Изучение транспорта Ti-плазмида pGV3850 из Agrobacterium tumefaciens в Escherichia coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Великов, Владимир Александрович

• Великов, Владимир Александрович
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Великов, Владимир Александрович

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Взаимоотношения фитопатогенных агробактерий с растениями

1.1.1. "Генетическая колонизация"

1.1.2. Структурно-функциональная организация Тьплазмид

1.2. Гены коньюгационного переноса Тьплазмид и регуляция

их экспрессии

1.2.1. Перенос Тьплазмид при конъюгации бактерий

1.2.2. Организация генов коньюгационного переноса Тьплазмид

1.2.3. Экспрессия генов коньюгационного переноса Тьплазмид

1.2.4. Гомология системы коньюгационного переноса Тьплазмид

с другими системами

1.3. Хромосомные гены вирулентности агробактерий

1.3.1. Хромосомные мутации, влияющие на патогенность микроорганизма

1.3.2. Сходство ранних этапов взаимодействия Agrobacterium и ЯкггоЫит с растениями

1.4. Ть и Ил-плазмидные гены вирулентности агробактерий и регуляция их экспрессии

1.4.1. Организация у/У-генов Тьплазмид

1.4.2. Экспрессия угУ-генов Тьплазмид

1.5. Процессинг Т-ДНК в бактериальной клетке и ее перенос в клетки растений

1.5.1. Формы процессированной Т-ДНК

1.5.2. Конъюгативная модель переноса Т-ДНК

1.6. Структурно-функциональное сходство vir- и /га-генов как доказательство конъюгативной модели

1.7. Взаимодействие систем переноса ДНК Ti-плазмид

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы

2.1.1. Оборудование

1.1.2. Реактивы и ферменты

2.1.3. Бактериальные штаммы и плазмиды

2.1.4. Растения

2.1.5. Среды, растворы

2.2. Методы

2.2.1. Проведение скрещиваний между Agrobacterium tumefaciens и Escherichia coli

2.2.2. Проведение скрещиваний в условиях, индуцирующих экспрессию v/л-генов

2.2.3. Анализ трансконъюгантов

2.2.4. Быстрое выделение небольших количеств плазмидной

ДНК методом щелочного лизиса

2.2.5. Модифицированный метод скрининга плазмид в геле

по Секару

2.2.6. Модифицированный метод выделения плазмидной ДНК

по Бирнбойму и Доли

2.2.7. Скрингинг плазмид в геле по Экхардту

2.2.8. Выделение тотальной ДНК из клеток E.coli

2.2.9. Приготовление компетентных клеток E.coli и их трансформация препартами плазмидной ДНК

2.2.10. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля

2.2.11. Приготовление ДНК-зондов и и блот-гибридизация ДНК

2.2.12. Введение векторных плазмид в Erwinia carotovora и эксперименты по трансформации растений

2.2.13. Клонирование ДНК

РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Конъюгационный перенос Ti-плазмиды pGV3850 из Agrobacterium tumefaciens в Escherichia coli

3.2. Перенос Ti-плазмиды pGV3850 из Agrobacterium tumefaciens в Escherichia coli в условиях, индуцирующих экспрессию уг>-генов

3.3. Анализ трансконъюгантов

3.4. Рестрикционный и гибридизационный анализ плазмид, полученных при скрещиваниях в условиях экспрессии Wr-генов

3.5. Клонирование у/>-области Ti-плазмиды pGV3850

3.6. Введение Wr-генов Agrobacterium tumefaciens в Erwinia carotovora и использование эрвинии в экспериментах по трансформации растений

3.7. Способ предотвращения размножения клеток Agrobacterium и Erwinia на среде для культивирования трансформируемых тканей растений

3.8. Скрещивания штаммов Agrobacterium tumefaciens, содержащих плазмиды бинарной векторной системы трансформации растений, с Escherichia coli

ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ЛИТЕРАТУРА

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БОБ - додецилсульфат натрия;

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат;

Трис - трис(оксиметил)аминометан;

БФС - бромфеноловый синий;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

1РТО - изопропилтиогалактозид;

Х-ва1 - 5-бром-4-хлор-3-индолил-{3-галактозид;

Ьр, п.н. - пар нуклеотидов;

кЬ, т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов;

МЮА - мегадальтон;

кОа - килодальтон;

РНКаза - рибонуклеаза;

ДНКаза - дезоксирибонуклеаза;

АТР - аденозинтрифосфат.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение транспорта Ti-плазмида pGV3850 из Agrobacterium tumefaciens в Escherichia coli»

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность работы. Свойство бактерий вида Agrobacterium tumefaciens вызывать у растений корончатогалловую болезнь связано с присутствием в их клетках крупных (95-156 MDa) конъюгативных плаз-мид - Ti-плазмид (tumor-inducing plasmid). В процессе инфицирования растений часть генетического материала Ti-плазмиды - Т-ДНК (transferred DNA) - переносится в растительные клетки и интегрируется в хромосомы, становясь частью наследственного аппарата высшего растения. Гены Т-ДНК, экспрессирующиеся в трансформированных растительных клетках, нарушают их фитогормональный статус, что приводит к развитию опухоли, и детерминируют синтез растениями необычных для них соединений - опинов, которые катаболизируются агробактериями. Опины выступают также в качестве стимуляторов экспрессии генов транспорта плазмиды (/га-генов) между клетками Agrobacterium при конъюгации, происходящей в природе в тканях корончатого галла (in planta). В отсутствии опинов дерепрессия tra-генов может произойти в результате спонтанных мутаций.

Перенос Т-ДНК в растительные клетки контролируют vzr-гены Ti-плазмиды, экспрессирующиеся в присутствии специфических индукторов - соединений фенольной природы из экссудатов механически поврежденных тканей растений. Транспорт Т-ДНК в растения осуществляется по механизму, сходному с механизмом транспорта ДНК при конъюгации бактерий. Получены данные о значительном структурном сходстве между белками и функциональными участками ДНК, вовлеченными в процесс передачи Т-ДНК и в процесс конъюгационного транспорта некоторых плазмид. Так, уг>-гены проявляют значительную гомологию ДНК с rra-генами конъюгативных плазмид широкого круга хозяев, а границы Т-ДНК являются структурно-функциональными

аналогами опТ. КгУ-гены Ti-плазмид проявляют гомологию также с собственными г/чз-генами, хотя и значительно менее выраженную.

Вопрос о взаимодействии этих двух родственных систем переноса ДНК в клетках агробактерий изучен мало. Мало известно о том, как экспрессия генов одной системы влияет на экспрессию другой. Не известно, способна ли система транспорта Т-ДНК в растения обеспечивать ее перенос в клетки бактерий. Нет полной ясности в вопросе о том, возможен ли транспорт Т-ДНК в растения из бактерий, не родственных Agrobacterium. В связи с широким использованием Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes в генной инженерии растений актуален также вопрос об опасности переноса элементов агробактери-альной системы трансформации растений в другие бактерии с приобретением ими трансформирующей способности.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение переноса Ti-плазмид и их Т-ДНК из клеток A.tumefaciens в клетки E.coli при конъюгации. Для этого в работе использовали векторную Ti-плазмиду для трансформации растений pGV3850 со встроенной в область Т-ДНК плазмидой pBR322. Структура pGV3850 позволяет следить за ее переносом (или переносом ее Т-ДНК) в кишечную палочку по спасению маркера ампициллин-резистентности плазмиды pBR322. Способность к автономному поддержанию в энтеробактериях позволяет исследовать возможность функционального выражения ген етического материала Ti-плазмид в неродственных бактериях. Структура этой векторной Ti-плазмиды позволяет также изучить влияние экспрессии vir-генов на процесс переноса плазмиды и выяснить вопрос об их способности обеспечивать транспорт Т-ДНК в бактерии.

В число основных задач входило:

1) Изучение транспорта Ti-плазмид в клетки неродственных бактерий при конъюгации.

2) Исследование влияния экспрессии у//--генов на процесс переноса Ti-плазмид.

3) Выяснение вопроса о возможности транспорта Т-ДНК в бактерии.

4) Клонирование wV-области Ti-плазмиды pGV3850 в клетках E.coli в высококопийной плазмиде на основе Со1Е1-репликона.

5) Введение v/У-генов A.tumefaciens в клетки взаимодействующих с растениями бактерий Erwinia carotovora и Erwinia herbicola и выяснение вопроса об их функциональном выражении в неродственных бактериях-хозяевах. Оценка риска распространения генов агробактериальных систем вирулентности среди бактерий.

6) Разработка способа предотвращения размножения A.tumefaciens на среде для культивирования трансформированных тканей растений.

Научная новизна работы. Впервые получена представительная коллекция производных векторной Ti-плазмиды pGV3850 с протяженными делециями генетического материала. Показано, что, несмотря на структурно-функциональную общность, система конъюгационного переноса Ti-плазмид и система транспорта Т-ДНК в растения работают независимо друг от друга и не взаимозаменяемы. Установлено, что система транспорта Т-ДНК в растения не способна обеспечить ее перенос в бактерии. Выделены методами "клонирования in vivo" гены у/>-области Ti-плазмиды pGV3850 в составе единого кластера в высококопийной плазмиде на основе Со1Е1-репликона. KzV-гены Agrobacterium tumefaciens введены в клетки взаимодействующих с растениями бактерий Erwinia carotovora и Erwinia herbicola; показано их стабильное поддержание в новых хозяевах и отсутствие способности трансформировать растения. В связи с этим оценена как незначительная опасность распространения генов вирулентности агробактерий среди микроорганизмов.

Практическое значение работы. В ходе работы получен широкий набор делеционных производных Ti-плазмиды pGV3850, в том числе

содержащих все у/г-гены. Разработан способ предотвращения размножения АЛите/а&ет на среде для культивирования растений при проведении их генетической трансформации. Предложенный метод позволяет устранить нежелательное стрессовое воздействие высоких доз антибиотика на трансформированные экспланты. Описанное явление делетирования 'Птплазмид, содержащих ориджин репликации опУ плазмиды Со1Е1, в результате переноса из клеток почвенных бактерий в клетки кишечной палочки предлагается использовать для клонирования фрагментов ДНК мегаплазмид.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Взаимоотношения фитопатогенных агробактерий с растениями 1.1.1. "Генетическая колонизация"

В природе растения постоянно контактируют с огромным количеством различных микроорганизмов. Однако, лишь небольшое число их видов способны формировать с растениями сравнительно стабильные ассоциации. В первую очередь это относится к бактериям, находящимся с растениями в отношения симбиоза, паразитизма или ассоциативного взаимодействия.

