cell.Biochem. 1977, 14, 1-3:143-9.

173. Hinnen A, Hicks J.B, Fink G.R. Transformation of yeast Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978,4: 1929-1933.

174. Hiraoka J., Hirao Y. Fate of sperm tail components after incorporation into the hamster egg. Gamete Res. 1988, 19, 4:369-80.

175. Hirt B. Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures. J. Mol. Biol. 1967, 26: 365-369.

176. Hixson J.E, Clayton D.A. Initiation of transcription from each of the two human mitochondrial promoters requires unique nucleotides at the transcriptional start sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985, 9: 2660-2664.

177. Hochi S., Ninomiya Т., Mizuno A., Honma M., Yuki A. Fate of exogenous DNA carrid into mouse eggs by spermatozoa. Anim. Biotech. 1990, 1:21-31.

178. Hodgson C.P. (ed.) Retroviral vectors for human therapy. Berlin, Heidelberg, 1996.

179. Holt I.J., Harding A.E., Petty R.K., Morgan-Hughes J.A. A new mitochondrial diseases associated with mitochondrial DNA heteroplasmy. Am. J. Hum. Genet. 1990, 46: 428-433.

180. Holt W.F. Membrane heterogenecity in the mammalian spermatozoon. Int. Rev. Cytol. 1984,87: 159-177

181. Hsiao C.L., Carbon J. Direct selection procedure for the isolation of functional centromeric DNA. Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1981, 78, 6:3760-4.

182. Hutchin Т., Cortopassi G. A mitochondrial DNA clone is associated with increased rise for Alzheimer disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995, 92: 6892-6895

183. Hutton M., Lewis J., Dickson D., Yen SH., McGowan E. Analysis of taupathies with transgenic mice. Trends Mol., Med. 2001,7, 10: 467-470.

184. Jang S.H, Jaehning J.A. The yeast mitochondrial RNA polymerase specificity l factor, MTF1, is similar to bacterial sigma factors. J. Biol. Chem. 1991, 33:22671-22677.

185. Janniere L, Bruand C, Ehrlich SD. Structurally stable Bacillus subtilis cloning vectors. Gene. 1990,1:53-61.

186. Johnston S.A. Biolistic transformation: microbe to mice. Nature. 1990, 346: 776-777.

187. Kaneda H., Hayashi J., Takahama S., Taya C., Lindahl K.F., Yonekawa H. Elimination of paternal mitochondrial DNA in intraspecific crosses during early mouse embryogenesis. Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1995, 92, 10:4542-6.

188. Kantoff P.W., Gillio A.P., McLachlin J.R. et al. Expression of human adenosine deaminase in nonhuman primates after retrovirus-mediated gene transfer. J. Exp. Med. 1987, 166: 219-234.

189. Kaplit G.M., Loewy D.F. (eds.) Viral vectors: gene therapy and neuroscience * applications. New York, 1995.

190. Karlsson S. Gene therapy of haematopoietic cells. J. Intern. Med. Suppl. 1997, 740: 95-99.

191. Kazakova T.B., Babich S.G., Mel nikova M.P., Tzymbalenko N.V., Braga E.A., Nosikov V.V. Physical and functional mapping of rat mitochondrial DNA. Mol. Cell. Biochem. 1980, 35: 39-47.5

192. Kazakova T.B., Mel nikova M.P., Sverdlov E.D. The character of protein-nucleic interaction in relation to the mtDNA-membrane complex. Mol. Cell. Biochem. 1977, 1: 37-45.

193. Kearsey S., Craig I. Altered ribosomal RNA genes in mitochondris from mammalian cells with chloramphenicol resistance. Nature/ 1981, 290: 607608.

194. Kelley W.S., Mapping of the polA locus of Escherichia coli K-12: genetic fine structure of the cistron. Genetics. 1980, I: 15-22.

195. Khoo H.W., Ang L.H. Lim H.B. Wong K.Y. Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into zebra fish. Aquaculture. 1992, 109: 1-19.

196. Kiem H.P. Andrews R.G., Morris J., Peterson L., Heyward S., Allen J.M., Rasko J.E., Potter J., Miller A.D. Improved gene transfer into babbon marrow repopulating cells using recombinant human fibronectin fragment CH-296 in

197. N combination with interleukin-6, stem cell factor, FLT-3 ligand, andmegakaryocyte growth and development factor. Blood. 1998, 92: 1878-1886.

198. Kikuno R., Miyata Т. Sequence homologies among mitochondrial DNA-coded URF2, URF4 and URF5. FEBS Lett. 1985, 189,1:85-8.

