Получение мутантных форм фоторецепторного белка рековерина по его Ca2+-связывающим доменам методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза и исследование их функциональных свойств тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Алексеев, Андрей Михайлович

• Алексеев, Андрей Михайлович
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Алексеев, Андрей Михайлович

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Оптимизация экспрессии эукариотических полипептидов в E.coli

1.1. Конфигурация векторов для эффективной экспрессии гетерологических белков

1.2.Факторы, оказывающие влияние на уровне транскрипции при экспрессии рекомбинантных генов

1.2.1. Промоторы

1.2.2.Терминаторы транскрипции

1.2.3. Антитерминаторы транскрипции

1.2.4. Строго регулируемые системы экспрессии

1.3. Регуляция на уровне трансляции

1.3.1. Инициация трансляции мРНК

1.3.2. Энхансеры трансляции

1.3.3. Стабильность мРНК

1.3.4. Терминация трансляции

1.4. Пространственная локализация экспрессированного белка в E.coli

1.4.1. Цитоплазматическая экспрессия

1.4.2. Экспрессия в периплазму

1.5. Гибридные белки

1.6. Молекулярные шапероны

1.7. Синонимические замены аминокислотных остатков

1.8. Протеолиз белка в процессе экспрессии белка

1.9. Выбор питательных сред и условий ферментации

1.10. Заключение

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Материалы и реактивы

2.2. Ферменты

2.3. Методы

2.3.1. Выделение ДНК плазмид из бактериальных клеток

2.3.1.1. Выращивание ночной культуры Е. coli

2.3.1.2. Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli

2.3.2. Выделение одноцепочечной формы фагаМ13шр19

2.3.3. Олигонуклеотид-направленный мутагенез рековерина

2.3.4. Мутагенез с помощью ПЦР, метод мегапраймера

2.3.5. Получение компетентных клеток E.coli

2.3.6. Трансформация клеток Е.coli

2.3.6.1. Трансформация клеток E.coli штамма XL-1 вектором М13шр19, несущим мутантную кДНК рековерина

2.3.6.2. Трансформация клеток Е.coli плазмидной ДНК

2.3.7. Определение нуклеотидной последовательности ДНК

2.3.8. Экспрессия рековерина и его мутантов в клетках Е.соН

2.3.9. Выделение рекомбинантного рековерина дикого типа

2.3.10. Выделение мутантных форм рекомбинантного рековерина

2.3.11. Аналитические процедуры

2.3.11.1. Определение концентрации белков

2.3.11.2. Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ)

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Конструирование и экспрессия гена рековерина

3.1.1. Выделение и идентификация полноразмерного гена рековерина.

3.1.2. Клонирование и экспрессия гена рековерина

3.1.2.1. Клонирование гена рековерина

3.1.2.2. Экспрессия гена рековерина и характеристика полученного рекомбинантного препарата рековерина

3.1.3. Получение миристоилированного рекомбинантного рековерина.

3.1.3.1. Коэкспрессия генов рековерина и миристоилтрансферазы

3.1.3.2. Сравнение свойств природного и миристоилированного рекомбинантного рековерина

3.2. Клонирование, экспрессия и выделение мутантов рековерина, модифицированных по его Са2+-связывающим участкам

3.2.1. Сайт-направленный мутагенез рековерина по его Са2+-

связывающим участкам

3.2.1.1. Сайт-направленный мутагенез ЕБ2 и ЕРЗ

3.2.1.2. Сайт-направленный мутагенез одновременно по ЕБ2 и ЕБЗ

3.2.1.3. Сайт-направленный мутагенез ЕР4

3.2.2. Экспрессия, выделение и очистка мутантов рековерина с

измененными Са - связывающими участками

3.3. Характеристика и функциональные свойства мутантов рековерина, модифицированных по его Са2+ - связывающим участкам

3.3.1. Связывание Са2+ мутантными формами рековерина

3.3.2. Связывание мутантных форм рековерина с

фоторецепторными мембранами

3.3.3. Функциональная активность мутантов рековерина

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список принятых сокращений

кДНК комплементарная ДНК

ДСН додецилсульфат натрия

ИПТГ изопропил-/?-тиогалактозид

НСП наружный сегмент палочек

ПААГ полиакриламидный гель

ПЦР полимеразная цепная реакция

ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭГТА этиленгликоль-бис/|3-аминоэтиловый эфир

тетрауксусной кислоты

O-i- о I

[Са ]f свободная концентрация ионов Са

EFl, EF2, EF3 и EF4 соответственно, первый - четвертый Са -

связывающие участки рековерина -EF2, -EF3, -EF2,3 соответственно, мутантные формы рековерина

с "испорченными" участками EF2, EF3 и одновременно EF2 и EF3 +EF4 мутантная форма с "восстановленным"

участком EF4

nRc и mRc соответственно, рекомбинантный

немиристоилированный и миристоилированный рековерин Rh родопсин

RK родопсинкиназа

SspA фрагмент белка А из Staphylococcus aureus

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение мутантных форм фоторецепторного белка рековерина по его Ca2+-связывающим доменам методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза и исследование их функциональных свойств»

ВВЕДЕНИЕ

Ионы Са2+ и процессы фосфорилирования дефосфорилирования белков используются клетками всех типов для передачи и регуляции самых разнообразных внешних и внутриклеточных сигналов, управляющих такими фундаментальными биологическими функциями, как клеточная рецепция, пролиферация и дифференцировка, иммунитет, транспорт. Благодаря методическому удобству работы с фоторецепторными клетками (исключительно высокое содержание сигнальных белков, возможность "запуска" передачи сигнала светом), зрительный пигмент родопсин, принадлежащий к семейству сопряженных с О-белками мембранных рецепторов, и зрительный каскад родопсин - трансдуцин - свМР-фосфодиэстераза послужили прототипами для огромного числа работ по системам рецептор - О-белок - эффекторный белок, функционирующим в клетках других типов.

Многие эффекты Са на системы клеточной сигнализации опосредованы Са2+-связывающими белками, мишенями для которых часто служат протеинкиназы и протеинфосфатазы. Одним из таких белков в фоторецепторном каскаде является рековерин, роль которого состоит в кальцийзависимом ингибировании фосфорилирования фотовозбужденного родопсина родопсинкиназой, находящейся в активированном состоянии.

Рековерин представляет собой белок состоящий из единственной полипептидной цепи длинной в 201 аминокислотных остатков и его расчетная масса составляет 23 кД, ТчГ-конец рековерина миристоилирован.

К настоящему времени определены аминокислотные последовательности рековерина из палочек сетчатки быка, человека и его гомолога из сетчатки лягушки 8-модулина. Сравнение первичных структур рековеринов из выше перечисленных источников показало высокую степень гомологии и выявило наличие четырех потенциальных Са -связывающих доменов типа ЕБ-Иапс!, первый и последний из которых не способны связывать ионы кальция.

Одним из наиболее эффективных приемов, позволяющих исследовать механизмы функционирования белков, является метод олигонуклеотид-направленного мутагенеза. Важнейшим моментом в осуществлении этого подхода является получение функционально активного рекомбинантного белка, то есть выбор адекватной системы экспрессии. Экспрессия в Е.соН является наиболее разработанным и экономичным способом получения некоторых эукариотических белков, включая и рековерин.

Настоящая работа посвящена оптимизации метода получения рекомбинантного рековерина и созданию его мутантных форм, с целью выяснения роли кальцийсвязывающих участков в формировании пространственной структуры и функции этого белка.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Оптимизация экспрессии эукариотических полипептидов в Е.соИ.

1.1. Конфигурация векторов для эффективной экспрессии гетерологических белков.

Конструирование плазмиды для экспрессии требует нескольких элементов, сочетание которых обязательно для эффективной экспрессии. Каноническая последовательность вектора экспрессии приведена на рис. 1.

RES

последовательность Устойчивость

R -35 -10 SD гена TT к антибиотику

Ori

-35 -Ю

' TTGACA (N)17TATAAT

mRNA 5' UAAGGAGG(N)8 16S rRNA AUUCCUCC

STOP ко дон UAAU UGA AUG

START ко дон AUG (91%) GUG (8%) UUG (1%)

Рис. 1. Схематическое представление элементов прокариотического вектора экспрессии. Представлен lac промотор (Р), в состав которого входят последовательности -35 и -10. Стрелкой указана последовательность транскрипции.

Для того, чтобы в клетках E.coli произошла экспрессия любого гена, этот ген должен быть транскрибирован РНК-полимеразой.

Транскрипция генов РНК-полимеразой начинается с её взаимодействия с промотором, определенной последовательностью нуклеотидов, расположенных перед структурной частью гена. На рис. 2 представлена каноническая последовательность нуклеотидов промотора Е. соН, в которой обобщены данные о первичной структуре 170 промоторов известных генов.

Рис. 2. Усредненная (каноническая) последовательность нуклеотидов промотора Е. coli с регуляторными сайтами. Обозначены нуклеотиды, встречающиеся в 39 % из 168 исследованных промоторов. Прописными буквами отмечены нуклеотиды, встречающиеся более чем у 54 % всех промоторов.

На схеме показаны нуклеотиды, которые с высокой частотой встречаются в этих положениях рассмотренных промоторов. Отсюда следует, что в любом промоторе E.coli присутствуют два консервативных участка, необходимых для эффективной работы промотора [1]. Первый из них расположен приблизительно за 10 нуклеотидов перед точкой инициации транскрипции, имеет обобщенную структуру ТАТААТ. Каноническую структуру второго участка, расположеного приблизительно за 35 нуклеотидов перед точкой инициации транскрипции (область -35), можно представить в виде последовательности TTGACT [2, 3].

Эффективность трансляции мРНК зависит от наличия на 5' конце этой РНК участка связывания рибосом, включающего инициирующей кодон AUG и последовательность длиной 3-9

-35

-10

1 . iy . Tat.Vnt

+1

а

tcTTGACat..t

нуклеотидов, комплементарных 3' концу 16S рибосомальной РНК и расположенной перед инициирующим кодоном. Этот комплементарный рРНК участок называют последовательностью Шайн-Дальгано (SD).

Терминатор транскрипции (TT) распологается вслед за кодирующей последовательностью и содержит сигналы как для терминации транскрипции [4] так и сигналы для предохранения мРНК от экзонуклеаз [5, 6, 7].

Помимо выше перечисленных элементов, для эффективной экспрессии вектор должен содержать ген, кодирующий устойчивость к антибиотику. Для этих целей широко используется ген ß-лактамазы (маркер, позволяющий проводить положительную селекцию).Однако при получении фармацевтических белков для человека, предпочитают использовать другие антибиотики для уменьшения возможного аллергического ответа [8].

Важно также и количество копий плазмиды на клетку, которое определяется областью начала репликации (ori). В большинстве случаях наблюдается корреляция между большим количеством плазмид на клетку и повышенным уровнем экспрессии целевого белка[9,10]. В других случаях увеличение количества копий плазмиды не приводит к увеличению уровня экспрессии чужеродного гена. Более того Васкварез [11] представил данные, что увеличение копий плазмиды на клетку привело к уменьшению экспрессии трипсина в E.coli. Также есть данные, что присутствие сильного промотора в высоко-копийных плазмидах снижает жизнеспособность клеток [12].

Анализ литературы по компьютерной сети "Internet" показывает, что наиболее используемым вектором экспрессии является серия векторов рЕТ, предложенная Студиером в 1991 году. В этих векторах сбалансированы сильный промотор и жесткая

регуляция этого промотора, повышен уровень синтеза мРНК. Штамм для экспрессии содержит мутации по генам протеаз. Более того, фирма "Invitrogen" добавила в эти вектора дополнительные сайты для клонирования и средства для более упрощенного выделения целевого белка.

1.2.Факторы, оказывающие влияние на уровне транскрипции при экспрессии рекомбинантных генов. 1.2.1. Промоторы.

Промоторы, используемые для экспрессии в E.coli (таблица 1) должны обладать следующими характеристиками. Во-первых, промотор должен быть сильным, т.е. обеспечивать накопление целевого белка 10-30% от сумарного клеточного белка. Во-вторых, должен проявлять минимальный уровень базальной активности, т.е. до добавления индуктора. Жесткая регуляция промотора необходима для синтеза белков, которые могут нарушать клеточный цикл. Например, токсичный для E.coli VP7 белок ротаровируса эффективно разрушает клетки и должен экспрессироваться в жестких условиях регуляции [65]. Однако в некоторых случаях недостаточно строгих условий регуляции, так как даже малейшее количество рекомбинантного белка критично для существования клетки. Примером могут служить молекулы белков которые инактивируют рибосомы или разрушают мембранный потенциал клетки. Токсичность может быть вызвана сверхэкспрессией некоторых собственных белков E.coli, таких как traT гена, который кодирует мембранный липопротеин; ЕсоШ рестриктазы в отсутствии соответствующей метилазы либо/или Ion гена. Более того, неполная репрессия экспрессирующей системы может быть причиной

нестабильности плазмид, уменьшения роста клеток и потери продукции рекомбинантного белка.

