Разработка векторов для молекулярного клонирования с позитивной селекцией, основанных на использовании летального эффекта гена барназы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Язынин, Сергей Анатольевич

• Язынин, Сергей Анатольевич
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Язынин, Сергей Анатольевич

СОДЕРЖАНИЕ

Список использованных сокращений

Введение

ГЛАВА 1. Литературный обзор

1.1. Вектора с позитивной селекцией

1.2. РНКаза барназа как фактор летальности

1.2.1. Характеристика фермента

1.2.2. Внутриклеточный ингибитор барназы — барстар

ГЛАВА 2 Материалы и методы

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение

3.1. Разработка на основе гена барназы вектора

рМТ440 с позитивной селекцией

3.1.1. Изучение влияния уровня индукции tac—промотора на выживаемость различных штаммов E.coli,

трансформированных плазмидой рМТ416

3.1.2. Клонирование с помощью плазмиды рМТ416 ПЦР— продукта,

кодирующего вариабельные регионы легкой цепи антитела к белку р24 вируса HIV— 1

3.1.3. Введение полилинкера в ген барназы и конструкция векторов рМТ438, рМТ438а и рМТ440

3.1.4. Использование вектора рМТ440 с позитивной селекцией для клонирования фрагментов чужеродной ДНК

3.2. Конструирование вектора рВа —7 с позитивной селекцией...70 3.2.1. Конструирование плазмид рВа —2, рВа — 3s и рВа —6

3.2.2. Сайт — специфический мутагенез для удаления .повторяющихся

сайтов рестрикции и конструкция вектора рВа —7

3.2.3. Использование вектора рВа —7 для клонирования фрагментов чужеродной ДНК

3.2.4. Использование вектора рВа — 7 для клонирования генов иммуноглобулинов мыши

3.3. Исследование с помощью иммуноблотинга рекомбинантной барназы и ее мутантов, продуцируемых с помощью плазмид рМТ440 и рВа-7

3.4. Характеристика вклада ряда мутаций в ферментативную активность модифицированной барназы

Заключение

ГЛАВА 4. ВЫВОДЫ

Приложение 1

Приложение 2

Приложение 3

Приложение 4

Список литературы

Список использованных сокращений

В* — барстар

Ва — рибонуклеаза барназа

САР — транскрипционный фактор, регулирующий траскрипцию генов, ответственных за катаболизм в клетке E.coli

ccdB — ген белка CcdB — ингибитора топоизомеразы II E.coli, регулирующего жизнеспособность бактериальных клеток, утративших F' — эписому.

ccdA — ген белка CcdA, ингибирующего активность белка CcdB в клетках E.coli.

Da(kDa) — дальтон (килодальтон)

DEPC — диэтилпирокарбонат

dNTP(s) — дезоксирибонуклеотидтрифосфат(ы)

DTT — дитиотритол

ЕСЕРР/3 — обозначение базового алгоритма для работы со структурами белков методом Монте Карло

GATA—1 — транскрипционный фактор, распознающий консенсус —

последовательность G AT (А).

GpN — гуанозил—3',5'— нуклеозид

GpU — гуанозил—3', 5' — уридинмонофосфат

GST — глутатион — S — трансфераза

HIV— 1 — вирус иммунодефицита человека

ICM — internal coordinates modeling, компьютерная программа для

моделирования структуры белков

Kd — константа диссоциации

Ккат — каталитическая константа

Кт _ константа Михаэлиса

iacF — ген Lac — репрессора

M —MuLV обратная транскриптаза — обратная транскриптаза из вируса мышиной лейкемии Moloney

MOPS — 3— (N — морфолино) пропансульфоновая кислота ОтрА — сигнальный пептид мембранного белка OmpA E.coli

PBS — натрий — фосфатный буфер

PhoA — сигнальный пептид щелочной фосфатазы E.coli

RT—ПЦР— реакция обратной транскрипции и сопряженная с ней

полимеразная цепная реакция с использованием в качестве исходной

матрицы мРНК.

SDS — додецилсульфат натрия

TBS - трис - HCl буфер

TEMED — N,N,N',N' — тетраметилэтилендиамин Tris/трис — трис (оксиметил) аминометан

X — gal - 5 — бром — 4 — хлор — 3 — индолил — ß — D — галактопиранозид

АТФ — аденозин —5'— трифосфат

а.о. — аминокислотный(е) остаток(и)

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

ИГ — иммуноглобулиновый(е) ген(ы).

ИПТГ — изопропил—ß —D —тиогалактопиранозид

кДНК — одноцепочечная ДНК, полученая в реакции обратной

транскрипции с использованием в качестве матрицы мРНК

мРНК — матричная РНК

ПЦР (PCR) — полимеразная цепная реакция

п.о. (bp) — пар оснований в ДНК

ПААГ — полиакриламидный гель

РНК — рибонуклеиновая кислота

РНКаза — рибонуклеаза

т.п.о. (kb) — тысяч пар оснований в ДНК

ТАЕ — трис — ацетатный буфер, содержащий ЭДТА

ТЕ — трис —HCl буфер, содержащий ЭДТА

цАМФ — аденозин —3', 5'— монофосфат

ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка векторов для молекулярного клонирования с позитивной селекцией, основанных на использовании летального эффекта гена барназы»

ВВЕДЕНИЕ

Возрастающая интенсивность исследований по молекулярной биологии и генетике требует повышения эффективности одной из основных методических процедур — молекулярного клонирования. В последние годы быстро развивается новое биотехнологическое направление — векторные системы с позитивной селекцией, при использовании которых выживают только клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды. Очевидны преимущества таких векторов, которые не требуют дефосфорилирования линеаризированной плазмиды для клонирования. При этом отсутствует влияние неразрезанного вектора, присутствующего практически в любых препаратах. Другим преимуществом является отсутствие необходимости использования дорогостоящих реагентов, таких как X —gal, дополнительные антибиотики и пр. Все перечисленное выше снижает стоимость и повышает эффективность генно — инженерных манипуляций. Первые вектора нового поколения уже появились в

продаже, например вектор pZErO-1™ (Invitrogen Inc., USA), основанный на использовании летального эффекта гена ccdB (control of cell death В gene) [1]. Однако в ряде случаев гены, определяющие летальность, слишком велики, что приводит к значительному превышению оптимальных размеров плазмиды. Либо известные вектора с позитивной селекцией требуют использования специальных штаммов E.coli или дополнительных компонентов питательных сред.

Большинство описанных в литературе векторов с позитивной селекцией не обладают всеми необходимыми атрибутами современных векторов, такими, как секвенирование с помощью универсальных праймеров, клонирование протяженных фрагментов чужеродной ДНК с использованием широкого спектра рестриктаз, получение одноцепочечной ДНК, in vitro транскрипция. Представляется актуальной дальнейшая разработка современных векторов с позитивной селекцией, не имеющих вышеперечисленных недостатков. В настоящей работе впервые получены вектора с позитивной селекцией, основанные на использовании летального эффекта гена барназы — рибонуклеазы из Bacillus amyloliquefaciens, вызывающей при экспрессии в бактериальных клетках летальный гидролиз внутриклеточной РНК [2,3]. Полученные векторные системы функционируют таким образом, что клонирование фрагментов ДНК в полилинкеры этих векторов приводит к структурной инактивации гена барназы, в результате чего вырастают только клоны трансформантов, содержащих вставки чужеродной ДНК. Трансформанты, содержащие религированную плазмиду, погибают при выращивании в присутствии ИПТГ, индуцирующего экспрессию барназы в клетках E.coli. Полученные вектора рМТ440 и фагемида рВа —7 могут быть использованы в широком спектре штаммов E.coli и позволяют выполнять полный спектр генно-инженерных манипуляций, характерный для современных векторов.

Целью настоящего исследования являлась разработка новых векторных систем с позитивной селекцией для клонирования фрагментов чужеродной ДНК, использующих летальный эффект гена барназы. Исходя из поставленной цели, были сформулированы

следующие задачи: а) изучить плазмиду рМ416, представляющую собой вектор для экспрессии барназы в клетках E.coli, содержащий кассету генов барназа —барстар, на предмет летальности для различных штаммов E.coli; б) использовать плазмиду рМТ416 в качестве модельного вектора с позитивной селекцией для клонирования фрагментов чужеродной ДНК; в) разработать на основе плазмиды рМТ416 вектор с позитивной селекцией, содержащий протяженный полилинкер из pUC19 внутри гена барназы; г) изучить эффективность новой векторной системы с позитивной селекцией для клонирования фрагментов чужеродной ДНК; д) разработать на основе вектора pBluescript KS II + (Stratagene, USA) современную полифункциональную векторную систему с позитивной селекцией, обладающую рядом специфических функций, таких, как синтез РНК in vitro (промотор ТЗ РНК — полимеразы), получение одноцепочечной ДНК (fl ориджин), секвенирование с помощью унивесальных праймеров (М13 rev, ТЗ, KS, SK), клонирование протяженных фрагментов чужеродной ДНК с использованием широкого спектра рестриктаз.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Вектора с позитивной селекцией.