199. Kirby S.L. The therapeutic potential of erytropoetin receptor transgenes. Cytokiness Cell. Mol. Ther. 1999, 5: 97-105.

200. Klein T.M., Arentzen R., Lewis P.A., Fitzpatric-McEllion S. Transformation of microbes, plants and animals by particle bombardment. Bio/Technology. 1992,10: 286-291.

201. Klein T.M., Wolf E.D., Wu R., Sanford J.C. High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Ibit. 1987, 327: 70-73.

202. Klimatcheva E., Rosenblatt J.D., Planelles V. Lentiviral vectors and gene therapy. Front. Biosci. 1999, 4: D481-D496.

203. Kobayashi M., Koike K. Construction and analysis of recombinant lambdaphages containing mitochondrial DNA fragments. Gene. 1979, 2: 123-131.

204. Kobayashi M., Seki Т., Yaginuma K., Koike K. Nucleotide sequences of small ribosomal RNA and adjacent transfer RNA genes in rat mitochondrial DNA. Gene. 1981,16, 1-3:297-307.

205. Kobayashi M., Yaginuma K., Seki Т., Roike K. Organization and expression mitochondrial genome. Amsterdam, 1980, p.221-229.

206. Kohn D.B., Nolta J.A., Crooks J.A., Clinical trials of gene therapy using hematopoietic cells. In Hematopoietic Cell Transplantation, 2nd Ed. S.G. Forman, K.G.Blume, E.D. Thomas, eds. Blackwell Scientific Publications, Boston MA 1998.

207. Koike К., Kobayashi M., Yaganuma К., Taira M., Yoshida E., Imai M. Nucleotide sequence and evolution of the rat mitochondrial cytochrom b gene containing the ochre termination codon. Gene. 1982, 2: 177-185.

208. Kolb K.H., Jaehicke G., Kramer M., Schulz P.E. Absorption, distribution, and elimination of labeled dimethyl sulfoxide in man and animals. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1967, 141, 85-95.

209. Kosovsky M.J., Soslau G. Mitochondrial DNA topoisomerase I from human platelets. Biochim.Biophys.Acta. 1991,1:56-62.

210. Kroll K.L. Amaya E. Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.

211. Development. 1996,122: 3173-3183.

212. Kroon A.M., de Vos W.M., Bakker H. The heterogeneity of rat-liver mitochondrial DNA. Biochim.Biophys.Acta. 1978, 519, 1:269-73.

213. Kuntzel H, Kochel HG. Evolution of rRNA and origin of mitochondria. Nature. 1981,5835: 751-755.

214. Lavitrano M., Camaioni A., Fazio V.M., Dolchi S., Farace M.G. Spadafora C. Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs: genetic transformation of mice.Cell. 1989, 57:717-723.

215. Lavitrano M., French D., Zani M., Frati L., Spadafora C. The interactionbetween exogenous DNA and sperm cells. Mol. Reprod. Dev. 1992, 31: 161169.

216. Lavitrano M., Maione В., ForteE., Francolini M., Sperandio S., Testi R., Spadafora C. The interaction of sperm cells with exogenous DNA a role of cd4 and major histocompatibility complex class ii molecules. Exp.Cell.Res. 1997, 233: 56-62.

217. Lavitrano M., Stoppacciaro A., Bacci M.L. Forni M., Fioretti D., Pucci L., Di S.C., Lazzereschi E., Rughetti A., Ceretta S., Zannoni A., Rahimi H., Moioli В., Rossi M., Nuti M., Rossi G., Seren E., Alfani D., Cortesini R., Frati L.

218. Human decay accelerating factor transgenic pigs for xenotransplantation obtained by sperm-mediated gene transfer. Transpl.Proc. 1999, 31: 972-974.

219. Lawrence J.W, Claire D.C, Weissig V, Rowe T.C. Delayed cytotoxicity and cleavage of mitochondrial DNA in ciprofloxacin-treated mammalian cells. Mol. Pharmacol. 1996, 5:1178-1188.

220. Lee L.S., Cheng Y.C. Human deoxythymidine kinase. I. Purification and general properties of the cytoplasmic and mitochondrial isozymes derived from blast cells of acute myelocytic leukemia. J.Biol.Chem. 1976, 9: 2600-2604.

221. Lee D.Y, Clayton D.A. RNase mitochondrial RNA processing correctly cleaves a novel R loop at the mitochondrial DNA leading-strand origin of replication. Genes Dev. 1997, Ц:582-592.

222. Leonard J. V., Schapira H.M. Mitochondrial respiratory chain disorders : mitochondrial DNA defects. Lancet. 2000, 355: 299-304.

223. Leppard K.N. E4 gene function in adenovirus, adenovirus vector and adeno-associated virus infections. J. Gen. Virol. 1997, 78: 2131-2138.