Ланзер и Бугард [67] провели интенсивные исследования широко используемой системы промотор-оператор гена lac и показали, что уровень репрессии промотора различается в зависимости от того, где расположен оператор. Так, если 17-членный оператор был помещен в пространство между -35 и -10 положениями уровень репрессии возрастал от 50 до 70 раз. Если оператор был помещен за позицией -35 или перед -10, то уровень репрессии резко уменьшался.

Таблица 1. Промоторы, используемые для высоко-эффективной экспрессии генов в E.coli.___

Промотор Регуляция Индуктор Ссылки

lac (E.coli) lacl, lacl4 ИПТГ 13, 14,15,16

ZacI(Ts), laclq (Ts) Термоиндукция 17

lacl4 (Ts) Термоиндукция 18

trp (Е. coli) Индол-акриловая кислота 19, 20,21,22

lpp {E.coli) ИПТГ, лактоза 23, 24, 25

phoA (E. coli) phoB позитивная фосфат 26, 27, 28, 29

phoR негативная

recA (E. coli) lexА Налидиксовая кислота 30

araBAD (E.coli) araC Ь-арабиноза 31

proU (E.coli) Осмотический шок 32

cst-1 (E.coli) Глюкоза 33

tetA (E.coli) Тетрациклин 34,35

cadA (E.coli) cadR РН 36,37, 38

nar (E.coli) fnr (FNR, NARL) Анаэробные условия 39

tac, (гибрид) lacl, lacl4 ИПТГ 40,41

trc, (гибрид) lacl, lacl4 ИПТГ 42

7acI(Ts), lacl01 (Ts) Термоиндукция 43,44

PiA) A,clts857 Термоиндукция 45, 46, 47, 48

Pl-9G-50 Уменьшение температуры 49, 50

Промотор Регуляция Индукция Ссылки

cspA (E.coli) Уменьшение температуры до 20°С 51, 52

Pr Pl тандем (À,) Xclts857 Термоиндукция 53,54

T7 (T7) №857 Термоиндукция 55, 56

Т7-1ас оператор laclq ИПТГ 57, 58, 59

Т3-1ас оператор lad4 ИПТГ 60

Т5- lac оператор laclq lacl ИПТГ 61,62

Т4- ген 32 (Т4) Инфекция фагом Т4 63,64

Третьей важной характеристикой промотора является его способ индукции. Для большинства широко используемых промоторов в биотехнологических целях применяется тепловая индукция или химический индуктор: индол-акриловая кислота [19, 20]. Индукция промотора lac и его производных tac и trc промоторов широко используется в лабораторных исследованиях. Однако использование ИПТГ в биотехнологических маштабах для получения рекомбинантных белков человека невозможно ввиду его токсичности и дороговизны. Этот недостаток ИПТГ в настоящее время является непреодолимым.

Способность мутантного гена lacl (Ts) продуцировать термочувствительный 1ас-репрессор сейчас позволяет использовать термочувствительную индукцию промоторов lac, вместо ИПТГ [17, 18]. К тому же новые вектора осуществляют строгую регуляцию trc промотора при 30°С [9]. В работе [68] описаны два различных термочувствительных мутанта гена lac, которые также хорошо, как и ИПТГ осуществляют индукцию.

Холодо-зависимые промоторы меньше исследованы, чем описанные выше, при этом показано, что они могут также эффективно использоваться для экспрессии рекомбинантного белка при пониженной температуре. Активность A,PL промотора возрастала при 20°С и снижалась, когда температура повышалась [49, 50]. Этот ответ промотора на понижение температуры регулируется фактором E.coli, который является многофункциональным белком, который осуществляет связывание и сворачивание ДНК. Промотор холодо-зависимого ответа гена cspA обладает схожей активностью с понижением температуры [51]. Молекулярные исследования cspA и PL промоторов ведет к обнаружению специфической последовательности ДНК, вовлеченной в усиление транскрипции при пониженнии температуры.

Создание векторов с холодо-зависимыми промоторами основано на том предположении, что правильное образование третичной структуры белка возможно при температурах 15-20°С. В то же время при этой температуре падает уровень транскрипции и трансляции. В этих условиях достаточно времени для правильного фолдинга, сборки активного белка, но и скорость образования неправильно сформированного белка уменьшается.

Недавно были охарактеризованы другие промоторы: очень сильным является рН-промотор [36, 38]. Рекомбинантный белок продуцируется на уровне 40-50% от общего клеточного белка. Однако уровень экспрессии различен для разных генов вследствие того, что синтез белка зависит и от эффективности трансляции, и от силы промотора.

Промоторы E.coli расположены обычно от -10 до -35, включая пространство в 15-19 н.п. между гексамерами. Однако было предположено, что нуклеотидная последовательность, следующая за

районом -35 может обладать стимулирующей активностью на промотор . Многие исследования показывают, что последовательность выше -35 увеличивает скорость инициации транскрипции in vivo [69]. Горе и др. [70] показали, что последовательность ДНК (UP-элемент) промотора rrnBPl функционирует как независимый модуль промотора. Это стало ясно из экспериментов в которых UP-элемент сшивали с промотором lacUV5, в следствие чего возрастала транскрипционная активность.

Хотя эти промоторы обладают повышенной активностью, они пока не используются для проведения экспрессии рекомбинантного белка, в следствие сложности их регуляции. Регуляция зависит от стадии клеточного роста. На логарифмической фазе, когда потребность в белках повышена, то активность этих промоторов также повышена.

1.2.2.Терминаторы транскрипции.

В прокариотах терминаторы транскрипции управляются двумя различными механизмами: Rho - зависимая терминация транскрипции зависит от холоферментного комплекса rho, который освобождает появляющуюся РНК от матрицы ДНК. Напротив, rho - независимая терминация зависит от сигналов, закодированных в матрице. Обязательным элементом терминатора транскрипции является палиндромная последовательность, которая на молекуле РНК формирует двухцепочечную шпильку. В случае Rho независимых терминаторов шпилька на 3'-конце молекулы РНК, как правило, является GC-богатой, а за ней следует последовательность олиго(Ц). Любые шпильки, возникающие в синтезирующейся РНК, по-видимому, заставляют полимеразу двигаться медленнее или останавливаться. На Rho-независимых терминаторах полимераза

отделяется от ДНК-матрицы и высвобождает РНК. Последовательность из остатков и, расположенная сразу за шпилькой, принимает участие в этом процессе. Комплекс РНК-ДНК и-ёА характеризуется очень слабым комплементарным взаимодействием. Поэтому достаточно минимального количества энергии, чтобы разрушить связи, удерживающие вместе две цепи. Остановка РНК-полимеразы в области шпильки в Шю-независимом терминаторе создает благоприятные условия для освобождения РНК из комплекса и-ёА.

В случае Шю-зависимых терминаторов в шпильке обычно меньше содержание ОС-пар и отсутствует олиго(Ц)-участок. Полагают, что фактор Шю связывается с 5'-концом синтезирующейся молекулы РНК и движется вдоль неё. В том случае, когда РНК-полимераза останавливается в районе шпильки, фактор Шю может догнать РНК-полимеразу и в результате взаимодействия с ней вызвать распад комплекса.

Эффективные терминаторы транскрипции являются необходимым элементом векторов экспрессии, в следствие важности выполняемых функций. Известны также случаи, когда РНЕС-полимераза игнорирует сигналы терминации и выключает следующий промотор для синтеза РНК. Это явление,называемое исключение промотора, можно предотвратить, поместив сильный терминатор транскрипции сразу после кодирующей последовательности, или перед промотором с которого будет экспрессироваться нужный ген.

Также известно, что транскрипция с сильного промотора может дестабилизировать плазмиду в результате сверхпродукции 1ЮР белка, который контролирует количество копий плазмиды на клетку [71]. Кроме того, терминаторы транскрипции усиливают стабильность мРНК [72, 73] и могут существенно увеличивать уровень наработки

рекомбинантного белка [72, 74]. Особенно эффективным являются два тандемных терминатора Т1 и Т2, взятых из rrnB рРНК оперона Е. coli, но также достаточно эффективны и многие другие последовательности терминаторов [75].

1.2.3. Антитерминаторы транскрипции.

В бактериях опероны биосинтеза аминокислот содержат аттенюаторы транскрипции на 5'-конце. Лидерная область состоит из 100-200 н.п., предшествующая структурным генам, транскрибируется РНК-полимеразой. Трансляционный продукт этого сегмента - пептид, богатый той аминокислотой, синтез которой контролируется данным опероном. РНК лидерной области способна формировать две взаимоисключающие шпилечные структуры. Одна из них представляет типичный терминатор транскрипции и возникает при избытке регуляторной аминокислоты. При недостатке соответствующей аминокислоты, терминатор транскрипции меняет вторичную структуру и формирует антитерминатор транскрипции. Это позволяет транскрипции продвигаться в район структурных генов [76].

Антитерминация транскрипции очень сложный процесс, в который вовлечены многие известные белки, а так же ещё неидентифицированные кофакторы [77]. Однако элементы антитерминации используются в экспрессии гетерологических генов в E.coli.

Один из широко используемых систем экспрессии является система, основанная на использовании позднего промотора фага Т7. Активность этой системы зависит от уровня транскрипции Т7 РНК-полимеразы и тех регуляторных механизмов, которые подавляют экспрессию Т7 РНК-полимеразы до момента индукции. Мертенс [78]

предложил экспрессировать Т7 РНК-полимеразу в составе плазмиды под контролем промотора A,pL. Между промотором и структурной частью гена были помещенны три тандемных терминатора транскрипции, что позволяло полностью блокировать базальный уровень экспрессии. Для индукции в состав плазмиды был встроен ген nutL/N фага X, продукт которого выполнял антитерминирующие функции. Белок nutL/N взаимодействуя с терминаторами транскрипции ослаблял их действие, что приводило к экспрессии Т7 РНК-полимеразы.

Антитерминирующйй регион транскрипции оперона rrnB рРНК использовался при конструировании плазмиды pSE420 с промотором trc [79]. Логическим обоснованием в данном случае было способствование транскрипции через жесткую вторичную структуру, для уменьшения преждевременной терминации транскрипции РНК-полимеразой. Однако в данном случае присутствие антитерминаторов транскрипции, по-видимому, было не эффективным [79].

1.2.4. Строго регулируемые системы экспрессии.

Преимущества строго регулируемых промоторов ведет к разработке многих высокорегулиремых систем экспрессии, которые особым образом используются для экспрессии генов, продукт которых является определяющим для жизнедеятельности E.coli.

В литературе описаны различные методы для усиления жескости регуляции систем экспрессии, включая использование метода "платто" [80], увеличения соотношения репрессор-оператор [81], индукция инфекцией мутантными фагами[82], ослабление силы промотора в высококопийных векторах [83], использование терминаторов транскрипции [79], комбинирование терминаторов с

антитерминаторами транскрипции [79]. Использование антисенс РЕПС, которая комплементарна мРНК клонированного гена [84].

Так же используется подход, основанный на принципе инвертированности промотора [85, 86]. Промотор, фланкированный двумя сайтами интеграции помещается перед кодирующей последовательностью в противоположном направлении. Промотор инвертируется индуцированием сайт-специфической генетической рекомбинацией с использованием интегразы фага X.

Выше описанные системы имеют как преимущества, так и недостатки, зависящие от их конкретного применения. Например, методы, рассчитанные на твердые среды не могут легко использоваться для широкомаштабной экспрессии. Высокий уровень репрессора часто служит причиной уменьшения выхода белка. Индукция, опосредованная фагом X ведет к усложнению экспрессирующих систем. Использование инвертированности промотора требует усложнения конструкции вектора.

Хотя большинство выше описанных систем не используется для широкомаштабной экспрессии белков, тем не менее их узучение играет важную роль в понимании процессов экспрессии генов.

1.3. Регуляция на уровне трансляции. 1.3.1. Инициация трансляции мРНК.

Интенсивные исследования процессов транскрипции позволяет использовать прокариотические промоторы кассетным способом, т.е. не обращая внимание на окружающий нуклеотидный контекст [87]. Однако факторы, определяющие инициацию белкового синтеза является более трудным процессом для расшифровки, принимая во внимание сложность этого процесса. Сейчас стало ясно, что широкая амплитуда в эффективности трансляции различных мРНК

предопределена уникальной структурой на 5' конце мРНК. Таким образом, в противоположность переносным промоторам, не была разработана универсальная последовательность для эффективной инициации трансляции. Однако в случае экспрессии генов E.coli эта проблема в настоящее время изучена более детально [88].

Инициирующая область трансляции большинства отсеквенированных генов содержит инициирующий кодон AUG (91%). GUG используется приблизительно в 8% генов, и UUG как стартовый кодон в 1% [89]. В одном случае AUU используется как стартовый кодон для гена infC [90]. Этот кодон требуется для аутогенной регуляции infC.

