Рибосомная супрессия и функционирование аппарата белкового синтеза у эукариот тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, доктор биологических наук Сургучев, Андрей Павлович

• Сургучев, Андрей Павлович
• доктор биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации доктор биологических наук Сургучев, Андрей Павлович

I. Введение

II. Обзор литературы .10 Механизм биосинтеза белка а).общая характеристика б).инициация . II в).элонгация г).терминация

Строение и функционирование рибосом у эукариот

• • • S

Координация синтеза рибосомных белков и рРНК .30 Генетический код

Точность белкового синтеза а).уровень ошибок в реакции аминоацилирования. б).точность рибосомного этапа белкового синтеза в).изучение неоднозначности .51 -переосмысление значащих кодонов . 53 -распознавание нонсенс кодонов как смысловых ошибки фазы трансляции

Генетические подходы к изучению трансляции. а).определение супрессии б).супрессия за счёт тРНК у прокариот в).супрессия нонсенс-кодонов за счёт тРНК у эукариот г).рибосомные мутанты прокариот с изменённой точностью трансляции д).рибосомные супрессоры у эукариот е).обнаружение и свойства рецессивных супрес-соров у дрожжей ж).модификаторы супрессоров з).взаимодействие доминантных и рецессивных супрессоров и). другие типы рибосомных мутантов у эукариот

Организация и экспрессия митохондриального генома

Дрожжи как объект исследования методами генной инженерии

III. Материалы и методы .114 Выращивание клеток дрожжей на твёрдой среде.115 Выращивание клеток дрожжей на жидкой среде

Разрушение клеток . 116 Выделение полисом и рибосом . 116 Определение скорости включения меченых аминокислот в интактных клетках

Определение скорости включения меченых предшественников в РНК в интактных клетках

Определение кинетики распада полисом

Сравнение количества связанной с 80 S рибосомами пептидил-тРНК по образованию пептидил-пуромицина

Количественная оценка связанной с рибосомами пептидил-тРНК

Определение акцепторной специфичности связанной с рибосомами пептидил-тРНК

Определение размеров новосинтезированного пептида, связанного с рибосомами в виде пептидил-тРНК

Определение способности к диссоциации на субчастицы рибосом, связанных с пептидил-тРНК

Определение поли- U-зависимого включения "^С-фенилаланина в s -30 экстракте

Определение поли- U-зависимого включения "^С-фенилаланина в бесклеточной системе, реконструированной из рибосомных субчастиц

Изучение влияния пуромицина на поли-и-зависимое включение фенилаланина.

Определение кинетических констант в реакции деа-т ; цилирования метионил-тРНК^ет

Изучение эффекта паромомицина на супрессию нонсенс-мутаций

Изучение синтеза белка и сборки рибосомных субчастиц у холодочувствительных штаммов

Изучение зависимых от даклогексимида штаммов

Изучение механизма дыхательной недостаточности

Клонирование гена supl

-трансформация клеток дрожжей

-выделение ДНК из трансформированных клеток .135 -трансформация клеток E.coli

-выделение плазмидной ДЕК для электрофорети-ческого анализа "

-электрофорез плазмидной ДНК в геле агарозы .137 -амплификация плазмиды

-субклонирование гена SUP

-выделение поли-А+РНК

-иммобилизация плазмидной ДНК и РНК-ДНК-гибридизация .139 -трансляция мРНК в бесклеточной системе из ре-тшсулоцитов кролика и проростков пшеницы ,.

1У. Результаты и их обсуждение

I. Использование плейотропных проявлений супрессорных мутаций для изучения механизма супрессии.

2.Изучение супрессорных мутантов, чувствительных к повышенной температуре

Влияние рецессивных супрессоров на синтез белка и РНК

Влияние непермиссивной температуры на состояние полисом в клетках супрессорных штаммов

Сравнение количества пептидил-тРНК, связанной с

80 S рибосомами, с помощью ^Н-пуромицина

Количественная оценка связанной пептидил-тРНК

Определение акцепторной специфичности тРНК, входящей в состав связанной с рибосомами пептидил-тРНК.

Определение длины связанного с тРНК пептида

Функциональные свойства рибосом, накапливающихся в непермиссивных условиях

3. Определение кодоновой специфичности рецессивных супрессоров

4. Определение уровня ошибок на рибосомном этапе трансляции

5. Кодоновая специфичность супрессорных мутаций в присутствии паромомицина

6. Роль реакции ферментативного деацилирования в определении точности трансляции ,.

7. Изучение рецессивных супрессорных мутантов дрожжей, чувствительных к пониженной температуре

8. Зависимые от циклогексимида супрессорные мутанты а).влияние щклогексимида на рост клеток б).изучение рибосом методам кругового дихроизма в).связывание ^Н циклогексимида с рибосомами условно-зависимого мутанта .,

9. Дыхательная недостаточность супрессорных штаммов

10.Клонирование гена supl а).принцип метода б).проведение опытов по клонированию в).локализация гена supl в клонированном фрагменте г).обнаружение гена supl в банке генов на основе плазмиды pYSl д). идентификация продукта гена supl .,

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Рибосомная супрессия и функционирование аппарата белкового синтеза у эукариот»

Последние два десятилетия ознаменовались огромными достижениями в исследованиях, касающихся механизмов хранения и передачи генетической информации. Тем не менее, многие вопросы, связанные с экспрессией генов и их взаимодействием» до сих пор остаются недостаточно исследованными, особенно для эукариотических организмов. Это касается, в частности, структуры и регуляции активности генов, контролирующих компоненты аппарата белкового синтеза, число которых только в ядерном геноме приближается к двумстам. Выяснение структурной организации аппарата белкового синтеза, а также механизмов его функционирования и генетического контроля представляется одной из ключевых проблем молекулярной биологии и молекулярной генетики. Белковые молекулы участвуют во всех важнейших функциях живой клетки, определяя её способность к воспроизведению, движению, взаимодействию с окружающей средой и т.п. Поэтому познание механизма сборки разнообразных по структуре и свойствам белковых молекул является необходимой предпосылкой, для более глубокого понимания самых разнообразных функций живой клетки, начиная от бактерий и кончая клетками человека.Кроме того, изучение аппарата белкового синтеза, в особенности за последнее время, приобрело и важное практическое значение, в связи с бурным развитием исследований по клонированию генов как про-, так и эукариотического происхождения. Подходы и методы генной инженерии позволяют выделять индивидуальные гены, а также информационные РНК для этих генов, которые могут} вступая во взаимодействие с аппаратом белкового синтеза, направлять синтез нужных для человека белковых и полипептидных продуктов. Очевидно, что для исследования сложного семейства генов, кодирующих компоненты аппарата белкового синтеза, недостаточны методы биохимии и молекулярной биологии. Использование же молекулярно-генетических подходов, оказавшихся столь эффективными в изучении экспрессии генов прокариот и вирусов, долгое время сдерживалось из-за отсутствия генетически охарактеризованных эукариотических организмов. В последние годы благодаря бурному развитию молекулярной генетики простейших эукариотических микроорганизмов - пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae -создалась возможность их использования в качестве модельного объекта для исследования организации эукариотическо-го генома, взаимодействия генов, структурной характеристики аппарата белкового синтеза и т.д.Эффективность таких исследований особенно возросла после разработки методов эффективной трансформации клеток дрогшей.

Классическим подходом молекулярной генетики к изучению экспрессии генов является исследование супрессии, позволяющее пролить свет на такие детали строения, функционирования и экспрессии генома, которые часто не удаётся выяснить с помощью других методических приёмов. Настоящая работа была начата с целью выяснения механизма нового типа супрессии -рецессивной супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae впервые обнаруженной на кафедре генетики и селекции Ленинградского Государственного университета профессором С.Г. Инге-Вечтомовым (Инге-Вечтомов, 1964).

На первом этапе работы с использованием условно-летальных мутантов, несущих супрессорные мутации, было установлено, что рецессивная супрессия реализуется за счёт изменения одного из компонентов аппарата трансляции. Механизм супрессии был выяснен в экспериментах по определению неоднозначности белкового синтеза в бесклеточной системе : оказалось, что супрессия обусловлена повышенным уровнем рибо-сомной неоднозначности. Далее для идентификации продуктов генов-супрессоров было использовано два подхода : электро-форетический анализ белков рибосом и клонирование гена-супрессора supl.в результате в качестве продукта супрес-сорного гена supl был идентифицирован один из белков большой рибосомной субчастицы.В ходе работы стало очевидным, что используемая экспериментальная модель чрезвычайно удобна для исследования таких важных вопросов, как взаимодействие ядерного и митохондриального генома, выяснение механизмов генетического контроля трансляции, механизма действия некоторых антибиотиков и т.д.

К числу результатов работы, представляющих принципиальный интерес, относится, в частности :I). Обнаружение связи между функционированием цитоплазмати-ческого и митохондриального аппарата трансляции. Существование такой связи было установлено при исследовании одного из плейотропных эффектов супрессорных мутаций, который проявляется как дыхательная недостаточность мутантов. Выяснение механизма дыхательной недостаточности показало, что в митохондриях супрессорных мутантов таким плейотропным эффектом нарушен процесс трансляции и изменены свойства рибосом. Поскольку в результате одной точечной мутации изменяются свойства как ци-топлазматических, так и митохондриальных рибосом, сделано заключение о существовании общего бежа, входящего всостав рибосом цитоплазмы и митохондрий. 2). Выявление функциональной роли некоторых рибосомныхбелков в аппарате белкового синтеза. Так, в результате проведённой работы удалось установить, в частности, что рибосомный белок, являющийся продуктом гена supl, участвует в терминации белкового синтеза, определении уровня рибосомной неоднозначности, сборке рибосомной субчастицы, диссоциации рибосом на субчастицы, а также оказывает влияние на функционирование митохондриальных рибосом.

Таким образом, в настоящей работе был не только выяснен механизм рецессивной супрессии и идентифицированы молекулярные компоненты, ответственные за супрессорную активность, но и обнаружены неизвестные до настоящего времени свойства некоторых компонентов аппарата трансляции.Кроме того, в экспериментах по клонированию был сконструирован новый тип векторов для клеток дрогшей, содергшщих в качестве вставки ДНК ген рибосомного белка.Одним из достоинств такого вектора является присутствие в его регуляторной области эффективного промотора, что может представлять интерес, в частности, для его прикладного использования.

Настоящая работа проводилась при сотрудничестве с кафедрой генетики и селекции Ленинградского государственного университета имени А.А.Жданова, руководимой профессором С.Г,Инге^Вечтомовым.

МЕХАНИЗМ БИОСИНТЕЗА БЕЛКАа) Общая характеристикаСинтез белка в клетках любых организмов является сложным многоступенчатым процессом, в котором участвует, по меньшей мере, двести различных молекулярных компонентов. Б этом процессе осуществляется считывание информации, закодированной в форме последовательности нуклеотидов мРНК и ее перевод в последовательность аминокислотных остатков в белковой молекуле. Считывание осуществляется на рибосомах и» >происходит в направлении от 5 к 3 концу мРНК, в то время, как молекула синтезирующего полипептида растет от аминотерминальной к карбокситерминальной аминокислоте. В процессе трансляции помимо рибосомы принимают участие растворимые белковые факторы, специфичные для каждого этапа, а также gtp. Включение аминокислот в синтезирующиеся полипептидные цепи происходит только после того, как каждая аминокислота присоединиться к определенной транспортной РНК. Эта реакция носит название реакции аминоацилирования и происходит вне рибосомы с участием ферментов аминоацил-тРНК-синтетаз. Ри-босомный этап белкового синтеза условно разделяется на три этапа: инициацию, элонгацию и терминацию.