Изучение на молекулярном уровне патогенеза, вызванного у растений фитопатогенными агробактериями, выявило совершенно особый тип паразитизма. Патогенное начало Ti-плазмид бактерий вида Agrobacterium tumefaciens и Ri-плазмид бактерий вида Agrobacterium rhizogenes заключается в том, что их фрагмент, так называемая Т-ДНК (transferred DNA), переносится в растительную клетку и интегрируется в ядерную ДНК, становясь частью наследственного аппарата высшего растения (Chilton et al., 1977). Трансформированные клетки растений начинают производить необычные для них соединения - опины, которые усваиваются бактериями (Petit et al., 1978). Такой тип взаимоотношений между организмами был назван "генетической колонизацией". Грамотрицательные почвенные бактерии вида Agrobacterium tumefacies вызывают у растений опухоли, называемые корончатыми галлами (Zaenen et al., 1974). Причиной неоплазии у растений является интеграция в их геном части генетического материала агробактериаль-ной Ti-плазмиды - Т-ДНК (Van Larebeke et al., 1974; Chilton et al., 1977). Экспрессирующиеся в трансформированных растительных клетках гены Т-ДНК нарушают их гормональный статус, приводящий к развитию опухоли (гены синтеза фитогормонов), и детерминируют синтез растениями опинов (гены опин-синтетаз). Опины представляют собой

конъюгаты некоторых аминокислот с оксикислотами (Klapwijk et al., 1978). Эти соединения катаболизируются агробактериями, выступая в качестве единственного источника углерода, азота и энергии, и, кроме того, служат индукторами экспрессии ira-генов, контролирующих перенос Ti-плазмид между клетками агробактерий при конъюгации, происходящей в природе в тканях корончатого галла (Kerr et al., 1977). Для микроорганизма это имеет приспособительное значение. В случае инфицирования растения в месте его механического повреждения и появления опинов в тканях развивающейся опухоли, размножившиеся клетки бактерий приобретают способность переносить Ti-плазмиды в клетки других штаммов агробактерий, которые тех не содержат.

1.1.2. Стуктурно-функциональная организация Ti-плазмид

На рис.1 приведена карта-схема нопалиновой плазмиды штамма A.tumefaciens С58 (Holsters et al.,1980), поражающего различные двудольные растения.

Т-ДНК

КБ

Рис. 1. Функциональная организация плазмиды pTiC58. VIR - область вирулентности,Noc - область, обеспечивающая катаболизм нопалина, LB, RB - левая и правая границы Т-ДНК, Tra,Trb - области ira-регулона, контролирующие конъюгацию, oriT - область инициации репликации при конъюгационном переносе, oriV - область вегетативной репликации плазмиды.

Т-ДНК Ti-плазмиды ограничена несовершенными 24-членными прямыми повторами нуклеотидов - границами Т-ДНК, правая из которых является абсолютно необходимой для ее нормального процессинга и переноса (Wang et al., 1984). Различия в пограничных повторах составляют несколько нуклеотидов. Процессинг Т-ДНК в бактериальных клетках и ее транспорт в клетки растений осуществляется в результате экспрессии у/>-генов Ti-плазмид. F/V-регулон, за исключением генов virA и virG, в норме зарепрессирован и его гены экспрессируются только в присутствии специфических индукторов -соединений фенольной природы типа ацетосирингона (4-ацетил-2,6-диметоксифенол) из экссудатов механически поврежденных тканей растений. Эти гены экспрессируются при особых условиях - низком значении рН и фосфатном голодании.

Перенос Ti-плазмиды между бактериями при конъюгации контролируется генами ira-регулона, картируемого в двух независимых регионах. Стимуляторами экпрессии генов конъюгационного переноса являются опины. Их катаболизм также контролируется особым регионом Ti-плазмиды.

Таким образом, обе системы переноса генетического материала природных Ti-плазмид (для транспорта Т-ДНК в растения и для переноса плазмиды в агробактерии при конъюгации) экспрессируются только в присутствии сигнальных молекул, поступающих из контактирующих с бактериями растительных клеток. Первая - в присутствии фенольных соединений из поврежденных растительных клеток, восстанавливающих клеточную стенку, вторая - в присутствии опинов, продуцируемых трансформированными клетками опухоли. Описаны спонтанные мутанты агробактерий с конститутивным транспортом Ti-плазмид (Holsters et al., 1980; Ellis et al., 1982).

1.2. Гены конъюгационного транспорта Ti-плазмид и регуляция их экспрессии

1.2.1. Перенос Ti-плазмид при конъюгации

Ti-плазмиды Ag'robacterium tumefaciens относятся к конъюгативным плазмидам и способны передаваться при скрещиваниях от одних клеток Agrobacterium к другим, бесплазмидным (Genetello et al., 1977; Kerr et al., 1977; Beck von Bodman et al., 1989). Экспрессия генов ¿ra-регулона (среди которых у агробактерий различают tra- и //-¿-гены (Cook at al., 1997; Alt-Moerbe et al., 1996) стимулируется, как уже отмечалось, специфическими растительными метаболитами - опинами, появляющимися в клетках растений в процессе формирования и развития опухоли. Опины представляют собой конъюгаты аргинина с кетокислотами - а-кето-глютаровой (нопалин) и пировиноградной (октопин). Тип катаболизи-руемого опина определяется типом плазмиды. Активация генов катаболизма опинов и индукция экспресии /га-генов происходит сопряженно (Fuqua and Winans,1994; Habeeb et al., 1991). Как показывают работы последних лет гены конъюгационного транспорта плазмиды могут быть активированы в результате автоиндукции при наличии в среде "агробактериального автоиндуктора" - N-ацил-гомосерин-лакто-на, продуцируемого arpo бактерия ми (Piper et al., 1993; Zhang et al., 1993; Hwang et al.,1995; Cook et al., 1997). Синтез бактериями этого автоиндуктора также зависит от появления опинов в среде. Как только по мере увеличения плотности бактериальной популяции в корончатом галле накапливается достаточно много автоиндуктора в среде обитания бактерий, Ti-плазмиды приобретают способность к эффективной передаче между бактериальными клетками. Конъюгация происходит только при достаточно большом количестве донорных клеток (система quorum sensing). Подобные регуляторные системы, реагирующие на ацилированный лактон гомосерина, описаны у различных бактерий.

Регион, ответственный за конъюгационный перенос, для ряда Ti-плазмид картирован и определенные мутации, возникающие спонтанно в этом регионе с частотой 10-8, обуславливают дерепрессированный транспорт Ti-плазмид между агробактериями (Von Bodman et al., 1989).

1.2.2. Организация генов конъюгационного переноса Ti-плазмид

Гены конъюгационного переноса наиболее типичных представителей октопиновых и нопалиновых Ti-плазмид картированы, клонированы и секвенированы. Для передачи нопалиновой Ti-плазмиды pTiC58 в клетки бактерии-реципиента необходимы два ее региона (Cook at al., 1997). Один кластер генов, обозначаемых как /га-гены, кодирует белки процессинга плазмидной ДНК и содержит область oriT с точкой инициации репликации ДНК при конъюгационном переносе, с которой взаимодействуют эти белки. Область oriT фланкируют два независимо транскрибируемых Глз-оперона, кодирующих белки, связанные с образованием релаксационного комплекса. Один оперон содержит гены traA, tra¥ и /гаВ, в то время как в другом находятся гены traC, tràD и traG, а также ген traR, который кодирует белок - транскрипционный активатор, необходимый для экспрессии всех генов транспорта плаз-ми ды.

Второй кластер генов, картируется отдельно и обозначается как trb-гены (с одним ¿га-геном в своем составе - irai). Ген tral кодирует автоиндуктор системы переноса плазмиды - N-ацил-гомосерин-лактон (Agrobacterium turaefacies N-acyl homoserine lacton autoinducer - AAI), в то время как остальные гены trb-оперона кодируют компоненты "моста спаривания" - белки трансмембранных пор и белок-пилин, участвующие в формировании канала для транспорта ДНК из клетки в клетку. Аци-лированный лактон гомосерина является низкомолекулярным эффектором транскрипционного активатора TraR.

1.2.3. Экспрессия генов конъюгационного переноса Ti-плазмид

Тонкий механизм активации генов конъюгационного переноса Ti-плазмид выявлен благодаря работам последних лет (Cook et al.,1997; Farrand et al.,1996; Hwang et al., 1995; Fuqua et al.,1995; Zhang et al., 1993). Передача нопалиновой Ti-плазмиды pTiC58 природного штамма Agrobacterium tumefaciens C58 индуцируется агроцинопинами А и В -опинами, продуцируемыми трансформированными клетками опухоли. Это регулирование осуществляется через транскрипционный репрессор AccR, действие которого снимается при появлении сигнальных молекул опина. Под контролем этого же репрессора находятся и гены катаболизма опинов (AccR - agrocinopine catabolism repressor).

Помимо негативного контроля со стороны репрессора, транскрипция tra-генов, как уже отмечалось, регулируется позитивно автоиндукцией через белок-активатор TraR и его эффектор гомосерин-лактон AAI, называемый "агробактериальным автоиндуктором" или "бактериальным феромоном".

Обнаружен регуляторный элемент, противодействующий TraR-зави-симой активации транскрипции генов конъюгационного транспорта. Этот ген, обозначенный как traM., подавляет активацию транскрипции ¿ля-генов, находящихся в составе рекомбинантных плазмид. Ген traM на Ti-плазмиде pTiC58 локализован рядом с traR, и оба эти гена транскрибируются конвергентно. traM на этой плазмиде располагается между traR. и traAF и считывается по направлению часовой стрелки. Он имеет размер 306 bp и кодирует 11.2 kDa белок, не имеющей гомологии с другими белками в базах данных. /гаМ-минус мутанты агробактерий имеют повышенную способность к конъюгации, усиленную транскрипцию rra-генов и продукцию AAI.

Мутации в гене traM нопалиновой плазмиды pTiC58 придают ей транспортно-конститутивный фенотип, и штаммы с такими плазмида-

ми производят легко детектируемые количества AAI. Эти же мутации в транспортно-конститутивной Ti-плазмиде pTiC58, имеющей делецию гена ассК, придают ей гиперконъюгативный фенотип и очень высокие уровни AAI продукции.

Подобным образом устроена и система конъюгационого транспорта октопиновой плазмиды pTiA6 (Alt-Morbe et al., 1996). Ее перенос также контролируется на нескольких уровнях. Конъюгация требует октопина - продукта конденсации аргинина и пирувата (Klapwijk et al.,1978). Катаболизм октопина и конъюгационный транспорт скоординированно регулируется через октопин-зависимый транскрипционный регулятор - OccR (Fugua and Winans,1994; Habeeb et al.,1991; Wang et al., 1992).

OccR и октопин не напрямую регулируют гены транспорта, а активируют экспрессию гена ¿raR (Fugua and Winans, 1994). Транскрипционный активатор TraR в свою очередь активирует экспрессию структурных ira-генов в присутствии его индуцирующего лиганда - ацилиро-ваного лактона гомосерина AAI. Продукция AAI контролируется геном tral. Вместе TraR, Tral и AAI составляют систему quorum sensor, контролирующую конъюгацию в зависимости от плотности бактериальной популяции (Fugua and Winans, 1996). Третий регуляторный протеин -антагонист активности TraR, подобен описанному выше для нопалино-вых плазмид белку TraM (Fugua et al., 1995; Hwang et al., 1995). Этот комплексный регуляторный каскад обеспечивает конъюгационный перенос плазмиды только при специфических условиях в присутствии значительных количеств октопина и большой плотности агробакте-риальных клеток. Такие условия создаются в корончатом галле.