Шайн и Дальгано обнаружили последовательность в РСУ мРНК бактериофага X, который взаимодействует с комплементарным 3' участком 16S рРНК в процессе инциации трансляции [91]. Пространство между SD и инициирующим кодоном AUG может различатся от5 до 13 нуклеотидов и это влияет на эффективность инциации трансляции. Интенсивные иследования были выполнены для определения оптимальной последовательности нуклеотидов в районе SD и расстояния от SD и первого инциирующего кодона. Рингвист и др. [92] проверили трансляционную роль рибосом-связывающего участка и пришли к следующим выводам: 1) Последовательность SD UAAGGAGG способствует 3-6 кратному увеличению выхода белка, чем последовательность AAGGA при любом расстоянии до первого инициирующего кодона. 2) Для каждой последовательности SD существует оптимальное расстояние до первого инициирующего кодона. Для AAGGA составляет 5-7 нуклеотидов; для UAAGGAGG - от 4-8 нуклеотидов. Такое расстояние объясняется, тем что должно существовать точное

физическое соответствие между 3'-концом 16S РНК и антикодоном формил Met-тРНК [92].

Вторичная структура инициирующего региона транскрипта мРНК играет важную роль в эффективности экспрессии гена [93]. Предполагается, что сопряжение SD области и AUG кодона в составе шпилечной структуры предотвращает доступность присоединения 30S субъединицы рибосомального белка и тем самым ингибируется инициация трансляции [94]. Несколько различных стратегий предложено для уменьшения образования вторичной структуры мРНК.

Обогащение рибосомсвязывающего участка аденином и тимидином увеличивает экспрессию некоторых генов [95]. Так же показано, что мутации перед участком SD или после него супрессируют образование вторичной структуры и усиливают эффективность трансляции [96, 97].

Другой подход заключается в использовании встречающегося в бактериях явления трансляционного сопряжения. Механизм трансляционного сопряжения заключается в подсчете коэфициента эффективности трансляции различных генов с полицистронной мРНК. Было показано, что умерено сильный промотор gal может синтезировать галактокиназу с большим выходом, когда galK был трансляционно сопряжен с выше стоящим геном. Тем самым поддержанно мнение, что даже слабый рибосом-связывающий участок может хорошо организовывать комплекс с рибосомами [98]. Счиперли и др. высказали мнение, что этот регуляторный механизм может иметь важное применение в сверхпродукции белков. Действительно, механизм трансляционного сопряжения, в дальнейшем широко использовался для высоко-эффективной экспрессии различных генов [99, 100].

Кроме связывания 8Б участка с 168 рРНК, другие взаимодействия между мРНК и рибосомой вовлечены в процесс инициации трансляции. Исследования методом кросс-сшивок показали, что рибосомальный белок напрямую вовлечен в процесс узнования и связывания мРНК белком 308 рибосомального комплекса [101]. Были исследованы структурно-функциональные взаимодействия многих компонентов комплекса инициации трансляции в прокариотах [102, 103].

1.3.2. Энхансеры трансляции.

Последовательности которые могут усиливать экспрессию гетерологичных генов в Е.соЫ идентифицированны как в бактериях, так и фагах. Олинс и др. [104] охарактеризовали последовательность в 9 нуклеотидов из гена 10 фага Т7 (§10-Ь), которая по-видимому влияет на рибосом-связывающий участок. В сравнении с канонической последовательностью 8Б, последовательность £10-Ь вызывает увеличение экспрессии некоторых генов от 40 до 340 раз [105]. Когда gl0-L поместили выше, чем синтетический участок ББ, то это вызывало 110-кратное увеличение уровня трансляции гена 1ас2, подсчитанное как соотношение уровня активности |3-галактозидазы к количеству мРНК гена lacZ. Модель, которая объясняет почему эта последовательность вызывает усиление трансляции сводится к тому, что §10-Ь взаимодействует с последовательностью 168 рРНК в позициях 458-466 [105]. Кроме того, высказано предположение, что только мРНК с ослабленным участком 8Б содержит подобные энхансеры для усиления стабильности мРНК. Последовательности, гомологичные §10-Ь, были обнаружены также и в других бактериофагах [106].

Последовательность glO-L была использована при конструировании серии векторов рЕТ [55]. Наряду с высокоэфективным промотором фага Т7 в состав этих векторов входит и область инициации трансляции гена 10, включающая как достаточно протяженную SD-последовательность, так и трансляционный энхансер, т.е. нуклеотиды, комплементарные двум различным областям 16S рРНК, и в следствие этого, обладающая повышенной эффективностью взаимодействия с рибосомами при инициации белкового синтеза [57].

Была также обнаружена уридин-богатая последовательность в 5'- нетранслируемой области (UTR) мРНК, которая действует как энхансер трансляции. Маккарфи и др. [107] охарактеризовали регион гена atpE в E.coli непосредственно перед участком SD. Последовательность в 30 нуклеотидов была использована для сверхпродукции генов интерлейкина 2 и ß-инерферона. Было показано, что U8 последовательность непосредственно перед участком SD эффективно транслирует мРНК гена РНК азы D. Делеция этого района несколько уменьшает уровень трансляции, при этом уровень мРНК гена rnd остается постоянным [108]. Бони и др. [101, 109] показали, что мишенью для подобных последовательностей является белок S1 из 30S рибосомального комплекса.

Интересную работу представили Спренхед и др., показав, что последовательность расположенная сразу за стартовым кодоном играет важную роль в процессе инциации трансляции. Специфический район, локализованный между позициями +9 и +26 гена 0.3 фага Т7 или район между позициями +9 и +21 гена 10 фага Т7 [110] функционируют как усилители трансляции. Эти участки комплементарены 16S рРНК в позиции 1469-1483. Делеция этих районов резко уменьшает трансляционную активность.

Эти обнаруженные факты показывают, что кроме SD-участка и первого инициирующего кодона, другие последовательности в мРНК играют важную роль в инициации трансляции. Хотя точный механизм вышеперечисленных явлений до конца еще не ясен, предпринимаются попытки использовать их для усиления сверхпродукции рекомбинантных белков.

1.3.3. Стабильность мРНК.

Различные РНКазы участвуют в деградации мРНК в E.coli включая эндонуклеазы РНКаза Е, РНКаза К, РНКаза III, и 3'-экзонуклеазы (РНКаза II и полинуклеотидфосфорилаза). В прокариотах не обнаруженно 5'-экзонуклеазной активности [111, 112].

Два класса защитных элементов известны для стабилизации мРНК в E.coli. Один класс содержит последовательность в 5'-нетранслируемой области мРНК [113] и другой класс включает образование шпилечной структуры в 3' нетранслируемой области. Некоторые из этих элементов действуют как стабилизаторы, но только в ограниченных условиях. Например: 5'-нетранслируемая область гена 32 бактериофага Т4 увеличивает период полураспада и стабильность сшитых с этой областью гетерологичных мРНК только в случае инфекции E.coli [114]. Гены устойчивости к эритромицину (erm) грамм-положительных бактерий, таких как Staphylococcus aureus и Bacillus subtilis кодируют мРНК, содержащие стабилизирующие элементы в 5'-нетранслируемой области. Однако стабилизация индуцируется антибиотиком, который, в свою очередь, ингибирует трансляцию и является причиной замедления продвижения рибосомы на мРНК. Подобные стабилизирующие

влияния 5'- участка наблюдается в случае транскриптов A.PL и A,PR при инфекции E.coli.

В противоположность выше описанным примерам 5' UTR Е. coli гена ошрА продлевает период полураспада мРНК в E.coli в нормальных условиях растущей клетки. Емори и др. [115] показали, что для стабилизации 5' UTR гена отрА необходимо присутствие шпилечной структуры недалеко от окончания 5' UTR. Более того, показано, что период полураспада нормальных лабильных мРНК, может быть продлен добавлением шпилечной струтуры на 5'-конце нетранслируемой области [115]. По-видимому, добавление 5' UTR гена отрА к гетерологичным генам может усиливать их экспрессию генов в E.coli. С другой стороны, если мРНК содержит внутренний сайт для РНКаз, то такое добавление стабилизатора не эффективно.

Другой класс защиты мРНК содержит 3' UTR последовательность, которая может формировать структуру в виде шпильки, тем самым блокируя экзонуклеазное разрушение транскрипта с 3' конца [116]. Вонг и Чанг [117] обнаружили такие элементы в терминирующей области гена кристаллического белка Bacillus thuringiesis. Слияние этого позитивного регулятора с 3' терминирующей областями пеницилиназы гена (penP) Bacillus licheniformis и кДНК интерлейкина-2 человека (IL-2) увеличивает продукцию соответствующих полипептидов как в В. subtilis так и в E.coli.

Однако как в случае некоторых 5' стабилизаторов, так и 3' не может служить универсальным стабилизатором мРНК. Например, замещение 3' терминирующей петли лабильной мРНК на подобную петлю из стабильной мРНК не усиливает экспрессию лабильной мРНК [117]. Более того, имеются данные о том, что экспрессия гена

может быть усилена использованием штаммов E.coli мутантным по РНКазам, таких как РНКаза II и РНРаза.

В этом случае также маловероятно использовать данную стратегию, потому что, отсутствие РНКазы II или РНРазы, а также сверхпродукция РНКазы II не увеличивает усредненного количества суммарной мРНК. Более того, штаммы дефектные одновременно и по РНКазе II и РНРазе нежизнеспособны [118].

Эти и другие исследования приводят к следующиму выводу: маловероятно, что различная стабильность большинства мРНК, которые имеют на 3'-конце шпилечных структур является результатом различной восприичивости этих шпилечных структур к действию З'-экзонуклеаз, более того, З'-экзонуклеазное разрушение мРНК возможно является редким процессом, исключая те случаи когда 3' мРНК не содержит шпилечной структуры [5].

1.3.4. Терминация трансляции.

Наличие стоп сигнала в мРНК является незаменимым компонентом процесса терминации трансляции. Кроме терминирующих кодонов UAA, UGA и UAG в процессе терминации вовлечены специфические факторы высвобождения [119]. В E.coli RF-1 терминирует трансляцию стоп кодона UAG. RF-2 терминирует трансляцию UGA кодона и оба фактора участвуют в терминации трансляции UAA кодона. Недавно был клонирован добавочный фактор RF-3 [120]. Конструирование векторов экспрессии часто включает в себя вставку всех трех стоп кодонов для предотвращения проскакивания рибосом. В E.coli такое проскакивание рибосом обнаружено для стоп-кодона UAA [121].

Статистический анализ более чем 2000 генов E.coli обнаружил специфическую последовательность как в стоп-кодонах, так и в

нуклеотидах идущих вслед за триплетом. Были тестированы сила каждого из 12 возможных тетрануклеотидных стоп-сигналов (ИДАМ, ЦХЗАМ, иАОТЧ). Эффект терминации зависел, как от самого стоп-кодона, так и четвертого нуклеотида. В процентах это выглядело следующим образом: иААи составляло 80% и 7% для 1ЮАи. Эти исследования показывают, что терминация трансляции сильно зависит от нуклеотида непосредственно следующим за стоп кодоном [122]. Таким образом, самый сильным терминатором в Е.соН является иААИ.

Нуклеотидный контекст 5' конца стоп-кодона также влияет на эффективность терминации. Так заряд и гидрофобные свойства предпоследней С-концевой аминокислоты в процессе синтеза белка является причиной 30-кратного различия в эффективности терминации ТЮА стоп-кодона. В тоже время стоп-сигнал ИАО в меньшей степени чувствителен к природе предпоследнего аминокислотного остатка. Для последнего аминокислотного остатка а-спираль и [3-изгиб являются определяющими факторами для иОА терминатора.

1.4. Пространственная локализация экспрессированного белка в Е.соН.

Гетерологичные гены в составе экспрессирующих плазмид можно конструировать таким образом, что детерминируемые ими чужеродные белки будут локализоваться в цитоплазме клеток Е.соН либо, если лидерную последовательность встроить перед кодирующей, будут секретироваться наружу через клеточную мембрану.

1.4.1. Цитоплазматическая экспрессия.

Большая часть рекомбинантных эукариотических белков при очень высоком уровне биосинтеза переходят в нерастворимое состояние, образуя в клетках так называемые тельца включения. Тельца включения представляют собой частицы, состоящие главным образом из агрегатов рекомбинантного белка и ряда бактериальных белков Образование телец включения имеет ряд преимуществ [таблица 2]. Однако это небольшие преимущества, принимая во внимание трудности перевода из агрегированного состояния в нативное, неясно будет ли этот белок обладать биологической активностью. Данные которые предсказывают физико-химические параметры для образования телец вкючения до конца ещё не ясны. Статистический анализ 81 белка которые необразовывают телец включения в E.coli показывает, что шесть параметров коррелирует с образованием телец включения: 1) общий заряд белка, 2) аминокислотные остатки, принимающие участие в формировании ос-спирали, 3) количество цистеинов, 4) количество пролинов, 5) гидрофильность, 6) общее количество остатков [123]. Первые два параметра сильно коррелирует с образованием телец включения, последние четыре показывают слабую корреляцию. Эти исследования использовались для развития модели которая предсказывает возможность образования телец включения в зависимости от последовательности аминокислотных остатков [123]. Эта модель была использована для предсказания появления телец включения в случае экспрессии в E.coli рецептора Vß5.3 Т-клеток человека [124].

Таблица 2. Пространственная локализация экспрессированных белков и возможные способы их выделения.

Пространственная локализация

Стратегия выделения

Цитоплазма: Преимущества:

Тельца включения:выделение белка с высоким выходом, белок защищен от протеаз.

Недостатки: Тельца включения: белок нерастворим, трудности перевода в растворимое состояние,

ренатурированный белок может быть не активным.