224. Lestienne P. Evidence for a direct role of the DNA polymerase gamma in the replication of the human mitochondrial DNA in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987, 146:.l 146-1153.

225. Levy S.E., Waymire K.G., Kim Y.L., MacGregor G. R., Wallace D.C. Transfer of chloramphenicol-resistant mitochondrial DNA into the chimeric mouse. Transgen Res. 1999,8: 137-145.

226. Liu F., Qi H., Huang., Cho H., Factors controlling the efficiency of cationic lipid-mediated transfection in vivo via intravenous administration. Gene Ther. 1997, 4: 517-523.

227. Look D.C., Brody S.L. Engeneering viral vectors to subvert the airway defense response. Am. J. Cell Mol. Biol. 1999, 20: 1103-1106.

228. Lothrop C.D.J. al-Lebban Z.S., Niemeyer G.P. et al. Expression of a foreign gene in cats reconstituted with retroviral vector infected autologous bone marrow. Blood. 1991, 78: 237-245.

229. Loyter A., Scangos J. A., Ruddle F.H. Mechanisms of DNA uptake by mammalian cells: fate of exogenously added DNA monitored by use of fluorescent dyes. Proc. Natl., Acad Sci. USA. 1982, 79: 422-426.

230. Maione В., Lavitrano M., Spadafora C.,Kiessling A.A. Sperm-mediated gene transfer in mice. Mol. Reprod. Dev. 1998, 50: 406-409.

231. Maione В., Pittoggi С., Achee L., Lorenzini R., Spadafora C. Activation of endogeous nucleases in mature sperm cells upon interaction with exogenous DNA. DNA Cell. Biol. 1997, 16: 1087-1097.

232. Manfredi G., Thyagarajan D., Papadopoulou L.C., Pallotti F., Schon E.A. The fate of human sperm-derived mtDNA in somatic cells. Am.J.Hum.Genet. 1997, 61,4:953-60.

233. Marchington D.R., Barlow D., Poulton J. Transmitochondrial mice earring resistance to chloramphenicol on mitochondrial DNA: Developing the first mouse model of mitochondrial DNA disease. Nature Medicine. 1999, 8: 957960.

234. Madsen C.S, Ghivizzani S.C, Hauswirth W.W. Protein binding to a single termination-associated sequence in the mitochondrial DNA D-loop region. Mol. Cell. Biol. 1993, 4: 2162-2171.

235. Mann R, Mulligan R.C, Baltimore D. Construction of a retrovirus packaging mutant and its use to produce helper-free defective retrovirus. Cell. 1983, 1: 153-159.

236. Mason T.L., Schatz G. Cytochrome с oxidase from bakers' yeast. II. Site of translation of the protein components. J.Biol.Chem. 1973, 248, 4:1355-60.

237. Matson S.W, Kaiser-Rogers K.A. DNA helicases. Annu. Rev. Biochem. 1990, 59:289-329.

238. Matthews D.E, Hessler R.A, Denslow N.D, Edwards J.S, O'Brien T.W. Protein composition of the bovine mitochondrial ribosome. J. Biol. Chem. 1982,15: 8788-8794.

239. Matthews K.E., Dev S.B., Toneguzzo F. Electroporation for gene therapy. Methods Mol. Biol. 1995, 48: 273-280.

240. McCreath, K.J., Howcroft, J., Campbell, K.H.S., Colman, A., Schnicke, A.E., Kind, A J. Production of gene-targeted shepp by nuclear transfer from cultured somatic cells. Nature, 2000, 405: 1066-1069.

241. Menalled LB, Chesselet MF. Mouse models of Huntington,s disease. Trends Pharmacol. Sci. 2002, 23, 1: 32-39.

242. Mialhe E., Miller L.H. Biolistic techniques for transfection of Mosquito Embryos (Anopheles gambiae). BioTechniques. 1994,16: 924-931.

243. Michaels G.S., Hauswirth W.W., Laipis P.J. Mitochondrial DNA copy number in bovine oocytes and somatic cells. Dev. Biol. 1982, 94, 1:246-51.

244. Miller A.D. Human gene therapy comes of age. Nature. 1992, 357: 455-460.

245. Miller A.D. Retroviral vectors. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1992(a), 158: 1-24.

246. Miller D.L., Andreone T.L., Donelson J.E. Translation in E.coli mini-cells containing hamster mitochondrial DNA-ColEI, Amp recombinant plasmids. Biochem. Biophys. Acta. 1977, 4: 323-329.