Система авторегуляции экспрессии генов конъюгационного транспорта Ti-плазмид Agrobacterium tumefaciens подобна системе Vibrio fischeri, которая регулирует экспрессию генов биолюминесценции (lux-

генов) в зависимости от плотности бактериальных клеток в популяции (Fuqua et al.,1993; Hwang et al.,1995).

В заключение рассмотрения регуляции экспрессии систем транспорта ДНК Ti-плазмид нужно подытожить, что опины, продуцируемые тканями корончатого галла, приводят к появлению клеток Agrobacterium tumefacies, производящих диффундирующий в среду коньюгационный фактор (AAI). Это повышает эффективность передачи Ti-плазмиды между бактериями. Мутанты, не производящие этот фактор, теряют способность конъюгировать, если не обеспечить его экзогенное введение в среду. Вышеназванный фактор AAI является второй после опинов сигнальной молекулой, передающей информацию из окружающей среды к ¿га-генам.

1.2.4. Гомология системы конъюгационного переноса Ti-плазмид с другими системами

Системы конъюгационного переноса Ti-плазмид проявляют значительную гомологию с другими подобными системами. Так, гены конъюгационного транспорта Ti-плазмиды октопинового типа pTiA6 проявляют значительную гомологию с генами конъюгационного транспорта плазмид широкого круга хозяев группы несовместимости IncP (Alt-Moerbe et al, 1996), а /га-регион плазмиды нопалинового типа pTiC58 является химерной системой с элементами, родственными системам транспорта конъюгативных плазмид RP4, F и RSF1010 (Farrand et al, 1996). Возможно, это отображает ее эволюцию, гга-гены Ti-плазмид проявляют гомологию и с wV-генами, хотя и значительно менее выраженную (Alt-Moerbe et al, 1996).

1.3. Хромосомные гены вирулентности агробактерий

1.3.1.Хромосомные мутации, влияющие на патогенность микроорганизма

Наличие Ti-плазмид в клетках агробактерий является абсолютно необходимым условием патогенности микроорганизма (Zaenen et al., 1974). Излеченные от Ti-плазмид штаммы агробактерий авирулентны.

На вирулентность Agrobacterium tumefacies оказывают влияние различные мутации, картируемые как на опухолеродных плазмидах, так и на хромосоме. Ранние этапы взаимодействия агробактерий с растениями, такие как хемотаксис, прикрепление к поверхности растительной клетки и специфическое связывание для удерживания в центрах инфекции контролируются генами, имеющими хромосомную локализацию. На хромосоме расположены и некоторые гены, регулирующие экспрессию vir-генов Ti-плазмид (см. раздел 1.4.).

Присоединение агробактерий к клеткам растения является одним из первых этапов, определяющих эффективное взаимодействие. Этот этап у Agrobacterium tumefacies контролируют два связанных между собой хромосомных локуса chvА и chvВ размерами 1,5 kb и 5 kb соответственно (Douglas et al.,1985). Гены этих локусов экспрессируются конститутивно. В результате транспозонного мутагенеза этих областей получают авирулентные или дефектные по прикреплению агробактерии. Мутации в этих локусах сильно понижают или ингибируют вирулентность бактерий для одних растений-хозяев, но не для других, таких как, например, Solarium tuberosum или Nicotiana knightiana (Melchers and Hooykaas,1987). Локус chv В определяет синтез нейтрального циклического р-Д-глюкана, который транспортируется в периплазматическое пространство клетки с помощью продукта гена chv А. Роль нейтрального Р-Д-глюкана в инфекционном процессе еще точно не установлена. Помимо циклического р-Д-глюкана в прикреплении патогенных агро-

бактерий к растительным клеткам принимают участие и другие полисахариды, в частности внеклеточные экзополисахариды (см. раздел 1.3.2).

1.3.2. Сходство ранних этапов взаимодействия Agrobacterium и Rhizobium с растениями

Интересно отметить общее сходство первых этапов патогенных и симбиотических взаимодействий бактерий родов Agrobacterium и Rhizobium с растениями. Агробактериальные вирулентные гены chvА и c/ivB и необходимые для образования нормальных клубеньков на корнях растений гены ризобий ndvА и ndvВ функционально взаимозаменяемы (Dylan et al., 1986). В этом процессе принимает участие также главный внеклеточный кислый экзополисахарид бактерий (EPS), причем агробактерии и ризобии снова проявляют функциональную взаимозаменяемость генов, участвующих в биосинтезе EPS. У Rhizobium meliloti обнаружено 6 различных комплементационных локусов ехо, определяющих биосинтез EPS (Leigh et al., 1985). Ехо- мутанты Agrobacterium tumefacies, за исключением ехоС-, образуют нормальные корончатые галлы. Эти мутанты характеризуются не только отсутствием EPS, но и нейтрального циклического р-Д-глюкана. Они не способны прикрепляться к клеткам растений и не образуют опухоли на растениях. Агробак-териальный хромосомный локус, структурно и функционально связанный с ризобиальным ехоС, названpcsA (Marks et al., 1987). Этот локус не комплементирует мутации в локусах chv А и chv В. Таким образом, агробактерии и ризобии имеют три функционально связанных хромосомных локуса, контролирующих ранние этапы взаимодействия.

Для прикрепления A.tumefaciens к клеткам растений требуется синтез не только специфических полисахаридов, но и специфических белков (Matthysse, 1987). После присоединения к клеткам растений бактериальные клетки синтезируют целлюлозные нити для прочного связы-

вания и удерживания в центрах инфекции, однако этот процесс несуществен для вирулентности (Matthysse et al., 1983). Непатогенные бактерии вида Agrobacterium radiobacter, не содержащие опухолеродных плазмид, прикрепляются к клеткам растений сходным образом (Solovova et al., 1995). В этом процессе также участвуют бактериальные полисахариды и поверхностные белки клетки (Соловова с соавт.,1995; Chumakov et al.,1995).

1.4. Ti- и Ri-плазмидные гены вирулентности агробактерий и регуляция их экспрессии

1.4.1. Организация v/r-генов Ti-плазмид

Вирулентные гены агробактерий на Ti- и Ri-плазмидах кластеризованы в области vir размером около 30-35 kb, проявляющей в этих плаз-мидах значительную гомологию ДНК. Выявлена также гомология vir-генов Ti-плазмид Agrobacterium tumefaciens с /га-генами конъюгативных плазмид. В нопалиновых Ti-плазмидах в области vir локализовано 6 различных групп комплементации A,B,C,D,E и G, организованных в единый регулон (Stachel and Nester, 1986; Stachel and Zambryski, 1986). Октопиновая Ti-плазмида Ach5 имеет дополнительный локус virF, расположенный справа от локуса virE (Hooykaas et al., 1984). Мутации в генах и оперонах virA, virG, virB и vz>D придают агробактериям авиру-лентный фенотип, в отличие от большинства хромосомных мутаций, снижающих вирулентность или сужающих круг трансформируемых растений-хозяев.

Продукты генов vzV-области контролируют процессинг Т-ДНК в бактериальной клетке, ее перенос в растительную клетку и интеграцию в ядерный геном растения, причем эти процессы гены vir могут определять не только в цис- но и в транс-положении по отношению к Т-ДНК (т.е. находясь на разных репликонах). Исходя из этого свойства области

vir, сконструированы и успешно используются в практике удобные бинарные векторы для генетической инженерии растений (Дрейпер с соавт., 1991).

Для процессов "вырезания" Т-ДНК из плазмиды (точнее, высвобождения в процессе репликативного синтеза) и ее переноса в растения необходимо фланкирование этой области особыми границами: несовершенными прямыми повторяющимися последовательностями ДНК размером 24 bp, проявляющими значительную гомологию у всех изученных Ti- и Ri-плазмид. Границы Т-ДНК гомологичны области oriT конъюгативных плазмид. В этой области сайт-специфические эндонук-леазы призводят одноцепочечный разрыв, служащий началом репликации по типу разматывающегося рулона, происходящей в процессе транспорта плазмиды. Репликация обеспечивает сохранение плазмиды в материнской клетке и появление ее копии в дочерней.

Для нормального процессинга Т-ДНК и ее переноса в растительную клетку особенно важна ее правая граница, которая одна может определять полярность переноса Т-ДНК (Wang et al., 1984). Удаление правой границы из Ti-плазмид делает агробактерии полностью авирулентны-ми. Замена ее на искусственно синтезированную, также как и на левую, восстанавливает вирулентность микроорганизма.

На процессинг Т-ДНК в клетках бактерий влияют мутации в генах vzVD-, vir С- и vzVE-оперонов, на транспорт Т-комплекса в растительную клетку мутации в генах virB- и vzVD-оперонов.

1.4.2. Экспрессия v/r-генов Ti-плазмид

Экспрессию генов у/г-области индуцируют специфические сигнальные молекулы посредством позитивной регуляторной системы, в состав которой входят гены 'vir А и virG (Melchers et al., 1986; Stachel and Zambryski,1986; Winans et al., 1986). Активаторами транскрипции vir-

генов являются низкомолекулярные моноциклические фенольные соединения, синтезируемые в механически поврежденных тканях растений (Stachel et al., 1985). Примерами таких соединений являются ацетоси-рингон, а-оксиацетосирингон, синапиновая кислота и довольно широкий круг других производных шикиматного биосинтетического пути -метаболитов защитной природы или предшественников лигнина. Структурная формула ацетосирингона приведена на рис.2.

Рис.2. Структурная формула ацетосирингона (4-ацетил-2,6-диметокси-фенол).

Позитивная регуляторная система virA-virG> контролирующая экспрессию генов угУ-регулона, работает следующим образом. Экспрес-сируемый конститутивно ген угУА выполняет функцию рецепции сигнальных молекул растений и трансмиссии этого сигнала в бактериальную клетку. Этот мембранный хеморецептор после принятия внешнего сигнала активирует продукт гена у/Ю, который в свою очередь выступает в качестве позитивного регулятора собственной транскрипции и транскрипции остальных генов у/У-регулона. Механизм активации следующий. Белок у/гА, дважды пронизывающий внутреннюю мембрану бактерии, при появлении сигнальных молекул автофосфорили-

О

сн

с

он

руется по остатку гистидина-474 на своем С-конце, переходя в активную форму. (В отсутствии индуктора С-терминальный домен белка vir А взаимодействует с его N-терминальным доменом, ингибируя киназную активность). Активированный белок virA в свою очередь фосфорили-рует внутриклеточный белок - трансдуктор сигнала virG - по остатку аспарагина-52 (Jin et al., 1990). Фосфорилированный белок virG связывается с промоторами остальных генов регулона и со своим собственным, выступая в качестве транскрипционного активатора. Индукция vir-генов обратима и каскад реакций может быть прерван, что очень важно для патогена: в случае если хозяин больной и нежизнеспособный организм, перенос Т-ДНК в его клетки не осуществляется (Hess et al., 1991).