Протеолиз:

Периплазма Преимущества:

Упрощенная процедура выделения экспрессированного белка.

Протеолиз менее интенсивен. Более правильное образование дисульфидных связей. 1Ч-концевое отщепление. Недостатки: Сигнальный пептид не всегда осуществляет транслокацию через мембрану. Экспорт белка через мембрану перегружен.

Уменьшение правильности сворачивания экспресированного белка. Могут формироваться тельца включения.

Уменьшение температуры после индукции. Холодо-зависимые промоторы. Использование различных штаммов Е. coli. Замещение аминокислотных остатков. Коэкспрессия с молекулярными шаперонами. Экспрессия в составе гибридных белков. Использование штаммов мутантных по тиоредоксин-редуктазе. Сорбитол и бетаин в культуральных средах. Изменение рН.

Сахароза, раффиноза в культуральных средах. Обогащение питательных сред.

Использование штаммов мутантных по протеазам. Мутагенез сайтов расщепления для протеаз. Экспрессия в составе гибридных белков. Изменение условий выращивания. Коэкспрессия с геном pin фага Т4. Коэкспрессия с молекулярными шаперонами.

Коэкспрессия с сигнальной пептидазой I Коэкспрессия с геном prlF. Использование штаммов мутантных по prlF.

Коэкспрессия с генами рг1А4 и secE. Экспрессия гена pspA Коэкспрессия с геном sec.

Экспрессия в составе гибридных белков. Замещение аминокислотных остатков Коэкспрессия с геном дисульфидизомеразой. Коэкспрессия с молекулярными шаперонами. Уменьшение температуры после индукции. Сахароза, раффиноза в культуральных средах.

Пространственная Стратегия выделения

локализация

Секреция в

культуральную среду.

Преимущества:

Наименьший уровень действия

протеаз.

Упрощенная процедура

выделения секретированного

белка.

Улучшенный фолдинг белка.

Ы-концевое отщепление

метионина.

Недостатки: Экспрессия в составе гибридных белков с нормальной

секреция может и секрецией.

отсутствовать Коэкспрессия с геном кП для повышения проницаемости.

Коэкспрессия с геном отрБ.

Использование сигнальной последовательности гена

отрА.

Использование сигнальной последовательности белка А.

Коэкспрессия с геном бактериоцина.

Секретированный белок Использование глицина в питательных средах.

разбавлен, трудности с Концентрирование, аффиная храмотография.

выделением.

Несколько экспериментальных подходов были использованы для уменьшения образования телец включения и улучшения правильности укладки белков. Это включало: наращивание биомассы при пониженных температурах после индукции [125]; подбор различных штаммов [126]; замещение различных аминокислотных остатков [127]; коэкспрессия с шаперонами [128]; использование тиоредоксина в качестве гибридного белка [128]; выращивание и индукция клеток в условиях осмотического шока в присутствии сорбитола и бетаина [129]; добавление неметаболизируемых Сахаров в культуральную среду [130]; изменение рН культуральной среды [131]; использование штаммов мутантных по тиоредоксинредуктазе [132].

Уменьшение потенциала окислительно-восстановительного состояния представляет другую проблему. Цитоплазматические белки E.coli содержат несколько цистеиновых остатков и несколько дисульфидных мостиков. Большинство белков, которые содержат стабильные дисульфидные мостики экспортируются через мембрану в периплазму. Так белки млекопитающих, которые обладают сложной пространственной структурой, которая зависит, в частности, и от правильности дисульфидных связей, в бактериальной цитоплазме могут и не сформировать в E.coli правильную конформацию. Бардвелл и др. предположил, что низкая частота дисульфидных связей в цитоплазматических белках может быть следствием отсутствия системы для формирования дисульфидных связей таких как, DsbA и DsbB белков и/или механизма который предотвращает образование дисульфидных связей в цитоплазме [133]. Мутант E.coli, который позволяет образовывать дисульфидные связи в цитоплазме были выделены [132]. Эта мутация инактивирует ген trxB который кодирует тиоредоксин-редуктазу и способствует уменьшению сульфгидрильного потенциала в цитоплазме. Однако сам по себе тиоредоксин не нужен для образования дисульфидных связей. Точная последовательность событий пока ещё не известна, и авторы придерживаются точки зрения, что в цитоплазме могут содержаться другие тиоредоксин-подобные белки, которые могут контролироваться тиоредоксин-редуктазой. В отсутствие тиоредоксин-редуктазы окисленные формы этих белков частично приводят к образованию дисульфидных связей в цитоплазме [132]. Другие исследователи недавно использовали штамм E.coli с незначащими мутациями в гене trxB и исследовали количество функциональных дисульфид содержащих белков в E.coli [134]. Такие

штаммы мутантные по тиоредоксин-редуктазе могут являться хорошим инструментом для экспрессии сложных белков в E.coli.

Экспрессия белков без лидерной последовательности требует присутствия инициирующего кодона, в большинстве случаев это метионин. Хотя эта аминокислота может и не влиять на синтезированный белок, в некоторых случаях этот добавочный метионин может изменить пространственную структуру белка. Для примера, сохранение инициирующего метионина в белке RANTES члена семейства цитокинин-подобных белков [135] полностью подавляет физиологическую активность этого белка и придает этому белку антагонистические свойства. Подобным образом, добавочный N-концевой метионин вызывает изменение в конформации молекулы гемоглобина. Более того, возможно, что добавочная аминокислота метионин изменяет иммунологические свойства фармацевтических белков, создавая трудности для применения ненативных белков в клиническом использовании.

Бактериальная трансляция инициируется TV-формил-метионином, который в ходе белкового синтеза деформилируется [136], но при этом метионин может и неудалятся. N-концевой метионин отщепляется экзогенными метионин пептидазами. Отщепление зависит также и от положения бокового радикала у второй аминокислоты. Если эти боковые радикалы малы как в случае Gly, Ala, Pro, Ser, Val то отщепление идет более успешно. Если это Asn, Asp, Leu, lie то отщепление идет хуже [137].

Недавно для удаления метионина была использована коэкспрессия с геном метионинаминопептидазы [138]. Альтернативный метод использовался в опытах in vitro отщеплением N-концевого метионина с использованием экзопептидазы: дипептидиламинопептидазы I [139]. Этот фермент удаляет дипептид с

N-конца. Ограничением является присутствии Pro во втором или в третьем положении.

Выделение экспрессированного белка из цитоплазмы имеет также свои трудности. Деградация белка более вероятно происходит в цитоплазме E.coli, чем в других компартментах, так как именно в цитоплазме локализованы большие количества протеаз [140]. Другая оссобенность заключаются в том, что нужный белок надо выделять из огромного количества внутриклеточных белков, синтезированных в цитоплазме. Подсчет количества белков исходя из количества ДНК может состоять 3-4 тысячи, хотя не все синтезируются в данных условиях роста.

1.4.2. Экспрессия в периплазму.

Для выделения экспрессированного белка периплазматическая локализация последнего более предпочтительна. В противоположность цитоплазме, в периплазме представлено всего 4% от общего количества белков E.coli или приблизительно 100 белков [141]. Если экспрессированный белок находится в периплазме, то его выделение представляет меньшие трудности.

Окисленное окружение периплазмы облегчает правильное сворачивание белка и отщепление сигнального пептида в течение перемещения к периплазме, более вероятно приводит к образованию нативного N-конца белка. В периплазме деградация белка также менее интенсивна [140].

В норме транспорт белка через внутриклеточную мембрану в периплазму требует сигнальной последовательности [142]. Для транслокации белка в периплазму используется широкий набор сигнальных пептидов. Это прокариотические сигнальные последовательности E.coli PhoA, OmpA, OmpT, LamB и OmpF, ß-

лактамаза, энтеротоксин ST-II, LT-A, LT-B [143], белок А из Staphylococcus aureus [144], эндоглюконаза из B.subtilis [145], PelB из Erwinia carotovora [146], модифицированный сигнальный пептид PelB [147], муриновая РНКаза [148] и сигнальный пептид человеческого гармона роста [149].

Тем не менее, транспорт в бактериальную периплазму является сложным и не до конца понятным процессом [150] и присутствие сигнального пептида не всегда приводит к транслокации через внутреннюю мембрану. Для примера: успешно проходит экспрессия иммуноглобулина человека в периплазму, в тоже время несмотря на сходную структуру рецептор Т-клеток очень плохо экспрессируется, т.е. несмотря на правильное удаление сигнального пептида, рецептор Т-клеток в периплазме не обнаружен. Правильное сворачивание рецептора Т-клеток в периплазме был получен Вуллом [151], который индуцировал белки теплового шока при понижении температуры совместно с коэкспрессией DsbA. Предположительно, что такой подход индуцировал широкий спектр шаперонов, включая ещё неизвестные, которые находятся в периплазме. Авторы делают вывод, что помимо сигнального пептида, на транслокацию в периплазму влияет и пространственная структура белка.

Для улучшения транслокации белка в периплазму и поддержки компонентов, включенных в эту транслокацию используются следующие стратегии: сверхпродукция сигнальной пептидазы I [152], использовании мутантных штаммов по гену prlE [153], коэкспрессия с генами рг1А4 и secE, коэкспрессия prlF гена, экспрессия pspA [154].

1.4.3.Секрекция в культуральную среду.

Экспрессия рекомбинантного белка в культуральную среду имеет ряд преимуществ. К сожаленью, в норме E.coli секретирует

очень малое количество белков, и управление процессом транспорта чужеродных белков в культуральную среду представляет грандиозную задачу [155].

Методологические подходы для секреции из E.coli можно разделить на две категории, первое - это разработка подходов для истиной секреции, определение тех параметров при которых происходит эта секреция [156]. Второй подход для транслокации через мембрану заключается в использовании сигнальных последовательностей, гибридных белков, проницаемых белков мембраны, других агентов, которые способствуют секреции.

Первый подход имеет преимущества в специфической секреции интересующего белка и следовательно минимум загрязнения неспецифическими белками. Возможно наилучшим примером является ген гемлизина, который используется для конструирования гибридных секретируемых белков [155]. Секреция однако не всегда эффективный процесс.

Второй подход заключается в индукции ограниченной утечки через наружную мембрану секретируемых белков [157]. Примером является использование лидерной последовательности генов pelB [146], ompA [158], белка А [144], коэкспрессия с геном бактериоцина, коэкспрессия с геном kil, продукт которого увеличивает проницаемость мембраны [159]. Некоторые из этих исследований показывают низкую или полное отсутствие ß-лактамазной активности, белка периплазмы. Это является индикатором целостности клетки, т.е. лизиса клеток не происходит при секретировании белков в культуральную среду.

1.5. Гибридные белки.

В последние годы значительный интерес возрос к созданию гибридных белков. Особенно это актуально для белков с малыми молекулярными массами. Такие гибриды защищают белки от протеаз, упрощают процедуру выделения белков.

Ухлен и др. [144] разработали систему экспрессии гибридных белков с использованием белка А из стафилоккоков. Кроме того, что белок А обладает аффиностью к IgG, этот белок действует как стабилизатор для улучшения фолдинга белка. Присутствие белка А служит причиной секреции в культуральную среду.

Альтернативным гибридным партнером является производное белка G из стрептоккоков, обладающее большой афинностью к альбумину. Минимальный домен связывания с альбумином содержит 46 аминокислотных остатков. Комбинация белка А и белка G в гибридных белках обеспечивает дополнительную стадию очистки, предохраняет гибридные белки от протеолитической деградации. Интересной особенностью белка G является способность продлевать период полураспада быстрораспадающих белков. Исследования показали, что период полураспада CD4 рецептора человека увеличивается в гибридных белках [160].

Присоединение тиоредоксина к белку резко увеличивает растворимость гибридных белков в цитоплазме Е. coli и предотвращает образование телец включения [161]. Подобным образом гомолог тиоредоксина DsbA недавно был использован в качестве гибридного белка для прямого транспорта белков в периплазму [162].

Таблица 3. Гибридные партнеры и их выделение.

Гибридный партнер Лиганд, Матрикс Условия выделения

Flag-пептид Anti-Flag моноклональные Са2+ в низкой концетрации

антитела ЕБТА, глицин.

His6 Ni2+ NTA-агароза Имидазол.

Глютатион-8-трансфераза. Глютатион-Сефароза Уменьшение глютатиона.

Белок А из стафилоккоков. Иммуноглобулин G- Уменьшение рН

сефароза.

Белок G из стрептоккоков. Альбумин Уменьшение рН

Кальмодулин Органические лиганды, Уменьшение концентрации

пептидные лиганды DEAE- Са2+

сефадекс

Тиоредоксин Тиосвязанная смола. Ион-обменная

храмотаграфия.

В-галактозидаза. р-аминофенил-P-D- Соли борной кислоты.

тиогалактозидаза

Убихитин

Хлорамфеникол Хлорамфеникол-Сефароза Хлорамфеникол

ацетилтрансфераза.

S-пептид (РНКаза, остатки S-белок (РНКаза, остатки Денатурирующие или не

1-20) 21-124) денатурирующие условия.

Авидин Биотин Денатурирующие условия (

мочевина, нагревание)

Стрептавидин. Биотин. Денатурирующие условия.