247. Milne C.P.,Elchen F.A., Collis J.E., Jensen T.L. Preliminary evidence for honeybee sperm mediated DNA transfer. International Symposium on Molecular Insect Science, Tucson, Arizona. 1989, 120-125.

248. Monnerot M., Mounolou J.C., Solignac M. Intra-individual length heterogeneity of Rana esculenta mitochondrial DNA. Biol. Cell. 1984, 3: 213218.

249. Montaya J., Christianson Т., Levens D., Rabinowitz M., Attardi G. Identification of initiation sites for heave-strand and light-strand transcriotion in human mitochondrial DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982, 79: 71957199.

250. Moritz C., Brown W.M. Tandem duplication of D-loop and ribosomal RNA sequences in lizard mitochondrial DNA. Science. 1986, 233, 4771:1425-7.

251. Mulligan R.C. The basic science of gene therapy. Science. 1993, 260: 926932.

252. Mulligan R.C., Berg P. Simian Virus 40 mediated expression of a bacterial gene in mammalian cells. Science. 1980, 5627: 1422-1427.

253. Mulligan R.C, Berg P. Factors governing the expression of a bacterial gene in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 1981a, 5: 449-459.

254. Mulligan R.C., Berg P. Selection for animal cells that express the Escherichia coli gene coding for xanthine guanine phosphorybozyl-transferase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981b, 78: 2072-2076.

255. Munyon W., Buechbaum R., Puoletti E. Electrophoresis of thymidin kinase activity sunthesized by cells transformed by Herpes Simplex Virus. Virology. 1972,3: 683-689.

256. Muramatsu Т., Mirutano Y., Ohmori Y., Okumura J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in vitro. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1997, 230: 376-380/

257. Murphy W.I., Attardi В., Tu C., Attardi G. Evidence for complete symmetrical yranscription in vivo of mitochondrial DNA in HeLa cells. J. Mol. Biol. 1975,99: 809-814.

258. Murray A.W, Szostak J.W. Construction of artificial chromosomes in yeast. Nature. 1983. 5931: 189-193.

259. Nabel C.J., Hobart P. Meeting report: Keystone Symposia on molecular and cellular niology of gene therapy and synthetic non-viral gene delivery systems.

260. Biochem. Biophys. Acvta. 1998, 1378: R19-R26.

261. Nakanishi A., Iritani A. Gene transfer in the chicken by sperm-mediated methods. Mol. Reprod. Dev. 1993, 36: 258-261.

262. Neering s. J., Hardy S.F., Minamoto D. Transduction of primitiv human hematopoietic cells with recombinant adenovirus vectors. Blood. 1996, 88: 1147-1155.

263. Nierlich D.P. Fragmentary 5S rRNA gene in the human mitochondrial genome. Mol. Cell. Biol. 1982, 2: 207-209.

264. Ogawa M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 1993, 81: 2844-2853.

265. Ojala D., Crews S., Montoya J., Gelfand R., Attardi G. A small polyadenylated RNA (7 S RNA), containing a putative ribosome attachment site, maps near the origin of human mitochondrial DNA replication.

266. J.Mol.Biol. 1981a, 150,2:303-14.

267. Ojala D., Montoya J., Attardi G. tRNA punctuation model of RNA processing in human mitochondria. Nature. 1981b, 290, 5806:470-4.

268. Olson M.W, Wang Y, Elder R.H, Kaguni L.S. Subunit structure of mitochondrial DNA polymerase from Drosophila embryos. Physical and immunological studies. J. Biol. Chem. 1995, 48: 28932-28937.

269. Olszewska E., Tait A. Mitochondrial chromatin in Paramecium aurelia. Mol.Gen.Genet. 1980,178, 2:453-7.

270. Orlic D., Bodine D.M. What defines a pluripotent hematopoietic stem cell (PHSC): Will the PHSC please stand up! Blood. 1994, 84: 3991-3994.

271. Pacey A.A., Hill C.J., Scudomore I.W., Warren M.A., Barratt C.L.R, Cooke I.D. The interaction in vitro of human spermatozoa with epithelial cells from the human uterine (fallopian) tube. Hum. Reprod. 1996, 10: 360-366.

272. Palevsky P.M., McEntee C.M., Cantwell R., Cox M., Hudson A.P. Molecular characterization of the Bufo marinus mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 1988, 16,4:1622.

273. Palmiter R.D., rinster R.L. Germ line transformation of mice. Annu. Rev. Genet. 1986, 20,465- 499.

274. Patil J.G., Khoo H.W. Nuclear internalization of foreign DNA by zebra fish spermatozoa and its enhancement by electroporation. J. Exp., Zool. 1996, 274: 121-129.