В настоящее время имеется огромный экспериментальный материал, касающийся механизма белкового синтеза и его регуляции, строения и функционирования рибосомы, регуляции синтеза и сборки отдельных компонентов аппарата трансляции и т.п; особенно подробно эти вопросы исследованы для прока-риотического аппарата белкового синтеза. В связи с этим в настоящей работе дается лишь общая структурно-функциональная характеристика процесса трансляции; более подробно эти вопросы рассматриваются для эукариотических организмов. Наиболее детально освещаются особенности строения и функционирования аппарата белкового синтеза у дрожжей.б) Инициация синтеза белка у эукариотИнициация белкового синтеза является, пожалуй, той стадией, которая более всего различается для про- и эукариотических организмов. Кратко эти отличия сводятся к следующему: инициаторная тРИКмет в эукариотических организмах не подвергается формилированию и связывается с малой рибосомной субчастицей до присоединения мРНК; для связывания мРНК с рибосомой эукариот необходима АТР; в инициации у эукариот участвует, по крайней мере, 8 факторов; протеин-киназная система может регулировать процесс трансляции на уровне инициации; в качестве инициирующего кодона у эукариот используется только триплет aug в то время как у прокариот наряду с этим кодоном используется триплет &UG.

Наиболее тщательно механизм инициации белкового синтеза исследован для ретикулоцитов кролика. Общая схема этого процесса приведена в табл. I.

Табл. I.

Хотя в настоящее время окончательные выводы делать ещеможнопреждевременно, тем не менее полагать, что последовательность нуклеотидов на 5'-конце мРНК имеет важное значение в определении эффективности ее трансляции не только за счетвзаимодействия с комплементарным участком в составе малой рибосомной РНК, но и за счет образования специфической вторичной структуры. В результате мутаций изменения вторичной структуры могут приводить к экспозиции важных для инициации участков или к их маскировке, что изменяет эффективность трансляции мРНК. Имеются наблюдения о том, что мутации, не влияющие на вторичную структуру и локализованные вне последовательности Шайна-Дальгарно, также влияют на эффективность трансляции; предполагается, что они расположены в тех участках матрицы, которые взаимодействуют с некими рибосомными белками, выполняющими важную функцию в процессе инициации белкового синтеза (Boyen et al., 1982).

В состав высокомолекулярной формы ef-1 входит белок с молекулярной массой 50 ООО дальтон, соответствующий по функциям фактору элонгации из fi. coli . Этот белоквзаимодействует cgtp и аминоацил-тРНК с образованием тройного комплекса. Помимо него в состав комплекса входят минорные белковые компоненты -lf-1^ и • Фактор lf-1^ имеет молекулярную массу 27 ООО дальтон ( Weissbach, 1979) и обладает функциональным сходством с бактериальным фактором EF-Ts стимулируя связывание аминоацил-тРНК с рибосомой и полимеризацию аминокислотных остатков ( Iwasaki et al., 1976) и обмен гуанозинового нуклеотида с *gdp. Хотя факторы EF-ijj и Б целом, видимо, функционально сходны с бактериальными факторами EF-Iu и LF-is тем не менее, для них обнаруживаются и некоторые отличия. Так, связывается с рибосомой лишь после того, какаминоацил-тРНК занимает А-участок рибосомы (Weissbach, 1979).

У дрожжей Saccharomyces cerevisiae обнаружено две формы (высокомолекулярная и низкомолекулярная) фактора элонгации. Обе формы катализируют зависимое от поли- и связывание ^ -ацетил-фенилаланил-тРНК и фенилала-нил-тРНК с рибосомами (Spremulli, Ravel, 1976). Позднее был очищен до гомогенного состояния, что позволило более детально охарактеризовать его свойства ( Dasmahapatra, 1981). Определение молекулярной массы дрожжей позволило сделать вывод о том, что он присутствует лишь в форме мономера (43 000-49 ООО дальтон). Активности, свойственной EF-1 в экстрактах дрожжей обнаружено не было ( ^asmahapatra, 1981), как и агрегатов с большой молекулярной массой.

Интересные наблюдения были сделаны по степени агрегации фактора EF-1 креветки Artemia salina. Было установлено, что размер этого белкового комплекса закономерно изменяется в цикле развития, что может свидетельствовать об участии этого фактора в процессе дифференцировки и развития ( Slobin and Roller, 1975).

Транслокация в рибосомах эукариот осуществляется с участием фактора элонгации 2 который по многим свойствам сходен с бактериальным фактором. Молекулярная масса этого белка рассчитана равной 110 ООО дальтон. Факторспособен связывать и с образованием стабильного бинарного комплекса в отсутствии рибосомы. При взаимодействии такого комплекса с рибосомой происходит быстрый гидролиз ™ (Henrickson et al., 1975). К числу отличий от его прокариотического аналога относится, вчастности, чувствительность к дифтерийному токсину, катализирующему абр -рибозилирование с участием молекулы biAD ; в результате (а(ткой модификации теряет активность ( Weissbach 1979).

У дрожжей Saccharomyces cerevisiae обнаружен фактор элонгации, обозначенный ЕЬ'-З с молекулярной массой равной 125 ООО. Этот фактор облигатно необходим для полимеризации фенилаланина, катализируемой рибосомой дрожжей, и обладает зависимой от рибосомы -азной и АТР-азной активностью. У других эукариотических организмов подобный фактор не обнаружен, и детальный механизм его действия остается пока неизвестным ( Dasmahapatra and Chakraburtty I981).

В настоящее время имеются некоторые косвенные наблюдения, позволяющие предполагать, что в механизме элонгации белковго синтеза могут принимать участие и рибосомные РНК. Роль рРНК в инициации трансляции в настоящее время можно считать установленной (см. предыдущий раздел). Свидетельства в пользу участия рРНК в элонгации немногочисленны, и окончательные выводы по этому вопросу пока преждевременны.

На рис. 1а изображен завершенный полипептид, связанный в форме пептидил-тРНК с Р-участком рибосомы, в то время как нонсенс-кодон UAA занимает А-участок. В присутствии фактора терминации происходит освобождение полипептида из70SРис. Iкомплекса рибосома -мРНК-деацилированная тРНК. Для диссоциации этого комплекса необходимо присутствие , другого фактора терминации и фактора itf-g #Впервые предположение о существовании растворимых факторов терминации было сформулировано Ганозой ( Ganoza, 1966). Позднее Капечи с соавт. (Capechi et al., 1970) выделили белковый фактор, необходимый для терминации белкового синтеза, используя в качестве мРНК мутантную РНК фага R. В этой РНК седьмой кодон GAG гена белка оболочки был му-тационно изменен на амбер-кодон. Удобная экспериментальная модель для изучения механизма терминации была предложена Каски с соавт. ( Caskey et al., 1968). Эти исследователи обнаружили, что активность фактора терминации может быть измерена по освобождению формилметионил-тРНК из комплекса формилметионин-тРНК-Д^-рибосома, для которого необходимо также присутствие триплета-терминатора ( UAA или uga ). Благодаря использованию такого методического подхода удалось выделить 2 фактора терминации: который обладал активностью в присутствии триплетов UAAи №-2 ? активного в присутствии UAA иU(iA ( СаРе chi,K.leirg;g70. Klein, Kapechi 1971).

Молекулярную массу фактора , очищенного до состояния гомогенности, определили равной 44 ООО, молекулярную массу KF-2 - равной 47 ООО ( Klein, Capechi, 1971), Количество молекул каждого из факторов в расчете на клетку Е. coli было найдено равным 500-700. Интересно, что в составе KF-1 и RF-2 обнаружены общие антигенные детерминанты ( Ratiiffe, Caskey 1977). Оба фактора терминации способны к образованию прочных комплексов с рибосомой в присутствии соответствующего триплета-терминатора. Для связывания с рибосомой требуются рибосомные белки L7 / L12 ( Brot et aiJ974). В лаборатории Каски был обнаружен и третий фактор терминации КР-3 ( Milman et al., 1969), который лишь стимулирует действие RF-1 и RF-2. Этот фактор, видимо, способствует связыванию RF-1 и R*1-2 с рибосомой, а также вызывает диссоциацию комплексов или R*1-2 - -рибосома.

В механизме терминации принимает участие пептидилтранс-феразный центр рибосомы; его роль, по-видимому, заключается в катализе реакции переноса полипептидного остатка на молекулу воды. Взаимодействие фактора терминации с нонсенс-ко-доном, расположенным в А-участке рибосомы, активирует пеп-тидилтрансферазу, в результате чего происходит освобождение (гидролиз) пептида, соединенного с ТРНК в составе комплекса с рибосомой.

Для эукариотических организмов механизм терминации наиболее подробно исследован на ретикулоцитах кролика с использованием принципиально сходного методического приема, основанного на освобождении формилметионил-тРНК. Однако, в этом случае использование нонсенс-триплетов оказалось неэффективным, и для анализа терминации в инкубационную пробу добавляли тетрануклеотиды uaaa ? uaga 5 ugaa или jagg Молекулярную массу фактора терминации нашли равной 115 ООО дальтон, однако, в денатурирующих условиях происходит диссоциация белка на две, видимо, идентичные субъединицы (Caskey 1977). В отличие от прокариотических организмов, у эукариот, видимо, имеется лишь один фактор терминации, способный распознавать все три нонсенс кодона. Фактор терминации (RF) из ретикулоцитов катализирует зависимый от рибосомы гидролиз который стимулируется тетрануклеотидом uaaa (Caskey 1977).

Капечи с сотрудниками обнаружили в ретикулоцитах фактор s ? стимулирующий освобождение формилметионина. Хотя этот фактор сам по себе и не обладал активностью, однако он стимулировал отщепление формилметионина, катализируемое ^ ( Konecki et al., 1977). Видимо, фактор s функционально сходен с прокариотическим фактором HF-5. Очищенные факторы терминации были также получены из печени морской свинки и китайского хомяка, а также из насекомого Tenebria molitor и морской креветки (Beaudet, Caskey jgvj. Innanen, Nicholls, 1973; Ilan 1973; Hedaington, Tate 1979).

После освобождения новосинтезированного полипептида рибосома остается в комплексе с мРНК и деацилированной тРНК, локализованной в Р-участке рибосомы. Хирашима и Кай впервые обнаружили фактор, названный ими (от ribosome releasingfactor )(Hirashima Kaji 1972), стимулирующий освобождение мРНК из такого комплекса. Физиологическая значимость этого фактора была подтверждена в опытах с использованием мутантной РНК фага R 17, содержащей амбер-кодон (i'^te et al., 1975), а также в экспериментах по ДНК-направленному синтезу in vitro р -галактозвдазы ( Kung et а1*» 1977).

Каски с сотрудниками установили, что для связывания факторов терминации с рибосомой необходимо наличие интакт-ного з'-конца 16 s рибосомной РНК. При отщеплении клоаци-ном 49 концевых нуклеотидов рРНК рибосомы сохраняли способность катализировать гидролиз формилметионил-тРНК, но не связывали факторы терминации в присутствии нонсенс-триплетов. Из этих экспериментов следует, что 3'-конец 16 s рРНК Е. coli необходим для терминации белкового синтеза ( Cas -key etaL!978). Кроме того, для корректной терминации оказалась существенной и последовательность нуклеотидов вблизи от кодона-терминатора. Так, Ганоза с соавторами показали,что гексануклеотид uaaaug в присутствии факторов терминации и рибосомы стимулирует гидролиз формилметионил-тРНК с такой же эффективностью, как и триплет иАА. В то же время, гексануклеотид auguaa не обладал активностью в этой реакции. Олигонуклеотид auguuuuaa также был способен стимулировать освобождение деацилированной тРНК и к -формил-метионилфенилаланина ( Ganoza, 1977). Из этих экспериментов следует, что для терминации полипептидной цепи необходимо, чтобы между инициирующим ( ) и терминирующим () триплетом был промежуток. Возможно, что распознавание нон-сенс-кодона осуществляется в специальном участке, отличном от А и Р-участков рибосомы.

В мРНК эукариот используется все 3 типа кодонов терминаторов, однако, существенно чаще других в них встречается триплет uaa. Эта тенденция особенно ярко выражена для эукариотических вирусов; кроме того, характерной особенностью для них является крайне редкое использование триплета uag. Сходные частоты использования кодонов терминаторов характерны и для прокариотических организмов и их фагов. Редкое использование нонсенс-кодона uag у прокариотических организмов может объясняться следующим. Аткинс, а также Кохли и Гросджин предположили, что нонсенс-кодоны uaa к uga располагаясь в полицистронных матрицах прокариот перед инициирующими кодонами, могут служить в качестве сигнала распознавания рибосомой при инициации, в то время, как триплет uag Не выполняет такой функции и поэтому крайне редко встречается в полицистронных мРНК (Atkins, I979;Kohli and Grosjean 1981).