Кроме позитивной регуляторной системы virA-virG, локализованной на Ti-плазмиде, в регуляции экспрессии v/У-генов принимают участие также хромосомные гены. Об этом свидетельствует обнаружение спонтанного хромосомного мутанта ros, у которого гены virC- и vzVD-one-ронов экспрессируются в отсутствии сигнальных молекул растений (Close et al., 1985). Эта мутация имеет плейотропный эффект, вызывая у бактериальных колоний, растущих на агаризованных питательных средах, в частности, шероховатую поверхность, связанную с отсутствием внеклеточного полисахарида. Предполагается, что фенотип ros агробактерий может представлять собой нормальное физиологическое состояние клетки в процессе ее взаимодействия с клетками растений на одной из последующих стадий этого взаимодействия после индукции генов vir.

Таким образом, экспрессия генов virC и vz>D подвергается двойному контролю - как со с стороны генов vzVA-v/Ю плазмиды, так и со стороны хромосомных генов. На функционирование такого механизма двойного контроля локусов virD и virC указывает факт обнаружения трех промоторов в регуляторной области локуса virD (Tait and Kado,1988).

Два тандемно расположенных промотора (ros и AS-ros) определяют транскрипцию генов v/>D, в то время как перекрывающий их третий промотор v/rC-ros, определяет транскрипцию с противоположной цепи генов virC. Промотор vzVD-AS-ros может функционировать в агробак-териальном ros мутанте только при индукции сигнальными молекулами растений через позитивную регуляторную систему virA-virG, а два других промотора функционируют в условиях, вызывающих мутацию ros. Таким образом, продукты локуса ros являются репрессорами. В клетках кишечной палочки в отсутствии этого репрессора гены virC- и vfrD-оперонов экспрессируются конститутивно (Close et al., 1985).

Таким образом, экспрессия v/r-генов в агробактериях подвержена как позитивной так и негативной регуляции и осуществляется на нескольких разных уровнях, что уже было отмечено также и для экспрессии ira-генов.

1.5. Процессинг Т-ДНК в бактериальной клетке и ее перенос в клетки растений

1.5.1. Формы процессированной Т-ДНК

При культивировании A.tumefaciens с механически поврежденными частями растений, регенерирующими протопластами или в присутствии ацетосирингона из клеток бактерий можно выделить различные молекулярные формы процессированной Т-ДНК - одноцепочечные линейные, двухцепочечные линейные и двухцепочечные кольцевые, которые могут претендовать на роль посредника в переносе генетического материала в растительную клетку (Koukolikova-Nicola et al., 1985; Stachel et al.,1986; Albright et al.,1987; Steck et al.,1989). Причем кольцевая форма, образующаяся за счет гомологичной рекомбинации между правой и левой границей Т-ДНК с образованием одной гибридной границы, встречается в очень малых количествах (Koukolikova-Nicola et

al., 1985). При ее образовании не происходит репликативного синтеза ДНК, в то время как в случае образования двух других форм возможно прохождение репликации Т-ДНК в бактериях в процессе ее транспорта в растения (к появлению одно цепочечных форм может приводить пре-рывание/ингибирование прерывистого синтеза запаздывающей цепи). Репликация призвана обеспечить сохранение Т-ДНК в исходной Ti-плазмиде, если только не допустить возможность существования физического вырезания материала Т-ДНК из Ti-плазмид за счет образования двухцепочечных разрывов в границах. Исчезновение Т-ДНК из Ti-плазмид является главным недостатком отошедшей на второй план подобной "эксцизионной модели". Тем не менее, образование двухцепочечных разрывов внутри границ и появление детектируемых количеств линейной двухцепочечной формы Т-ДНК при культивировании бактериальных клеток в присутствии ацетосирингона исследователи наблюдали уже через 30 минут после добавления этого индуктора в среду (Steck et al., 1989). Также, в условиях индукции Wr-генов ацетосиринго-ном в клетках агробактерий обнаруживается линейная одноцепочечная форма процессированной Т-ДНК (Stachel et al., 1986; Albright et al., 1987). Появление этого интермедиата обнаруживается через 8 часов после добавления индуктора и его количество накапливается на протяжении последующих 40 часов более чем в 2 раза, а затем идет на убыль, показывая, что процесс лимитирован (Stachel et al., 1986).

Какая из форм транслоцируется через бактериальную мембрану в растительную клетку до сих пор остается невыясненным из-за трудности определения относительного количества каждой из форм и выявления динамики их превращений. Возможно, процессинг и транспорт Т-ДНК не разобщены во времени и идут сопряженно подобно конъюга-ционному переносу плазмид, происходящему в месте контакта мембран конъюгирующих клеток (Clark and Warren, 1979). Тогда все обнаружи-

ваемые интермедиаты могут быть аберрантными формами прерванного на каком-то этапе неделимого процесса (или неправильно завершенного). В случае индуцирования экспрессии vi'r-генов ацетосирингоном отсутствует главный момент взаимодействия - контакт бактериальной и растительной клетки, и, поэтому, все обнаруживаемые в этом случае формы могут претендовать на роль посредника лишь с определенными допущениями. Достоверно известно, что в растительную клетку попадает только одна цепь Т-ДНК и конвертируется в двухцепочечную уже в растительной клетке (Rodenberg et al.,1989). Обсуждается, что в случае прохождения в клетке A.tumefaciens нормальной полуконсервативной репликации Т-ДНК, вторая цепь может в процессе переноса гидро-лизоваться, высвобождая энергию для транспорта переносимой цепи (Kado,1991). Такие процессы имеют место при проникновении ДНК через мембраны бактерий Bacillus subtilis, Haemophilis influenzae, Neisseria gonorrheae при их естественной трансформации (Googdal,1982; Kahn et al., 1984; Stewart et al., 1986).

1.5.2. Конъюгативная модель переноса Т-ДНК в растения

Наиболее признанной и имеющей экспериментальные подтверждения моделью переноса Т-ДНК в растения, как уже отмечалось, является "конъюгативная модель". Согласно этой модели при переносе задействованы те же механизмы, что и при конъюгации бактерий и перенос Т-ДНК в растения связан с ее репликативным синтезом в бактериальной клетке. В процессинге Т-ДНК и ее транспорте в растительную клетку принимают участие уг>-белки, кодируемые оперонами virD, vz>B, virC и virE.

Появившийся в результате индукции генов Wr-регулона продукт гена v7>D? (сайт-специфическая эндонуклеаза) осуществляет в комплексе с топоизомеразой virD\ при участии белков virC\ и virDz однонитевые

разрывы сахарофосфатного остова цепи внутри границ Т-ДНК. Разрыв происходит точно между 3 и 4 нуклеотидами 24-членного повтора. После никирования ДНК повтора белок virD2 ковалентно связывается с 5'-концом цепи в месте разрыва по остатку тирозина-29 (Ward and Barnes, 1988; Yuong and Nester, 1988). Это способствует появлению свободного З'-ОН конца для начала синтеза клеточными ДНК-поли-меразами замещающей цепи ДНК на месте вытесняемой исходной. Замещающая цепь, синтезируемая непрерывно в направлении 5'- 3', является лидирующей; на запаздывающей цепи прерывистый синтез не идет. Вытесняемая цепь (Т-цепь) транслоцируется в растительную клетку. Белок virT>2, после образования разрыва ковалентно связанный с 5'-концом Т-цепи, выполняет "пилотную" функцию на протяжении всего процесса ее транспорта (Bakkeren et al., 1989). Благодаря наличию особой NLS-последовательности (Nuclear location sygnal) (Herrera-Estrella et al., 1992; Howard et al., 1992; Shurvinton et al., 1995) этот белок обеспечивает попадание Т-ДНК в ядро растительной клетки; Т-ДНК не встраивается в митохондриальный или хлоропласный геном растений. Кроме этого белок v¿>D: принимает непосредственное участие во встраивании генетического материала в хромосомы (Tinland et al., 1995).

Т-цепь переносится в растительную клетку через трансмембранные поры и канал, сформированные продуктами генов, кодируемых оперо-нами virB и virD. В формировании канала и образовании пилеподобных структур, а также в энергетическом обеспечении транспорта вытесненной нити, участвует ряд белков, кодируемых wVB-опероном и белок vz>D4. Большинство v/rB-генов кодирует белки с сигнальными последовательностями, характерными для мембранных белков. Ген vz>B2 кодирует белок, подобный пропилину F-фактора E.coli. Пропилин в клетках кишечной палочки процессируется с образованием 7,2 кД субъединиц пилина; белок vfrB2 подвергается процессингу сходным образом. АТР-

азной активностью обладают продукты генов virb4 и vz>Bn. В составе белка vfrBn имеется особая нуклеотидсвязывающая последовательность, нарушение которой приводит к авирулентности бактерий (Stephens et al., 1995). От деградации одноцепочечной ДНК в бактериальной клетке ее защищает взаимодействие с белком virEi, кооперативно связывающимся с Т-цепью. Этот белок, подобно vz>D2, имеет NLS-n о следов а-тельность и, возможно, принимает участие во встраивании Т-ДНК в одну из растительных хромосом.

Эта модель не предусматривает синтеза ДНК на запаздывающей цепи. Матрица для ее синтеза - Т-цепь - переносится в реципиентную клетку. При индукции ацетосирингоном в отсутствии межклеточного контакта одноцепочечная Т-ДНК остается в донорной клетке, что позволяет легко обнаружить ее с помощью стандартных молекулярно-биологических методов.

На рис.3 приводятся схема переноса плазмид при конъюгации бактерий и схема транспорта Т-ДНК в растения, составленные на основе данных литературы.

Г-гшпи

Рис.3. Схемы переноса плазмид при конъюгации бактерий (А) и транспорта Т-ДНК в растения (Б).

опТ - начало репликации по типу разматывающегося рулона, ВЬ, ВЯ - левая и правая границы Т-ДНК, МО - клеточная мембрана клетки-донора, МЯ - клеточная мембрана клетки-реципиента.

1.6. Структурно-функциональное сходство vir- и ira-генов как доказательство конъюгативной модели

Получены данные о значительном структурном сходстве между белками и функциональными участками ДНК, вовлеченными в процесс передачи Т-ДНК в растения и в процесс конъюгационного транспорта некоторых плазмид широкого круга хозяев. Так уг>-гены проявляют значительную гомологию с /га-генами конъюгативных плазмид, а границы Т-ДНК являются структурно-функциональными аналогами oriT. В таблице 1 суммированы экспериментальные данные, говорящие в польг зу конъюгативной модели переноса генетического материала в растения.