Для клонирования фрагментов ДНК и идентификации или отбора клонов, содержащих рекомбинантные плазмиды, разработан целый ряд векторных систем [4 — 8]. Однако они не лишены недостатков, основным из которых является наличие балластных колоний, представляющих собой клоны, содержащие плазмиды без вставок чужеродной ДНК. Для увеличения количества и селекции позитивных клонов применяются различные методы, например дефосфорилирование вектора после линеаризации [9], что делает невозможным религирование вектора, но не мешает включению в вектор фосфорилированной (кинированной) вставки.

Другие методы, основанные на использовании репортерных генов, функционируют таким образом, что при клонировании нарушается структура репортерного гена или его промотора [10]. На этом принципе работает распространенная система, основанная на инактивации Im.cZ пептида Р — галактозидазы, теряющего способность участвовать в акте а — комплементации с большим фрагментом [10] Р — галактозидазы, экспрессирующимся в клетках ряда штаммов Е.соИ конститутивно [10]. При использовании этой системы селекции негативные клоны окрашиваются в голубой цвет, а рекомбинантные клоны остаются неокрашенными.

Примером высокоэффективного клонирования с предварительной обработкой вектора является ТА—клонирование, основанное достраивании Гадг—полимеразой 3'— концов ПЦР — продуктов

преимущественно на один dA—нуклеотид [11]. Такой продукт может быть напрямую лигирован в линеаризованный вектор, содержащий на 5' —концах комплементарные dT—нуклеотиды. Подобные вектора могут быть получены с помощью находящегося в полилинкере сдвоенного сайта рестриктазы Xcml [11]. После разрезания соответствующей [Xcml] рестриктазой образуются одиночные dT на 3' —концах линеаризированного вектора. В данном случае вектор не может быть религирован и балластные клоны образуются только в том случае, если в препарате вектора присутствует неразрезанная плазмида или при контаминации нуклеазами.

Интересен ставший в последнее время популярным подход, вызывающий значительное увеличение эффективности клонирования, разработанный фирмой Invitrogen Inc., USA и основанный на использовании топоизомеразы I из Vaccinia virus [12, 13]. Эта топоизомераза специфично узнает две СССТТ —последовательности, находящиеся в полилинкерной области вектора pCR 2.1—TOPO (Invitrogen Inc., USA). Хотя этот процесс слабо изучен, известно, что топоизомераза I из Vaccinia virus, вносит разрыв в ДНК по СССТТ— сайтам. В дальнейшем при ликвидации разрыва при других условиях реакции она может интегрировать ПЦР —фрагмент в последовательность вектора pCR®2.1— TOPO при наличии у него 3'— концевых dA— нуклеотидов [13].

Однако все перечисленные выше методы, повышающие количество позитивных клонов, требуют предварительной обработки вектора, которая может протекать с различной эффективностью. Наличие баластных клонов определяется также условиями проведения реакции

лигирования [10]. Новейший подход в области молекулярного клонирования, так называемая позитивная селекция, основана на использовании токсичных для E.coli генов. Клонирование вставки с нарушением рамки считывания токсичного гена или непосредственно внутрь последовательности токсичного гена приводит к исчезновению летальности и выживанию только рекомбинантных клонов. Клоны, содержащие религированный вектор, погибают при востановлении исходной структуры токсичного гена. В настоящем обзоре сделана попытка обобщить основной массив описанных в литературе векторов с позитивной селекцией и проанализировать возможные области их применения.

Одними из самых успешных на сегодняшний день векторов с позитивной селекцией являются вектора pZErO™ фирмы Invitrogen Inc., USA [14], функционирующие на основе использования ccdB гена [15]. Ген ccdB входит в состав локуса ccd (control of cell death), находящегося в F'—плазмиде E.coli и кодирующего два белка CcdA из 72 и CcdB из 101 а.о. [16—19]. Локус ccd ответственен за ликвидацию клеток E.coli, утративших F'— плазмиду после конъюгации. [20]. Белок CcdB способен взаимодействовать с бактериальной гиразой (топоизомеразой II), которая катализирует АТФ — зависимое раскручивание ДНК, необходимое для репликации. В процессе каталитического акта топоизомераза II образует параллельный разрыв в обеих цепях двухцепочечной ДНК. 5'— фосфат ДНК в области разрыва ковалентно связывается с остатком тирозина в А—субъединице топоизомеразы II. Белок CcdB, как было показано исследованиями in vivo

[21] и in vitro [22], взаимодействуя с интермедиатом гираза—ДНК, ингибирует восстановление двухцепочечного разрыва в ДНК, что является летальным для бактериальной клетки. Механизм ликвидации клеток E.coli, утративших F'— плазмиду, основан на том, что время полужизни в бактериальной клетке белка CcdB значительно продолжительнее, чем белка CcdA, который является его специфическим ингибитором [21]. Таким образом, после потери или передачи F' — плазмиды, оставшиеся в клетке CcdB и CcdA инактивируются с различной скоростью, до тех пор пока избыточное присутствие ccdB не становится летальным для бактериальной клетки. Искусственная сверхпродукция белка CcdB также является летальной для E.coli [23, 24].

ccdB ген как перспективный ген, обеспечивающий летальность, был использован для создания вектора pKIL18/19 с позитивной селекцией [25] (рис.1). В качестве основы для создания вектора были выбраны плазмиды pUC18 и pUC19. ПЦР —продукт, кодирующий ccdB ген, фланкированный содержащимися в праймерах HmdIII — (для pUC18) или £coRI — (для pUC19) сайтами, был клонирован в последний в направлении от lac— промотора сайт рестрикции полилинкера (HmdIII — или EcoRl — ) в плазмидах pUC18 и pUC19, соответственно. Рамка считывания LacZ — пептида была сохранена таким образом, что клонирование фрагмента чужеродной ДНК в полилинкер pKIL18/19 за счет сбоя рамки считывания приводило к инактивации ccdB гена [25].

Позже фирма Invitrogen Inc., USA разработала на основе гена ccdB вектора pZEro™ "1 и -2 (рис. 2) и pBAD — 1 и — 2, снабженные всеми необходимыми элементами для клонирования и секвенирования

Рис.1. Схема векторов с позитивной селекцией pKILtß/19, функционирующих на основе ccdB гена [1].

фрагментов чужеродной ДНК. Ограничениями векторных систем на основе ccdB гена являются невозможность использования как штаммов, содержащих F'— плазмиду, так как в ней находится ген ингибитора — CcdA, что вызывает значительное повышение количества негативных клонов, так и штаммов дугА462+, полностью резистентных к продукту гена ccdB.

Перспективным вектором с позитивной селекцией, разработанным фирмой Boehrmger Mannheim, Germany, является вектор pCAPs [26].

Рис.2. Схемы векторов с позитивной селекцией pZErO ™—1 и —2 фирмы Invitrogen Inc., USA, функционирующих на основе ccdB гена. Векторные системы различаются по генам антибиотикорезистентности (к зеоцину и канамицину), а также различными ориджинами репликации: ColEl ориджин и дополнительный ft ориджин (pZErO — 2) или pUC ориджин (pZErO—1). Представленные векторные системы могут быть использованы только в штаммах, не содержащих F'— эписому.