Тер-Аванесян и Сойдла (1981), проанализировав последовательность нуклеотидов мРНК вблизи от сигналов терминации, высказали интересную гипотезу о функциональном значении з'-конца рибосомной РНК малой субчастицы в процессе терминации. Предполагается, что з'-конец рРНК малой субчастицы сканирует мРНК, узнавая при этом нонеенс-кодоны, находящиеся в кодирующей фазе гена, з'-конец 16s рРНК -E.coli имеет структуру oh-auucgiiccacua и, следовательно, нонсенс-кодоны uaa и uga комплементарны триплетам в этом концевом фрагменте. Этот механизм гложет осуществляться за счет разрыва и образования комплементарных пар оснований между мРНК и з'-концом рРНК при каждом акте транслокации. Авторы гипотезы предполагают, что 3 -конец 16 s рРНК должен обладать кон-формацией, позволяющей сканирование матрицы для поиска нонсенс-кодонов; такое сканирование, видимо, осуществляется до>А-участка рибосомы. Помимо собственно нонсенс-кодонов 3 -конец рРНК малой субчастицы может распознавать и контекст, расположенный вблизи от терминирующих триплетов; такое распознавание может происходить и вне фазы считывания. Участки, тлеющие сродство с 3 -концом мРНК, обнаружены во многих мРНК, в интервале от 7-го до 20-го нуклеотида терминатора, за исключением тех случаев, когда в матрице тлеются наиболее четкие сигналы терминации (тандемы нонсенс-кодонов или триплет uaa ). Эти участки могут быть расположены как справа, так и слева от нонсенс-кодона. Авторы гипотезы предполагают, что для высокоэффективного протекания терминации не»обходимо взаимодействие 3 -конца рРНК малой рибосомной субчастицы с участками матрицы, расположенными вблизи от нонсенс-кодона. Следует сказать, что гипотеза о сканировании мРНК 3'-концом рРНК выдвинута, в основном, на основании анализа нуклеотидных последовательностей и нуждается в прямой экспериментальной проверке.

Сейчас накапливается все больше данных о том, что для протекания нормального процесса терминации может быть недостаточно наличия в мРНК лишь одного кодона терминатора. В ряде случаев терминация обеспечивается тандемом терминирующих кодонов, в других важную роль играет контекст, в котором расположен триплет, служащий сигналом завершения синтеза полипептида ( КоШ and Urosjean, 1981). (О влиянии контекста на эффективность супрессии нонсенс-кодонов см. также главу "Генетические подходы к изучению трансляции", подзаголовок "Эффективность супрессии за счет тРНК у про-и эукариот). Терминация на тандемах нонсенс-кодонов реализуется у прокариот, а также в эукариотических клетках и их вирусах относительно редко. Чаще второй терминирующий кодон обнаруживается в РНК бактериофагов ( Kohli and Grosjean 1981). Jly и Рич рассчитали, что в клетках i.coli около 13% всех терминаторов представлены тандемами; эти тандемы оказались весьма эффективными сигналами терминации (Ьи and Kich, 1971). Есть основания полагать, что контекст вблизи от кодона терминатора может выполнять и иную функцию, а именно обеспечивать с определенной вероятностью "прочтение" нон-сенс-кодона как смыслового, что должно приводить к синтезу удлиненного полипептида ( read-throw protein ). При трансляции некоторых (преимущественно фаговых) РНК образование таких белков реализуется111 vivo и, видимо, выполняет определенную функциональную роль ( Weiner and Weber 1973; G-eller and Rich 1980).

Итак, как и в случае инициации белкового синтеза, где помимо кодонов aug и gug s важную роль выполняют другие нуклеотидные последовательности мРНК, при терминации нон-сенс-кодоны, видимо, являются основными, но не единственными сигналами окончания трансляции.

Строение и функционирование рибосом эукариотПо многим свойствам рибосомы эукариот отличаются от бактериальных рибосом: они имеют существенно более крупные размеры, содержат большее количество белков (70-80 вместо 53 у рибосом E.coli а также дополнительный тип рРНК. В среднем как белковые компоненты, так и рРНК обладают более крупными размерами по сравнению с компонентами бактериальных рибосом. Причина существенных различий в размерах рибосом про- и эукариот и в количестве составляющих их компонентов остаются до конца неясными, поскольку оба класса рибосом выполняют принципиально сходную функцию - синтез полипептидов, который проходит через те же этапы для обоих типов рибосом. Лишь стадия инициации существенно различается для про- и эукариотических типов белкового синтеза.

Эукариотические рибосомы, также как и рибосомы прокариот, состоят из двух субъединиц, коэффициент седиментации которых различается для рибосом разных организмов, однако близок к 60 s для большой и 40 s для малой субчастицы. Коэффициент седиментации рибосом эукариот близок к 80 s. Молекулярная масса эукариотических рибосом колеблется вс Спределах от 3,9 х 10 для растений, до 4,55 х 10 для млекопитающих ( Wool, 1979). Различия в размерах и молекулярной массе эукариотических рибосом обусловлены большими субчастицами, масса которых колеблется в пределах от 2,4 дог3,05 х 10. Увеличение молекулярной массы в этом случае связано с возрастанием количества как белка, так и РНК.

В противоположность этому, размер малой субчастицы практически не претерпевал изменений в ходе эволюции. Сморфологической точки зрения наиболее хорошо исследованы рибосомы из печени крысы. С помощью электронной микроскопии было установлено, что малая субчастица состоит из двух структурных доменов и располагается ассиметрично на большой субчастице. Малая субчастица представляет собой вытянутый элипсоид с размерами 230 х 140 х Но Л ( hake et а1-» 1974); она подразделяется на "головку", составляющую около одной трети по массе, и "тело" (две трети). В составе малой субчастицы рибосом печени крысы обнаружено 34 белка; молекулярная масса их колеблется в пределах от II 200 до 39 ООО (средняя молекулярная масса - около 22 ООО). Большая субчастица содержит 50 белков со средней молекулярной массой 21 000 дальтон ( от II 500 до 41 800)( Wool> 1979).

Японские исследователи предложили метод выделения рибосомных белков дрожжей в препаративных количествах. Имудалось выделить в высокоочшценном состоянии 14 рибосомных белков из малой и 23 белка из большой субчастицы ( Higo ала Otaka 1979; Itoh et al.,I979). Часть рибосомных белков дрожжей подвергаются метилированию (от трех до девяти)(для большой субчастицы) ( Cannon et al., 1977), фосфорилированию ( Sanchez-Madrid et al., 1979; Sanchez-Madrid et al. 1981). Количество фосфорилируемых рибосомных белков рассчитано равным двум для малой и четырем для большой субчастицы ( Kru-iswijk et al., 1978). Поскольку большая часть фосфорилируемых белков присоединяется к предшественникам рибосомных частиц на поздних стадиях сборки рибосомы, предполагается, что фосфорилирование играет важную роль в функционировании, а не в сборке рибосомы (Kruiswijk et al., 1978).

В лаборатории Ворнера при использовании генно-инженерных подходов было установлено, что большая часть генов, кодирующих рибосомные белки, несцеплена, и гены лишь для двух белков образуют кластер ( Fried et al., 1981). Для некоторых рибосомных белков получены доказательства в пользу того, что они присутствуют в виде одной копии в геноме дрожжей. Данные об отсутствии множественности копий генов рибосомных белков были получены и при генетическом анализе маркёров устойчивости к антибиотикам (Mortimer, Haethorn, 1966; Grant et al., 1976; Skogerson et al., 1973). Однако, авторы не исключают того, что для некоторых рибосомных белков дрожжей может существовать множественность генов. При анализе температурочувствительных штаммов дрожжей с нарушенным синтезом мРНК удалось установить, что в восьми из одинадцати проанализированных генов, видимо, присутствуют интроны. Авторы полагают, что большинство, если не все, гены рибосомных белков дрожжей являются мозаичными.

Прямое экспериментальное доказательство наличия интро-на было получено, в частности, для гена, кодирующего рибо-сомный белок ъ 29 (yl 24), мутации по которому придают клеткам дрожжей свойство устойчивости к щшлогексимиду ( Kaufer et al., 1983). Эти исследователи, проведя клонирование гена рибосомного белка L 29, установили, что на немтранскрибируется РНК длиной I 082 нуклеотида, содержащая j на 5 -конце интрон размером оЮ нуклеотидов.

Координация синтеза рибосомных белков и рРНК у эукариотВ клетках высших организмов синтез компонентов рибосомы можно подразделить на два основных этапа:1) Транскрипция предшественников рРНК, их связывание с ри-босомными белками и процессинг с образованием "зрелых" рРНК, который происходит преимущественно в ядре.

2) Транскрипция и процессинг мРНК, специфичных для рибосомных белков, который также проходит в ядре с последующей их трансляцией на цитоплазматических полирибосомах.

Регуляция биосинтеза рибосомы может осуществляться на каждом из перечисленных выше этапов. Биосинтез рибосом в эукариотических клетках, как видно из перечисления отдельных его этапов, реализуется при постоянном транспорте отдельных компонентов рибосомы или их комплексов через ядерную мембрану: рибосомных белков из цитоплазмы в ядро, а мРНК и рибосомных субчастиц - из ядра в цитоплазму.

Совершенно очевидно, что биосинтез составляющих рибосомы компонентов (их количество для рибосом эукариот приближается к 80) должен быть скоординирован. В самом деле, перенос клеток дрожжей на богатую среду приводит к быстрой интенсификации транскрипции рРНК (в 2,5 раза) и к параллельному увеличению скорости синтеза рибосомных белков (v/arner et al., 1979). При голодании по азоту синтез РНК и рибосомных белков также снижается параллельно (v/arner et al.,1979). Принципиально сходные выводы были сделаны и на основании экспериментов с облучением клеток /Ф-светом, которое снижало синтез практически всех рибосомных белков в одинаковой степени, причем это снижение коррелировало со снижением эффективности транскрипции рРНК ( Warner et al., 1979). На основании этих экспериментов был сделан вывод о том, что синтез мРНК, специфичных для рибосомных белков, тесно сцеплен с синтезом или процессингом предшественников рибосомной РНК.

Процессию: предшественников pPIffi строго зависит от синтеза рибосомных белков; при изменении температуры выращивания клеток происходит параллельное снижение скорости процессинга рРНК и синтеза рибосомных белков (v/arner, udem, 1972).

Поскольку большая часть (если не все) гены рибосомных белков несцеплены (pried et al., I981) и, кроме того, имеются сведения о том, что единицы транскрипции и трансляции для них являются моноцистронными ( Gorenstein, Warner, 1977)з возникает вопрос о том, каким образом может осуществляться регуляция экспрессии десятков генов, разбросанных по геному. Одним из объяснений такой регуляции может быть существование общих деталей строения для всех генов рибосомных белков (например, на уровне их промоторов), либо существование общего механизма процессинга предшественников мРНК для рибосомных белков. Существует интересная гипотеза о том, что в координации синтеза рибосомных белков важную роль могут играть фрагменты предшественников рРНК, образующиеся в ходе ее процессинга ( Y/arner et al., 1979).

Важную роль для понимания механизма координации синтеза рибосомных белков играет работа, выполненная в лаборатории Ворнера ( Pearson et al.,I982). Ее авторы изменили дозу гена для одного из рибосомных белков большой субчастицы ( L3 ), введя в клетку дрожжей автономно реплицирующуюся плазмиду, содержащую ген этого белка - tcml. Содержащие 5-10 копий этой плазмиды клетки транскрибировали в 7,5 раз больше специфичной для белка L 3 мРНК. Эта мРНК содержалась в клетках, обладающих плазмидой, в количестве, в 3,5 раза превышающем ее содержание в контрольных клетках; однако, количество синтезирующегося в клетках с плазмидойбелка ЬЗ практически не отличалось от контроля. Зто позволило сделать вывод о том, что координация синтеза рибосомных белков в дрожжевых клетках поддерживается за счет модуляции эффективности трансляции и времени полужизни специфичных для рибосомных белков мРНК ( Pearson et al., 1982).