Таблица 1

Данные, подтверждающие конъюгативную модель

Генетические функции mob и oriT плазмиды RSF1010 обеспечивают за счет v/л-белков транспорт производных этой плазмиды в ядро растительной клетки и встройку в хромосомы (Buchanan-Wollaston et al., 1987)

Генетические v/r-белки обеспечивают транспорт производных плазмиды RSF1010 между клетками агробакте-рий при конъюгации (Beijersbergen et al., 1992)

Молекулярно-генетические никирование границ Т-ДНК vzr-белками приводит к образованию одноцепочечных молекул ДНК (Stachel et al.,1986; Albright et al., 1987)

Молекулярно-генетические гены Тга2-региона плазмиды RP4 проявляют гомологию с v/VB-генами, гены leader-оперона - с генами vzVC-оперона, ген сайт-специфической эндонуклеазы tral - с геном virD2, ген топоизоме-разы iraJ - с wVDi, ген транспортного белка traG

- с V//-D4, а опТ - с границами Т-ДНК (Motallebi-Vesharen et al.,1992; Cook and Farrand,1992; Lessl et al., 1992)

Молекулярно-генетические ген белка конъюгативного пилина плазмиды R388 проявляет гомологию с уг>В-генами (Shirasu and Kado, 1993)

Молекулярно-генетические v/V-гены Ti-плазмид проявляют гомологию с собственными Гга-генами этих плазмид (Alt-Moerbe et al, 1996)

Молекулярно-генетические ген F- пилина проявляет гомологию с vz>B-генами (Shirasu and Kado, 1993; Shirasu et al., 1993)

Биохимические К/>В2-белок (12,3 кД) процессируется с образованием 7,2 кД белка, подобно ТгаА- пропилину F-фактора (Shirasu and Kado, 1993; Jones et al., 1996)

1.7. Взаимодействие систем переноса ДНК природных Ti-плазмид

Несмотря на то, что в последнее, время накапливается все больше сведений о структурно-функциональном сходстве vir- и tra-генов, вопрос о взаимодействии этих двух систем переноса ДНК Ti-плазмид в клетках агробактерий изучен мало.

О том, что /га-гены не существенны для онкогенности показано в ряде работ (Holsters et al.,1980; Von Bodman et al.,1989; Rogowsky et al.,1990) и исследований, приведенных в предыдущих главах. Мутации в любом из ira-генов никак не влияют на вирулентность агробактерий, а векторные системы на основе Ti-плазмид, полностью лишенные ira-генов, обеспечивают эффективный транспорт Т-ДНК в растения.

С другой стороны, имеются данные о том, что vzV-гены могут влиять на перенос Ti-плазмид при конъюгации бактерий. Так, мутации в vir-генах, обусловленные инсерциями транспозона Тп5, ведут к снижению частоты переноса Ti-плазмид между агробактериями. Исследователями было показано, что мутации в генах virA, virG, 5'-v/>B, virE нопалино-вой плазмиды pTiC58 имеют наибольшее влияние на процесс конъюга-ционного транспорта плазмиды pTiC58, в то время как мутации в генах v/z-C-оперона не оказывают на него никакого влияния (Steck and Kado, 1990). Частоту переноса октопиновых плазмид понижают мутации в генах vir A, virB, virC и virG (Gelvin and Habeck, 1990). Причем ингибиру-ющий эффект не зависит от присутствия ацетосирингона в среде.

Также сообщалось о том, что индукция экспрессии vzV-генов ацето-сирингоном ведет к повышению частоты переноса Ti-плазмид. Для нопалиновой плазмиды pTiC58 с инсерцией транспозона в Т-ДНК такое повышение принимало до 7-кратного значения (Steck and Kado, 1990). Эффективность переноса плазмиды с различными описанными выше мутациями в vzr-генах в присутствии ацетосирингона также возрастала по сравнению с контролем (без индукции). Были высказаны предположения, что у/г-гены, не являясь абсолютно необходимыми для переноса плазмиды при конъюгации бактерий, могут влиять на этот процесс, выполняя сходные с Гга-генами функции. Это также предполагало, что может существовать функциональная взаимозаменяемость различных элементов этих двух систем транспорта ДНК.

В данной работе мы ставили задачи изучить влияние экспрессии vir-генов на транспорт генетического материала векторной Ti-плазмиды pGV3850 в клетки неродственной бактерии E.coli. Структура этой Ti-плазмиды, содержащей между правой и левой границами Т-ДНК встроенную плазмиду pBR322, позволяет следить за ее переносом в кишечную палочку (или переносом ее Т-ДНК) по спасению маркера

ампициллин-резистентности плазмиды рВЯ322. В результате исследований предполагалось выяснить, как влияет экспрессия системы транспорта Т-ДНК в растения на перенос "П-плазмиды при конъюгации бактерий; повышается ли частота переноса плазмиды при ее экспрессии, остается неизменной или, может быть, напротив, понижается. Также предполагалось решить вопрос, может ли у/г-система, являясь структурно-функциональным аналогом ¿га-системы, осуществлять транспорт Т-ДНК в бактерии при конъюгации. Неясным был вопрос о том, могут ли агробактериальные у/л-гены обеспечивать транспорт Т-ДНК в растения из клеток неродственных бактерий (в отсутствии хромосомных генов вирулентности Agrobacterium). В связи с широким использованием Agrobacterшm Ште/аЫет и Agrobacterium rhizogenes в генной инженерии растений вопрос об опасности переноса элементов агробактериальной системы трансформации растений в другие бактерии с приобретением ими трансформирующей способности является актуальным.

Исследования процесса переноса Т1-плазмид в клетки неродственных бактерий представляют значительный научный интерес, поскольку расширяют представления о горизонтальном переносе генов в природе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. МАТЕРИАЛЫ 2.1.1. Оборудование

В работе использовали микробиологические качалки (New Brunswik, США), термомиксер 5436 (Eppendorf, США), прибор для горизонтального электрофореза (LKB, Швеция), прибор для вертикального электрофореза 2010 Macrophor Electrophoresis Unit (LKB, Швеция), источники питания 2197 и 2301 (LKB, Швеция), центрифуги Centrifuge 5415С (Eppendorf, США), УФ-трансиллюминатор (Mineralight, США), счетчик радиоактивности Minimonitor tml25 (Victoreen, США), термо-стат ТС-80М-2 (отеч. производства).

2.1.2. Реактивы и ферменты

Использовали следующие реактивы отечественного производства -(квалификация "х.ч" или "о.с.ч"): хлорид натрия, ацетат калия, нитрат аммония, нитрат калия, хлорид кальция, сульфат магния, гидрофосфат калия, сульфат марганца, сульфат цинка, сульфат меди, сульфат железа, хлорид кобальта, натрий молибденовокислый, гидроксид натрия, метол, гидрохинон, бромид калия, тиосульфат натрия, сульфит натрия, карбонат натрия, натрий сернокислый пиро, борную кислоту, этиловый спирт, изопропиловый спирт, медицинский хлороформ, фенол, 8-оксихинолин, мезо-инозитол, сахароза.

В работе использовали следующие импортные реактивы: ацетат натрия - Fluka, Швейцария; этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) - Serva, Германия; бромистый этидий - Sigma, США; трис(оксиметил)аминометан (трис) - Sigma, США; додецилсульфат натрия (SDS) - Serva, Германия; агароза - Bio-Rad, США;

бромфеноловый синий - Sigma, США; ксиленцианол - Sigma, США; лизоцим - Calbiochem, США; саркозил (N-lauroylsarcosine) - Sigma, США;

бакто-агар - Difco, США; бакто-триптон - Difco, США; дрожжевой экстракт - Difco, США.

Использовали следующие ферментативные препараты: РНКаза А, проназа Е, эндонуклеазы рестрикции отечественного производства и фирмы "Fermentas" (Латвия). При приготовлении ДНК-зондов использовали набор "DNA multiprime labellin system" (Amersham, Англия).

2.1.3. Бактериальные штаммы и плазмиды

Использованные в работе бактериальные штаммы и векторные плазмиды представлены в табл.2.

Таблица 2.

Бактериальные штаммы и плазмиды

Штаммы, плазмиды Характеристика Источник, ссылка

Escherichia coli:

HBlOl F-, hsdS20(rB- mB-), recA13, aral4, proA2, lacYl, galK2, rpsL20, xyl-5, mtl-l, supE44 Маниатис и др., 1984

ABl 157 F-, recA99, thr-1, leu-6, lacYl, galK2,ara-l 7,xyl-5,mtl-l,pro A2, his-4, argE3, str-31, tsx-33 Маниатис и др., 1984

GM272-Sm F-,dam3,dcm6,hsdS21, (rK-mK-) lac Yl, tsx 78,supE44,galK2,galR2 mtll, metBl (thil tonA31) Маниатис и др., 1984

GJ23 RecA-мутант AB 115; содержит плазмиды pGJ28 и R64drdl 1 Van Haute et al., 1983

Erwinia carotovora:

B15 Smr, Emr, прототроф Dye, 1969

Erwinia herbicola:

ATCC27155 Smr, Em1, прототроф Wing et al., 1972

Agrobacterium

tumefaciens:

C58C1 Rifr Van Larebeke et., 1974

LBA4301 Rifr Klapwijk et.al.,1979

LBA2525 Rifr, virB::LacZ Mel chers et.al.,1989

NT1-RE Rifr, Emr Kao et al., 1982

Плазмиды: Маркеры для E.coli A.tumefaciens

pGV3850 Apr Cbr Zambryski et.al.,1983

pBR322 Apr Tcr - Bolivar et.al., 1977

pRK2013 Krar - Ditta et.al.,1980

pSup106 Cmr,Tcr Cmr,Tcr Simon et.al.,1983

pGA482 Tcr,(Kmr) Tcr,(Kmr) An G., 1986

pMH1701 Apr,Cmr,Tcr,Kjrair - Hynes et al., 1988

pUCD2614 Apr,Nmr •Cbr,Nmr Rogowsky et.al, 1990

pUCD2619 Apr,Tcr Rogowsky et.al, 1990

pUCD2340 Gmr Gmr Ziprian et.al, 1990

pUCD2335 Gmr Grar Ziprian et.al, 1990

pLGY2382 Apr,Kmr Cb' Herrerra-Estrella, 1983

pGJ28 Krar - Van Haute et al., 1983

R64drdl1 Tcr,Smr - Van Haute et al., 1983

pYB19 Apr - Настоящая работа

pVB47 Apr - Настоящая работа

pVB49 Apr - Настоящая работа

pVB402 Apr - Настоящая работа

Примечание. Рабочие концентрации антибиотиков и принятые сокращения для маркеров антибиотико-резистентности приводятся в табл.4 (Разд.2.

2.1.4. Растения

В работе использовали стерильно выращенные растения табака Nicotiana tabacum L. cv Samsun. Растения поддерживали на среде MS (разд. 2.1.5) с добавлением феруловой кислоты (Serva,ФРГ)

2.1.5. Среды, растворы

LB - бульон - бакто-триптон (Difco) 10 г

дрожжевой экстракт (Difco)

5 т

NaCl

10т

Среду автоклавировали 1 ч при 1 атм.