Strep-tag. Стрептавидин. 2-иминобиотин,

диаминобиотин.

с-тус Анти-myc антитела.

Дигидрофолат редуктаза. Метотрексат-агароза. Буфер содержащие фолат.

Полиаргинин. S-Сефароза. №С1

Полицистеин. Тиопропил-Сефароза Дитиотрейтол.

Полифенил аланин Фенил-Супероза Этилен гликоль.

Lac репрессор Lac оператор Аналог лактозы, ДНКаза,

эндонуклеазы рестрикции.

Мальтоза-связывающий Амилоза-смола. Мальтоза.

белок

Галактозо-связывающий Галактозо-Сефароза Галактоза.

белок

Цикломальтодекстрин а-циклодекстрин-агароза. а-циклодекстрин.

глюкотрансфераза

Целлюлозо-связывающий Целлюлоза. Вода.

домен

Гемолизин A E.coli.

A,cII белок

Зеленый флюресцирующий

белок.

Присоединение гена убихитина к белку увеличивает выход белка от недектируемого до 20 % от тотального клеточного белка. Убихитин отсутствует в метаболичческом пути в Е.соИ. Для удаления

убихитина из гибридного белка Вакер и др. [163] коэкспрессировали убихитин и специфическую протеазу Ubp2.

1.6. Молекулярные шапероны.

Правильное сворачивание полипептидных цепей некоторых белков в клетках эукариот обеспечивается специфическими белками, называемых шаперонами, которые обеспечивают правильное формирование третичной структуры полипептидных цепей других белков, но не входят в состав конечной белковой структуры [164, 165]. Шапероны оказывают влияние лишь на конформацию полипептидных цепей и не действуют на ковалентные связи белковых молекул. К этому классу полипептидов относятся цитозольные белки теплового шока hsp70 и hsp60, а также гомологичные им белки, например белок, связывающийся с тяжелой цепью иммуноглобулинов. У E.coli соответствующие функции выполняют белки SecB, тригерный фактор, а также GroEL и GroES, обеспечивающие экспорт полипептидов из цитоплазмы и участвующие в морфогенезе бактериофагов [166]. Из других белков, участвующих в сворачивании полипептидных цепей, следует назвать так называемые фолдазы и изомеразы. Наиболее хорошо изученными ферментами этой группы является тиоредоксин и глутароредоксин, которые наряду с глутатион-зависимым превращением рибонуклеотидов в дезоксирибонуклеотиды способны восстановить дисульфидные связи в белках, способствуя стабилизации у них правильной третичной структуры. Те же функции выполняют и дисульфидизомераза белков, осуществляя образование дисульфидных связей в секретируемых белках после их переноса через мембраны эукариотических клеток.

В норме правильное образование третичной структуры протекает в направлении термодинамической стабильности N и С концов белка. Нестабильные белки (короткоживущие; лабильные) возможно, неправильно уложены в пространственную структуру даже в присутствии шаперонов. Примером может служить экспрессия отдельных субъединиц мультиферментного комплекса. В естественных условиях между субъединицами существуют дисульфидные связи которые отсутствуют при экспрессии отдельных субъединиц. Наличие пострансляционных модификаций, таких как гликозилирование, может сделать невозможным достижение термодинамической стабильности экспресированного белка в E.coli.

В настоящий момент становится ясным, что различные типы шаперонов в E.coli действуют совместно [165]. Более того, сверхпродукция единственного шаперона может быть и не эффективна. Например, сверхпродукция только DnaK приводит к нестабильности плазмид, которая устраняется коэкспрессией DnaJ [167]. Подобным образом, коэкспрессия трех шаперонов в E.coli увеличивает растворимость некоторых киназ [168]. В отдельных случаях требуется коэкспрессия шаперона и целевого белка, клонированных из одного и того же объекта [169].

На действие шаперонов также влияет и температура выращивания E.coli. Например, коэкспрессия GroES-GroEL увеличивает продукцию ß-галактозидазы при 30°С, но не при 37°С или 42°С, в то время как коэкспрессия DnaK и DnaJ эффективна при любой тестированной температуре [170].

В работах [171, 172] показано, что коэкспресия дисульфидизомераз, клонированных из человека и кролика вместе с целевым белком, усиливает выход корректно пространственно-сложенных белков в периплазме E.coli. Образование дисульфидных

связей в периплазме усиливается группой белков которые поддерживают окислительный потенциал клетки. Предположительно, что БбЬА, растворимый белок периплазмы, напрямую катализирует образование дисульфидных связей в белках, БбЬВ - внутренний мембранный белок, включен в восстановление БзЬА. Эукариотические дисульфидизомеразы способны комплементировать некоторые мутации гена БбЬА. К тому же способность дисульфидизомераз увеличивать выход в растворимой форме целевого белка возрастает в присутствии экзогенно добавленного глутатиона [171].

Недавно методом сайт-направленного мутагенеза был получен мутант БбЪА, в котором два активных цистеина заменены на серины [173]. Эти мутации резко уменьшают окси-редуктазную активность, но не влияют на растворимость и локализацию целевого белка. БзЬАту1 в виде гибридного белка использовался для получения в растворимой форме целого ряда эукариотических белков, таких как трансформирующий ростовой фактор-{3-2, инсулин-подобный ростовой фактор-1, зеленый флюресцентный белок.

В настоящее время появились коммерчески реализуемые векторы фирмы "1пукп^еп", содержащие ген тиоредоксина в качестве гибридного партнера. Удобство этой системы проявляется также в наличии 6 гистидинов, что позволяет использовать металл-хелатную храмотографию.

1.7. Синонимические замены аминокислотных остатков.

Среди факторов, оказывающих влияние на эффективность трансляции, одним из важных факторов является частота встречаемости кодонов при кодировании белков в структурных частях разных генов. В настоящее время установлено, что использование

синонимических кодонов (кодирующих одну и ту же аминокислоту) вырожденного генетического кода неслучайно и отражает количественное содержание отдельных изоакцепторных тРНК в клетках организма. С другой стороны, частота использования кодонов в разных генах одного и того же организма является фактором, регулирующим уровень экспрессии этих генов в процессе трансляции. Чем реже тот или иной кодон используется для кодирования аминокислоты в данном организме, тем с меньшей скоростью он будет транслироваться рибосомами в следствие низкой внутриклеточной концентрации тРНК, узнающей такой кодон.

В таблице 4 представлены кодоны, которые встречаются с наиболее низкой частотой в E.coli.

Таблица 4. Кодоны E.coli с низкой частотой встречаемости. Данные представлены Макридесом [174].

Кодоны Аминокислоты

AGA, AGG, CGA, CGG Arg

UGU, UGC Cys

GGA, GGG Gly

AUA Ile

CUA, CUC Leu

CCC, CCU, CCA Pro

UCA, AGU, UCG, UCC Ser

АСА Thr

В бактериальной экспрессии некоторых генов лимитирующим фактором является минорные количества тРНК для аргинина

АРР/АР А

Arg , потому что кодоны AGA и AGG не часто встречаются в

E.coli. Коэкспрессия гена argU, который кодирует тРНК для аргинина с кодонами AGG/AGA, приводит к высоко-эффективной экспрессии целевых генов [175]. Голдман и др. [176] сообщили, что инициация трансляции мРНК была намного эффективнее в случаях Arg и Leu,

Г» {

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Алексеев, Андрей Михайлович

ВЫВОДЫ

1. Проведена оптимизация системы экспрессии гена рековерина дикого типа в Е.соИ и получен рекомбинантный миристоилированный рековерин, идентичный природному белку.

2. Показано, что Ы-концевое миристоилирование существенно усиливает ингибирующую активность рековерина в отношении родопсинкиназы.

3. Методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза получены следующие мутантные формы рековерина с заменами в его Са2+-связывающих доменах:

-ЕР2 с заменой Е85(^) во втором ЕР-Ьапё домене;

-ЕРЗ с заменой Е 121(3 в третьем ЕР-Ьапс! домене;

-ЕР2,3 с заменами Е85<3 и Е121С) одновременно во втором и третьем ЕР-Иапё доменах одновременно;

ЕР4 с заменами С16(Ю, К161Е, К162Ы, Б165С, К166<3 в четвертом ЕР-Ь.апс1 домене.

4. Методом кальциевого блота показано, что Са2+-связывающая способность мутантных форм рековерина, в сравнении с таковой рековерина дикого типа находится в ряду: +ЕР4 > тЫС > -ЕР2 > -ЕРЗ >-ЕР2,3.

5. Мутанты -ЕР2, -ЕРЗ и -ЕР2,3 с "испорченными" Са2+-связывающими доменами не способны связываться с фоторецепторными мембранами Са2+-зависимым образом и ингибировать фосфорилирование родопсина, катализируемое родопсинкиназой.

6. Мутант +ЕР4, содержащий три Са2+-связывающие домена, способен, подобно рековерину дикого типа, взаимодействовать с фоторецепторными мембранами и ингибировать фосфорилирование родопсина, при этом эффективность +ЕБ4 даже выше, чем у рековерина дикого типа.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Алексеев, Андрей Михайлович, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Hawley, D.K., McClure W.R,. (1983). Compilation and analysis of Escherichia coli promoter DNA sequences. Nucleic Acids Res. 25, 11(8):2237-2255.

2. Galas, D.J., Eggert, M., Waterman M.S. (1985). Rigorous pattern-recognition methods for DNA sequences. Analysis of promoter sequences from Escherichia coli. JMol Biol. 186: 117-128.

3. Harley, C.B., Reynolds R. P. (1987). Analysis of E. coli promoter sequences. Nucleic Acids Res.l5:2343-2361

4. Rosenberg M., Court D. (1979). Regulatory sequences involved in the promotion and termination of RNA transcription. Annu Rev Genet; 13:319-353

5. Belasco, J.G. (1993) mRNA degradadion in procariotic cells: an overview, p.3-12. In J.G. Belasco and G. Brawerman (ed.). Control of messendger RNA stability. Academic Press. Inc., San Diego.Calif.

6. Belasco J.G., Higgins C.,F. (1988). Mechanisms of mRNA decay in bacteria: a perspective. Gene 72:15-23

7. Ehretsmann, C.P., Carpousis, A.J., Krisch, H.M. (1992). mRNA degradation in procaryotes. FASEB J. 6:3186-3192

8. Berkow, R. (1992). The Merck manual of diagnosis and therapy. 16th ed., p.24-30. Merck Researh Laboratories. Pahway, N.J.

9. Morino, Т., Morita, M., Seya, K., Sukenaga, Y., Kato, K., and Nakamura T. (1988). Conctruction of a ranway vector and its use for a high-level expression of a cloned human superoxide dismutase gene. Appl. Microbiol. Biotechnol. 28:170-175.

10. Nordstrom, K., Uhlin, B.E. (1992) Runaway-replication plasmids as tools to produce large quantities of proteins from cloned genes in bacteria. Biotechnology 10:661-666.

11. Vasquez, J.R., Evnin, L.B., Higaki, J.N., Craik, C.S. (1989). An expression system for trypsin. J Cell Biochem. 39:265-276.

12. Minas, W., Bailey, J.E. (1995). Co-overexpression of prlF increases cell viability and enzyme yields in recombinant Escherichia coli expressing Bacillus stearothermophilus alpha-amylase. Biotechnol Prog. 11(4):403-411.

13. Backman, K., Ptashne, M. (1978). Maximizing gene expression on a plasmid using recombination in vitro. Cell 13:65-71.

14. Gronenborn, B. (1976). Overproduction of phage lambda repressor under control of the lac promotor of Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 148:243-250.

15. Roberts, T.M., Kacich, R., Ptashne, M. (1979). A general method for maximizing the expression of a cloned gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(2):760-764.

16. Yanisch-Perron, C., Vieira, J., Messing. J. (1985). Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene. 33:103-119.

17. Hasan, N., Szybalski, W. (1995). Construction of laclts and laclqts expression plasmids and evaluation of the thermosensitive lac repressor. Gene. 163:35-40.

18. Yabuta, M., Onai-Miura, S., Ohsuye, K. (1995). Thermo-inducible expression of a recombinant fusion protein by Escherichia coli lac repressor mutants. J. Biotechnol. 39(l):67-73.

19. Masuda, K., Kamimura, Т., Kanesaki, M., Ishii, K., Imaizumi, A., Sugiyama, Т., Suzuki, Y., Ohtsuka, E. (1996). Efficient production of the C-terminal domain of secretory leukoprotease inhibitor as a thrombin-cleavable fusion protein in Escherichia coli. Protein Eng. 9:101-106.

20. Russell, D.R., Miller, P.D., Bennett, G.N. (1985). In vitro characterization of hybrid promoters and altered tryptophan operon promoters. Biochemistry. 24:1410-1417.

21. Tacon, W., Carey, N., Emtage, S. (1980). The construction and characterisation of plasmid vectors suitable for the expression of all DNA phases under the control of the E. coli tryptophan promoter. Mol. Gen. Genet. 177:427-438.

22. Yansura, D.G., Henner, D.J. (1990). Use of Escherichia coli trp promoter for direct expression of proteins. Methods Enzymol. 185:54-60.