Генетический кодРасшифровка генетического кода является выдающимся вкладом в биологию, который можно сравнить с построением периодической системы элементов в химии. Первым крупным вкладом в расшифровку кода можно считать классические генетические работы с бактериофагом Т4, в которых Крик с соавторами показали, что каждой из 20 аминокислот соответствует в генетическом коде триплет нуклеотидов ( Crick et al., 1961).

Большой вклад в расшифровку кода был внесен работами Виттмана и Френкель-Конрата с сотрудниками, которые исследовали аминокислотные замены у спонтанных и индуцированных мутантов вируса тачачной мозаики (ВТМ). Эти исследователи, в частности, установили, что у одного мутанта в результате точечной мутации может быть замещена лишь одна аминокислота, что доказывало постулат о неперекрываемости генетического кода, т.е. то, что каждый нуклеотид входит в состав только одного кодона (правда, позднее было установлено, что у некоторых фагов имеет место исключение из этого правила). (См. главу "Точность рибосомного этапа белкового синтеза. Ошибки фазы считывания"). Построив схемы взаимоотношений между родственными кодонами для ряда аминокислот, Виттман и Френкель-Конрат положили основу к расшифровке кода. Однако, в 1961 г. Ниренберг сделал открытие, которое дало возможно с ть расшифровать код более быстрым и эффективным способом. Используя синтетические матрицы, построенные из одного типа нуклеотидов, Ниренберг установил, что кодоном для фенилаланина является триплет пии для лизина - AAA и для пролина - GCG (Nirenberg and Mattaei I961). Расшифровка остальных кодонов, содержащих более одного типа нуклеотидов, была проведена с использованием искусственных полирибонуклеотидов со случайной, а затем с определенной последовательностью нуклеотидов. Работа по расшифровке кода ускорилась после того, как было установлено, что рибосому можно запрограммировать не только полинуклеотидами, но и простыми тринуклеотидами, в результате чего она будет связывать только ту ашшоацил-тРНК, антикодон которой комплементарен добавленному триплету.

Окончательный результат работы по расшифровке генетического кода представлен в табл. 2. Генетический код обладает следующими закономерностями:1. Почти для кадцой аминокислоты (за исключением метионина и триптофана) в коде имеется по нескольку синонимов, т.е. код является вырожденным. Так, для трех аминокислот: аргинина, лейцина и серина имеется по шесть кодонов, для пяти: валина, пролина, треонина, аланина и глицина - по четыре кодона, одна аминокислота - изолейцин - имеет три кодона и девять - по два кодона.

2. Разные кодоны одной аминокислоты распределены по таблице не случайно. Кодоны-синонимы почти всегда находятся в одном и том же квадрате, т.е. отличаются между собой лишь последним из трех нуклеотидов.

3. Код содержит три кодона терминатора (uaa, uag jiUGA ).

Таблица 2.

Эти непонятные вначале данные о спектре узнавания кодонов разными тРНК нашли свое объяснение после опубликования работы Крика, в которой была выдвинута гипотеза неоднозначного соответствия ( v/obble -гипотеза) ( Crick 1966). Согласно этой гипотезе, при взаимодействии на рибосоме между мРНК и тРНК лишь два первых основания кодона образуют комплементарные пары с основаниями антикодона в соответствии с правилом Уотсона и Крика (А спаривается си a g с С, (Crick 1966). В то же время, при взаимодействии третьего основания кодона и антикодона из-за неоднозначности соответствия спаривание не подчиняется столь строгому правилу. В этом случае, согласно гипотезе Крика, неоднозначное соответствие допускает образование нестандартных пар оснований, например, между g и и i и и а также i и А. Таким образом, третье основание в антикодоне тРНК может узнавать целый спектр оснований в третьем положении кодона: третье основание кодона третье основание кодонаиа или gСgАUgи или Си > с ЕЛИ АГипотеза неоднозначного соответствия объясняет, почему кодоны-синонимы находятся в одном квадрате таблицы генетического кода.

Следует сказать, что в ряде случаев неоднозначность соответствия проявляется по отношению не к третьему, а к первому основанию кодона. Так, например, формилметионино-вая тРНК способна связываться не только с триплетом aug но и с кодоном для валина GUG и, кроме того, обладает слабым сродством к лейциновым кодонамиш и CUG.

ТОЧНОСТЬ БЕЛКОВОГО СИНТЕЗА И ЕЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕПрактически ни одна из реакций в живой клетке не может протекать с абсолютной точностью. Это справедливо, в частности, и для процесса биосинтеза белковых молекул, построенных из структурно сходных мономеров - аминокислот, различия между которыми иногда заключаются лишь в одной из функциональных групп (например, для валина и изолейцина). Ошибки при синтезе белка могут появляться в результате, по крайней мере, четырех стадий передачи генетической информации: синтеза мРНК, синтеза тРНК, реакции ферментативного аминоацилирования тРНК соответствующей аминокислотой и распознавания кодона на рибосоме. Две последние стадии относятся собственно к процессу белкового синтеза. Следует отметить, однако, что скорость накопления ошибочно синтезированных белковых молекул in vivo может быть ниже, чем рассчитанная путем суммирования частоты ошибок на каждой из стадий за счет существования этапов корректирования ошибок, а также за счет предпочтительного расщепления ошибочно синтезированных белков.

В работах Лофтфильда с соавторами (Loftfield 1963;Loftfieldj Yanderjagt, 1972) по определению суммарной частоты ошибочного включения валина вместо изолейцина в молекулу гемоглобина кролика эта величина была рассчитана равной 1:3000. Очевидно, что вероятность ошибок отдельных стадий белкового синтеза не может превышать этой рассчитанной величины. Если считать определенную Лофтфильдом с соавторами вероятность ошибок белкового синтеза в среднем справедливой и для других белков, то легко рассчитать, что одна из 12 синтезирующихся белковых молекул с длиной в 250 аминокислотных остатков содержит одну ошибочно включенную аминокислоту. Частота считывания нонсенс кодона как смыслового была определена равной 1:2000 ( Gorini, 1969). Частота ошибочного присоединения валинового остатка к молекуле тРНКиле, катализируемого изолейщш-тРНК-синтетазой, была определена равной 1:10 000 ( Hopfield and Yamane 1980). Примерно такой же уровень ошибок был рассчитан для реакции, катализируемой рнк-полимеразой (Hopfield and Yamane 1980). Таким образом, каддый из перечисленных выше этапов потенциально может вносить свой вклад в суммарную частоту ошибок.

Экспериментально определенный уровень ошибок белкового синтеза для разных белков как про- так и эукариотических клеток подтверждает вывод о том, что эта величина ко-3 -4леблется в пределах от 10 до 10. Так, Эдельман и Гал-лант ( Edelman, Gallant 1977), определив уровень включения S -цистеина в белок E.coli -флагелин, который в обычных условиях не содержит этой аминокислоты, рассчитали частоту ошибочного включения, равной 6 х Ю-^ на молекулу белка. Это соответствует частоте ошибок в пересчетена кодон с учетом всех возможных аминокислотных замен рав--4 -3ной 10 -10. Стрептомицин, повышающий частоту рибосомно-го этапа трансляции, стимулировал число ошибок примерно в 7 раз, из чего можно заключить, что включение цистеина обусловлено преимущественно ошибками кодон-антикодонового взаимодействия. Наиболее вероятно, что включение цистеина в данном случае происходит за счет использования аргинино-вых кодонов. Следует сказать, что в искусственных системах уровень ошибок синтеза белка может быть существенно выше. Так, при голодании мутантаrel"E.eoli по аминокислотам происходит образование неактивной термолабильной й-галактозидазы, в которой частота ошибок в расчете на аргининовый кодон превышает 1%, а в расчете на гистидиновый кодон - 10% (Hall and Gallant, 1972)для фактора элонгации эта величина найдена еще более высокой ( 20%)(larker et а1*» 1978). Столь высокий уровень ошибок белкового синтеза обнаруживается лишь в отсутствии одной из аминоацил-тРНК и, по-видимому, обусловлен использованием ашшоацил-тРНК, не соответствующей кодону. Таким образом, в отсутствии одной из аминоацил-тРНК частота ошибок на рибосомном этапе трансляции увеличивается на 2-3 порядка.а) Уровень ошибок в реакции аминоацилированияПоскольку точность рибосомного этапа трансляции определяется преимущественно кодон-антикодоновым взаимодействием, то очевидно, что ошибка аминоацилирования, т.е. присоединение к тРНК не специфичной для нее аминокислоты (мисацили-рование) неизбежно повлечет за собой появление ошибочной аминокислоты в синтезирующейся белковой молекуле. Поэтому часто реакцию аминоацилирования тРНК соответствующей аминокислотой, катализируемую аминоацил-тРНК-синтетазами, называют ключевой реакцией белкового синтеза.

Появление ошибок в реакции аминоацилирования может произойти в результате распознавания ферментом чужеродной аминокислоты или чужеродной тРНК. Примером ошибочной реакции может служить активация валина, катализируемая изолей-ЦПЛ-тРЖ-СИНтетазой ИЗ.b.coli (Baldv/in and Berg,L966).

Очевидно, что корректирование ошибочно активированной аминокислоты необходимо лишь для структурно близких аминокислот (валин-изолейцин или треонин-валин). Для структурно более далеких аналогов вероятность ошибочного распознавания столь низка, что она не гложет влиять на точность трансляции. Так, частота ошибочного распознавания о^-аминомасляной кислоты цистеинил-тРНК-синтетазой из ^«coli рассчи—6тана равной 2,9 х 10 что примерно на два порядка шике,чем частота ошибок белкового синтеза ( Y&rus, 1979).

Распознавание другого субстрата - тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами потенциально может быть существенно более точным, т.к. в этом случае в акте распознавания могут участвовать значительные по длине последовательности нуклеотидов (тРНК) и аминокислот (фермент). Кроме того, в распознавании определенную роль может играть и пространственная структура тРНК. Тем не менее, уже в ранних экспериментах была обнаружена способность к распознаванию аминоацил-тРНК-син-тетазами чужеродных тРНК. Особенно высокий уровень ошибок наблюдался в гетерологичной системе in vi^1'0 когда тРНКи фермент выделялись из разных организмов, например, дрож/жей и Ь.coli ( Ludock et al., 1971; Gie£e et al-t 1971).

Реакция агш-шоацилирования в таких системах протекает наибо2 +лее эффективно при высоком отношении концентраций /АТР или в присутствии органических растворителей. Б ряде случаев Kj для таких гетерологичных систем имеет низкое значение, приближаясь к К^. для гомологичной системы, а значение vmax> хотя и не достигает vmax. для гомологичной системы, но приближается к ней по значению ( Roe et а1*» 1973). В гомологичной системе (тРНК и фермент из одного организма) при определенных условиях также может происходить распознавание аминоацил-тРНК-синтетазой чужеродной тРНК. Так, комплексы, содержащие неспецифическую тРНК, были получены для глютамил-тРЖ-синтетазы из ^.coli (Lapointe and Soil,1973) и других ферментов. Константы связывания неспецифических тРНК в ряде случаев приближались к значениям констант для образования корректных комплексов (Yarus, 1979). Кажущееся противоречие между высокой точностью реакции аминоацилирования и способностью к образованию таких неспецифических комплексов может объясняться следующим образом. Образование комплексов между аминоацил-тРШ\-синтетазой и неспецифической тРНК in vitro обычно происходит в искусственных условиях, а именно, в отсутствии гомологичной тРНК, соответствующей ферменту по специфичности. Присутствие соответствующей тРНК резко снижает вероятность образования ошибочного комплекса, т.к. гомологичная тРНК конкурирует с чужеродной за участок связывания на молекуле фермента (Yarus 1972). Известно много примеров того, что ошибочное ацилирование обнаруживается в том случае, когда проводится инкубация очищенной агжноацил-тРНК-синтетазы с неспецифической тРНК в отсутствии специфической тРНК. В присутствии же смеси тРНК или же при проведении реакции в менее очищенной системе ошибочное ацилирование не регистрируется (Ebel 1973).