275. Pawlink R., Eaves C.J., Humphries R.K. Sustained high-level reconstitution of the hematopoietic system by precelekted hematopoietic cells expressing a transduced cellsueface antigen. Hum. Gene Ther. 1997, 8: 1595-1604.

276. Pavco P.A., Van Tuyle G.C. Purification and general properties of the DNA-binding protein (PI6) from rat liver mitochondria. J.Cell.Biol. 1985, 100, 1:258-64.

277. Perlino E., Contese R., Ciliberto G. The human a-1-antitrypsin gene is transcribed from two different promters in macrophages and hepatocytes. EMBO J., 1987, 6, 2767-2771.

278. Perlmutter D.H., Cole F.S., Kilbridge P. et al. Expression of the a-1-proteinase inhibitor gene in human monocytes and macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985, 82, 795-799.

279. Perlmutter D.H., Daniels J.D., Auerbach H.S. et al. The a-1-antitrypsin gene is expressed in a human intestinal epithelial cell line. J. Biol. Chem. 1989, 264, 16: 9485-9490.

280. Perry A., Wakayama Т., Kishikawa H., Kasai Т., Okabe M., Toyoda Y., Yanagimachi R. Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection. Science. 1999, Ш- 1180-1183.

281. Pico L., Matsumoto L. Number of mitochondria and some properties of motochondrial DNA in the mouse egg. Dev.Bil. 1976, 49: 1-10.

282. Potter D.A., Fostel J.M., Berninger M., Pardue M.L., Cech T.R. DNA-protein interactions in the Drosophila melanogaster mitochondrial genome as deduced from trimethylpsoralen crosslinking patterns. Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1980, 77, 7:4118-22.

283. Prince D.L., Kotin R.M., Dubin D.T. Evidence that the methylation inhibitor cycloleucine causes accumulation of a discrete ribosomal RNA precursor in hamster mitochondria. Mol.Biol.Rep. 1986,11, 1:51-5.

284. Pusyriov A.T., Mazo A.M., Minchenko A.G., Ardonina T.A., Transcriptional mapping of the rat liver mitochondrial genome, Gene, 1983, 24, 1: 115-124.

285. Radloff R., Bauer W., Vinograd J. A Dye-buoyant-density method for the detection and isolation of closed circular duplex DNA: the closed circular DNA in HeLa cells. Proc. Natl., Acad. Sci. USA. 1967, 5: 1514- 1518.

286. Rana M., de Coo I., Diaz F., Smeets H., Moraes C.T. An out-of-frame cytochrom b gene deletion from a patient with parkinsonism in assotiated with impeired complex III assembly and an increase in free radical production. Ann. Neurol. 2000, 48: 774-781.

287. Rill D.R., Moen R.C., Buschle M., Holliday M., Heslop H.E. An approach for the analysis of relapse and marrow reconstitution after autologous marrow transplantation using retrovirus-mediated gene transfer. Blood. 1992, 79: 26942700.

288. Roberti M, Musicco C, Polosa P.L, Gadaleta M.N, Cantatore P. DNA-helicase activity from sea urchin mitochondria. Biochem Biophys Res Commun. 1996,1: 134-139.

289. Roberti M., Musicco C., Polosa P.L., Milella F., Gadaleta M.N., Cantatore P. Multiple protein-binding sites in the TAS-region of human and rat mitochondrial DNA. Biochem. Biophys.Res.Commun. 1998, 243, 1:36-40.

290. Robertson E.S., Ooka Т., Kieff E.D. Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to В lymphocytes. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1996, 93: 1133411340.

291. Robin E.D., Wong R. Mitochondrial DNA molecules and virtual number of mitochondria per cell in mammalian cells. J.Cell Physiol. 1988, 136, 3: 507-13.

292. Roe B.A., Ma D.P., Wilson R.K., Wong J.F. The nucleotide sequence of the Xenopus laevis mitochondrial genome. J.Biol.Chem. 1985. 260, 17: 9759-74.

293. Roizman B.The functions of herpes simplex virus genes: a primer for genetic engeneering of novel vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996, 95: 1130711312.

294. Rose M.D, Novick P, Thomas J.H, Botstein D, Fink G.R. A Saccharomyces cerevisiae genomic plasmid bank based on a centromere-containing shuttle vector. Gene. 1987, 2-3: 237-243.

295. Rosenberg S.A., Aebersold P., Cornetta K. Gene transfer into humans -immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. New Engl. J. Med. 1990, 323: 570-578.

296. Ruggieri L., Aiuti A., Salomoni M. et al. Cell-surface marking of CD(34+)-restricted phenotypes of human hematopoietic progenitor cells by retro virus-mediated gene transfer. Hum. Gene Ther. 1997, 8: 1611-1623.