Принцип действия векторной системы основан на открытом Schlieper и соавт. [26] токсическом эффекте мутанта САР —белка (catabolite gene

activator protein) — транскрипционного фактора, регулирующего экспрессию генов, ответственных за катаболизм в клетке E.coli [27]. САР состоит из двух идентичных 22 kD — субъединиц, каждая из которых обладает одним ДНК— и одним цАМФ — связывающими доменами [28]. САР связывается в присутствии цАМФ с промоторами катаболитных генов, содержащих мотив TGTGA, индуцируя транскрипцию [27]. Мутант CAPS является продуктом гена crps, который кодирует транскрипционный фактор САР с заменой по положению Е181 на Q181 [29]. Было обнаружено, что при экспрессии в бактериальной клетке в высоких концентрациях CAPS~ белок летален для большинства штаммов E.coli. Однако летальность отсутствует для штаммов, дефицитных по аденилатциклазе (суа'). Это связано с тем, что клетки этих штаммов не способны продуцировать цАМФ, который необходим для образования комлекса CAPS — ДНК. Добавление в агар цАМФ восстанавливает CAPS — зависимую летальность в отношении суа~ штаммов E.coli. Повышенная токсичность CAPS —белка связана, по —видимому, с большим сродством к консенсус — последовательности промоторных областей катаболитных генов по сравнению с белком дикого типа [26]. Таким образом, индукция экспрессии CAPS с помощью плазмиды pBG2E81Q [29] в клетках суа+ штаммов E.coli (DH5a или XL— lblue MRF'Kan) является летальной и приводит к полному подавлению клеточного роста.

Для конструкции вектора (рис. 3) авторы использовали вышеназванную плазмиду pBG2E81Q. Структура кодонов в центре фермента была изменена с помощью сайт — специфического мутагенеза для того, чтобы ввести полилинкер из 19 уникальных рестрикционных

Рис.3. Схема вектора с позитивной селекцией pCAPs фирмы Boehringer Mannheim, Germany, функционирующего на основе crps гена [26].

сайтов, не изменяя последовательности аминокислот. Протяженный рестрикционный сайт Notl, состоящий из 8 нуклеотидов, было невозможно ввести аналогичным способом. Для введения сайта Notl с помощью методов компьютерного моделирования и использования данных рентгеноструктурного анализа САР [30, 31] был найден регион, в котором было возможно осуществить замену треонин—140 на серин — 140 без существенного снижения летальности и интегрировать Notl сайт.

Вектор pCAPs был использован для клонирования фрагментов ДНК различной длины от 21 п.о. до 9,3 т.п.о. При клонировании ПЦР — продуктов размером до 1,7 т.п.о. была достигнута эффективность от 88 до 100% в зависимости от очистки и обработки ПЦР — продуктов и использованной термостабильной ДНК — полимеразы (Taq- или Pwo

ДНК — полимеразы). При клонировании ПЦР — продуктов размером 4,8 т.п.о. 2 из 5 исследованных клонов содержали вставку, при клонировании ПЦР —продукта размером 9.3 т.п.о. 2 из 12 исследованных клонов содержали вставку правильного размера [26].

При всей привлекательности этого типа селекции (достаточно широкий спектр штаммов — хозяев и отсутствие важных для функционирования системы компонентов питательных сред) вектор обладает рядом существенных недостатков: невозможность секвенирования вставки с помощью универсальных праймеров, трудности при клонировании фрагментов большого размера, невозможность получения одноцепочечной ДНК (отсутствие fl ориджина) для эффективного секвенирования или сайт — специфического мутагенеза.

Вектор с позитивной селекцией pGATA основан на использовании в качестве условнолетального для бактериальных клеток гена эукариотического транскрипционного фактора GATA— 1 [32]. GATA— 1 (413 аминокислот) состоит из трех доменов (R1,R2 и R3), важных для активации транскрипции (transcriptional activation domains), и ДНК — связывающего домена, который ответственен за связывание с тринуклеотидом GAT. Эффективность связывания также зависит от фланкирующих нуклеотидов [34, 35]. ДНК — связывающий домен GATA — 1 состоит из четырех субдоменов — из двух так называемых "цинковых пальцев" (Z1 и Z2) со следующей общей структурой: CysX2CysX17CysX2Cys, где X— различные аминокислоты— (см. рис.4. ) и двух основных регионов (В1 и В2).

Рис.4. Схема строения транскрипционного фактора GATA—1 [33].

Trudel Р. с соавторами обнаружили, что экспрессия фрагмента ДНК — связывающего домена GATA—1 (Z1B2) в клетках различных штаммов E.coli токсична для последних [33]. Для получения вектора с позитивной селекцией pGATA фрагмент ДНК, кодирующий домены GATA— 1 — Z2B2 был клонирован по сайтам ВатШ (5') и EcoRI (3') в экспрессионный вектор, содержащий GST ген — pGEX —2Т (Pharmacia Biotech, USA). Далее по сайту Swal был помещен полилинкер вектора pBhiescript (127 п.о.), вырезанный из него с помощью ßssHII и затупленный. Таким образом, экспрессионная кассета под контролем lac — промотра состоит из GST (глутатион — S — трансферазы) [36], полилинкера и Z1B2 домена GATA—1 (рис.5.). Клонирование фрагмента чужеродной ДНК в полилинкер вектора pGATA за счет сбоя рамки

считывания приводит к исчезновению летального эффекта таким образом, что выживают только клоны содержащие вставку. При тестировании эффективности клонирования в различных штаммах Е. coli (DH10B, DH5a, XL1 blue и HB101) было получено 66-100% позитивных клонов в зависимости от размера вставки, штамма и условий эксперимента.

К преимуществам вектора pGATA относятся возможность экспрессии клонированного гена и очистки рекомбинантного белка с помощью GST, наличие в полилинкере универсальных секвенирующих праймеров ТЗ и Т7 и широкий спектр используемых штаммов; недостатками являются большой размер вектора (5322 и.о.), отсутствие возможности для клонирования крупных фрагментов ДНК и получения одноцепочечной ДНК.

2655 2588

Рис.5. Схема вектора с позитивной селекцией pGATA [33].

Интересен вектор с позитивной селекцией pSCV— 1 [37], использующий токсичный ген, характеризующийся экстремально малыми размерами — ген крысиного кортикостатина R4 (антимикробного дефензина RatNP—1), состоящего из 32 аминокислот. Активность этого пептида и кортикостатинов в организме млекопитающих связана с их способностью конкурировать с аденокортикотропным гормоном за связывание с его рецептором [38]. Кроме того кортикостатины принадлежат к тому же самому семейству пептидов, что и дефензины [39], которые присутствуют в высоких концентрациях в гранулах нейтрофилов и обладают антимикробной активностью в отношении грам — позитивных и грам — негативных бактерий. Авторы вектора обнаружили факт подавления роста при экспрессии кортикостатина R4 в бактериальных клетках [37].

Разработанный вектор pSCV — 1 был создан на основе плазмиды N —р1.2 [37] и содержит экспрессионную кассету из сигнального пептида OmpA, пептида FLAG, полилинкера из pUC18 и гена кортикостатина R4 под контролем tac — промотора, так что экспрессируемый слитый белок состоит из 68 аминокислот. При клонировании в вектор фрагмента чужеродной ДНК за счет сдвига рамки считывания происходит инактивация гена кортикостатина R4. По оценкам авторов, достигалась 95 —100% эффективность клонирования. К достоинствам вектора следует отнести широкий спектр используемых штаммов, возможности для экспрессии клонированного гена и очистки продукта.

Различные гены бактериофагов — регуляторные или гены, обладающие потенциальной токсичностью для бактериальных клеток, также могут быть использованы для разработки векторов с позитивной

селекцией. Вектора рБКМЮ и рБКМП [40] (рис. 6) несут ген с/ фага К кодирующий С1 —репрессор, который блокирует экспрессию генов под контролем ря промотора фага X. Авторы поместили внутрь с1 гена полилинкер из плазмиды р1С20Н [41], так что инсерция не нарушила функции С1 —репрессора. Система селекции основана на том, что С1 — репрессор блокирует экспрессию Тс гена, ответственного за устойчивость к тетрациклину и находящегося под контролем ри промотора. При нарушении структуры с1 гена, например, при клонировании вставки, инактивированный С1 — репрессор не может блокировать ря промотор Тс гена, что приводит к возникновению тетрациклин —резистентного фенотипа [40]. Таким образом, при использовании ЬВ —агара, содержащего тетрациклин и ампициллин, должны выживать только клоны, содержащие вставку. Авторы сообщают об успешном использовании этих векторов при конструировании бактериальных геномных ДНК — библиотек [40]. Вектор может быть использован в большинстве грам — негативных бактерий.

Недостатками, затрудняющими практическое использование векторов рБКМЮ и р$КМ11, являются большой размер плазмиды (4,4 т.п.о и 6,3 т.п.о. соответственно), наличие метилированных сайтов в полилинкере (на рис. 6 они помечены " + "), использование дополнительного антибиотика и отсутствие большинства атрибутов современных векторов. Кроме того, клонирование только по определенным рестрикционным сайтам полилинкера приводит к инактивации С1 — репрессора (на рис. 6 эти сайты отмечены звездочкой).