Начало работ Горини относится к 1961 году, когда ему удалось выделить класс мутантов E.coli условно зависимых от стрептомицина ( CSD -мутанты) (liorini et al., 1961; Gorini andKataja 1964). Для одного из таких мутантов, являющихся ауксотрофами по аргинину, было установлено, что метки приобретают способность к росту, если вместо этой аминокислоты в среде содержится стрептомицин. Кроме того, оказалось, что в экстрактах мутантных клеток в присутствии стрептомицина появляются некоторые ферменты, которые не обнаруживаются в отсутствии антибиотика. Горини предположил, что эффект стрептомицина, названный фенотипической супрессией, объясняется тем, что в его присутствии повышается уровень ошибок рибосомного этапа белкового синтеза. Это предположение было подтверждено экспериментами по определению ошибок трансляции в бесклеточной системе ( Davies et al., 1964).

Мутации в локусе str А, повышающие чувствительность клеток к стрептомицину, снижают как уровень ошибок трансляции, так и способность к фенотипической супрессии (Gorini 1974). В дальнейших исследованиях было установлено, что эти свойства обусловлены мутационным изменением белка s12 малой 30 S субчастицы рибосомы. Были обнаружены также мутанты по другому рибосомному белку малой субчастицы -s4, которые повышают уровень неоднозначности трансляции merman et al., 1971). Эти мутанты были названы r;^ (сокращение от ribosomal ambiguity ). Поскольку ram -мутации и присутствие стрептомицина обладают на клетки сходнымэффектом, было сделано заключение о том, что антибиотик оказывает прямой эффект на рибосому.

Принципиальный вывод из работ Горини заключается в установлении им важной роли рибосомы в селекции тРНК в ходе трансляции. Эти работы Горини вместе с наблюдением Хир-ша ( Hirsh I97X), который установил, что триптофановая тРНК в результате мутации noD -стеблю изменяет свою кодо-новую специфичность и приобретает способность "осмыслять" нонсенс-кодон позволили предположить, что рибосомане просто влияет на кодон-антикодоновое взаимодействие, но обладает способностью к специфическому распознаванию участков тРНК, локализованных вне антикодона.

Б результате этих исследований] возникло некое противоречие между двумя группами экспериментальных фактов. С одной стороны, в выборе аминоацил-тРНК на рибосоме главную роль должны выполнять кодон-антикодоновые взаимодействия; вместе с тем рибосома каким-то образом модулирует селекцию тРНК, взаимодействуя с теми участками ее молекулы, которые не входят в состав антикодона. Для разрешения этого кажущегося противоречия Горини постулировал существование в рибосоме некого молекулярного "сита" ( ribosomal screen ) ? которое позволяет тРНК связываться с рибосомой, но может в определенных случаях препятствовать достижению тРНК того сайта, где осуществляется кодон-антикодоновое взаимодействие. Участие той или иной тРНК в процессе трансляции в этом случае может зависеть не только от ее антикодоновой специфичности, но также и от структурных особенностей иных участков молекулы, что создает дополнительный механизм дискриминации тРНК (Gorini 1971). Следует сказать, однако, что молекулярный механизм такой селекции оставался неизвестным.

Позднее появилось несколько работ, в которых была сделана попытка конкретизировать и более детально охарактеризовать процесс селекции и дискриминации тРНК в рибосоме. Заслуживает внимания кинетическая модель селекции тРНК, предложенная Нинио ( Ninio >1974). Согласно этой модели, процесс селекции аминоацил-тРНК проходит в два этапа: на первом этапе образуется непрочный комплекс между рибосомой и аминоацил-тРНК, а на втором - более прочная ассоциация и образование пептидной связи. Время перехода из первого состояния во второе является, согласно модели Нинио, переменной характеристикой, которая различается для рибосом мутантов разных классов, описанных Горини. Так, мутационные изменения рибосом, которые снижают время перехода, приводят к увеличению частоты ошибок трансляции, а изменения рибосом, увеличивающие это время, наоборот, уменьшают рибосомную неоднозначность. Другими словами, не нашедшее своего конкретного структурного воплощения "молекулярное сито" Горини было заменено фактически временным понятием - временем перехода.

Наряду с кинетической теорией Нинио следует упомянуть гипотезу конформационной селекции, согласно которой молекула тРНК может находиться в нескольких конформатдионных состояниях, различающихся по способности к образованию специфического комплекса с кодоном ( Kurland et al., 1975; kurland 1979). Кодон-антикодоновое взаимодействие способно вызывать конформационное изменение молекулы тРНК в ее участках, отдаленных от антикодона. Возможно, (хотя этот факт нельзя считать доказанным), что такие структурные изменения тРНК, в свою очередь, могут влиять на кодоновую специфичность тРНК, связанной с рибосомой. Кинетическая теория и гипотеза конформационной селекции не исключают взаимно друг друга; кон-формационные изменения тРНК в ходе ее связывания с антико-доном, вероятно, играют определенную роль в процессе кинетической селекции.

Интересные данные были получены Томпсоном с сотрудниками ( Thompson ana Stone 1977;Thompson et 1981), который выдвинул гипотезу о существовании этапа корректирования ошибок на рибосомном этапе белкового синтеза, который осуществляется с участием zf-tu и g-tp. Корректирование, согласно гипотезе Томпсона, осуществляется непосредственно после связывания аминоацил-тРНК с запрограммированной мРНК рибосомой до транспептидации и протекает с образованием промежуточного комплекса ашноащл-тРНК- iF-Tu-GTP. Селекция комплекса рибосомой осуществляется за счет образования комплементарных пар оснований между кодоном мРНК и антикодоном тРНК. При связывании с антикодоном соответствующей амино-ацил-тРНК происходит гидролиз лишь одной молекулы gtp с последующим включением аминокислоты в синтезирующуюся полипептидную цепь. В том же случае, если с антикодоном связывается несоответствующая ему аминоацил-тРНК, происходит стимуляция g-тр -азной активности, и такая аминоацил-тРНК отвергается, что сопровождается гидролизом дополнительной молекулы gtp. Следует, однако, сказать, что данные Томпсона были получены в системе in vitro не содержащей одного из факторов элонгации - bF-G и запрограммированной неприродной матрицей - поли- и. Поэтому вопрос о существовании и роли такого этапа корректирования in vivo следует считать открытым. В целом следует подчеркнуть, что преобладающая часть данных но неоднозначности трансляции была получена в экспериментах in vitro. Скорость же элонгации в бесклеточных системах даже после тщательной оптимизации условий не превышает 0,05 пептидных связей в секунду в расчете на рибосому, в то время как соответствующее значение для условий in vivo достигает 10-20 ( Kurland 1932). Вполне очевидно, что при различии в скорости процесса в 200-400 раз лимитирующие скорость этапы могут различаться in vivo и vitro. В последнее время разработаны бесклеточные системы поли-и -зависимого синтеза полшоенилаланпна, скорость образования пептидных связей в которых сопоставима с существующей in vivo ( Kurland, 1982), однако, они еще не использовались для детальной характеристики механизма трансляции и, в частности, для определения уровня ошибок.

Интересные данные были по вкладу факторов элонгации в определении точности трансляции были получены при сравнении уровня ошибок в системе обычной и бесфакторном трансляции ( Gavrilova et al., 1980). Было установлено, что рибосомы Е. col1 в присутствии матрицы поли- и обладают в 10-30 раз более высокой скоростью синтеза полифенилалаьшна по сравнению со скоростью полилейцина. Присутствие факторов элонгации существенно не влияет на уровень неоднозначности в такойт. 2+бесклеточной системе при концентрациях свыше 10 мМ.

Добавление к бесфакторной системе фактора элонгациии или ee-g симулирует скорость образования полифенилаланина и полилейцина в одинаковой степени. При низких же кон-2+центрациях &Е (менее 10 mil) в бесклеточной системе белкового синтеза, содержащей , синтез полилейцина происходит с существенно более низкой скоростью. Авторы, однако, не смогли сделать заключения о том, обусловлено ли такое изменение в дискриминационной способности присутствием фактора элонгации или же только пониженной концентрацией . Показательно, что предварительная обработкарибосом р-хлормеркурийбензоатом, которая стимулирует бесфакторную трансляцию на поли- и матрице (Gavrilova et al., I971), существенно повышает точность трансляции. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что уровень неоднозначности трансляции определяется структурными компонентами самой рибосомы.в) Изучение неоднозначности трансляции Неоднозначность трансляции может реализоваться в виде следующих типов ошибок:а) Переосмысление значащих кодонов, в результате которого происходит одиночная аминокислотная замена (кодон мРНК спаривается с антикодоном не соответствующей данному кодону аминокислоты). В принципе в результате переосмысления значащий кодон может считываться рибосомой и фактором терминации как бессмысленный, что приводит к появлению фрагмента полипептида.б) Распознавание нонсенс-кодона как значащего (ошибки терминации). В результате таких ошибок происходит удлинение синтезирующегося полипептида и образование "сквозного"( read-through ) белка.в) Ошибки фазы считывания мРНК, при которых считываются не триплеты, а дуплеты или квадриплеты оснований.

Ошибки трансляции могут возникать как в результате естественного свойства аппарата белкового синтеза к неоднозначности "прочтения" информации, так и в результате мутационных изменений некоторых компонентов трансляции (тРНК, рибосомных белков и т.д.).

Естественный уровень неоднозначности не является минимаяьно возможным, т.к. известны мутанты b.coli ) устойчивые к аминогликозидным антибиотикам, для которых уровень неоднозначности трансляции ниже, чем у природных штаммов ( Gorini> 1974). Этот факт может свидетельствовать о биологическом значении определенного уровня ошибок трансляции; видимо, в ходе эволюции был выработан оптимальный, но не наименьший уровень неоднозначности работы аппарата трансляции. Это заключение может быть справедливо как для переосмысления значащих кодонов, так и для распознавания нонсенс-кодонов как смысловых.

Переосмысление значащих кодоновО значении для клеточной физиологии переосмысления значащих кодонов известно относительно мало. Очевидно, что повышение неоднозначности трансляции может иметь приспособительное значение при некоторых экстремальных условиях. Так, адаптивное изменение какого-либо взятого в отдельности бежа или нескольких белков может быть достигнуто мутационным путем, однако, совершенно очевидно, что таким способом невозможно достигнуть изменения большого количества клеточных белков, что может быть необходимым при изменении условий среды. Этот результат может быть достигнут при повышении неоднозначности трансляции. Проведенные недавно эксперименты показали, что неоднозначность трансляции может иметь большее адаптивное значение, чем мутационный процесс для популяции гаплоидных организмов при периодических изменениях условий окружающей среды (Бачинский, 1981).

Ошибки трансляции (прежде всего, переосмысление значащих кодонов) могут выражаться в поливариантности белкового синтеза. В результате в клетке под контролем одного гена образуется группа родственных белков, что расширяет возможности приспособления организма к меняющимся условиям среды. Существует предположение о том, что поливариантность может выполнять определенную роль и в процессах дифференцировки (Инге-Вечтомов и др., 1971).

С другой стороны, превышение некого уровня неоднозначности может иметь для клетки негативные последствия. В самом деле, при увеличении общей частоты ошибок трансляции число аминокислотных замен возрастает и в тех белках, которые входят в состав аппарата белкового синтеза, что, в свою очередь, может повлечь новое возрастание уровня неоднозначности. Благодаря такой положительной обратной связи в конечном счете клетка может потерять жизнеспособность. Оргел предположил, что такая "катастрофа ошибок" служит причиной старения фиб-робластов в культуре ( Orgei 1970; orgei 1973). Следует признать, что экспериментальных данных, подтверждающих гипотезу Оргела, пока недостаточно. Правда имеется много данных о том, что синтез белка в "старых" клетках обладает повышенной термолабильностью и другими измененными свойствами, а синтезированные в таких клетках белки обладают высокой скоростью распада ( Goldstein and Singal l974;Linn et al., 1976; Shakespeare and Buchaman 1976).