297. Russell W.C. Update on adenovirus and its vectors. J. Gen. Virol. 2000, 81: 2573-2604.

298. Ryan K.R, Jensen R.E. Protein translocation across mitochondrial membranes: what a long, strange trip it is. Cell. 1995, 4: 517-519.

299. Saccone C., De Benedetto C., Godaleta G.Mitochondrial genes. Cold Spring Harbor, N.Y. 1982, p.121-129.

300. Sambrook J., Fritch E.F., Maniatis Т., Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Lab., 1989, Vol. 1,2,3.

301. Sanford J.C. The biolistic process. Trends in Bio Technology. 1988, 6: 299302.

302. Saraste M. Oxidative phosporylation at the fin de siecle. Science, 1999, 283: 1488-1493.

303. Schapira A.H.V., Cooper J.M., Dexter D., Clark J.B., Jenner P., Marsolen C.D. Mitochondrial complex I deficiency in Parkinson s disease. J. Neurochem. 1990, 54: 823-827.

304. Schellander K., Peli J., Schmoll F., Brem G. Artificial insemination in cattle with DNA-treated sperm. Anim Biotech. 1995, 6: 41-50.

305. Sherberg N.H., Refetoff S. RNA-DNA hybridisation. Nature New Biol. 1973, , I: 142-143.

306. Schnierle B.S., Groner B. Retroviral targeted delivery. Gene therapy. 1996, 3: 1069-1073.

307. Schon E.A., Bonilla E., DiMauro S. Mitochondrial DNA mutations and pathogenesis. J. Bioenerg. Biomembr.l997, 29: 131-149.

308. Scovassi A.I, Wicker R, Bertazzoni U. A phylogenetic study on vertebrate mitochondrial DNA polymerase. Eur. J. Biochem. 1979, 15:491-496.

309. Seibel P, Trappe J, Villani G, Klopstock T, Papa S, Reichmann H. i Transfection of mitochondria: strategy towards a gene therapy ofmitochondrial DNA diseases. Nucleic Acids Res. 1995, J: 10-17.

310. Sevaljevic L., Petrovic L.S., Rickwood D. Isolation and partial characterization of a mitochondrial deoxyribonucleic acid-protein complex from sea urchin embryos. Mol.Cell.Biochem. 1978, 21, 3:139-43.

311. Shadel G.S, Clayton D.A. Mitochondrial transcription initiation. Variation and conservation. J. Biol. Chem. 1993, 22: 16083-16086.

312. Shadel G.S, Clayton D.A. Mitochondrial DNA maintenance in vertebrates. Annu. Rev. Biochem. 1997, 66: 409-35.

313. Shibata D., Fu Y.S., Gupta J.W., Shan K.V. ArnheimN., Martin W.J. Detection of human papilloma virus in normal and dysplastic tissue by the polymerase chain reaction. Lab. Invest. 1988, 59: 555-559.

314. Shoffner J.M., Wallace D.C. Oxidative phosphorylation diseases. Adv. Hum. Genet. 1990,19: 267-330.

315. Shuster R.C., Rubenstein A.J., Wallace D.C. Mitochondrial DNA in anucleate human blood cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 1988, 155. 3:1360-5.

316. Siefers R.N., Carlson J.A., Clift S.N. Tissue specific expression of the human a-1-antitrypsin gene in transgenic mice. Nucl. Acids Res. 1984,15, 1459-1475.

317. Sin F.Y.T., Bartley A.I., Walker S.P., Sin I.L. Symonds J.E., Hawke L., Hopkins C.L. Gene transfer in chinook salmon (Oncorhynchus tsawytscha) by electroporation sperm in presence of pRSV-lacZ DNA. Aquacultare. 1993, 117:57-69.

318. Sinn P.L., Sigmund C.D. Transgenic models as tools for studying the regulation of human renin expression. Regul. Peptides. 2000, 86> 77-82.

319. Smeitink J., Heuvel L., Di Mauro S. The genetics and pathology of oxidative phosporylation. Nature Rev. Genet. 2001, 5: 342-352.

320. Southern S.O, Southern P.J, Dizon A.E. Molecular characterization of a cloned dolphin mitochondrial genome. J Mol Evol. 1988 Dec-1989 Feb;28(l-2):32-42.

321. Spadafora C. Sperm cells and foreign DNA: a controversial relation. Bioessays. 1998, 20: 955-964.

322. Spandidos D.A., Harrison P.R., Paul J. Replication and amplification of recombinant plasmid molecules as extrachromosomal elements in transformed mammalian cells. Exp.Cell Res. 1982,1: 149-159.