Другим примером использования гена бактериофага для позитивной селекции рекомбинантных клонов является ген Е фага

фХ174, вызывающий лизис бактериальных клеток [5]. Авторы поместили полилинкер, содержащий уникальные сайты рестрикции, внутрь Е гена без его существенной инактивации, tac/lac—зависимая экспрессия модифицированного Е гена вызывала лизис клеток различных штаммов E.coli. Инактивация Е гена при клонирования вставки приводила к росту только позитивных рекомбинантов. Вектор был использован для клонирования ПЦР — продуктов различной длины с 95—100% эффективностью.

Перечисленные выше вектора с позитивной селекцией не требуют использования каких —либо компонентов питательных сред, или специальных штаммов E.coli, за исключением вектора на основе ccdB.

MOS

fiysc^BgXRvСRScKSm BXS PSpH

MCS

H ^ Sc Xh B*gX R v С RScKSmBXS PSpH

ort

on

Рис.6. Схема векторов с позитивной селекцией рБКМЮ/П, функционирующих на основе с! гена С1 — репрессора бактериаофага А, [40].

В тоже время, описано большое количество векторов с позитивной селекцией, требующих специальных бактериальных штаммов, или дорогостоящих компонентов питательных сред. Информация об этих плазмидных векторах сведена в таблицу 1.

Важность разработки векторов с позитивной селекцией для быстрого и эффективного клонирования ПЦР — продуктов или фрагментов чужеродной ДНК, полученных из различных источников, в значительной степени диктуется потребностями проектов "Геном человека" [49]. В последнее время работы по геномам привели к созданию столь репрезентативных библиотек, что даже наличие незначительного в процентном отношении количества негативных рекомбинантных клонов уменьшает вероятность успешного поиска нового гена или соответствующего транскрипта. Основную роль в поисках новых генов играют кДНК— и геномные библиотеки [50], представляющие собой фильтры, на которых иммобилизованы сотни тысяч рекомбинантных клонов и предназначенные для гибридизации с различными ПЦР — продуктами или фрагментами ДНК, возможно, содержащими новые гены. Эффективность и репрезентативность таких библиотек зависят в первую очередь от того, какое количество позитивных клонов они содержат.

Для получения нормализованной кДНК — библиотеки, например Human Universal cDNA Library (HUCL) фирмой Stratagene, USA [51], из клеток 29 различных органов и тканей была выделена поли А+ мРНК. Выделеная мРНК была объединена в пул, который в свою очередь был разделен на две фракции, одна из которых была непосредственно

Таблица 1. Вектора с позитивной селекцией, требующие использования специальных штаммов или компонентов питательных сред.

Вектор Размер Т.П.О. Ген, определяющий летальность Специальные компоненты среды Штаммы Эффектив -ность Полилинкер Секве ни-рован ие ПЦР-скрининг Размер вставки Т.П.О. вэДНК in vitro транскрипция Ссылка

pKSS 4,133 мутант Ala294Gly фенилаланин-тРНК синтетазы, а-субъединица п-хлор-фенилаланин НВ101 DH5oc JM109 -99% pBluescript® + + E.coli ДНК nd + + 42

pKGS 3,4 Эндонуклеаза EcoRl штаммы, негативные по EcoRl-метилазе 95-100% MndlH 43

pERISm 7,2 rsB ген E.coli, регулирующий продукцию колановой кислоты НВ101 JM109 С600 W3110 <98% Kpnl, Pst\ К.рпеи-moniae ДНК nd 44

PLEK100 4,9 ген ксилулокиназы В из E.coli (xylB) ксилитол МС1116, ХК201 хуЬ штаммы <95% Pstl, Hindill, Sali - - Sali S. albus ДНК - - 45

pBN73 pAC92 pLA7 ~4 4,329 4,1 температуро-чувствительная ДНК-метилтрансфераза (ts-Mtase) а-амилаза, ату ген Вас. subtilis ush ген, определяющий активность 5'-нуклеотидазы и UDP-гидролазы крахмал-иод-комплекс 5 фтор-урацил и 5'-АМФ rglB+ (С600) штаммы, позитивные по rglB-нуклеазе, разруш. Метилированную ДНК TG1 GT3 100% 86-99% -95% EcoRl, Stul,Bgll, Hind III, Sacl, Kpnl pUC18 Единичный сайт Вей - nd ~8 X Hindlll nd -7 - - 46 47 48

использована для синтеза кДНК, другая была помечена биотином. Суммарная кДНК была синтезирована с помощью олигонуклеотида 5' — CCCGGG(T)18 —3'. После щелочного гидролиза мРНК, синтезированная кДНК была гибридизирована с мРНК, маркированной биотином. С помощью разделения на магнитных частицах с адсорбированным стрептавидином кДНК —мРНК гибриды были удалены. Таким образом, после двух стадий очистки пул кДНК был обеднен одинаковыми последовательностями, синтезирующимися во всех 29 тканях. После отжига с поли —(А) ig-содержащим праймером, достраивания второй цепи и фракционирования, фрагменты длинее чем 1 т.п.о. были клонированы в плазмиду рТ7ЕЗ 18U через сайты Pstl и Sacl. Лигатом были трансформированы компетентные клетки E.coli и было получено 2х105 ампициллин — резистентных клонов. Каждый индивидуальный клон с помощью робота наносился на фильтр в виде микроточек. Пользователь может гибридизовать фрагменты ДНК, содержащих новые гены, с такими библиотеками. По вычисленным координатам каждый позитивный клон может быть получен из банка и секвенирован. Созданы также так называемые параллельные экспрессионные библиотеки, где каждый клон экспрессирует индивидуальный протеин и при иммуноскрининге или по связыванию с лигандами может быть найдена последовательность соответствующей кДНК [52].

Очевидно, что при наличии 15 — 20% негативных клонов репрезентативность таких библиотек снижается. Таким образом, применение более совершенных векторов с позитивной селекцией может внести существенный вклад в развитие проектов, связанных с исследованиями геномов.

1.2. РНКаза барназа как фактор летальности

Рибонуклеазы являются перспективными кандидатами на роль условнолетальных генов при конструировании векторов с позитивной селекцией. Токсичность рибонуклеаз при экспрессии их в клетках E.coli описана рядом авторов [2, 53 — 55]. Впервые клонирование гена рибонуклеазы в E.coli с целью получения ее экспрессии проведено в работах Hartley и соавт. [53], выполненных на внеклеточной циклизующей РНКазе из Bacillus amyloliquefaciens, барназе (Ва). Из —за трудностей при экспрессии токсичного белка, первоначально была сконструирована плазмида, в которой ген мутантной неактивной барназы, слитый с геном сигнального пептида щелочной фосфатазы E.coli (PhoA), экспрессировался под контролем промотора щелочной фосфатазы [54]. Сигнальный пептид обеспечивал секрецию неактивной барназы в периплазму и накапливание там процессированного белка.

Воспользовавшись наличием у барназы природного белкового ингибитора барстара (В*), R.W. Hartley сконструировал плазмиду, которая обеспечивала одновременную экспрессию гена барназы дикого типа, слитого с геном сигнального пептида PhoA, и гена ее ингибитора [56, 57]. Экспрессия барназы проводилась под контролем tac — промотора, в то время как транскрипция барстара происходила с использованием собственного естественного промотора. Применение этой схемы обеспечивало жизнеспособность клеток — продуцентов и значительный уровень экспрессии барназы после индукции промотора.

Позднее использование одновременной экспрессии генов рибонуклеазы и ее специфического ингибитора было применено Шульгой с соавт. [92] для клонирования и экспрессии гена гомологичной рибонуклеазы из Bacillus intermedius (биназы). Барназа и биназа—два очень близких белка (гомология по первичной последовательности около 83% [94], и ингибитор барназы ингибирует также и активность биназы [92].

В работе Nambiar et al. [58] была описана экспрессия в E.coli гена рибонуклеазы А, слитого с геном ß — галактозидазы, под контролем lac — промотора. Слитый белок РНКазы А и ß — галактозидазы не обладает существенной рибонуклеазной активностью и, следовательно, не оказывает токсического влияния на клетку. Для получения нативной РНКазы А авторы работы ввели между генами ß — галактозидазы и РНКазы А последовательность, кодирующую тетрапептид, являющийся сайтом расщепления фактора Ха, который используется на одном из конечных этапов очистки для расщепления химерного белка.