В последние годы, главным образом, благодаря развитию метода электрофореза в полиакриламидном в сочетании с электрофокусировкой, позволяющего разделять практически все белки клетки с высоким разрешением ( О»Parrel, 1975) стало возможным систематическое исследование ошибок белкового синтеза in vivo. о'фаррел, а затем Паркер с сотрудниками нашли, что при голодании клеток бактерий (E.coli ), а также культуры клеток яичников китайского хомячка и L-клеток мыши по некоторым аминокислотам происходит стимулирование ошибок трансляции. Б результате в клетках накапливаются содержащие аминокислотные замены белки с измененным зарядом, которые легко идентифицируются на двумерной электрофореграмме. Направление смещения бежа, содержащего аминокислотную замену, может быть предсказано, исходя из природы кодона и,в частности, из его третьего нуклеотида (табл. 3)( O'Parell, 1975; Parker 1978).

Таблица 3.

Аминокислотные замены, предсказанные на основании ошибочного "считывания" третьего нуклеотида кодонаАминокислота : Заряд Кодон: Ошибочное : прочитыва-: ние кодона: • Ошибочно включенная аминокислота :Заряд оши-:бочно включенной амп-:нокислотыГистидин основной CAU GAG GAA СА'- глютамин нейтральныйАспарагин нейтральный AAU ААС AAA AAG ААА лизин основнойЛейцин нейтральный С ии 0U С С UA CUG СиА лейцин нейтральныйИз генетического кода следует, что ошибочное "прочтение" третьего нуклеотида гистидиновых кодонов может привести к включению глютамина вместо гистидина, в результате чего заряд белковой молекулы сместится в более кислую область.

Аналогично этому ошибки при спаривании с третьим положением кодонов аспарагина могут сопровождаться аминокислотной заменой аспарагин —лизин, в результате чего белок приобретает более основные свойства. Вместе с тем, ошибочное "прочтение" третьего положения лейциновых кодонов в силу вырожденности кода не приведут к аминокислотным заменам и изменению заряда белковой молекулы.

Образование аномальных белков с измененным зарядом> действительно было обнаружено методом разделения по 0 Фарелу. Так, при голодании по гистидину в клетках -ь'.сои накапливаются факторы элонгации белкового синтеза ET-TU и EF-G с более кислыми свойствами по сравнению с исходными белками, а в культуре клеток яичников китайского хомяка образование белковых продуктов с более кислыми свойствами доказано для актина. Авторы объясняют эти результаты тем, что в условиях голодания по гистидину возрастает конкуренция между ацили-рованными гистидиновыми тРНК, концентрация которых резко снижается, и ацилированными глзотаминовыми тРНК при связывании с гистидиновыми кодонами САи и САС ( barker et al., 1980; Parker and Friesen 1980).

В более поздних работах Паркер с соавторами показали, что голодание по аспарагину клеток E.coli приводит к появлению ошибок трансляции и изменению заряда в молекуле фактора элонгации ef-Iu (повышение его основности) и белка оболочки фага , что согласуется с заменой аспарагинана лизин (см. табл. I). Количество ошибок в этом случае было расчитано равным 0,12 в расчете на аспарагиновый кодон для ^F-iu и 0,3 для белка оболочки tiS2. Данные Паркерас соавторами подтверждают выдвинутую ранее Лагерквистом гипотезу ( ^agerkvist, 1978), ( ou"t three "со don reading)согласно которой кодон-антикодоновое взаимодействие определяется специфичностью спаривания лишь двух нуклеотидов, а третья "буква" кодона играет даже еще меньшую роль, чем это следует из "вобл"гипотезы Крика ( Crick 1966). Тем не менее, природа третьей "буквы" кодона небезразлична для кодон-антикодонового взаимодействия, поскольку, например, голодание по глютамину или серину практически не приводит к появлению белков с аминокислотными заменами.

Таким образом, ошибки трансляции, связанные с неправильным "прочтением" по третьему положению кодона, видимо, происходят не ТОЛЬКО in Vitro ( Elias et al.,1979; Goldman et a5e79), но и in vivo. Интересно, что белки, содержащие такие аминокислотные замены (лизин вместо аспарагина или глютамин вместо гистидина), не подвергаются преимущественному протеолитическому расщеплению, а рибосомные белки с заменами такого рода способны включаться в состав рибосомы (£arker » 1981). По-видимому, белки, содержащие ограниченное количество замен такого рода, не распознаются клеткой как аномальные и не подвергаются быстрому гидролизу протеазами.

Распознавание нонсенс-кодонов как смысловыхВ последние годы в литературе появляются данные, дающие основание полагать, что другой тип неоднозначности трансляции, а именно, распознавание нонсенс-кодонов как смысловых, также может выполнять определенную физиологическую функцию. Первым указанием на важную роль такой неоднозначности стала работа по изучению морфогенеза фага Qj5 • Сигнал терминации гена, кодирующего белок оболочки этого вируса, с эффективностью около 3% считывается как значащий триплет; в результате синтезируется "сквозной" белок (read-throughprotein ) ? который,включаясь в оболочку вируса, обеспечивает его пнфекционность ( Hofstetter et al., 1974; V/einer and v/eber 1973). Молекулярная масса такого белка больше массы белка оболочки на 22 ООО, что соответствует примерно 600 нук-леотидам мРНК. Примечательно, что межгенный промежуток с длиной 600 нуклеотидов не содержит в фазе считывания ни одного терминирующего кодона, хотя при случайном распределении один нонсенс кодон приходится на каждые 60 нуклеотидов ( foin Jou et al., 1972). Совершенно очевидно, что фаза считывания со столь значительной длиной должна иметь определенную функциональную нагрузку. И в самом деле, при удалении "сквозного" белка из капсиды инфекционные свойства фага теряются ( Hofstetter et al., 1974)."Сквозные" белки были обнаружены также в бесклеточных системах белкового синтеза, направляемых РНК опухолевых вирусов ( PMlipson et al., 1978), вируса табачной мозаики (Pelham 1978) и фага (Yates et al., 1977). Трансляция нонсенс-кодонов, с некоторой частотой необходима также для развития некоторых нитевидных фагов £2 и щз, в мутантах E.coli с пониженной эффективностью супрессии и, следовательно, с более высокой эффективностью терминации, развития этих фагов не происходило, что может быть связано с отсутствием "сквозных" белков ( Engelberg-Kulka, 1979;.

Из перечисленных выше вирусов наиболее тщательно изучен механизм образования "сквозного" белка для вируса лейкемии ( ). В этом случае обратная транскриптаза (РНК-зависимая ДНК-полимераза) является продуктом ошибочного считывания амбер-кодона. Такое считывание нонсенс-триплета происходит за счет обычной клеточной тРНК, но значительно стимулируется в присутствии амбер-супрессорной тРНК(Ryoji et al., 1983).

Природа аминокислоты, вводимой в ответ на определенный нонсенс-триплет, может различаться для разных организмов, а также в зависимости от природы матрицы. Так, в клетках b.coli триплет "считывается" как триптофан, в то время, как в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика этот же триплет в составе РНК вируса мозаики альфаальфа -как глютамин. С другой стороны, этот же нонсенс-триплет может транслироваться как серии за счет особого изоакцептор-ного типа тРНК, присутствующей в печени быка e"t al.» 1983).

Следует отметить, что помимо описанного механизма распознавания нонсенс-триплета за счет обычных клеточных тРНК, являющихся фактически нонсенс-супрессорами с низкой эффективностью, существует и другая возможность трансляции нонсенс-кодонов. Она реализуется в том случае, если рибосома вблизи от кодона-терминатора изменяет рамку считывания, в результате чего распознавания нонсенс-кодона как бессмысленного не происходит. В этом случае -конец синтезирующегося полипептида представлен нормальным продуктом гена, а С-конец обладает совершенно иной аминокислотной последовательностью, образующейся за счет "прочтения" матрицы в новой рамке. Существует предположение о том, что такой сдвиг рамки считывания является довольно частым явлением, и что в результате него может обеспечиваться образование физиологически важных полипептидов. Вполне вероятно, что этот механизм реализуется при синтезе обратной транскриптазы вируса саркомы птиц ( ). В этом случае рибосома, возможно, меняет рамку считывания между генами £а£ и Ро1 которые расположены не в фазе считывания, так что механизм ошибочногосчитывания нонсенс-кодона за счет тРНК с потенциальной суп-рессорной активностью не может реализоваться e-t а1»>1983).

Хотя в настоящее время доказательства физиологического значения "прочтения" нонсенс-кодона как смыслового с образованием "сквозного" белка получены лишь для вирусов, есть все основания полагать, что этот механизм реализуется и в клетках про- и эукариот с целью обеспечения синтеза некоторых белков. Таким образом, строго говоря, трансляция триплетов-терминаторов в ряде случаев не является ошибкой, поскольку она обеспечивает образование биологически важных белков. Для предотвращения такого механизма и обеспечения высокоэффективной терминации может быть использовано тан-демное расположение нонсенс-кодонов; кроме того, эффективность терминации существенно зависит от контекста, в котором располагается нонсенс-триплет.

Таким образом,естественные эффективные терминаторы генов - это нонсенс-кодоны, расположенные в таком нуклеотид-ном окружении, которое способствует терминации и препятствует их "прочтению" супрессорной тРНК (Тер-Аванесян, Сойдла, 1981). Важная роль контекста (нуклеотидного окружения нонсенс-триплетов) в эффективности супрессии доказана с использованием различных методических приемов и мутационных систем (Fluck et al., 1977).

Ошибки сЬазы трансляцииВ последние годы появляются данные о том, что неоднозначность такого типа также в ряде случаев выполняет важную физиологическую функцию. Так, у РНК-содержащего фага ViS2 ген, контролирующий белок лизиса, частично перекрывается с предшествующим ему геном, кодирующим белок оболочки вируса.

Оказалось, что для экспрессии "гена лизиса" необходим сдвиг "рамки считывания" в области гена белка оболочки. Рибосомы, совершившие такой сдвиг считывания, заканчивают трансляцию на нонсенс-кодоне, предшествующем "гену лизиса" и после ре-инициации синтезируют белок лизиса ( Kastelein et al., 1982). Использование ошибок трансляции при экспрессии фагового генома, видимо, служит целям экономичности, поскольку при этом обеспечивается наибольшее количество информации при минимальных размерах генома матрицы.

Механизм смены рамки считывания при трансляции мРНК гена ij-j-B бактериофага Т4 был исследован Вейсом и Галлан-том (Weiss and Gallant 1983). Зти исследователи установили, что при недостатке триптофана смена раджи считывания происходит на кодоне UGG расположенный в положении 94-96; этот кодон распознается за счет лейциновой тРНК, которая в обычных условиях транслирует кодон UUG. Кстати, именно эта тРНК с высокой частотой распознает фенилаланиновый триплет иии. Распознавание кодона триптофана UGG лейциновой тРНК (UUG) предполагает ошибочное спаривание между двумя пуринами, расположенными во втором положении. Одной из возможностей смены рамки считывания в этом случае, по мнению авторов, является изменение пространственной структуры А-сай-та рибосомы в результате ошибочного связывания лейциновой тРНК в ответ на кодон триптофана. В результате такого кон-формационного изменения рибосомного А-сайта. тРНК, следующая за лейциновой тРНК, считывает триплет со сдвигом рамки. Кроме того, авторы предполагают, что как и в случае трансляции нонсенс-кодонов, при изменении рамки считывания важную роль играет контекст, в котором располагается данный кодон (weiss and Gallant 1983).генетические подхода к изучешж) трансляцииВ исследовании механизма трансляции важную роль сыграло выделение и характеристика мутантов с измененными компонентами белок-синтезирующего аппарата. Поскольку трансляция является важнейшей функцией клетки, мутанты по аппарату трансляции часто являются нежизнеспособными. В связи с этим для изучения аппарата трансляции часто используются условно-летальные мутанты, мутанты с измененной чувствительностью к антибиотикам, а также мутанты с неполным проявлением ( leaky ). Важным классом мутантов по аппарату трансляции являются информационные супрессоры (см. следующий раздел), среди которых можно выделить мутанты по тРНК и мутанты по рибосомным белкам.