LB-arap - перед автоклавированием в бульон LB добавляли агар (Difco) до концентрации 1.5%.

Среда YEB - дрожжевой экстракт (Oxoid)

1 г

мясной экстракт (Oxoid) пептон (Difco) сахароза

5 г 5 г 0,5 г

5 г

MgS04x7H20

Среда АВ - Раствор I

20-кратный 60 г 20 г

1 -кратный

К2НР04 NaH2P04 Раствор II

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Великов, Владимир Александрович

ВЫВОДЫ.

1. Получен широкий набор делеционных производных Ti-плазмиды pGY3850 с размерами от 3-4 до 50 kb при исследовании процесса ее переноса из Agrobcicterium tumefciciens в Escherichia coli. Клонирована vir-область Ti-плазмиды.

2. Атробактериальная система переноса Т-ДНК в клетки растений не обеспечивает транспорт Т-ДНК в бактерии. Индукция экспрессии vir-генов не оказывает заметного влияния на эффективность переноса Ti-плазмид при скрещиваниях с E.coli.

3. Предложен подход для клонирования в E.coli крупных фрагментов мегаплазмид со встроенным в них ориджином репликации плазмиды ColEl, основанный на неспособности Со1Е1-репликона обеспечивать поддержание мегаплазмиды в исходном размере после переноса в реципиентную клетку.

4. К/>-гены Agrobcicterium tumefaciens перенесены в клетки бактерий Erwinia carotovora и Erwinia herbicola, в которых они стабильно поддерживаются, но не обеспечивают транспорт Т-ДНК в растения. Оценена как незначительная опасность распространения элементов агробакте-риальной системы вирулентности среди неродственных бактерий.

5. Разработан способ предотвращения размножения агробактерий на трансформированных эксплантах, основанный на придании штаммам A.tumefaciens чувствительности к сахарозе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на структурно-функциональное сходство, обе системы переноса агробактериальной ДНК (для транспорта Т-ДНК в растения и для переноса Ti-плазмид при конъюгации arpo бактерий), являются глубоко специализированными и работают независимо друг от друга. Индукция экспрессии генов системы транспорта Т-ДНК синтетическими индукторами типа ацетосирингона не влияет на частоту переноса Ti-плазмиды при конъюгации бактерий. Система природных Ti-плазмид для транспорта Т-ДНК в растения не может обеспечивать перенос генетического материала в бактерии.

Система конъюгационного переноса Ti-плазмиды способна обеспечивать ее перенос как в бактерии своего вида, так и в клетки неродственных бактерий, в которых плазмида не поддерживается. Спонтанная дерепрессия Гга-генов обеспечивает перенос Ti-плазмиды в отсутствии опинов. При этом частота переноса в неродственные бактерии соответствует частоте переноса при внутривидовых скрещиваниях.

Материал векторной Ti-плазмиды для трансформации растений pGV3850 может сохраниться в клетках E.coli благодаря наличию в плазмиде ориджина репликации плазмиды pBR3.22 и ее спонтанному делегированию до размеров, не превышающих значений 50 kb.

Две транспортные системы опухолеродных плазмид одновременно не экспрессируются. Вероятно, в клетках Agrobacterium существует альтернативная регуляция экспрессии генов этих систем. Проведенные нами эксперименты показывают, что если даже искусственным образом индуцировать систему переноса ДНК в растения, но предложить агро-бактерии вместо растительной клетки клетку прокариотического организма, то происходит "сбой" в механизмах процессинга и транспорта Т-ДНК и "перенастройка" на более специфичную систему конъюгационного переноса плазмиды.

К/>-гены, введенные в составе рекомбннантных плазмид в клетки филогенетически отдаленных от Agrobacterium бактерий рода Erwinia, также как и в E.coli, стабильно поддерживаются в новом генетическом окружении, но при этом бактерии не приобретают способность трансформировать растения. Поэтому, опасность попадания плазмид агро-бактериальной системы трансформации растений в неродственные бактерии невелика, так как из их клеток транспорта Т-ДНК в растения не происходит даже при использовании синтетических индукторов экспрессии v//--генов.

Предложенный в работе способ предотвращения размножения Agrobacterium на среде для регенерации трансформированных эксплан-тов, связанный с использованием гена sacB Bacillus subtilis, и полученная рекомбинантная плазмида pSUP106 с этим геном пригодны для использования при проведении агробактериальной генетической трансформации растений.

Полученный в настоящей работе широкий набор производных векторной Ti-плазмиды pGV3850 может иметь применение в работах по конструированию векторов для трансформации растений. Описанный подход к получению делеционных вариантов плазмиды pGV3850 и ей подобных, основанный на неспособности Со1Е1-репликона обеспечивать поддержание . плазмид в исходном размере после их переноса в кишечную палочку, можно использовать для "клонирования in vivo" относительно крупных фрагментов ДНК мега-плазмид. В частности, мы применили его для клонирования vir-области плазмиды pGV3850, непосредственно прилегающей к Т-ДНК. Введя oriV ColEl в некодирующие области бактериальных транспозонов, можно получить универсальный инструмент для подобного клонирования любых участков плазмидной ДНК, находящихся вблизи места инсерции мобильного генетического элемента.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Великов, Владимир Александрович, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Анализ генома. Методы. П\р К.Дейвиса. М.Мир.1990. 247 с.

2. Беликов В.А., Бурьянов Я.И. Образование делеционных производных Ti-плазмиды pGV3850 при конъюгационном переносе из Agrobacterium tumefaciens в Escherichia coli. Генетика, 1998. №8, т.34, с.1056-1062.

3. Беликов В.А.. Бурьянов Я.И. Изучение конъюгационного транспорта Ti-плазмиды pGV3850 из Agrobacterium tumefaciens в Escherichia coli. Тезисы докладов III Пущинской конференции молодых ученых. Пущино, 27-30 апреля 1998 г.. с.49.

4. Беликов В.А. Перенос у/У-генов Agrobacterium tumefaciens в фито-патогенный микроорганизм Erwinia carotovora. Тезисы докладов II открытой городской конференции молодых ученых г.Пущино. Пущино, 28-30 апреля 1997 г.. с.49-50.

5. Беликов В.А. Использование гена sacB Bacillus subtilis для предотвращения контаминации эксплантов агробактериями при проведении трансформации растений. Биотехнология, 1997, №11-12. С. 14-17.

6. Беликов В.А., Мельников А.А. Введение угУ-генов Agrobacterium tumefaciens в Erwinia carotovora в составе векторных систем для трансформации растений. В сборнике трудов II открытой городской конф. молодых ученых г.Пущино. Пущино, 1997, с.29-35.

7. Беликов В.А., Чернышов С.В. Введение v/У-генов Agrobacterium tumefaciens в фитопатогенные м икр о р ган из м ы рода Erwinia и их стабильное поддержание. В сборнике 'Проблемы общей биологии и прикладной экологии '. Изд.Саратовского ун-та, 1997 г., Выпуск 1, с.34-37,

8. Беликов В.А., Лештаев А. А., Семенюк Е.Г. Ген sacB из Bacillus subtilis способен предотвращать размножение агробактерий на среде для культивирования растений-трансформантов. Тезисы докладов III

Пущинской конференции молодых ученых. Пущино, 27-30 апреля 1998 г., с.69.

9. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. М.Мир. 1991. 408 с.

10. Клонирование ДНК. Методы. П\р Д.Гловера. М.Мир. 1988. 538с.

11. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Методы генетической инженерии. М.:Мир. 1984. 463 с.

12. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. П\р Р.И. Салганик. Новосибирск. Наука. 1990. 248 с.

13. Мобильность генома растений. П\р Б.Хон и Е.С.Деннис. М. Агропромиздат. 1990. 272 с.

14. Плазмиды. Методы. П\р. Д.Харди. М.Мир. 1990. 267 с.

15. Пехов А.П. Основы плазмидологии. Москва. 1996. 231 с.

16. Сельскохозяйственная биотехнология. Векторные системы молекулярного клонирования. П\р Р.Л.Родригерс и Д.Т.Денхардта. М. Агропромиздат. 1991. 535 с.

17. Соловова Г.К., Кривопалов Ю.В., Беликов В.А., Чумаков М.И. Прикрепление Agrobacterium radiobacter к корням пшеницы. Микробиология, 1995, т.64, №4, с. 526-530.

18. Albright L.M., Yanofsky В., Lerous D.M., Nester E.W. Processing of T-DNA of A.tumefaciens generates border nicks and linear, single-stranded T-DNA. J.Bacteriol.,1987, v. 169, pp. 1045-1055.

19. Alt-Morbe J, Stryker J.L., Fugua C., Li P.L., Farrand S.K., Winans S.C. The conjugal transfer system of Agrobacterium tumefaciens octopine-type Ti plasmids is closely related to the transfer system of an IncP plasmid and distantly related to Ti plasmid vir genes. J.Bacteriol., 1996, v. 178(14), pp. 4248-4257.

20. An G. Developement of plant promoter expression vectors and their use for analysis of differential activity of nopaline synthase promoter in transformed tobaco cells. Plant Physiol., 1986, v.81, pp.86-91.

21. Ashby A.M., Watson M.D., Shaw S.N. Ti plasmid determine func-tion is responsible for chemotaxis towards the plant wound product acetosyringone. FEMS Microbiol.Lett., 1987, v.41, pp. 189-193.

22. Bakkeren G., Koukolikova-Nicola Z., Grimsley N., Hohn B. Recovery of Agrobacterium tumefaciens T-DNA molecules from whole plants early after transfer. Cell, 1989, v.57, pp.847-851.

23. Beaty J.S., Powell G.K., Lica L., Regier D.A., Macdonald E.M.S., Hommes M.G., Morris R.Q. Tzs, a nopaline Ti plasmid gene from Agrobacterium tumefaciens associated with trans-zeatine biosynthesis. Mol.Gen.Genet., 1986, v.203, pp.274-278.

24. Baker R.F., Idler I.B.. Thompson D.V., Kemp J.D; Nucleotide sequence of the T-DNA region from Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTi 15955. Plant Mol.Biol., 1983, v.2, pp.335-350.

25. Beijersbergen A., den Dulk-Ras A.K., Shiperoort R.A., Hooykass P.J.J. Conjugative transfer by the virulence system of Agrobacterium tumefaciens. Science, 1992, v.256, pp. 1324-1327.

26. Bevan M., Barnes W.M., Chilton M.D. Structure and transcription of the nopaline synthase gene region ofd T-DNA. NucI.Acids Res., 1983, v. 11, pp.368-385.

27. Birnboim H.C., Dolv J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. NucI.Acids Res., 1979, v.7, pp. 15131523.

28. Bolivar F., Rodrigers R.L., Greene P.J., Betlach M.C., Heynecker H.L., Boyer K.W., Crosa J.H., Falkow S. Construction and characteriza-tion of new cloning vechicles. II. A multipurpose cloning system. Gene 2, 1977, pp.95-113.