Многие авторы использовали для ослабления токсического действия РНКаз различные сигнальные пептиды с целью ускорить секрецию синтезированной рибонуклеазы из клетки [59]. В ряде случаев РНКазы животного происхождения синтезируются и скапливаются в бактериальных клетках в виде телец включения и практически не оказывают токсического воздействия на клетку.

Однако на сегодняшний день самой удачной системой, которая может быть успешно использована для создания векторов с позитивной

селекцией, является система с совместной экспрессией барназа — барстар в клетках E.coli.

1.2.1. Характеристика фермента.

Было показано, что рекомбинантная барназа обладает одинаковыми характеристиками по сравнению со свойствами белка, выделенного из природного штамма — продуцента Bacillus amyloliquefaciens [60] (рис.7). Фермент состоит из 110 аминокислот и катализирует гидролиз динуклеозидов типа GpN, при этом первым основанием должен быть гуанин, а для второго нуклеотида существует следующая предпочтительность: A>G>C>U.

Получение штамма продуцента Ва послужило стимулом для структурно — функциональных исследований молекулы фермента методами белковой (генной) инженерии. Наиболее интересным представляется выяснение механизма действия барназы. Предполагают, что Glu73, Arg87 и Hisl02 формируют активный центр в молекуле Ва, где Glu73 выступает как общий основный, а остаток Hisl02 как общий кислотный катализатор [93]. Результаты изучения Ва методами генной инженерии находятся в полном соответствии с предложенным механизмом катализа. Направленное введение точечных мутаций Hisl02Ala и Glu73Ala в молекулу Ва приводит к полной потере ею ферментативной активности [60, 61]. Кроме того, была выявлена существенная роль Lys27 в катализе. Ва с мутацией Lys27Ala обладает всего лишь 1.3% активности природного фермента по отношению к дрожжевой РНК и в 3500 раз меньшей Ккат на субстрате GpA.

Замены Н18102А1а, Агд87А1а и Ьуз27А1а приводят не только к потере ферментативной активности, но и к уменьшению в 20 раз связывания фосфата в активном центре [61]. Интересно отметить, что при изменении нескольких положительно заряженных остатков Ьуз27А1а, Агд59А1а, Ш8102А1а, которые взаимодействуют с отрицательно заряженной РНК, значительное уменьшение активности сопровождается увеличением стабильности [62].

Н - |*пмп{М

Рис.9. Структура рибонуклеазы барназы (93).

Удаление нескольких остатков, образующих водородные связи: 5ег57А1а, Азр58Азп, ТутЮЗРЬе с гуанином субстрата, приводит к небольшому снижению активности фермента, а стабильность либо увеличивается, либо остается без изменения. Замена отрицательно заряженного остатка А£р54А8п, наоборот, уменьшает стабильность и увеличивает активность Ва [93].

Важным для понимания функционирования Ва является факт уменьшения специфичности при переходе на полирибонуклеотиды.

Повышение гуаниловой специфичности Ва в 35 раз удалось получить путем замены Ser57Glu в гуанил—связывающей петле [63]. Авторы работы считают, что это вызвано дополнительной водородной связью, образуемой гидроксильной группой серина и N(7) атомом азота пуринового основания в фермент — субстратном комплексе. Однако по уточненным данным в комплексе барназы с 3' —GMP такая связь отсутствует и боковая цепь серина находится вне полости, в которой происходит связывание основания [93].

Из теоретической модели комплекса Ва с GpG следует, что остаток Glu60 играет важную роль в специфичности Ва к гуанозину. Чтобы проверить это предположение, Glu60 в молекуле Ва заменили на Gin [64]. Данная замена увеличивает Кт для динуклеозидов GpC, GpA и АрА в 10 раз и не изменяет Ккат. Однако, для субстрата поли (А) и РНК такая замена не приводит ни к изменению Ккат, ни к изменению Кт. Авторы полагают, что это связано с различием во взаимодействии Glu60 с ди— и полинуклеотидным субстратом.

Из данных, имеющихся в литературе, следует, что в молекуле Ва существует, по —видимому, не один, а несколько сайтов связывания субстрата. Об этом свидетельствует увеличение более чем в 104 раз значения Ккат/Кт для Ва при переходе от динуклеозидных субстратов к полирибонуклеотидным. Чтобы показать это, изучали активность Ва на специально синтезированном наборе субстратов типа Zp0G, Zp0Gpi и.т.д. до Zp0GpiXp2Y, где р —фосфат, X,Y,Z — нуклеотиды, a G —гуанозин, который занимает так называемый участок первичной специфичности [65]. Показано, что участок связывания рг является вторичным сайтом связывания субстрата. Заполнение этого участка дает 1000 —кратное

увеличение Ккат/Кт Не существует специальных участков для связывания Z и р0 . Участок для связывания с У дает дальнейшее 20 —кратное увеличение Ккат/Кт> У субстрата врАрА значение Ккат/Кт= 2x108 наибольшее [93].

Данные по кинетике Ва на субстратах типа гроСр^ргУ полностью коррелируют с данными по структуре комплекса РНКазы Ва с тетрадезоксинуклеотидом сЦССАС), определенной с разрешением 1,76 А [66]. Каждая молекула Ва связывается с одной молекулой олигонуклеотида, причем участок первичной специфичности занимается гуанином, а все три фосфатные группы субстрата образуют электростатические взаимодействия с основными в положительно заряженных райнах активного центра. Остаток №8102 располагается напротив аденинового основания подобно тому, как это имеет место в комплексе Ва — ЩврС) [67]. При образовании комплекса с сЦССАС) общая структура белка не претерпевает изменений. Однако, в области активного центра наблюдаются некоторые незначительные конформационные перестройки. Гуанин субстрата образует стекинг с ароматическими кольцами РЬе56 и ТутЮЗ в участке узнавания. Основные взаимодействия между Ва и аналогом субстрата являются электростатическими по своей природе: это— взаимодействия между фосфатами р0, р1( р2 и остатками Ьув27, Агд83, Н1з102 и ТутЮЗ. Всего между белком и олигонуклеотидом образуется 15 водородных связей, семь из которых между белком и фосфатом р^. Отсутствие водородных связей между белком, 5' цитозином и сахаром согласуется с кинетическими данными [60], которые показывают, что присутствие этих групп никак не влияет на скорость катализа. 5' фосфатная группа р0

образует водородную связь с Ne атомом Lys27, однако, это происходит из — за непродуктивной конформации гуанина субстрата. В каталитически продуктивной син — конформации р0 направлен к растворителю и не образует взаимодействий с белком [93].

Интересной особенностью барназы, использованной в настоящей работе, является образование стабильного комплекса из двух пептидов (с 1 по 36 а.о. и с 37 по 110 а.о.), получаемых при химическом расщеплении мутанта барназы. Продемонстрировано, что каждый из фрагментов Ва (с 1 по 36 а.о. и с 37 по 110 а.о.) по отдельности представляет собой в растворе беспорядочно свернутый клубок и не имеет каталитической активности. Однако при их смешивании образуется стабильный ассоциат (Kd=0.2 —0.6х10-6М), спектральные свойства которого такие же, как у нерасщепленного белка. При этом восстанавливается и ферментативная активность, которая всего лишь в 3 — 4 раза ниже, чем у природной Ва [68].

1.2.2. Внутриклеточный ингибитор барназы - барстар

В 1968 году [57] было обнаружено, что штамм Bacillus amyloliquefaciens продуцирует внутриклеточный белковый ингибитор, предохраняющий клетку от летального действия собственной рибонуклеазы. Позже этот белок назвали барстаром (В*). Клонирование и экспрессия гена этого белка в Escherichia coli создало необходимый базис для изучения структуры и механизма действия барстара с помощью методов белковой инженерии [56].

Молекула барстара состоит из одной полипептидной цепи длиной 89 а.о., содержащей два остатка цистеина, Функциональная роль этих

остатков непонятна, поскольку дисульфидная связь между ними не образуется. В ходе исследования мутантов барстара, в которых один или оба остатка цистеина были заменены на остатки Gly, Ser и Ala, было выяснено следующее. Все мутанты обладали ингибирующей активностью как in vivo, так и in vitro, включая и двойной мутант. Замена остатка Cys82 в В* существенно понижает его стабильность. Тепловая денатурация этого мутанта в отсутствие денатурирующих агентов происходит при температуре 55°С, а Тпл В* дикого типа около 80°С. Стабильность природного В* в присутствии восстанавливающих агентов, таких как Р — меркаптоэтанол, также сильно снижается. На основании чего ранее был сделан ошибочный вывод, что молекула В* стабилизируется посредством образования дисульфидной связи между остатками Cys40 и Cys82 [71, 72].