23. Duffaud, G.D., March, P.E., Inouye, M. (1987). Expression and secretion of foreign proteins in Escherichia coli. Methods Enzymol. 153:492-507.

24. Ghrayeb, J., Kimura, H., Takahara, M., Hsiung, H., Masui, Y., Inouye, M. (1984). Secretion cloning vectors in Escherichia coli. EMBO J. 3:2437-2442.

25. Inouye, S., Inouye, M. (1985). Up-promoter mutations in the lpp gene of Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 13:3101-3110.

26. Chang, C.N., Kuang, W.J., Chen, E.Y. (1986). Nucleotide sequence of the alkaline phosphatase gene of Escherichia coli. Gene. 44:121-125.

27. Inouye, H., Michaelis, S., Wright, A., Beckwith, J. (1981). Cloning and restriction mapping of the alkaline phosphatase structural gene (phoA) of Escherichia coli and generation of deletion mutants in vitro. J. Bacteriol. 146:668-675.

28. Kadokura, H., Watanabe, K., Tsuneizumi, K., Yoda, K., Yamasaki, M. (1995). Physiological and biochemical analysis of the effects of alkaline phosphatase overproduction in Escherichia coli. J. Bacteriol. 177:3596-3600.

29. Miyake, T., Oka, T., Nishizawa, T., Misoka, F., Fuwa, T., Yoda, K., Yamasaki, M., Tamura, G. (1985). Secretion of human interferon-alpha induced by using secretion vectors containing a promoter and signal sequence of alkaline phosphatase gene of Escherichia coli. J. Biochem. (Tokyo). 97:1429-1436.

30. Easton, A.M., Gierse, J.K., Seetharam, R., Klein, B.K., Kotts, C.E. (1991). Production of bovine insulin-like growth factor 2 (bIGF2) in Escherichia coli. Gene. 101:291-295.

31. Taylor, A., Brown, D.P., Kadam, S., Maus, M., Kohlbrenner, W.E., Weigl, D., Turon, M.C., Katz, L. (1992). High-level expression and purification of mature HIV-1 protease in Escherichia coli under control of the araBAD promoter. Appl. Microbiol. Biotechnol. 37:205-210

32. Herbst, B., Kneip. S., Bremer, E. (1994). pOSEX: vectors for osmotically controlled and finely tuned gene expression in Escherichia coli. Gene. 151:137-142.

33. Tunner, J.R., Robertson, C.R., Schippa, S., and Matin A. (1992). Use of glucose starvation to limit growth and induce protein production in Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 40:271-279.

34. de la Torre, J.C., Ortin, J., Domingo, E., Delamarter, J., Allet, B., Davies, J., Bertrand, K.P., Wray, L.V., Jr., Reznikoff, W.S. 1984. Plasmid vectors based on TnlO DNA: gene expression regulated by tetracycline. Plasmid 12:103-110.

35. Skerra, A. (1994). Use of the tetracycline promoter for the tightly regulated production of a murine antibody fragment in Escherichia coli. Gene 151:131-135.

36. Chou, C.-H., Aristidou A.A., Meng S.-Y., Bennett, G.N., and San, K.-Y. (1995). Characterization of a pH-inducible promoter system for high-level expression of recombinant proteins in Escherchia coli. Biotechnol. Bioeng. 47:186-192.

37. San, K.Y., Bennett, G.N., Chou, C.H., Aristidou, A.A. (1994). An optimization study of a pH-inducible promoter system for high-level recombinant protein production in Escherichia coli. Ann. N Y Acad. Sei. 721:268-276.

38. Tolentino, G.J., Meng S.-Y., Bennett, G.N., San, K.Y. (1992) A pH-regulated promoter for the expression of recombinant proteins in Eschrechichia coli. Biotechnol. Lett. 14:157-162.

39. Lee, J., Cho, M., Hong, E.-K., Kim, K.-S., Lee, J. (1996). Caracterization of the nar promoter to use as an inducible promoter. Biotechnol. Lett. 18:129-134.

40. Amann, E., Brosius, J., Ptashne, M. (1983). Vectors bearing a hybrid trp-lac promoter useful for regulated expression of cloned genes in Escherichia coli. Gene 25:167-178.

41. de Boer, H.A., Comstock, L.J., Vasser, M. (1983). The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp and lac promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2125.

42. Brosius, J., Erfle, M., Storella, J. (1985). Spacing of the -10 and -35 regions in the tac promoter. Effect on its in vivo activity. J. Biol. Chem. 260:3539-3541.

43. Adari, H., Andrews, B., Ford, P.J., Hannig, G., Brosius, J., Makrides, S.C. (1995). Expression of the human T-cell receptor V beta 5.3 in Escherichia coli by thermal induction of the trc promoter: nucleotide sequence of the laclts gene. DNA Cell Biol. 14:945-950.

44. Andrews, B., Adari, H., Hannig, G., Lahue, E., Gosselin, M., Martin, S., Ahmed, A., Ford, P.J., Hayman, E,G., Makrides, S.C. (1996). A tightly regulated high level expression vector that utilizes a thermosensitive lac repressor: production of the human T cell receptor V beta 5.3 in Escherichia coli. Gene 182:101-109.

45. Bernard, H.U., Remaut, E., Hershfield, M.V., Das, H.K., Helinski, D.R., Yanofsky, C., Franklin, N. (1979). Construction of plasmid cloning vehicles that promote gene expression from the bacteriophage lambda pL promoter. Gene 5:59-76.

46. Caulcott, C.A., Dunn, A., Robertson, H.A„ Cooper, N.S., Brown, M.E., Rhodes, P.M. (1987). Investigation of the effect of growth environment on the stability of low-copy-number plasmids in Escherichia coli. J. Gen. Microbiol. 133:1881-1889.

47. Derom, C., Gheysen, D., Fiers, W. (1982). High-level synthesis in Escherichia coli of the SV40 small-t antigen under control of the bacteriophage lambda pL promoter. Gene 17:45-54.

48. Hedgpeth, J., Ballivet, M., Eisen, H. (1978). Lambda phage promoter used to enhance expression of a plasmid-cloned gene. Mol. Gen. Genet. 163:197-203

49. Giladi, H., Goldenberg, D., Koby, S., Oppenheim, A.B. (1995). Enhanced activity of the bacteriophage lambda PL promoter at low temperature. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2184-2188.

50. Giladi, H., Goldenberg, D., Koby, S., Oppenheim, A.B. (1995). Enhanced activity of the bacteriophage lambda PL promoter at low temperature. FEMS Microbiol. Rev. 17:135-140.

51 . Goldstein, J., Pollitt, N.S., Inouye, M. (1990). Major cold shock protein of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:283-287.

52. Ostermeier, M., De Sutter, K., Georgiou, G. (1996). Eukaryotic protein disulfide isomerase complements Escherichia coli dsbA mutants and increases the yield of a heterologous secreted protein with disulfide bonds. J. Biol. Chem. 271:1061610622.

53. Elvin, C.M., Thompson, P.R., Argall, M.E., Hendry, P., Stamford, N.P., Lilley, P.E., Dixon, N.E. (1990). Modified bacteriophage lambda promoter vectors for overproduction of proteins in Escherichia coli. Gene 87:123-126.

54. Schauder, B., Blocker, H., Frank, R., McCarthy, J.E. (1987). Inducible expression vectors incorporating the Escherichia coli atpE translational initiation region. Gene 52:279-283.

55. Studier, F.W., Moffatt, B.A. (1986). Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. 189:113-130.

56. Tabor, S., Richardson, C.C. (1985). A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:1074-1078.

57. Dubendorff, J.W., Studier, F.W. (1991). Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor. J. Mol. Biol. 219:45-59.

58. Giordano, T.J., Deuschle, U., Bujard, H., McAllister, W.T. (1989). Regulation of coliphage T3 and T7 RNA polymerases by the lac repressor-operator system. Gene 84:209-19.

59. He, B., McAllister, W.T., Durbin, R.K. (1995). Phage RNA polymerase vectors that allow efficient gene expression in both prokaryotic and eukaryotic cells. Gene 164:75-9.

60. Yamada, M., Kubo, M., Miyake, T., Sakaguchi, R., Higo, Y., Imanaka, T. (1991) Promoter sequence analysis in Bacillus and Escherichia: construction of strong promoters in E. coli. Gene 99:109-14.

61.61 Bujard, H., Gentz, R., Lanzer, M., Stueber, D., Mueller, M., Ibrahimi, I., Haeuptle, M.T., Dobberstein, B. (1987). A T5 promoter-based transcriptiontranslation system for the analysis of proteins in vitro and in vivo. Methods Enzymol. 155:416-33.

62. Mukhija, R., Rupa, P., Pillai, D., Garg, L.C. (1995). High-level production and one-step purification of biologically active human growth hormone in Escherichia coli. Gene 165:303-6.

63. Duvoisin, R.M., Belin, D., Krisch, H.M. (1986) A plasmid expression vector that permits stabilization of both mRNAs and proteins encoded by the cloned genes. Gene 45:193-201.

64. Gorski, K., Roch, J.M., Prentki, P., Krisch, H.M. (1985). The stability of bacteriophage T4 gene 32 mRNA: a 5' leader sequence that can stabilize mRNA transcripts. Cell 43:461-469.

65. Williams, K.L., Emslie, K.R., Slade, M.B. (1995). Recombinant glycoprotein production in the slime mould Dictyostelium discoideum. Curr Opin Biotechnol. 6(5):538-42.

66. Suter-Crazzolara, C., Unsicker, K. (1995). Improved expression of toxic proteins in E. coli. Biotechniques 19(2):202-204.

67. Lanzer, M., Bujard, H. (1988). Promoters largely determine the efficiency of repressor action. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:8973-8977.

68. Ward, G.A., Stover, C.K., Moss, B., Fuerst, T.R. (1995) Stringent chemical and thermal regulation of recombinant gene expression by vaccinia virus vectors in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92(15):6773-6777.

69. Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., Bujard, H. (1986) Promoters of Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. EMBO J. 5(ll):2987-2994.

70. Gaal, T., Barkei, J., Dickson, R.R., deBoer, H.A., deHaseth, P.L., Alavi, H., Gourse, R.L. Saturation mutagenesis of an Escherichia coli rRNA promoter and initial characterization of promoter variants. (1989) J. Bacteriol. 171(9):4852-4861.

71. Hsu, L.M., Giannini, J.K., Leung, T.W., Crosthwaite, J.C. (1991) Upstream sequence activation of Escherichia coli argT promoter in vivo and in vitro. Biochemistry 30(3):813-822.

72. Josaitis, C.A., Gaal, T., Ross, W., Gourse, R.L. (1990) Sequences upstream of the-35 hexamer of rrnB PI affect promoter strength and upstream activation. Biochim. Biophys. Acta. 1050(l-3):307-311.

73. Stueber, D., Bujard, H. (1982) Transcription from efficient promoters can interfere with plasmid replication and diminish expression of plasmid specified genes. EMBO J. 1(11):1399-1404.

74. Hayashi, M.N., Hayashi, M. (1985) Cloned DNA sequences that determine mRNA stability of bacteriophage phi XI74 in vivo are functional. Nucleic. Acids Res. 13(16):5937-5948.

75. Brosius, J., Ullrich, A., Raker, M.A., Gray, A., Dull, T.J., Gutell, R.R., Noller, H.F. (1981) Construction and fine mapping of recombinant plasmids containing the rrnB ribosomal RNA operon of E. coli. Plasmid 6(1):112-118.

76. Condon, C., Squires, C., Squires, C.L. (1995) Control of rRNA transcription in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 59(4):623-645.

77. Richardson, J.P., Greenblatt, J. (1996) Control of RNA chain elongation and termination, p. 822-848. In F.C. Neidhardt, R. Curtiss III, J.L. Ingraham, E.C.C. Lin, K.B. Low, B. Magasanik, W.S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, and H.E. Umbarger (ed.), Escherichia coli and Salmonella-, cellular and molecular biology, vol. 1. ASM Press, Washington, D.C.

78. Mertens, N., Remaut, E., Fiers, W. (1995) Tight transcriptional control mechanism ensures stable high-level expression from T7 promoter-based expression plasmids. Biotechnologyl 3(2): 175-179.

79. Brosius, J. (1992) Compilation of superlinker vectors. Methods Enzymol. 216:469483.

80. Suter-Crazzolara, C., Unsicker, K. (1995) Improved expression of toxic proteins in E. coli. Biotechniques 19(2):202-204.

81. Muller-Hill, B., Crapo, L., Gilbert, W. (1968) Mutants that mke more lac repressor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 59(4): 1259-1264.

82. Brown, W.C., Campbell, J.L. (1993) A new cloning vector and expression strategy for genes encoding proteins toxic to Escherichia coli. Gene 127(1):99-103.

83. Warne, S.R., Thomas, C.M., Nugent, M.E., Tacon, W.C. (1986) Use of a modified Escherichia coli trpR gene to obtain tight regulation of high-copy-number expression vectors. Gene 46(1): 103-112.

84. O'Connor, C.D., Timmis, K.N. (1987) Highly repressible expression system for cloning genes that specify potentially toxic proteins. J. Bacteriol. 169(10):4457-4462.