29. Bundock P., den Dulk-Ras A.K., Beijersbergen A., Hooykass P.J.J. Trasns-kingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. EMBO J., 1995, v.14, pp.3206-3214.

30. Buryanov Ya.I., Velikov V.A., Kalyaeva M.A., Zakharchenko N.S. Peculiarities of Agrobacterium Ti-plasmid transfer to plant and bacterial cells. Int.symp. "Molecular mechanisms of stress responses in plants". Sept.28-oct. 1,1998, Moscow, Abstr. P8, p. 110.

31. Chilton M.-D., Drummond M.N., Merlo D.J., Montoya A., Gordon M.P., Nester E.W. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: the molecular basis of crown gall tumorigenesis. Cell, 1977, v. 11, №2. pp.263-267.

32. Cho K., Fugua C., Winans S.C. Transcriptional regulation and locations of Agrobacterium tumefaciens genes required for complete catabolism of octopine. J.Bacteriol.,1997, v. 179(1), pp.1-8.

33. Chumakov M.I., Solovova G.K., Velikov V.A., Gorban V.V., Krivopalov Yu.V., Dykman L.A., Bogatyrev V.A., and C.Kennedy. Associative interaction Agrobacterium radiobacter 5D-1 with mono- and dicotyledonous plants.In Nitrogen Fixation: Fundamental and Application. Proceedings 10th Int.Congress of Nitrogen Fixation. Saint-Petersburg, Russia. (Eds. Tikhonovich I.A., Provorov N.A., Romanov V.I., and W.E.Newton) Kluwer Academical Publishers. Dordrecht, Boston, London, 1995, p.822.

34. Clark A.J., Warren G.J., Conjugal transmission of plasmid. Ann. Rev. Genet., 1979, v.13, pp.99-125.

35. Close T.J., Tait R.C., Kado C.I. Regulation of Ti plasmid virulence genes by a chromosomal locus of Agrobacterium tumefaciens. J.Bacteriol., 1985, v.164, pp.774-781.

36. Cook D.M., Li P.L., Ruchaud F., Padden S., Farrand S.K. Ti plas-mid conjugation is independent of vir. reconstitution of the tra functions from pTiC58 as a binary system. J.Bacteriol., 1997, v. 179(4),

pp. 1291-1297.

37. Cook D.M., Farrand S.K. The OriT region of Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTiC58 shares DNA sequence identity with the transfer origins of RSF1010 and RK2\RP4 and with T region borders. J.Bacteriol., 1992, v. 174(19), pp.6238-6246.

38. Dhaese P., De Greve H., Decraemer H., Shell J., Van Montagu M. Rapid mapping of transposon incertion and deletion mutants in the large Ti-plasmid of Agrobacterium tumefaciens. Nucl.Acids Res.,1979, v.7, pp.18371849.

39. Ditta G., Stanfield S., Gorbin D.,Helinsky D.R. Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria - Construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 1980, v.77, pp.73477349.

40. Douglas C.J., Staneloni R.J., Rubin R.A., Nester E.W. Identification and genetic analisys of an Agrobacterium tumefaciens chromosomal virulence rigion. J.Bacteriol., 1985, v.161, pp.850-860.

41. Dye D.M. A taxonomic study of the genus Erwinia. II. The "carotovora" group. New Zealand J.Sci., 1969, v. 12, pp.81-97.

42. Eckhardt T. A rapid method for identification of plasmid deoxyribonucleic acids in bacteria. Plasmid, 1978, v.l, pp.574-578.

43. Ellis J.G., Kerr A.. Petit A., Tempe J. Conjugal transfer of nopaline and agropine Ti-plasraids - the role of agrocinopines. Mol.Gen.Genet., 1982, v. 186, pp.269-273.

44. Farrand S.K.. Hwang I., Cook D.M. The tra region of the nopaline-type Ti plasmid is a chimera with elements related to the transfer systems of RSF1010, RP4, and F. J.Bacteriol., 1996, v. 178(14), pp.4233-4247.

45. Fuqua C., Winans S.C. Localization of OccR-activated and TraR-activated promoters that express two ABC-type permeases and the traR gene of Ti plasmid pTiRlO. Mol.Microbiol., 1996, v.20(6), pp.1199-1210.

46. Fuqua C., Winans S.C. Conserved cis-acting promoter elements are required for density-dependent transcription of Agrobacterium tumefaciens conjugal transfer genes. J.Bacterid., 1996, v. 178(2), pp.435-440.

47. Fuqua C., Burbea M., Winans S.C. Activity of the Agrobacterium Ti plasmid conjugal transfer regulator TraR is inhibited by the product of the traM gene. J.Bacteriol., 1995, v. 177(5), pp. 1367-1373.

48. Fuqua C., Winans S.C. Common ancestry between IncN conjugal transfer genes and macromolecular export systems of plant and animal pathogens. Mol. Microbiol., 1994, v. 14(4), pp.655-668.

49. Gelvin S.B., Habeck L.L. Vir genes influence conjugal transfer of the Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens . J.Bacteriol., 1990, v. 172, pp. 16001608.

50. Gelvin S.B., Gordon M.R., Nester E.W., Aronson A.I. Transcription of Agrobacterium Ti plasmid in the bacterium and in the crown gall tumors. Plasmid, 1981, v.6, pp.17-29.

51. Googdal S.H. DNA uptake in Haemophilis transformation. Ann. Rev. Genet. 1982, v.16, pp.169-173.

52. Hwang I., Cook D.M., Farrand S.K. A new regulatory element modulates homoserine lactone-mediated autoinduction of Ti plasmid conjugal transfer. J.Bacteriol.. 1995, v. 177(2), pp.449-458.

53. Habeeb L.F., Wang L., Winans S.K. Transcription of the octopine catabolism operon of the Agrobacterium tumor-inducing plasmid pTiA6 is activated by a LysR homolog. Mol. Plant-Microbe Interact., 1991, v.4, pp.379-385.

54. Herrera-Estrella L.. De Block M., Messens E., Hernalsteens J.-P., Van Montagu M., Shell J. Chimeric genes as dominant selectable markers in plant cells. EMBO J., 1983, v.2, pp.987-995.

55. Herrera-Estrella L.. Van Montagu M., Wang K. A bacterial peptide acting as a plant nuclear targeting sygnal: the amini-terminal portion of Agrobacterium virDi protein directs a (3-galactosidase fusion protein in tobacco nuclei. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1990, v.87, pp.9534-9537.

56. Hess K.M., Dadley M.W., Lynn D.G. Mechanism of phenolic activation of of Agrobacterium virulence genes - development of acpecific inhibitor of bacterial sensor response system. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1991, v.88, pp.7854-7858.

57. Heusterspreute M., Davidson J. A method for the generation of small pre-determined deletions in plasmid DNA: deletion analysis of the tetK region of vector pBR322. Gene, 1983, v.23, pp35-40.

58. Holsters M., Villaroel R., Gielen J., Seurink J., De Greve H., Van Montagu M., Shell J. An analisys of the boundaries of the octopine TL-DNA in tumors induced by Agrobacterium tumefaciens. Mol.Gen.Genet., 1983, v. 190, pp.35-38.

59. Holsters M., Silva B., Van Vliet F., Genetello C., De Block M., Dhaese P., Depicker A., Inze D., Engler G., Villaroel R., Van Montagu M., Shell J. The functional organization of the nopaline Ti plasmid pTiC58. Plasmid, 1980, v.3, pp.212-230.

60. Hooykaas P.J.J., Hofker M., den Dulk-Ras A.K., Shilperoort R.A.

A comparison of virulence determinants in the octopine Ti plasmid, a nopaline Ti plasmid, and an Ri plasmid by complementation analysis of Agrobacterium tumefaciens mutants. Plasmid, 1984, v.l 1, pp. 195-205.

61. Howard E.A., Zupan J.R., Citovsky V., Zambrysky P. The virTh protein of A.tumefaciens contains a C-terminal bipartite nuclear localiza-tion

sygnal: implication for nuclear uptake of DNA in plant cells. Cell, 1992, v.68, pp. 109-119.

62. Hynes M.F., Quadrant J., Connel M.P.O., Puhler A. Direct selection for curing and deletion of Rhisobium plasmids using transposons carryng the Bacillus subtilis sacB gene. Gene 78. 1989, pp.111-120.

63. Janssens A., Engler J., Zambryski P., Van Montagu M. The nopaline C58 T-DNA regoion is transcribed in Agrobacterium tumefaciens. Mol.Gen.Genet., 1984, v. 195, pp.341-350.

64. Jones A.L., Lai E.M.. Shurasi K. VirB2 is a processed pilin-like protein encoded by the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid. J.Bacteriol., 1996, v. 178(19), pp.5706-5711.

65. Kado C.I. Molecular mechanisms of crown gall tumorigenesis. Critical Reviewers in Plant Sciences, 1991, v. 10, №1, ppl 1-32.

66. Kado C.I. Promiscuous DNA transfer system of Agrobacterium tumefaciens: role of the virB operon in sex pilus assembly and synthesis. Mol.Microbiol., 1994. v. 12. №i, pp. 17-22.

67. Kado C.I., Liu S.T. A rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmid. J.Bacteriol., 1981, v. 145, pp. 1365-1373.

68. Kahn M.E., Smith H.O. Transformation in Haemofilis: a problem in membrane biology. Mol.Gen.Genet., 1984, v.81, pp.89-92.

69. Kao J.C.. Perry K.L., Kado C.I. Indoleacetic acid complementation and its relation to host range specifiyng genes on the Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens. Mol.Gen.Genet., 1982, v. 188, pp.425-432.

70. Klapwijk P.M., Schleuderman R., Shilperoort R.A. Coordinated regulation of octopine degradation and conjugative transfer of Ti plasmid in Agrobacterium tumefaciens: evidence for a common regulatory gene and separate operons. J.Bacteriol., 1978, v. 136, pp.775-785.

71. Kiapwijk P.M., Shilperoort R.A. Negative control of octopine degradation and transfer genes of octopine Ti plasmids in Agrobacterium tumefaciens. J.Bacterid., 1979, v. 139(2), pp. 424-431.

72. Kiapwijk P.M., van Breukelen J., Korevaar K., Ooras G., Shilpe-roort R.A. Transposition of Tn904 encoding streptomycin resistance into the octopine Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens. J.Bacteriol., 1980, v. 141(1), pp. 129-136.

73. Koukolikova-Nicola Z., Shillito R.D., Hohn B., Wang K., Van Montagu M., Zambrisky P. Involvement of circular intermediates in the transfer of T-DNA from Agrobacterium tumefaciens to plant cells. Nature, 1985, v.313, № 5999, pp.191-197.

74. Kwok S., Kellog D.H., McKinney N., Spacik D., Goda L., Levenson C., Shinsky J.J. Effect of primer-template mistmatches on the polimerase chain reaction: Human immunodeficiency virus 1 model studies. Nucl.Acids Res.,1990, v.18, pp.999-1005.