Пространственная структура В* дикого типа определена двумя методами— рентгеноструктурным анализом [73] и ЯМР — спектроскопией [74]. Структура состоит из трех параллельных а —спиралей (остатков 14 — 25, 33 — 43, 68 — 81), расположенных напротив трех р —цепей (остатки 1 — 6, 49 — 54, 83 — 88). В* содержит 24 заряженных остатка: llGlu, 4 Asp, 6Lys и ЗАгд, которые распределены равномерно по поверхности молекулы.

Исключением является область, состоящая из второй спирали и С —конца четвертой спирали, где концентрация отрицательно заряженных остатков существенно выше, чем в остальной части молекулы [92]. Гидрофобное ядро В* образовано боковыми группами первой, второй и чествертой спиралей и р —слоем. Согласно данным

ЯМР, остатки Суз40 и Суз82 в восстановленном В* находятся достаточно далеко друг от друга, чтобы образовать дисульфидную связь [92].

С помощью методов белковой инженерии были установлены остатки барназы и барстара, входящие в участки взаимного узнавания. В

Рис.10. Структура сайта взаимодействия барназы и барстара (93).

молекуле Ва наибольшее изменение энергии связывания с барстаром происходит при замене Агд59, Азп58 и остатков активного центра: Ьу&27, Агд87 и №$102 [75] (рис. 8).

В молекуле В* наиболее заметное влияние на связывание с Ва оказывает замена отрицательно заряженных аминокислот [75]. Например, В* с мутациями Авр35Ьу8 и АярЗЭЬуз не обладает ингибирующей активностью, в то время как замена А5р39А1а приводит к увеличению к_ ] в 3x105 раз. Это может быть объяснено многочисленными солевыми мостиками и водородными связями между

Asp39 и остатками активного центра барназы Arg83, Arg87 и Hisl02. Введение мутации Asp35Ala в В* увеличивает k_i в 1000 раз.

Анализ структуры комплекса Ва —В* (Cys42,80 Ala) дает возможность более детально изучить роль различных взаимодействий при образовании белок — белковых ассоциатов [66, 73]. В" ингибирует Ва путем стерического блокирования активного центра а — спиральку и сегментом смежной петли. Половина из 14 водородных связей, присутствующих в участке связывания между Ва и В*, образованы парами заряженных остатков и треть — парами, где хотя бы одна из кислот заряжена [93]. При связывании с ингибитором два фосфат — связывающих участка в активном центре Ва оказываются занятыми остатками Asp39 В* и Gly43 В*. Наибольшие изменения в скорости водородно — дейтериевого обмена наблюдаются для остатков, находящихся в активном центре и в субстрат — связывающей петле [76]. Таким образом, связывание с Ва индуцирует структурные перестройки в молекуле белкового ингибитора [93].

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Язынин, Сергей Анатольевич

ГЛАВА 4. ВЫВОДЫ

1. Впервые разработана высокоэффективная векторная система для молекулярного клонирования с позитивной селекцией, использующая в качестве селективного маркера ген рибонуклеазы. Получены векторные плазмиды, содержащие в кодирующей части гена рибонуклеазы из Bacillus amyloliquefaciens — барназы участки узнавания 2 (рМТ438) и 10 (рМТ440) наиболее употребительных рестрикционных эндонуклеаз.

2. Впервые получены инсерционные мутанты барназы, содержащие вместо Val —36 вставки из 6 и 19 аминокислот. Продемонстрировано наличие ферментативной активности у таких мутантов, что согласуется с данными о структурно — функциональной организации барназы, положенными в основу разработанного подхода.

3. Впервые сконструирован фагемидный вектор рВа —7 с позитивной селекцией, использующий летальный эффект гена барназы. Вектор предоставляет возможности для клонирования протяженных фрагментов чужеродной ДНК с использованием широкого набора рестриктаз, секвенирования с помощью универсальных праймеров, получения одноцепочечной ДНК, а также для синтеза РНК in vitro.

4. Разработана полуколичественная методика оценки ферментативной активности мутантов барназы по их цитотоксичности, основанная на измерении среднестатистического диаметра бактериальных колоний. С ее помощью оценено влияние ПЦР — индуцированных мутаций на ферментативную активность модифицированной барназы, содержащей вставку из 6 аминокислот по положению Val — 36.

5. Эффективность разработанных векторов оценена как на примере клонирования индивидуальных фрагментов ДНК, так и на примерах получения геномной библиотеки из Bacillus amyloliquefaciens и кДНК — клонотеки иммуноглобулиновых генов мыши. Показано, что описанные вектора обеспечивают надежный отбор позитивных клонов.

Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю д.б.н. С.М. Дееву за внимание, поддержку и чуткое руководство работой.

Автор глубоко признателен за сотрудничество в работе и постоянную доброжелательную поддержку части работы, сделанной в Биохимическом Институте Университета г. Киля, Западная Германия, немецким коллегам: профессорам: X. Лемке, Б. Хавстену, В. Гизельману, докторам: X. Ланге, X. Тирзе, X. Хансену, К. Хаманну, К. Хайдорну, Т. Киселевой и Я. Малых, биологам и докторантам медицинского факультета Университета г. Киля: К.Писот, Т.Мокросу, А.Реке и С. Дитриху.

Автор глубоко благодарен за участие и всестороннюю поддержку данного исследования профессору Р.Хартли (NIH, Bethesda, USA).

Автор выражает глубокую благодарность профессору, д.б.н. О.Л.Поляновскому, д.б.н. А.А.Габибову за помощь, доброжелательность, полезное обсуждение и чуткое отношение.

Заключение

Таким образом, разработаны два вектора с позитивной селекцией, использующие летальный эффект гена барназы: рМТ440 и рВа —7. Один из них — вектор рМТ440 — предназначен для решения основных задач клонирования и субклонирования фрагментов ДНК, другой — фагемида рВа —7 — является современным вектором, предоставляющим широкий спектр возможностей для генного инженера.

Позитивный опыт этих разработок позволяет заключить, что разработанный принцип селекции рекомбинантных клонов с использованием условнолетального гена барназы может лечь в основу создания нового поколения векторов с нулевым фоном.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Язынин, Сергей Анатольевич, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bernard Р, New ccdB positive — selection cloning vectors with kanamycin or chloramphenicol selectable markers. Gene 162(1): 159 — 60, 1995.

2. Yazynin SA, Deyev SM, Jucovic M and Hartley RW, A plasmid vector with positive selection and directional cloning based on a conditionally lethal gene. Gene 159(1): 131-2, 1996.

3. Deyev SM, Yazynin SA, Kuznetsov DA, Jukovich M and Hartley RW, Ribonuclease — charged vector for facile direct cloning with positive selection. Mol Gen Genet 259(4): 379-82, 1998.

4. Vieira J and Messing J, The pUC plasmids, an M13mp7 —derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19(3): 259-68, 1982.

5. Henrich В and Schmidtberger B, Positive — selection vector with enhanced lytic potential based on a variant of phi X174 phage gene E. Gene 154(1): 51-4, 1995.

6. Henrich В and Plapp R, Use of the lysis gene of bacteriophage phi XI74 for the construction of a positive selection vector. Gene 42(3): 345 — 9, 1986.

7. Ozaki LS, Maeda S, Shimada К and Takagi Y, A novel ColEl::Tn3 plasmid vector that allows direct selection of hybrid clones in E. coli. Gene 8(3): 301-14, 1980.

8. Vernet T, Lau PC, Narang SA and Visentin LP, A direct — selection vector derived from pColE3 — CA38 and adapted for foreign gene expression. Gene 34(1): 87-93, 1985.

9. Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T, Molecular cloning : a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

10. Ullmann A, Complementation in beta — galactosidase: from protein structure to genetic engineering. Bioessays 14(3): 201 — 5, 1992.

11. Testori A, Listowsky I and Sollitti P, Direct cloning of unmodified PCR products by exploiting an engineered restriction site. Gene 143(1): 151 — 2, 1994.

12. Shuman S and Prescott J, Specific DNA cleavage and binding by vaccinia virus DNA topoisomerase I. J Biol Chem 265(29): 17826-36, 1990.