85. Backman, K., O'Connor, M.J., Maruya, A., Erfle, M. (1984) Use of synchronous site-specific recombination in vivo to regulate gene expression. Bio/Technology 2: 1045-1049.

86. Balakrishnan, R., Bolten, B., Backman, K.C. (1994) A gene cassette for adapting Escherichia coli strains as hosts for att-Int-mediated rearrangement and pL expression vectors. Gene 138(1-2): 101-104.

87. Harley, C.B., Reynolds, R.P. (1987) Analysis of E. coli promoter sequences. Nucleic Acids Res. 15(5):2343-2361.

88. de Smit, M.H., van Duin, J. (1994) Control of translation by mRNA secondary structure in Escherichia coli. A quantitative analysis of literature data. J. Mol. Biol. 244(2):144-150.

89. Gren, E.J. (1984) Recognition of messenger RNA during translational initiation in Escherichia coli. Biochimie 66(1): 1-29.

90. Butler, J.S., Springer, M., Grunberg-Manago, M. (1987) AUU-to-AUG mutation in the initiator codon of the translation initiation factor IF3 abolishes translational autocontrol of its own gene (infC) in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(12):4022-4005.

91. Shine, J., Dalgarno, L. (1975) Determinant of cistron specificity in bacterial ribosomes. Nature 254(5495):34-38.

92. Ringquist, S., Shinedling, S., Barrick, D., Green, L., Binkley, J., Stormo, G.D., Gold, L. (1992) Translation initiation in Escherichia coli: sequences within the ribosome-binding site. Mol. Microbiol. 6(9):1219-1229.

93. Hartz, D., McPheeters, D.S., Gold, L. (1991) Influence of mRNA determinants on translation initiation in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 218(l):83-97.

94. Ramesh, V., De, A., Nagaraja, V. (1994) Engineering hyperexpression of bacteriophage Mu C protein by removal of secondary structure at the translation initiation region. Protein Eng. 7(8):1053-1057.

95. Chen, H., Pomeroy-Cloney, L., Bjerknes, M., Tam, J., Jay, E. (1994) The influence of adenine-rich motifs in the 3' portion of the ribosome binding site on human IFN-gamma gene expression in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 240(l):20-27.

96. Coleman, J., Inouye, M., Nakamura, K. (1985) Mutations upstream of the ribosome-binding site affect translational efficiency. J. Mol. Biol. 181(1):139-143.

97. Lee, N., Zhang, S.Q., Cozzitorto, J., Yang, J.S., Testa, D. (1987) Modification of mRNA secondary structure and alteration of the expression of human interferon alpha 1 in Escherichia coli. Gene 58(l):77-86.

98. Schumperli, D., McKenney, K., Sobieski, D.A., Rosenberg, M. (1982) Translational coupling at an intercistronic boundary of the Escherichia coli galactose operon. Cell 30:856-871.

99. Birikh, J.-M., Lebedenko, E.N., Boni, I,V., Berlin, Y.A. (1995) A high-level prokaryotic expression system: synthesis of human interleukin la and receptor antagonist. Gene 164:341-345.

100. Makoff, A.J., Smallwood, A.E. (1990)The use of two-cistron constructions in improving the expression of a heterologous gene in E. coli. Nucleic Acid Res. 18:1711-1718.

101. 101.Boni, I.V., Isaeva, D.M., Musychenko, M.L., Tzareva, N.V. (1991) Ribosome-messenger recognition: mRNA target sites ror ribosomal protein SI. Nucleic. Acids Res. 19:155-162.

102. Firpo, M.A., Connelly, M.B., Goss, D.J., Dahlberg, A.E. (1996) Mutations at two invariant nucleotides in the 3'-minor domain of Escherichia coli 16 S rRNA affecting translational initiation and initiation factor 3 function. J. Biol. Chem. 271(9):4693-4698.

103. Gualerzi, C.O., Pon, C.L. (1990) Initiation of mRNA translation in prokaryotes. Biochemistry 29(25):5881-5889.

104. Olins, P.O., Lee, S.C. (1993) Recent advances in heterologous gene expression in Escherichia coli. Curr. Opin. Biotechnol. 4(5):520-525.

105. Olins, P.O., Devine, C.S., Rangwala, S.H., Kavka, K.S. (1988) The T7 phage gene 10 leader RNA, a ribosome-binding site that dramatically enhances the expression of foreign genes in Escherichia coli. Gene 73(l):227-235.

106. Olins, P.O., Rangwala, S.H. (1989) A novel sequence element derived from bacteriophage T7 mRNA acts as an enhancer of translation of the lacZ gene in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 264(29):16973-16976.

107. McCarthy, J.E., Schairer, H.U., Sebald, W. (1985) Translational initiation frequency of atp genes from Escherichia coli: identification of an intercistronic sequence that enhances translation. EMBO J. 4(2):519-526.

108. Zhang, J.R., Deutscher, M.P. (1988) Escherichia coli RNase D: sequencing of the rnd structural gene and purification of the overexpressed protein. Nucleic. Acids Res. 16(14A):6265-6278.

109. Tzareva, N.V., Makhno, V.I., Boni, I.V. (1994) Ribosome-messenger recognition in the absence of the Shine-Dalgarno interactions. FEBS Lett 337(2):189-194.

110. Sprengart, M.L., Fuchs, E., Porter, A.G. (1996) The downstream box: an efficient and independent translation initiation signal in Escherichia coli. EMBO J. 15(3):665-674.

111. Laird-Offringa, I.A., Belasco, J.G. (1996). In vitro genetic analysis of RNA-binding proteins using phage display libraries. Methods Enzymol. 267:149-168.

112. Chen, C.Y., Belasco, J.G. (1990) Degradation of pufLMX mRNA in Rhodobacter capsulatus is initiated by nonrandom endonucleolytic cleavage. J. Bacteriol. 172(8):4578-4586.

113. Bechhfer, D. (1993) 5' m RNA stabilizers. P. 31-52. In J.G. Belasco and G. Brawerman (ed.), Control of messenger RNA stability. Academic Press, Inc., San Diego, Calif.

114. Duvoisin, R.M., Belin, D., Krisch, H.M. (1986) A plasmid expression vector that permits stabilization of both mRNAs and proteins encoded by the cloned genes. Gene 45(2): 193-201.

115. Emory, S.A., Bouvet, P., Belasco, J.G. (1992) A 5'-terminal stem-loop structure can stabilize mRNA in Escherichia coli. Genes Dev. 6(1):135-148.

116. Higgins, S.F., Causton, H.C., Dance, G.S.C., Mudd, E.A. (1993) The role of the 3' end in mRNA stability and decay, p. 13-30. In J.G. Belasco and G. Brawerman (ed.), Control of messenger RNA stability. Academic Press, Inc., San Diego, Calif.

117. Wong, H.C., Chang, S. (1986) Identification of a positive retroregulator that stabilizes mRNAs in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83(10):3233-3237.

118. Donovan, W.P., Kushner, S.R. (1983) Amplification of ribonuclease II (rnb) activity in Escherichia coli K-12. Nucleic. Acids Res. J. 11(2):265-275.

119. Tate, W.P., Brown, C.M. (1992) Translational termination: "stop" for protein synthesis or "pause" for regulation of gene expression. Biochemistry 31(9):2443-2450.

120. Grentzmann, G., Brechemier-Baey, D., Heurgue, V., Mora, L., Buckingham, R.H. (1994) Localization and characterization of the gene encoding release factor RF3 in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(13):5848-5852.

121. Sharp, P.M., Bulmer, M. (1988) Selective differences among translation termination codons. Gene 63(1):141-145.

122. Poole, E.S., Brown, C.M., Tate, W.P. (1995) The identity of the base following the stop co don determines the efficiency of in vivo translational termination in Escherichia coli. EMBO J. 14(1):151-158.

123. Wilkinson, D.L., Harrison, R.G. (1991) Predicting the soubility of recombinant proteins in Escherichia coli. Biotechnology (NY) 9(5):443-448.

124. Andrews, B., Adari, H., Hannig, G., Lahue, E., Gosselin, M., Martin, S., Ahmed, A., Ford, P.J., Hayman, E.G., Makrides, S.C. (1996) A tightly regulated high level expression vector that utilizes a thermosensitive lac repressor: production of the human T cell receptor V beta 5.3 in Escherichia coli. Gene 182( 1 -2): 101 -109.

125. Schein, C.H. (1993) Solubility and secretability. Curr. Opin. Biotechnol. 4(4) :456-461.

126. Kenealy, W.R., Gray, J.E. Ivanoff, L.A., Tribe, D.E., Reed, D.L., Korant, B.D., Petteway, S.R., Jr. (1987) Solubility of proteins overexpressed in Escherichia coli. Dev. Ind. Microbiol. 28:45-52.

127. Dale, G.E., Broger, C., Langen, H., D'Arcy, A., Stuber, D. (1994) Improving protein solubility through rationally designed amino acid replacements: solubilization of the trimethoprim-resistant type SI dihydrofolate reductase. Protein Eng. 7(7):933-939.

128. Yasukawa, T., Kanei-Ishii, C., Maekawa, T., Fujimoto, J., Yamamoto, T., Ishii, S. (1995) Increase of solubility of foreign proteins in Escherichia coli by coproduction of the bacterial thioredoxin. J. Biol. Chem. 270(43):25328-25331.

129. Blackwell, J.R., Horgan, R. (1991) A novel strategy for production of a highly expressed recombinant protein in an active form. FEBS Lett. 295(1-3): 10-12.

130. Bowden, G.A., Georgiou, G. (1988) The effect of sugars on ß-lactamase aggregation in Escherichia coli. Biotechnol. Prog. 4:97-101.

131. Sugiomoto, S., Yokoo, Y., Hatakeyama, N., Yotsuji, A., Teshiba, S., Hagino, H. (1991) Higher culture pH is preferable for inclusion body formationof recombinant salmon growth hormone in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 13:385-388.

132. Derman, A.I., Prinz, W.A., Belin, D., Beckwith, J. (1993) Mutations that allow disulfide bond formation in the cytoplasm of Escherichia coli. Science 262(5140): 1744-1747.

133. Bardwell, J.C. (1994) Building bridges: disulphide bond formation in the cell. Mol. Microbiol. 14(2): 199-205.

134. Proba, K., Ge, L., Pluckthun, A. (1995) Functional antibody single-chain fragments from the cytoplasm of Escherichia coli: influence of thioredoxin reductase (TrxB). Gene 159(2):203-207.

135. Proudfoot, A.E., Power, C.A., Hoogewerf, A.J., Montjovent, M.O., Borlat, F., Offord, R.E., Wells, T.N. (1996) Extension of recombinant human RANTES by the retention of the initiating methionine produces a potent antagonist. J. Biol. Chem. 271(5):2599-5603.

136. Adams, J.M. (1968) On the release of the formyl group from nascent protein. J. Mol. Biol. 33(3):571-589.

137. Hirel, P.H., Schmitter, M.J., Dessen, P., Fayat, G., Blanquet, S. (1989) Extent of N-terminal methionine excision from Escherichia coli proteins is governed by the side-chain length of the penultimate amino acid. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86(21):8247-8251.

138. Sandman, K., Grayling, R.A., Reeve, J.N. (1995) Improved N-terminal processing of recombinant proteins synthesized in Escherichia coli. Biotechnology (NY) 13(5):504-506.

139. Dalboge, H., Dahl, H.-H.M., Pedersen, J., Hansen, J.W., Christensen, T. (1987) A novel anzymatic method for production of authentic hGH from an Escherichia coli prodused hGH-precursor. Bio/Technology 5:161-164.

140. Talmadge, K., Gilbert, W. (1982). Cellular location affects protein stability in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:1830-1833.

141. Pugsley, A.P., Francetic, O. (1998). Protein secretion in Escherichia coli K-12: dead or alive? Cell Mol. Life Sei. 54(4):347-352.

142. Schatz, G., Dobberstein, B. (1996). Common principles of protein translocation across membranes. Science 271(5255): 1519-1526.

143. Morioka-Fujimoto, K., Marumoto, R., Fukuda, T. (1991). Modified enterotoxin signal sequences increase secretion level of the recombinant human epidermal growth factor in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 266(3): 1728-1732.

144. Hogset, A., Blingsmo, O.R., Saether, O., Gautvik, V.T., Holmgren, E., Hartmanis, M., Josephson, S., Gabrielsen, O.S., Gordeladze, J.O., Alestrom, P. (1990). Expression and characterization of a recombinant human parathyroid hormone secreted by Escherichia coli employing the staphylococcal protein A promoter and signal sequence. J. Biol. Chem. 265(13):7338-7344.

145. Lo, A.C., MacKay, R.M., Seligy, V.L., Willick, G.E. (1988). Bacillus subtilis beta-l,4-endoglucanase products from intact and truncated genes are secreted into the extracellular medium by Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 54:22872292.

146. Better, M., Chang, C.P., Robinson, R.R., Horwitz, A.H. (1988). Escherichia coli secretion of an active chimeric antibody fragment. Science 240(4855):1041-1043.

147. Le Calvez, H., Green, J.M., Baty, D. (1996). Increased efficiency of alkaline phosphatase production levels in Escherichia coli using a degenerate PelB signal sequence. Gene 170:51-55.