323. Stead R.B., Kwok W.W., Storb R. et al. Canine model for gene therapy: inefficient gene expression in dogs reconstituted with aautologous marrow infected with retroviral vectors. Blood. 1988, 71: 742-747.

324. Stenlund A. Papillomavirus DNA replication. In: "DNA replication in eucaryotic cells", Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1991, pp.679-697.

325. Struhl K, Stinchcomb D.T, Scherer S, Davis R.W. High-frequency transformation of yeast: autonomous replication of hybrid DNA molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979, 3: 1035-1039.

326. Subramani S., Southern P.J. Analysis of gene expression using simian virus 40 vectors. Anal. Biochem. 1983,135: Ы5.

327. Sutovsky P., Navara C.S., Schatten G. Fate of the sperm mitochondria, and the incorporation, conversion, anddisassembly of the sperm tail structuresi during bovine fertilization. Biol.Reprod. 1996, 55, 6:1195-205.

328. Sutovsky P., Navara C.S., Schatten G. Ubiquitin tag for sperm mitochondria. Nature. 1999, 402:371-372.

329. Szostak J.W, Blackburn E.H. Cloning yeast telomeres on linear plasmid vectors. Cell. 1982,1: 245-255.

330. Szybalska E.H., Szybalski W. Genetics of human cell lines IV. DNA-mediated heritable transformation of a biochemical trait. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1962,48,2026-2034.

331. Taanman J.-W. The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication. Biochem. Biophys. Acta. 1999, 1410:103-123.

332. Tabak H.F, Grivell L.A, Borst P. Transcription of mitochondrial DNA. CRC Crit. Rev. Biochem. 1983, 4: 297-317.

333. Tanaka S, Koike K. DNA polymerase-gamma is localized in mitochondria.

334. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1978, 3: 791-797.

335. Tarrago-Litvak L., Viratelle O., Darriet D., Dalibart R., Graves P.V., Litvak S. The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells byintercalating drugs. Nucleic Acids Res. 1978, 5, 6:2197-210.

336. Tebbutt S.J. Technology evolution: transgenic alpha-1-antitrypsin (AAT), PPL therapeutics. Curr. Opin. Mol. Ther., 2000, 2, 2: 199-204.

337. Tiranti V, Rocchi M, DiDonato S, Zeviani M. Cloning of human and rat cDNAs encoding the mitochondrial single-stranded DNA-binding protein (SSB). Gene. 1993, 2: 219-225.

338. Toh E. A., Wickner R.B. Curing of the 2 mu DNA plasmid from Saccharomyces cerevisiae. J.Bacteriol. 1981, 145, 3:1421-4.

339. Tominaga K, Akiyama S, Kagawa Y, Ohta S.Upstream region of a genomic gene for human mitochondrial transcription factor 1. Biochim. Biophys. Acta. 1992, 2:217-219.

340. Tracy R.L, Stem D.B. Mitochondrial transcription initiation: promoter structures and RNA polymerases. Curr. Genet. 1995, 3: 205-216.

341. Tsai H.J., Lai C.H., Yang H.S. Sperm as a carier to introduce an exogenous DNA fragment into the oocyte of japanese abalone (Haliotis divorsicolor suportexta). Trans. Res. 1997, 6: 85-95.

342. Van Tuyle G.C., McPherson M.L. A compact form of rat liver mitochondrial DNA stabilized by bound proteins.J.Biol.Chem. 1979, 254, 13:6044-53.

343. Vasilyev VB, Sokolova VA, ArbuzovaNI, Sorokin AV, Bass MG, Kustova ME. Human mtDNA persist in some organs of mouse embryos and of neonate mice originated from zygotes microinjected with human mitochondria. Mitochondrion, 2001.1, 1: S94-S95.

344. Vestweber D, Schatz G. DNA-protein conjugates can enter mitochondria via the protein import pathway. Nature. 1989, 6211: 170-172.

345. Vile R.G., Tuszynski A., Casteden S. Retroviral vectors: from laboratory tools to molecular medicine. Mol. Biotechnol. 1996, 5: 139-158.

346. Viral expression vectors// Curr. Topics Microbiol. Immunol.,v.l52, 1992.

347. Walberg M.W., Clayton D.A. Sequence and properties of the human KB cell and mouse L cell D-loop regions of mitochondrial DNA. Nucleic Acids Res. 1981,9, 20:5411-21.

348. Wallace D.C. Diseases of the mitochondrial DNA. Ann. Rev. Biochem. 1992, 61: 1175-1212.

349. Wang C.Y., Huang L. pH-sensitive immunoliposome mediated, cell-specific delivery and controlled expression of a foreign gene in mouse. Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 1991, 88: 4255-4259.