13. Shuman S, Novel approach to molecular cloning and polynucleotide synthesis using vaccinia DNA topoisomerase. J Biol Chem 269(51): 32678 — 84, 1994.

14. Gabant P, Dreze PL, Van Reeth T, Szpirer J and Szpirer C, Bifunctional lacZ alpha —ccdB genes for selective cloning of PCR products. Biotechniques 23(5): 938-41, 1997.

15. Hengen PN, Methods and reagents. Reducing background colonies with positive selection vectors. Trends Biochem Sci 22(3): 105 — 6, 1997.

16. Miki T, Yoshioka K and Horiuchi T, Control of cell division by sex factor F in Escherichia coli. I. The 42.84 — 43.6 F segment couples cell division of the host bacteria with replication of plasmid DNA. J Mol Biol 174(4): 605 — 25, 1984.

17. Miki T, Chang ZT and Horiuchi T, Control of cell division by sex factor F in Escherichia coli. II. Identification of genes for inhibitor protein and trigger protein on the 42.84-43.6 F segment. J Mol Biol 174(4): 627-46, 1984.

18. Karoui H, Bex F, Dreze P and Couturier M, Ham22, a mini —F mutation which is lethal to host cell and promotes recA— dependent induction of lambdoid prophage. Embo J 2(11): 1863-8, 1983.

19. Ogura T and Hiraga S, Mini —F plasmid genes that couple host cell division to plasmid proliferation. Proc Natl Acad Sci USA 80(15): 4784 — 8, 1983.

20. Jaffe A, Ogura T and Hiraga S, Effects of the ccd function of the F plasmid on bacterial growth. J Bacteriol 163(3): 841-9, 1985.

21. Bernard P and Couturier M, Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA— topoisomerase II complexes. J Mol Biol 226(3): 735-45, 1992.

22. Bernard P, Kezdy KE, Van Melderen L, Steyaert J, Wyns L, Pato ML, Higgins PN and Couturier M, The F plasmid CcdB protein induces efficient ATP-dependent DNA cleavage by gyrase. J Mol Biol 234(3): 534-41, 1993.

23. Van Melderen L, Bernard P and Couturier M, Lon — dependent proteolysis of CcdA is the key control for activation of CcdB in plasmid — free segregant bacteria. Mol Microbiol 11(6): 1151 — 7, 1994.

24. Van Melderen L, Thi MHD, Lecchi P, Gottesman S, Couturier M and Maurizi MR, ATP — dependent degradation of CcdA by Lon protease. Effects of secondary structure and heterologous subunit interactions. J Biol Chem 271(44): 27730-8, 1996.

25. Bernard P, Gabant P, Bahassi EM and Couturier M, Positive — selection vectors using the F plasmid ccdB killer gene. Gene 148(1): 71 — 4, 1994.

26. Schlieper D, von Wilcken — Bergmann B, Schmidt M, Sobek H and Muller—Hill B, A positive selection vector for cloning of long polymerase chain reaction fragments based on a lethal mutant of the crp gene of Escherichia coli. Anal Biochem 257(2): 203-9, 1998.

27. Kolb A, Busby S, Buc H, Garges S and Adhya S, Transcriptional regulation by cAMP and its receptor protein. Annu Rev Biochem 62: 749 — 95, 1993.

28. Stryer L, Biochemie. Spektrum, Heidelberg, 836-7, 1990 .

29. Lopata M, Schlieper D, von Wilcken — Bergmann B and Muller —Hill B, A lethal mutant of the catabolite gene activator protein CAP of Escherichia coli. Biol Chem 378(10): 1153-62, 1997.

30. Schultz SC, Shields GC and Steitz TA, Crystal structure of a CAP-DNA complex: the DNA is bent by 90 degrees. Science 253(5023): 1001-7, 1991.

31. Parkinson G, Wilson C, Gunasekera A, Ebright YW, Ebright RE and Berman HM, Structure of the CAP —DNA complex at 2.5 angstroms resolution: a complete picture of the protein —DNA interface. J Mol Biol 260(3): 395-408, 1996.

32. Pevny L, Simon MC, Robertson E, Klein WH, Tsai SF, D'Agati V, Orkin SH and Costantini F, Erythroid differentiation in chimaeric mice blocked by a targeted mutation in the gene for transcription factor GATA— 1. Nature 349(6306): 257-60, 1991.

33. Trudel P, Provost S, Massie B, Chartrand P and Wall L, pGATA: a positive selection vector based on the toxicity of the transcription factor GATA — 1 to bacteria. Biotechniques 20(4): 684-93, 1996.

34. Ko U and Engel JD, DNA-binding specificities of the GATA transcription factor family. Mol Cell Biol 13(7): 4011-22, 1993.

35. Merika M and Orkin SH, DNA—binding specificity of GATA family transcription factors. Mol Cell Biol 13(7): 3999-4010, 1993.

36. Smith DB and Johnson KS, Single —step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S — transferase. Gene 67(1): 31-40, 1988.

37. Chan RY, Palfree RG, Congote LF and Solomon S, Development of a novel type of cloning vector for suicide selection of recombinants. DNA Cell Biol 13(3): 311-9, 1994.

38. Zhu QZ, Hu J, Mulay S, Esch F, Shimasaki S and Solomon S, Isolation and structure of corticostatin peptides from rabbit fetal and adult lung. Proc Natl Acad Sci USA 85(2): 592-6, 1988.

39. Selsted ME, Harwig SS, Ganz T, Schilling JW and Lehrer RI, Primary structures of three human neutrophil defensins. J Clin Invest 76(4): 1436 — 9,

1985.

40.Mongkolsuk S, Rabibhadana S, Vattanaviboon P and Loprasert S, Generalized and mobilizable positive — selection cloning vectors. Gene 143(1): 145-6, 1994.

41. Marsh JL, Erfle M and Wykes EJ, The pIC plasmid and phage vectors with versatile cloning sites for recombinant selection by insertional inactivation. Gene 32(3): 481-5, 1984.

42. Kast P, pKSS--a second — generation general purpose cloning vector

for efficient positive selection of recombinant clones. Gene 138(1 — 2): 109— 14, 1994.

43. Kuhn I, Stephenson FH, Boyer HW and Greene PJ, Positive — selection vectors utilizing lethality of the EcoRI endonuclease. Gene 42(3): 253 — 63,

1986.

44. Arakawa Y, Wacharotayankun R, Ohta M, Shoji K, Watahiki M, Horii T and Kato N, Construction of a novel suicide vector: selection for Escherichia coli HB101 recombinants carrying the DNA insert. Gene 104(1): 81-4, 1991.

45. Stevis PE and Ho NW, A novel xylB—based positive selection vector. Plasmid 20(1): 92-5, 1988.

46. Noyer—Weidner M and Reiners — Schramm L, Highly efficient positive selection of recombinant plasmids using a novel rglB—based Escherichia coli K- 12 vector system. Gene 66(2): 269-78, 1988.

47. Barros EV, Bataus LA, Valencia FF, Maranhao AQ and Astolfi - Filho S, A novel cloning system for direct screening using a suicidal strategy. Gene 179(2): 287-9, 1996.

48. Burns DM and Beacham IR, Positive selection vectors: a small plasmid vector useful for the direct selection of Sau3A—generated overlapping DNA fragments. Gene 27(3): 323-5, 1984.

49. Collins FS, Patrinos A, Jordan E, Chakravarti A, Gesteland R and Walters L, New goals for the U.S. Human Genome Project: 1998-2003. Science 282(5389): 682-9, 1998.

50. Lennon G, Auffray C, Polymeropoulos M and Soares MB, The I.M.A.G.E. Consortium: an integrated molecular analysis of genomes and their expression. Genomics 33(1): 151 — 2, 1996.

51. Lelias JM, de Leon L, Jerpseth B and Soares S, Human universal cDNA Library Array I. Strategies Newsletter 11(2): 29-32, 1998.

52. Bussow K, Cahill D, Nietfeld W, Bancroft D, Scherzinger E, Lehrach H and Walter G, A method for global protein expression and antibody screening

on high— density filters of an arrayedcDNA library [In Process Citation]. Nucleic Acids Res 26(21): 5007-8, 1998.

53. Paddon CJ and Hartley RW, Cloning, sequencing and transcription of an inactivated copy of Bacillus amyloliquefaciens extracellular ribonuclease (barnase). Gene 40(2-3): 231-9, 1985.