75. Lessl M., Balser D., Pansegraw W., Lanka E. Sequence similarities between the RP4 Tra2 and the Ti VirB region strongly support the conjugation model for T-DNA transfer. J.Biol.Chem.,1992, v.267(28), pp.20471-20480.

76. Machida Y., Usami S., Yamamoto A., Niwa J., Takebe I. Plant-inducible recombination between the 25 bp border sequenses of T-DNA in Agrobacterium tumefaciens. Mol.Gen.Genet., 1986, v.204, pp.374-379.

77. Marks J.R., Lynch T.J., Karlinsey J.E., Thomashov M.F. Agrobacterium tumefaciens virulence locus pscA is related to the Rhizobium meliloti exoC locus. J.Bacteriol., 1987, v. 169, pp.5835r5837.

78. Mattysse A.G. Role of bacterial cellulose fibrils in Agrobacterium tumefaciens infection. J.Bacteriol., 1983, v.154, pp.906-915.

79. Melchers L.S.. Hooykaas P.J.J. Virulence in Agrobacterium. Oxford Surv.Plant Mol.Cell Biol.. 1987, v.4, pp.167-170.

conjugation model for T-DNA transfer. J.Biol.Chem., 1992, v.267(28), pp.20471-20480.

89. Priefer U.B.. Simon R., Puhler A. Extension of the host range Escherichia coli vectors by incorporations of RSF1010 replication and mobilization functions. J.Bacteriol., 1985, v. 163, pp.324-330.

90. Ramanatan V.? Velutambi K. Transfer of non-T-DNA portions of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTiA6 from the left terminus of TL-DNA. Plant Mol.Biol., 1995, v.28, pp. 1149-1154.

91. Reverchon S., Robert-Baudouy J. Genetic transformation of the phytopathogenic bacteria, Erwinia chrysanthemi. Biochimie, 1985, v.67, pp.253-257.

92. Rogowsky P.M., Powell B.S., Shirasu K., Lin T.-S., Morell P., Zyprian E.M., Steck T.R.. Kado C.I.. Molecular characterization of the vir regulon of Agrobacterium tumefaciens: complete nucleotide seguence and gene organization of the 28.63-kbp regulon cloned as single unit. Plasmid 23, 1990, pp.85-106.

93. Sawasaki Y, Inomata K., Yoshida K. Trans-kingdom conjugation between Agrobacterium tumefaciens and Saccharomyces cerevisiae, a bacterium and a yeast. Plant Cell Physiol., 1996, v.37(l), pp.103-106.

94. Schitt F., Oakeley E.J., Jost J.P. Antibiotics induce genome-wide hypermethylation in cultured Nicotiana tabacum plants. J.Biol.Chem., 1997, v.272, №3, pp. 1534-1540.

95. Schluter K.. Futterer J., Potrykus I. "Horizontal" gene transfer from a transgenic potato line to a bacterial pathogen (Erwinia chrysanthemi) occurs -if at all - at an extremely low frequency. Biotechnology, 1995, v. 13, pp. 10941098.

96. Schroder A., Klipp W., Hillebrand A., Ehring R., Koncs C., Schroeder J. The conserved part of the T region expresses four protein in bacteria. EMBOJ., 1983, v.2, pp.403-409.

97. Secar V. A rapid screening procedure for the identification of recombinant bacterial clones. BioTechniques, 1987, v.5, pp.11-13.

98. Shaw C.H., Ashby A.M., Watson M.D. Plant tumor induction. Nature, 1986, v.324, pp.415-418.

99. Shirasu K. et al. Membrane location of the Ti plasmid VirB proteins involved in the biosynthesis of a pilin-like conjugative structure on Agrobacterium tumefciciens. FEMS Microbiol Lett., 1'993, v.111(2-3), pp.287294.

100. Shurvington C.E., Hodges L., Ream V. A nuclear localization sygnal and the C-terminal omega sequence in the Agrobacterium tumefaciens virD2 endonuclease are important for tumor formation. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1992, v.89, pp.11837-11842.

101. Simon R. High frequency mobilization of Gram negative bacterial replicons using the in vitro constructed Tn5-Mob transpozon. Mol.Gen. Genet., 1984, v.196, pp.413-420.

102. Simon R., Prieffer U.B., Puhler A. A broad host range mobilization system for the in vivo genetic engineering: transpozon mutagenesis in Gram negative bacteria. Biotechnology, 1983, v.l, 784-791.

103. Simon R., Weber G.. Arnold W. and Puhler A. Proc.of 8th North American Rhizobium Conference. (K.W.Klark and J.H.G.Stephens Eds.) University of Manitoba, 1983, Manitoba. P.67-89.

104. Solovova G.K.,Velikov V.A., Krivopalov Yu.V., Chumakov M.I. Short-term attachment of bacteria from the Rhizobiaceae family to the roots of cereals. In: Azospirillum VII and related microorganisms: genetics, physiology, ecology. (Eds.I.Fendrik, M.del Gallo, J.Vanderleyden, M.de Zamagoczy). NATO ASI series G., Ecological sciences,vol.37. Springer-Yerlag Berlin Geidelberg. 1995, p.223-230.

105. Solovova G.K.. Velikov V.A., Chumakov M.I. Wheat root colonization by non-pathogenic agrobacterium. Conference "Microbial

Ecology and Biological Control". Fallen Leaf Lake, South Lake Tahoe, California, USA, 1995, Sept. 15-18, Abstr., p32.

106. Sprinzl M., Geider K. Transfer of Ti plasraid from Agrobacterium tumefaciens into Esherichici coli cells. J.Gen.Microbiol., 1988, v. 134, pp.413424.

107. Stachel S.E., Nester E.W. The genetic and transcriptional organization of the vir regulon of the A6 Ti plasraid of Agrobacterium tumefaciens. EMBO J., v.5, pp. 1445-1454.

108. Stachel S.E., Messens E., Van Montagu M., Zarabryski P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature, 1985, v.318, pp.624-629.

109. Stachel S.E.. Timmerman B., Zambryski P. Generation of single-stranded T-DNA molecules during the initial stages of T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to plant cells. Nature, 1985, v.322,

№ 6081, pp.706-712.

110. Stachel S.E., Nester E.W., Zambryski P. A plant cell factor induces Agrobacterium tumefaciens vir gene expression. Proc.Natl.Acad.Sei.USA, 1986, v.83, pp.379-383.

111. Steck T.R. and Kado C.I. Virulence genes promote conjugative transfer of the Ti plasmid between Agrobacterium strains. J.Bacteriol., 1990, v.172, №4, pp.2191-2193.

112. Steck T.R.. Close T.R., Kado C.I. High levels of double-stranded transferred DNA (T-DNA) processing from an intact nopaline Ti plasmid. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1989. v.86, pp.2133-2137.

113. Stephens K.M., Roush C., Nester E. Agrobacterium tumefaciens virBu protein reguires a consensus nucleotide-binding site for function in virulence. Rew.Plant Pathol.. 1995. v.74. pp.681-685.

114. Stewart G.J.. Carlson C.A. The biology of natural transformation. Annu.Rev.Microbiol.. 1986, v.40, pp.211-214.

115. Timmerman B., Van Montagu M., Zambryski P. Vir-induced recombination in Agrobacterium. Physical characterization of precise and imprecise T-cycle formation. J.MoI.Biol., 1988, v.203, pp.373-384.

116. Tinland B., Schoumacher F., Gloeckler V., Bravo-Angel A.M., Hohn B. The Agrobacterium tumefaciens virulence D2 protein is responsible for precise integration of T-DNA into the plant genome. EMBO J., 1995, v. 14(14), pp.3585-3595.

117. Van Haute E., Joos H.; Maes S., Warren G., Van Montagu M., Shell J. Intergeneric transfer and exchange recombination of restriction fragments cloned in pBR322: a novel strategy for reversed genetics of the Ti plasmids of Agrobacterium tumefaciens. EMBO J., 1983, v.2,

pp.411-418.

118. Van Larebeke N., Engler N., Holsters M., Van den Elsacker S., Zaenen I., Shilperoort R.A., Shell J. Large plasmid in Agrobacterium tumefaciens essential for crown-gall inducing ability. Nature, 1974, v.252, №5479, pp. 169-175.

119. Von Bodman S., McCutchan J.E., Farrand S.K. Characterization of conjugal transfer function of Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTiC58. J.Bacteriol., 1989. v. 171, №10. pp.5281-5289.

120. Wang K.. Herrera-Estrella L., Van Montagu M., Zambryski P. Right 25 bp terminus sequence of a T-DNA is eesential for and determine direction of DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to plant genome. Cell, 1984, v.38, pp.455-459.

121. Ward E.R.. Barnes W.M.. VirDi protein of Agrobacterium tumefaciens is very tighly linked to the 5 -end of T-strand DNA. Science, 1988, v.242, pp.927-930.

122. Winans S.C., Erbert P.R., Stachel S.E., Gordon M.P., Nester E.W. A gene essential for Agrobacterium virulence is homologous to a family of positive regulatory loci. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1986, v.46, pp.325-333.

123. Wing W.N., Fife M.A. Enterobacter agglomerans (Beijerink) comb, nov. (The Herbicola-Lcithiri bacteria). Internat. J. Systematic Bacterid., 1972, v.22. pp.4-11.

124. Young C., Nester E.W. Association of virD2 protein with the 5 end of T-strand DNA in Agrobacterium tumefaciens. J.Bacteriol., 1988, v.8, pp.33673374.

125. Zaenen I., Van Larebeke N., Teuchy H., Van Montagu M., Shell J. Supercoiled circular DNA in crown gall-inducing Agrobacterium strains. J.Mol.Biol.,1974. v.86, pp.109-127.

126. Zambryski P., Joos N., Genetello C., Leemans J., Van Montagu M., Shell J. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity. EMBO J., 1983, v.2, pp.2143-2150.

127. Zhan X., Jones D.A.. Kerr A. The pTiC58 tzs gene promotes high efficiency root induction bv agropine strain 18955 of Agrobacterium rhizogenes. Plan Mol.Biol., 1990, v. 14, pp.785-789.

128. Zhang L.. Murphy P.J., Kerr A., Tate M.E. Agrobacterium conjugation and gene regulation by N-acyl-L-homoserine lactones. Nature, 1993, v.362(6419), pp.446-448.

129. Ziprian E.. Kado C.I. Agrobacterium-medi&ted plant transformation by novel mini-T vectors in cojunction with a high-copy vir region helper plasmid. Plant Mol.Biol.. 1990, v. 15, pp.245-256.

.л ч „. „ ^ I :, . \ г1 ^ л . !-1 > л

заведующему Ярославу Ивановичу Бурьянсву за всестороннюю яомошь в работе. Выражаю лтрш^ат&хь^осхь Анатолию Александровичу Мельникову л Сергею Вячеславовичу Чернышеву за плодотворное обсуждение результатов экспериментов, Наталье Сергеевне Захарчшко за помощь в освоении ряда методов исследования, Валерию Анатольевичу Доройко за техническую оомощь при оформлении работы.