148. Schein, C.H., Boix, E., Haugg, M., Holliger, K.P., Hemmi, S., Frank, G., Schwalbe, H. (1992). Secretion of mammalian ribonucleases from Escherichia coli using the signal sequence of murine spleen ribonuclease. Biochem. J. 283 ( Pt 1):137-144.

149. Gray, G.L., Baldridge, J.S., McKeown, K.S., Heyneker, H.L., Chang, C.N. (1985). Periplasmic production of correctly processed human growth hormone in Escherichia coli: natural and bacterial signal sequences are interchangeable. Gene 39(2-3):247-254.

150. Schatz, P.J., Beckwith, J. (1990). Genetic analysis of protein export in Escherichia coli. Annu. Rev. Genet. 24:215-248.

151. Wülfing, C., Pluckthun, A. (1994). Correctly folded T-cell receptor fragments in the periplasm of Escherichia coli. Influence of folding catalysts. J. Mol. Biol. 242:655-669.

152. van Dijl, J.M., de Jong, A., Vehmaanpera, J., Venema, G., Bron, S. (1992). Signal peptidase I of Bacillus subtilis: patterns of conserved amino acids in prokaryotic and eukaryotic type I signal peptidases. EMBO J. 11:2819-2828.

153. Snyder, W.B., Silhavy, T.J. (1992). Enhanced export of beta-galactosidase fusion proteins in prlF mutants is Lon dependent. J. Bacteriol. 174:5661-5668.

154. Kleerebezem, M., Tommassen, J. (1993). Expression of the pspA gene stimulates efficient protein export in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 7: 947-956.

155. Blight, M.A., Chervaux, C., Holland, I.B. (1994). Protein secretion pathway in Escherichia coli. Curr. Opin. Biotechnol. 5:468-474.

156. Stader, J.A., Silhavy, T.J. (1990). Engineering Escherichia coli to secrete heterologous gene products. Methods Enzymol. 185:166-187.

157. Obukowicz, M.G., Turner, M.A., Wong, E.Y., Tacon, W.C. (1988). Secretion and export of IGF-1 in Escherichia coli strain JM101. Mol. Gen. Genet. 215:19-25.

158. Kim, I.C., Kim, J.S., Lee, S.H., Byun, S.M. (1996). C-terminal peptide of streptokinase, Met369-Pro373, is important in plasminogen activation. Biochem. Mol. Biol. Int. 40:939-945.

159. Nakamura, S., Kitai, K., Soma, K., Ichikawa, Y., Kudo, T., Aono,R., Horikoshi, K. (1992). Extracellular production of human immunoglobulin epsilon-chain/gamma 1-chain chimeric Fc polypeptide by Escherichia coli. Biosci. Biotechnol. Biochem. 56:349-350.

160. Uhlen, M., Forsberg, G., Moks, T., Hartmanis, M., Nilsson, B. (1992). Fusion proteins in biotechnology.Curr. Opin. Biotechnol. 3:363-369.

161. Wilkinson, D.L., Ma, N.T., Haught, C., Harrison, R.G. (1995). Purification by immobilized metal affinity chromatography of human atrial natriuretic peptide expressed in a novel thioredoxin fusion protein. Biotechnol. Prog. 11:265-269.

162. Collins-Racie, L.A., McColgan, J.M., Grant, K.L., DiBlasio-Smith, E.A., McCoy, J.M., LaVallie, E.R. (1995). Production of recombinant bovine enterokinase catalytic subunit in Escherichia coli using the novel secretory fusion partner DsbA. Biotechnology 13:982-987.

163. Baker, R.T., Smith, S.A., Marano, R., McKee, J., Board, P.G. (1994). Protein expression using cotranslational fusion and cleavage of ubiquitin. Mutagenesis of the glutathione-binding site of human Pi class glutathione S-transferase. J. Biol. Chem. 269(41):25381-25386.

164. Becker, J., Craig, E.A. (1994). Heat-shock proteins as molecular chaperones. Eur. J. Biochem. 219(1-2): 11-23.

165. Scheibel, T., Buchner, J. (1998). The Hsp90 complex—a super-chaperone machine as a novel drug target. Biochem. Pharmacol. 56(6):675-682.

166. Goloubinoff, P., Gatenby, A.A., Lorimer, G.H. (1989). GroE heat-shock proteins promote assembly of foreign prokaryotic ribulose bisphosphate carboxylase oligomers in Escherichia coli. Nature337(6202):44-47.

167. Blum, P., Ory, J., Bauernfeind, J., Krska, J. (1992). Physiological consequences of DnaK and DnaJ overproduction in Escherichia coli. J. Bacteriol. 174:7436-7444.

168. Carter, P., Kelley, R.F., Rodrigues, M.L., Snedecor, B., Covarrubias, M., Velligan, M.D., Wong, W.L., Rowland, A.M., Kotts, C.E., Carver, M.E. (1992). High level Escherichia coli expression and production of a bivalent humanized antibody fragment. Biotechnology 10(2): 163-167.

169. Cloney, L.P., Bekkaoui, D.R., Hemmingsen, S.M. (1993). Co-expression of plastid chaperonin genes and a synthetic plant Rubisco operon in Escherichia coli. Plant. Mol. Biol. 23:1285-1290.

170. Georgiou, G., Valax, P. (1996). Expression of correctly folded proteins in Escherichia coli. Curr. Opin. Biotechnol. 7:190-197.

171. Humphreys, D.P., Weir, N., Mountain, A., Lund, P.A. (1995). Human protein disulfide isomerase functionally complements a dsbA mutation and enhances the yield of pectate lyase C in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 270:28210-28215.

172. Ostermeier, M., De Sutter, K., Georgiou, G. (1996). Eukaryotic protein disulfide isomerase complements Escherichia coli dsbA mutants and increases the yield of a heterologous secreted protein with disulfide bonds. J. Biol. Chem. 271:1061610622.

173. Zhang, Y., Olsen, D.R., Nguyen, K.B., Olson, P.S., Rhodes, E.T., Mascarenhas,

D. (1998). Expression of eukaryotic proteins in soluble form in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 12:159-165.

174. Makrides, S.C. (1996). Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 60:512-538.

175. Garcia, G.M., Mar, P.K., Mullin, D.A., Walker, J.R., Prather, N.E. (1986). The

E. coli dnaY gene encodes an arginine transfer RNA. Cell 45:453-459.

176. Goldman, E., Rosenberg, A.H., Zubay, G., Studier, F.W. (1995). Consecutive low-usage leucine codons block translation only when near the 5' end of a message in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 245:467-473.

177. Ivanov, I., Alexandrova, R., Dragulev, В., Saraffova, A., AbouHaidar, M.G. (1992). Effect of tandemly repeated AGG triplets on the translation of CAT-mRNA in E. coli. FEBS Lett. 307:173-176.

178. Bula, C., Wilcox, K.W. (1996). Negative effect of sequential serine codons on expression of foreign genes in Escherichia coli. Protein Expression Purif. 7: 92-103.

179. Goldberg, A.L. (1992). The mechanism and functions of ATP-dependent proteases in bacterial and animal cells. Eur. J. Biochem. 43:835-869.

180. Gottesman, S., Maurizi, M.R. (1992). Regulation by proteolysis: energy-dependent proteases and their targets. Microbiol. Rev. 56:592-621.

181. Kaufmann, A., Stierhof, Y.-D., Henning, U. (1994). New outer membrane-associated protease of Escherichia coli K-12. Bacteriol. 176:359-367.

182. Keiler, K.C., Waller, P.R.H., Sauer, R.T. (1996). Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science 271:990-993.

183. Varshavsky, A. (1992). The N-end rule. Cell 69:725-735.

184. Bachmair, A., Finley, D., Varshavsky, A. (1986). In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue. Science 234:179-186.

185. Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. (1986). Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science 234:364-368.

186. Enfors, S.-O. (1992). Control of in vivo proteolysis in the production of recombinant proteins. Trends Biotechnol. 10:310-315.

187. Murby, M., Uhlen, M., Stahl, S. (1996). Upstream strategies ti minimize proteolytic degradation upon recombinant production in Escherichia coli. Protein Expression Purif. 7: 129-136.

188. Swarny, K.H.S., Goldberg, A.L. (1981). E. coli contains eight soluble proteolytic activities, one being ATP dependent. Nature (London) 292:652-654.

189. Talmadge, K., Gilbert, W. (1982). Cellular location affects protein stability in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1830-1833.

190. Goff, S.A., Goldberg, A.L. (1987). An increased content of protease La, the Ion gene product, increases protein degradation and blocks growth in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 262:4508-4512.

191. Lee, S.C., Olins, P.O. (1992). Effect of overproduction of heat shock chaperones GroESL and DnaK on human procollagenase production in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 267:2849-2852.

192. Aristidou, A.A., San, K.-Y., Bennett, G.N. (1994). Modification of central metabolic pathway in Escherichia coli to reduce acetate accumulation by heterologous expression of the Bacillus subtilis acetolactate synthase gene. Biotechnol. Bioeng. 44:944-951.

193. Sadiev, S., Taylor, A. (1996). Alternative method for isolation of double-sranded template for DNA sequencing. BioTechniques 21: 233-235.

194. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A.R. (1997). DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad Sci. USA 12:5463-5467.

195. Flaherty, K.M., Zozulya, S., Stryer, L. and McKay, D.B. (1993). Three-dimensional structure of recoverin, a calcium sensor in vision. Cell 75: 709-716.

196. Практикум по бихимии/ Издательство Московского университета 1989, стр. 85.

197. Laemmli U. К. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the heard of bacteriophage T4. Nature 227:680-685.

198. Holbrook, I.B., Leaver, A. (1976). A procedure to increase the sensitivity of staining by Coomassie brilliant blue G250-perchloric acid solution. Anal. Biochem. 75:634-636.

199. Dizhoor, A.M., Ray, S., Kumar, S., Niemi, G., Spencer, M., Brolley, D., Walsh, K.A., Philipov, P.P., Hurley, J.B., Stryer, L. (1991). Recoverin: a calcium sensitive activator of retinal rod guanylate cyclase. Science 251:915-918.

200. Hurley, J.B, Dizhoor, A.M., Ray, S., Stryer, L. (1993). Recoverin's role: conclusion withdrawn. Science 260:740.

201. Gorodovikova, E.N. and Philippov, P.P. (1993). The presense of a calcium-sensitive p26-containing complex in bovine retina rod cell. FEBS Lett. 335: 277279.

202. Kutuzov, M.A., Shmukler, B.E., Suslov, O.N., Dergachev, A.E., Zargarov, A.A., Abdulaev, N.G. (1991). P26-calcium binding protein from bovine retinal photoreceptor cells. FEBS Lett. 293:21-24.

203. Dizhoor, A.M., Ericsson, L.H., Johnson, R.S., et al. (1992). The NH2 terminus of retinal recoverin is acylated by a small family of fatty acids. J.Biol.Chem. 267: 16033-16036.

204. Hirel, P.H., Schmitter, M.J., Dessen, P., Fayat, G., Blanquet, S. (1989). Extent of N-terminal methionine excision from Escherichia coli proteins is governed by the side-chain length of the penultimate amino acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:8247-8251.

205. Towler, D.A., Gordon, J.I., Adams, S.P., Glaser, L. (1988). The biology and enzymology of eukaryotic protein acylation. Annu. Rev. Biochem.7:69-99.

206. Matsuda, S., Hisatomi, O., Ishino, T., Kobayashi, Y., Tokunaga, F. (1998). The role of calcium-binding sites in S-modulin function. J. Biol. Chem. 270: 2022320227.

207. Gorczyca, W.A., Polans, A.S., Surgucheva, I.G., Subbaraya, I., Baehr, W., Palczewski, K. (1995). Guanylyl cyclase activating protein. A calcium-sensitive regulator of phototransduction. J. Biol. Chem.270:22029-22036.

Автор выражает глубокую признательность своим научным руководителям Филиппову Павлу Павловичу и Липкину Валерию Михайловичу за постоянное внимание к работе, поддержку и полезное обсуждение результатов. Особую благодарность автор выражает Заргарову Амину как организатору этих исследований в группе регуляторных белков ФИБХ, и за ценные замечания и советы в ходе работы. Автор выражает благодарность старшему научному сотруднику отдела энзимологии Института физико-химической биологии МГУ, к.х.н. Сенину Ивану Ивановичу за помощь в работе, консультации и обсуждении результатов. Особую благодарность автор выражает аспиранту группы регуляторных белков Нуриевой Розе Инсафетдиновне за помощь при оформлении диссертации. Автор выражает признательность м.н.с. Зинченко Дмитрию Валерьевичу за активную помощь и консультации при выделении и тестировании мутантных форм рекомбинантного рековерина, Шмуклеру Борису Ефимовичу (ИБХ РАН) за любезно предоставленную плазмиду содержащую кДНК рековерина, а также Быстрову Николаю Сергеевичу (ИБХ РАН) за синтез и очистку необходимых олигонуклеотидов.

Автор выражает признательность Зинченко Валерию Петровичу (ИБК РАН) за помощь в измерениях концентрации кальция.

Автор выражает благодарность всем сотрудникам группы регуляторных белков ФИБХ за помощь и создание творческой обстановки в ходе данной работы.