54. Paddon CJ and Hartley RW, Expression of Bacillus amyloliquefaciens extracellular ribonuclease (barnase) in Escherichia coli following an inactivating mutation. Gene 53(1): 11 — 9, 1987.

55. Hartley RW and Paddon CJ, Use of plasmid pTVl in transposon mutagenesis and gene cloning in Bacillus amyloliquefaciens. Plasmid 16(1): 45-51, 1986.

56. Hartley RW, Barnase and barstar. Expression of its cloned inhibitor permits expression of a cloned ribonuclease. J Mol Biol 202(4): 913 — 5, 1988.

57. Hartley RW, Barnase and barstar: two small proteins to fold and fit together. Trends Biochem Sci 14(11): 450-4, 1989.

58. Nambiar KP, Stackhouse J, Presnell SR and Benner SA, Expression of bovine pancreatic ribonuclease A in Escherichia coli [published erratum appears in Eur J Biochem 1987 May 4;164(3):713]. Eur J Biochem 163(1): 6771, 1987.

59. Tarragona —Fiol A, Taylorson CJ, Ward JM and Rabin BR, Production of mature bovine pancreatic ribonuclease in Escherichia coli. Gene 118(2): 239-45, 1992.

60. Mossakowska DE, Nyberg K and Fersht AR, Kinetic characterization of the recombinant ribonuclease from Bacillus amyloliquefaciens (barnase) and

investigation of key residues in catalysis by site — directed mutagenesis. Biochemistry 28(9): 3843-50, 1989.

61. Meiering EM, Bycroft M and Fersht AR, Characterization of phosphate binding in the active site of barnase by site — directed mutagenesis and NMR. Biochemistry 30(47): 11348-56, 1991.

62. Meiering EM, Serrano L and Fersht AR, Effect of active site residues in barnase on activity and stability. J Mol Biol 225(3): 585-9, 1992.

63. Yakovlev GI, Moiseyev GP, Struminskaya NK, Romakhina ER, Leshchinskaya IB and Hartley RW, Increase of specificity of RNase from Bacillus amyloliquefaciens (barnase) by substitution of Glu for Ser57 using site — directed mutagenesis. Eur J Biochem 215(1): 167 — 70, 1993.

64. Bastyns K, Froeyer M, Volckaert G and Engelborghs Y, The role of Glu —60 in the specificity of the recombinant ribonuclease from Bacillus amyloliquefaciens (barnase) towards dinucleotides, poly(A) and RNA. Biochem J300(Pt 3): 737-42, 1994.

65. Day AG, Parsonage D, Ebel S, Brown T and Fersht AR, Barnase has subsites that give rise to large rate enhancements. Biochemistry 31(28): 6390 — 5, 1992.

66. Buckle AM, Schreiber G and Fersht AR, Protein — protein recognition: crystal structural analysis of a barnase— barstar complex at 2.0 —A resolution. Biochemistry 33(30): 8878-89, 1994.

67. Baudet S and Janin J, Crystal structure of a barnase —d(GpC) complex at 1.9 A resolution. J Mol Biol 219(1): 123-32, 1991.

68. Sancho J and Fersht AR, Dissection of an enzyme by protein engineering. The N and C — terminal fragments of barnase form a native — like complex with restored enzymic activity. J Mol Biol 224(3): 741 — 7, 1992.

69. Hartley RW, Rogerson DL, Jr. and Smeaton JR, Production and purification of the extracellular ribonuclease of Bacillus amyloliguefaciens (barnase) and its intracellular inhibitor (barstar). II. Barstar. Prep Biochem 2(3): 243-50, 1972.

70. Hartley RW and Smeaton JR, On the reaction between the extracellular ribonuclease of Bacillus amyloliquefaciens (barnase) and its intracellular inhibitor (barstar). J Biol Chem 248(16): 5624-6, 1973.

71. Hartley RW, A reversible thermal transition of the extracellular ribonuclease of Bacillus amyloliquefaciens. Biochemistry 7(6): 2401 — 8, 1968.

72. Hartley RW, A two —state conformational transition of the extracellular ribonuclease of Bacillus amyloliquefaciens (barnase) induced by sodium dodecyl sulfate. Biochemistry 14(11): 2367-70, 1975.

73. Guillet V, Lapthorn A, Fourniat J, Benoit JP, Hartley RW and Mauguen Y, Crystallization and preliminary X —ray investigation of barstar, the intracellular inhibitor of barnase. Proteins 17(3): 325 — 8, 1993.

74. Lubienski MJ, Bycroft M, Freund SM and Fersht AR, Three-dimensional solution structure and 13C assignments of barstar using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochemistry 33(30): 8866 — 77, 1994.

75. Schreiber G and Fersht AR, Interaction of barnase with its polypeptide inhibitor barstar studied by protein engineering. Biochemistry 32(19): 5145 — 50, 1993.

76. Jones DN, Bycroft M, Lubienski MJ and Fersht AR, Identification of the barstar binding site of barnase by NMR spectroscopy and hydrogen — deuterium exchange. FEBS Lett 331(1-2): 165-72, 1993.

77. Fasman GD and Chemical Rubber Company., Handbook of biochemistry and molecular biology. CRC Press, Cleveland, 1975.

78. Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J, Molecular cloning : a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982.

79. Mullis KB and Faloona FA, Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase — catalyzed chain reaction. Methods Enzymol 155: 335 — 50, 1987.

80. Lange H, Solterbeck M, Berek C and Lemke H, Correlation between immune maturation and idiotypic network recognition. Eur J Immunol 26(9): 2234-42, 1996.

81. Hanahan D, Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol 166(4): 557-80, 1983.

82. Perrin S and Gilliland G, Site — specific mutagenesis using asymmetric polymerase chain reaction and a single mutant primer. Nucleic Acids Res 18(24): 7433-8, 1990.

83. Lee LG, Spurgeon SL, Heiner CR, Benson SC, Rosenblum BB, Menchen SM, Graham RJ, Constantinescu A, Upadhya KG and Cassel JM, New energy transfer dyes for DNA sequencing. Nucleic Acids Res 25(14): 2816-22, 1997.

84. Chomczynski P and Sacchi N, Single —step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate— phenol — chloroform extraction. Anal Biochem 162(1): 156-9, 1987.

85. Laemmli UK, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227(259): 680-5, 1970.

86. Kabat EA and National Institutes of Health (U.S.). Division of Research Resources., Sequences of immunoglobulin chains : tabulation and analysis of amino acid sequences of precursors, V-regions, С-regions, J-chain and [beta] 2-microglobulins, 1979. U. S. Dept. of Health, Bethesda, 1979.

87. Kabat EA, National Institutes of Health (U.S.) and Columbia University., Sequences of proteins of immunological interest. U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, 1991.

88. Yanisch — Perron C, Vieira J and Messing J, Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC 19 vectors. Gene 33(1): 103-19, 1985.

89. Abagyan R and Totrov M, Biased probability Monte Carlo conformational searches and electrostatic calculations for peptides and proteins. J Mol Biol 235(3): 983- 1002, 1994.

90. Wu E, Croucher PI and McKie N, Expression of members of the novel membrane linked metalloproteinase family ADAM in cells derived from a range of haematological malignancies. Biochem Biophys Res Commun 235(2): 437-42, 1997.

91. Jucovic M and Hartley RW, In vivo system for the detection of low level activity barnase mutants. Protein Eng 8(5): 497 — 9, 1995.

92. Нуркиянова K.M., Шульга А.А., Захарьев B.M., Кирпичников М.П.,Скрябин К.Г., Баев А.А. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности гена РНКазы Bacillus intermedius, Докл. Академии наук СССР, т. 309.. с. 1476- 1479, 1989.

93. Курбанов Ф.Т. Структурно — функциональное картирование молекул барназы и биназы методом гибридных генов. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Москва, 1996.

94. Афанасенко Г.А., Дудкин С.М., Каминир A.B. Первичная структура РНКазы Bacillus intermedius. Биоорганическая химия., т. 5., с. 187 — 202, 1979

95. Shiyanov P.A., Bespalov I.A., Terletskaya H.N. and Deyev S.M. X78108 GenBank report. M.musculus (BALB/c) mRNA for immunoglobulin kappa light chain variable region, 1994.

96. Shiyanov P.A., Bespalov I.A., Terletskaya H.N. and Deyev S.M. X78107 GenBank report. M.musculus (BALB/c) mRNA for immunoglobulin gamma 1 chain heavy chain variable region, 1994.