Наиболее часто информационная супрессия реализуется за счет изменения тРНК. Такие супрессоры могут подавлять нонсенс и миссенс мутации, а также мутации типа сдвига рамки считывания.а) Определение супрессии. Различные виды супрессииСупрессорной мутацией называется такая мутация, которая локализована в ином участке генома, чем первичная мутация и которая восстанавливает фенотип дикого типа, несмотря на присутствие первичной мутации. Восстановление фенотипа дикого типа при этом может носить как полный, так и частичный характер. В случае, когда супрессорная мутация локализуется в том же гене, что и первичная мутация, супрессия носит название внутригенной. В том же случае, если супрессорная и первичная мутация локализуются в разных генах, супрессия называется межгенной, а ген, содержащий супрессорнуюмутацию - геном-супрессором. Последний тип супрессии, в свою очередь, подразделяется на функциональную и информационную. Функциональные супрессоры действуют, как правило, на все мутантные аллели данного локуса. В противоположность этому, информационные супрессоры^для которых супрессия обусловлена мутационным изменением одного из компонентов аппарата трансляции, обладают аллельной специфичностью и эффективностью только по отношению к определенным аллелям данного локуса, но не обладают генной специфичностью, действуя на различные мутантные гены. Одним из наиболее распространенных типов являются супрессоры, специфичные к нонсенс-кодонам ( Uaa uag и uga ).

Следует выделить еще один тип супрессии - фенотипическую, которая не связана с изменениями генотипа клетки, аобусловлена изменениями внешней среды, например, повышениемосмотической силы, наличием антибиотиков (стрептомицина, омпаромйцина и т.п.) в среде выращивания.б) Супрессия за счет тРНК у прокариотНонсенс-супрессорные тРНК, как правило, содержат нук-леотидную замену в антикодоне, в результате чего они приобретают способность спариваться с одним из кодонов-термина-торов, расположенных во внутренней части гена. Некоторые сведения о ионсенс-супрессорах E.coli представлены в таблице 4.

Из приведенной таблицы следует, что в результате нонсенс-супрессии, обусловленной мутациями по тРНК, терминирующий кодон может стать триплетом для шести разных аминокислот (серина, шпотамина, тирозина, лейцина, триптофана и лизина). В результате супрессии такого типа возможно получить как исходный белок дикого типа, так и варианты новых белков, отличающихся от исходного лишь одной аминокислотной заменой. "Осмысление" нонсенс-кодона само по себе еще не обеспечивает восстановления исходной активности белка. Во-первых, введенный в результате супрессии аминокислотный остаток должен быть совместим с белковой структурой; кроме того, эффективность супрессии должна быть достаточно высокой, чтобы обеспечить потребности клетки в супрессируемом полипептиде.

Эффективность супрессии нонсенс-кодонов колеблется в широких пределах. Амбер и опал-супрессоры обычно обладают высокой (более 30%), а охр-супрессоры - низкой (менее Ъ%) эффективно с тыо.

Нуклеотидное окружение (контекст) нонсенс-кодона оказывает влияние на эффективность супрессии. К такому выводу пришли исследователи, работающие с разными мутационными системами при определении эффективности супрессии одного и того же супрессора на одном и том же нонсенс-кодоне, но расположенном в разном "контексте" ( Salser 1969; Elucit et al., 1977). Так, эффективность супрессии амбер-кодона UAG зависит от его положения в гене 1ас1 что связано с эффектом контекста, т.е. нуклеотидного окружения нонсенс-кодона (Bossi 1983). Разные супрессорные тРНК различаются по чувствительности к нуклеотидному окружению нонсенс-кодона. Так, в наибольшей степени эффективность супрессии зависит от контекста, в котором расположен нонсенс-кодон для амбер-супрес-сора supE ( su2 ); в этом случае наблюдаются почти 20-кратные изменения эффективности. Наибольшее влияние на эффективность супрессии оказывает нуклеотидная последовательность, расположенная по направлению к з'-концу от амбер-кодона, причем в этой последовательности наиболее существенную роль играет основание, непосредственно прилегающее к нонсенс-ко-дону. В том случае, если в этом положении находится пурин, супрессия амбер-кодона осуществляется более эффективно, чем в случае расположения в этом положении пиримидина. Возможно, что влияние контекста на эффективность супрессии обусловлено участием в распознавании нонсенс-кодонов компонентов аппарата терминации белкового синтеза ( Bossi 1983).

К сходным выводам относительно влияния контекста на эффективность супрессии амбер-кодонов в гене J3 -галактози-дазы пришли Миллер и Альбертини (Miller and Albertini 1983). Зти авторы также отметили важную роль нуклеотидной последовательности, расположенной по направлению к 3'-концу отнонсенс-кодона и, прежде всего, ближайшего к нонсенс-триплету основания. Одной из причин влияния контекста на эффективность супрессии, по мнению авторов, может быть образование специфической вторичной структуры мРНК вблизи от нонсенс-кодона. Образование шпильки в районе нонсенс-кодона может, в частности, влиять на взаимодействие факторов терминации с нонсенс-кодоном и таким образом регулировать эффективность связывания супрессорной тРНК с нонсенс-триплетом (Miller and Albertini 1983).в) Супрессия нонсенс-кодонов за счет тРНК у эукариотНонсенс супрессорные мутанты, действующие за счет изменения тРНК, выделены и охарактеризованы для дрожжей Saccharomyces cerevisiae ( Hawthorn and Leupold 1974; Olson et al., 1980; Piper 1980) иSchizosaccharomyces pombe ( Kohli et al., 1980), дрозофилы Drosophila melanoga-ster и других эукариотических организмов (Steege and Soil, 1979) и т.п. Наиболее детально этот тип супрессии исследован у дрожжей. Для характеристики опосредованной тРНК супрессии у дрожжей обычно используются бесклеточные системы белкового синтеза, в которые вводятся супрессорные тРНК и тРНК дикого типа; информативным оказывается также определение первичной структуры супрессорных тРНК или их генов. При использовании этих подходов для изучения механизма супрессии нонсенс-кодонов у дрожжей было установлено, что также как и в случае прокариот (см. стр. ), супрессорная активность появляется в результате нуклеотидных замен в ан-тикодоне тРНК (табл. 5).

Для столь сложно организованной органеллы, какой является рибосома, генетический подход является особенно эффективным в получении информации относительно роли отдельных компонентов, механизма их сборки и регуляции синтеза.

При получении и анализе мутантов по рибосомным компонентам обычно преследуется две цели. Во-первых, анализ мутантов позволяет локализовать гены на хромосомах, а также выявить регуляторные элементы, участвующие в их экспрессии. В ряде случаев при использовании методов электрофореза с высоким разрешением удается также установить соответствие между геном и его белковым продуктом. Во-вторых, такой подход часто позволяет получить ценную информацию о структуре и функциях компонентов рибосомы. Так, например, при анализе рибосомных мутантов были получены данные о роле индивидуальных рибосомных белков в биогенезе этой органеллы,а также об их взаимодействии с другими рибосомными белками и рРНК. Кроме того, с помощью такого подхода была выяснена функция отдельных компонентов рибосомы в цикле трансляции, а также механизм действия многих ингибиторов.

Информация о рибосомных мутантах содержится также и в других главах настоящего обзора (например, в главе "Точность рибосомного этапа белкового синтеза", "Организация митохонд-риального генома").г) Рибосомные мутанты прокариот с измененной точностью трансляцииДля получения мутантов с измененной точностью трансляции часто используется отбор штаммов с повышенной или пониженной чувствительностью к аминогликозидным антибиотикам. Такой подход оказывается эффективным в связи с тем, что как правило, наблюдается корреляция между чувствительностью к аминогликозидам и измененным уровнем точности трансляции (табл. 6): мутации, повышающие устойчивость к антибиотику, увеличивают точность трансляции и напротив: мутации, приводящие к увеличению рибосомной неоднозначности, одновременно придают клеткам повышенную чувствительность к аминогликозидам (Piepersterg et al., 1980).

Среди мутантов с пониженной рибосомной неоднозначностью наиболее хорошо изучены устойчивые к стрептомицину штаммы E.coli с измененным белком S12 ( Gorini 1973). Как видно из табл. 5, пониженный уровень неоднозначности свойственен как устойчивым, так и зависимым от стрептомицина мутантам по этому белку. Степень снижения неоднозначности у разных мутантов существенно различается в зависимости от типа аминокислотных замен в белке S12Рибосомные мутации, влияющие на чувствительность к аминогликозидным антибиотикам и на точность трансляцииMyт ан тныйАмин огли-белок : козидФенотипУровень :Название ошибоктрансляции;мутацииS12 S12S 4S 5 S17 ЪбRDстрептомицин устойчивость понижен-"- зависимость -"-"- гиперчувстви- увеличентельностьнеамин гентамицинустойчивость понижен устойчивость -"str str ramram spc neaR - устойчивость D - зависимостьДругим рибосомным белком, мутации по которому снижают уровень неоднозначности, является белок S17 ; одновременно мутантные клетки приобретают устойчивость к неамину (Boiien et al., 1975).

Интересные данные были получены при исследовании механизма устойчивости coli к гентамицину ( Kuhberger et al., 1979). В мутантах с повышенной устойчивостью к этому антибиотику оказался измененным рибосомный белок большой субчастицы Ь6. Было обнаружено три формы этого белка с разными аминокислотными заменами и различной степенью влияния на точность трансляции. Принципиально новым в этой работе является то, что в ней впервые было доказано, что кодон-ан-тикодоновое взаимодействие находится под контролем белков не только малой, но и большой рибосомной субчастицы.

Для идентификации рибосомных белков, мутации по которым увеличивают неоднозначность трансляции (ram -мутации), использовалось два подхода: выделение ревертантов со стрептомицин-зависимым фенотипом и выделение ревертантов, в которых происходила реверсия рестрикции при трансляции нонсенс-мутаций с leaky проявлением (Gorini, 1974). С помощью этих приемов было установлено, что к увеличению ошибок трансляции приводят мутации по белкам малой субчастицы S4 и s5 (Gorini, 1974; Cabezon et al., 1976;Piepersberg et al.,1975). При изучении двух классов мутаций: увеличивающих и снижающих точность трансляции сформировалось представление о том, что уровень неоднозначности контролируется за счет кооперативного взаимодействия нескольких рибосомных белков (Piepersberg et al., 1980). Штаммы л. coli содержащие две мутации типа ra-m (по белкам s4 и )j оказались жизнеспособными, хотя скорость их роста была резко снижена. Частота ошибок трансляции в таком двойном мутанте была выше, чем в штаммах с одной мутацией гага однако аддитивности действия таких двух мутаций не наблюдалось (Piepersberg, 1980).

Важные данные по взаимодействию белков, локализованных в разных рибосомных субчастицах, были получены при исследовании мутаций, снимающих рестрикционные эффекты мутационных изменений по белку. Из 100 исследованных мутантов такого типа у 10 были обнаружены изменения белка s4 и у двух - изменения белка s5. Лишь три электрофоретически различных типа белка S4 были способны снимать рестрикционный эффект мутаций по белку. Предполагается, что этой способностью обладают только те мутационные формы s4 которые проявляют наиболее высокую эффективность в повышении ошибоктрансляции (Piepersberg et al., 1980). Эти данные позволяют высказать предположение о том, что контроль за точностью трансляции осуществляется межсубъединичной поверхностью, причем в этом процессе важную роль выполняет корректное взаиморасположение субчастиц (Olson et al., 3:979. Piepersberget al., 1980). Ниже схематически приводятся данные по взаимодействию рибосомных белков -ь.соИ ? влияющих на неоднозначность трансляции:(+) означает увеличение, а (-) уменьшение ошибок трансляции в результате мутаций по рибосомному белку. Стрелки указывают на существование кооперативности между парами белков при их влиянии на точность трансляции.