350. Wang T.S. Eukaryotic DNA polymerases. Annu. Rev. Biochem. 1991, 60:513-52.

351. Webster G, Genschel J, Curth U, Urbanke C, Kang C, Hilgenfeld R. A common core for binding single-stranded DNA: structural comparison of the single-stranded DNA-binding proteins (SSB) from E.coli and human mitochondria. FEBS Lett. 1997, 2-3: 313-316.

352. West J., Rodman D.M., Gene therapy for pulmonary diseases, Chest, 2001, 119.2:613-617

353. Wigler M.A., Pellicer A., Silveestein S. DNA-mediated transfer of the adenin phosporybosyl transferase locus into mammalian cells. Proc. Nat. Acad. Sci.USA. 1979,76: 1373-1381.

354. Wigler M.A., Pellicer A., Silveestein S., Axel P. Biochemical transfer of single copy eucaryotic genes using total cellular DNA as donor. Cell. 1978, 14: 725-731.

355. Williams D.A. Lemischka I.R., Nathan D.G., Mulligan R.C. Introduction of new genetic material into pluri potent haemapoietic stem cells of the mouse. Nature. 1984, 3K): 476- 480.

356. Wohlleben W., Muth G. In: Plasmid. A practical approach. Hardy K.G.(ed.), 1993 p.l47-175,IRL Press, Oxford, New York, Tokyo.

357. Wolff J.A., Malone R.W., Williams P. Direct gene trasfer into mouse muscle in vivo. Science. 1990,247: 1645-1648.

358. Wolstenholme D.R, Fauron C.M, Goddard J.M. Nucleotide sequence of Rattus norvegicus mitochondrial DNA that includes the genes for tRNAile, tRNAgln and tRNAf-met. Gene. 1982 Nov;20(l):63-9.

359. Wong T.W, Clayton D.A. In vitro replication of human mitochondrial DNA: accurate initiation at the origin of light-strand synthesis. Cell. 1985, 3: 951958.

360. Wu X., Pandolfi PP. Mouse models for multistep tumorigenesis. Trends Cell Biol., 2001, И, 11: S2-9.

361. Yaginuma K., Kobayashi M., Taira M., Koike K. A new RNA polymerase ^ and in vitro transcription of the origin of replication from rat mitochondrial

362. DNA. Nucleic Acids Res. 1982, 10, 23:7531-42.

363. Yamamoto A, Hen R, Dayer WT. The ons and offs of inducible transgenic technology: a review. Neurobiol. Dis., 2001, 8, 6: 923-932.

364. Yang W.N., Zhou X.A. rRNA genes are located far away from the D-loop region in Peking duck mitochondrial DNA. Curr.Genet. 1988, 13, 4:351-5.

365. Yeh P., Perricandet M. Advances in adenoviral vectors: from genetic engeneering to their biology. Experim. Cell Res. 1996, 229: 233-239.

366. Yoza B.K, Bogenhagen D.F. Identification and in vitro capping of a primary transcript of human mitochondrial DNA. J. Biol. Chem. 1984, 6: 3909-3915.

367. Xu B, Clayton D.A. RNA-DNA hybrid formation at the human mitochondrial heavy-strand origin ceases at replication start sites: an implication for RNA-DNA hybrids serving as primers. EMBO J. 1996, 12: 3135-3143.

368. Zakian V.A. Origin of replication from Xenopus laevis mitochondrial DNA promotes high-frequency transformation of yeast. Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1981,78,5:3128-32.

369. Zani M., Lavitrano M., French D., Lulli V., Maione В., Sperandio S., Sadafora C. The mechanism of binding of exogenous DNA to sperm cells: factors controlling the DNA uptake. Exp. Cell Res. 1995, 217: 57-64.

370. Zelenin A.V., Alimov A.A., Zelenina I.A., Semenovs M.L., Rodova M.A., Chernov B.K., Kolesnikov V.A. Transfer of foreign DNA into the cells of developing mouse embryos by microprojectile bombardment. FEBS Lett. 1993. 315: 29-32.

371. Zelenin A.V.,Titomirov A.V., Kolesnikov V.A. Genetic transformation of mouse cultered cells with help of high velocity mechanical DNA-injection. FEBS Letters. 1989, 244: 65-67.

372. Zimmermann W., Chen S.M, Bolden A, Weissbach A. Mitochondrial DNA replication does not involve DNA polymerase alpha. J. Biol. Chem. 1980, 24:11847-11852.

373. Zoragi G., Spadafora C. Integration of foreign DNA sequences into mouse sperm genome. DNA Cell Biol. 1997, 16: 291-300.