Существует корреляция между кооперативным! эффектами рибосомных белков и их влиянием на фенотип чувствительности к аминогликозидным антибиотикам. Мутанты с увеличенной точностью трансляции всегда обладают свойством устойчивости, в то время как мутанты с пониженной точностью трансляции -свойством чувствительности к аминоглшсозидам ( uorini, 1974; Piepersberg et al., 1980). Повышенная чувствительность ram -мутантов по белку s4 к стрептомицину, видимо, объясняется аддитивностью действия мутаций и антибиотика на неоднозначность трансляции.

Так, например, у дрожжей Sacchuromyces cerevisiae недавно был описан доминантный рибосомный супрессор SU146. Супрессорные мутации в этом гене обладают широким спектром действия, подавляя проявление охр-, амбер, опал-, а также, возможно, и миссенс мутаций ( Kasurekar et al., 1981; Ishigu-ro et al., 1981; Ono et al., I981). При использовании мутационной системы гена cyci кодирующего структуру изо-1-цитохрома с, было установлено, что в присутствии этого супрессора происходит включение серина на место, соответствующее положению охр-кодона ( Ono et al., 1980). мутации в гене SUP 46 приводят к чувствительности к паромомицину ик повышенной неоднозначности в бесклеточной поли -зависимой системе трансляции. Повышение уровня неоднозначности трансляции в этом случае, однако, было связано с мутационным изменением малой 40 s субчастицы рибосомы (l'iasurekar et al., i981). При электрофоретическом анализе белков рибосом было обнаружено, что мутантным являлся белок малой субчастицы S11 ( Ishiguro et al., iggl).

Супрессоры, принадлежащие, по-видимому, к классу рибосомных, были описаны и для другого эукариотического организма - todospora anserina ( Picard-Bennoun 1976;PicardBennoun and Coppin-Raynal 1977). У Р» anserina идентифицировано пять подобных генов. Мутации в одном из них (s II) приводят к повышению неоднозначности трансляции. 7 этого мутанта было зарегистрировано также изменение электро-форетической подвижности одного из белков малой субъединицы цитоплазматических рибосом (Picard-Bennoun and Begueret, I981). Большинство описанных супрессорных мутаций у P.anserina приводили (как и аналогичные супрессорные мутации у s.Cerevisiae ) к сверхчувствительности к паромомицину.е) Обнаружение и свойства рецессивных супрессоров у дрожжей ♦У бактерий, а также У дрожжей (Hawthorne ana i.or timer, 1963; Sherman et al., 1966; Gooaman et al., 1970; Celliset al., IS76; V/eigert et al., 1965) были детальноохарактеризованы супер-еупрессоры, для которых механизм "осмысления" нонсенс-кодонов обусловлен мутационным изменением транспортных РНК. Чаще всего тРНК приобретает супрес-сорную активность в результате замены основания, расположенного в антикодоне (Glass et al., 1982; Steege and Soil1979). Однако, известны случаи, когда замены оснований в иных участках тРНК приводят к такому же эффекту (tLirsch, 1971). Характерным свойство1л супрессоров этого типа (в том случае, когда речь идет об эукариотических организмах) является их доминантность (Подробнее см. главу "Супрессия нонсенс-кодонов за счет тРНК у эукариот", стр. ).

В 1964 году С.Г.Пнге-Вечтомовым у дрожжей был обнаружен принципиально новый класс супрессоров - рецессивные супрессоры (Инге-Вечтомов, 1964). Уже исходя из свойства рецессивности можно было полагать, что проявление супрессорной активности не связано с мутационным изменением тРНК. В качестве исходных штаммов для получения рецессивных супрессоров были использованы мутанты, ауксотрофные одновременно по аденину и гистидину вследствие мутаций acie 1—14 и his 7-1, соответственно. Такой подход позволял исключить появление ревертантов за счет измененных тРНК (доминантных супрессоров, обладающих кодоновой специфичностью) и получить коллекцию штаммов, несущих рецессивные супрессорные мутации.

Все рецессивные супрессоры (несколько сотен) на основании функционального теста на аллелизм распределялись на две комплементарные группы, соответствующие двум генам: sup I и sup 2 (в первых работах - s-| и sz ). Результаты тетрадного анализа диплоидов, содержащих комплементарные и функционально аллельные рецессивные супрессоры, позволили сделать вывод о том, что гены эир1и sup2 не сцеплены менаду собой, а сочетание мутации по двум этим генам в одном гаплоидном геноме летально; позднее было установлено, что они локализованы в разных хромосомах (см. ниже).

Другой характерной чертой рецессивных супрессоров,отличающей их от доминантных, является омнипотентность их действия, т.е. способность супрессировать все три типа нонсенс-кодонов (Инге-Вечтомов, Симаров, 1967; Инге-Вечтомов, Андрианова, 1972). Так, уже в первых работах была обнаружена эффективность рецессивных супрессоров по отношению к амбер и охр-нонсенсам (Инге-Вечтомов, Андрианова, 1970), а позднее и к опал кодону ( Surguchov et al., 1980).

Рецессивные омнипотентные супрессоры у дрожжей Saccharomyces cerevisiae были также описаны Герлахом ( L-erlach 1975; Gerlach 1976); в этом случае супрессорные мутации локализовались также лишь в двух генах: supp и supQ Количество рекомбинационно разделимых сайтов в гене supP в которых могли происходить супрессорные мутации, расчитано равным, по меньшей мере, 26-27. Было высказано предположениео том, что гены supP и supw кодируют белки, участвующие в процессе трансляции; мутационная инактивация этих белков приводит к появлению супрессорной активности.

Уже довольно давно у дрожжей описаны ядерные антисуп-рессоры, снижающие эффективность тРНК'овых супрессоров (Инге-Вечтомов, 1967; Hawthorne and Leupold 1974;MacCready and Cox, 1973; 1976). Такие антисупрессорные мутации могут затрагивать различные компоненты белоксинте-зирующего аппарата, однако, до настоящего времени рибосомные антисупрессоры среди них не идентифицированы. Для Schizosaccharomyces cerevisiae описаны антисупрессорные мутации, модифицирующие супрессорные тРНК (Janner et al., 1980). У дрожжей S. cerevisiae описан цитоплазматически наследуемый детерминант psi который снижает эффективность опосредованной тРИК супрессии охр-мутаций и мутаций типа сдвига рамки считывания ( Liebman et al., 1975; Cummins et al., 1980). Однако, молекулярный механизм действия детерминанта psi остается пока неясным.

Прямой метод селекции рибосомных антисупрессоров дрожжей использовала Либман с сотрудниками ( Liebman et al., 1980). Селекцию мутантов с антисупрессорами проводили по признаку подавления экспрессии рибосомных супрессоров по генам sup 35 или sup 45. Молекулярный продукт генов-антисупрессоров пока не идентифицирован, но в качестве наиболее вероятного кандидата рассматривается рибосомный белок. При электрофоре-тическом анализе рибосомных белков одного из таких антисуп-рессорных мутантов (антисупрессор asu 9-1) было установлено, что антисупрессорная мутация приводит к появлению дополнительного белка в составе 40 S субъединицы рибосом ( Lieb-man and Cevenag(I98l). Эти данные дают основание связывать эффект антисупрессорной мутации со структурным компонентом рибосомы, однако, не позволяют идентифицировать мутантный продукт.

Мутантный продукт удалось идентифицировать для другого антисупрессора у дрожжей 3.cerevisiae - asu11 ? препятствующего проявлению супрессорного эффекта рибосомного супрес-сора SUP 46. Эта рецессивная антисупрессорная мутация вызывала изменения электрофоретической подвижности белка S 27. Таким образом, мутационное изменение белка s II (ген sup46) может быть компенсировано появлением в составе рибосом другого мутантного белка - S27 (ген asu II). Антисупрессорнаямутация asu II обладает еще одним эффектом: приводит к устойчивости клеток к паромомицину. Видимо, эта мутация вызывает повышение точности трансляции ( Ishiguro, 1981).

Антисупрессоры, влияющие на проявление рецессивных супрессорных мутаций, описаны также у дрожжей S.pombe. Одна из таких антисупр ее сорных мутаций, возникшая в гене cyhl 5 приводила к устойчивости к щжлогексимиду, что было обусловлено мутационным изменением 60S субъединицы рибосомы ( Berry et al., 1978). Для одного из рибосомных белков большой субчастицы было обнаружено увеличение молекулярной массы, что может быть связано с дефектом процессинга этого белка ( Coddinghton and Flurri 1977).

Для рибосомных антисупрессоров из гриба Podospora anserina было установлено, что антисупрессорные мутации приводят к увеличению точности трансляции; в этом отношении они сходны с мутациями устойчивости к стрептомицину (Coppin-Raynal 1982; Gorini, 1974).

Наряду с мутациями, снижающими эффективность супрессии или предотвращающими эффект генов-супрессоров, для дрожжей были описаны мутации с противоположными свойствами. Такие мутации, получившие название аллосупрессоров ( sal ) увеличивают эффективность супрессорных мутаций. Так, например, Кокс обнаружил рецессивные мутации в пяти различных локусах sail - sal5 которые повышают эффективность UAA -специфичных супрессоров SUP 16, кодирующих тирозиновую тРНК. Некоторые из таких аллосупрессоров вызывают резкое снижение жизнеспособности мутантов или их летальность. В ряде случаев аллосупрессоры обладают плейотропными проявлениями: чувствительностью к пониженной или повышенной температуре.

Сочетание двух аллосупрессоров: sal 4-2 и sal 3 обладает слабым суирессорным эффектом по отношению к нонсенс-мутации UAA.

Хоторном и Лыопольд (Hawthorne and Leupold 1974) были описаны аллосупрессоры иного типа. Эти аллосупрессоры сами по себе обладали слабой супрессорной активностью по отношению к нонсенс-мутациям UAG. Наиболее вероятными продуктами генов-аллосупрессоров являются рибосомные белки, хотя при их электрофоретическом анализе изменений электро-форетической подвижности обнаружено не было ( Waldron and Сох, 1978).

Йялбертсоном с соавторами ( Culberson et al., 1980) были описаны 18 аллосупрессоров, которые увеличивали эффективность супрессоров типа "сдвига рамки считывания". Результаты генетического анализа свидетельствовали о том, что эти алло супрессоры локализованы в двух локусах UI>]F I и 2.з) Взаимодействие доминантных и рецессивных супрессоровВзаимодействие рецессивных супрессоров с доминантными, обусловленными мутациями по тРНК со специфичностью к охр-му-тациям, приводит к резкому ингибированию роста клеток или вызывает их летальность (Инге-Вечтомов, Андрианова, 1970; Тер-Аванесян, Инге-Вечтомов, 1980). Поэтому гаплоидные штаммы дрожжей являются непригодной моделью для количественного изучения взаимодействия рецессивных и доминантных супрессоров. В связи с этим с этой целью были получены диплоидные гибриды между штаммом, несущим охр-мутацию в гене pho I (структурном гене конститутивной фосфатазы I), а также рецессивные и доминантные супрессорные мутации (Тер-Аванесян, Инге-Вечтомов, 1980).

Штаммы, дигетерозиготные по рецессивным и доминантным супрессорным мутациям, обладали более высокой активностью кислой фосфатазы I по сравнению с соответствующими моноге-терозиготами по доминантным супрессорам. Анализ активности кислой фосфатазы у разных гибридов показал, что диплоиды, дигетерозиготные по рецессивным супрессорам sup j и sup 2, не обладают активностью кислой фосфатазы I. Взаимодействие доминантных и рецессивных супрессоров приводит к более высокой эффективности супрессии в диплоидах, дигетерозиготных по этим супрессорным мутациям. Это, видимо, и является причиной летальности (или подавленного роста) гаплоидных штаммов, одновременно несущих рецессивные и доминантные супрес-сорные мутации.и) Другие типы рибосомных мутантов У эукариотКак указывалось выше, при изучении аппарата трансляции с помощью генетических подходов часто используются условно-летальные мутанты, а также мутанты с измененной чувствительностью к антибиотикам. У дрожжей, в частности, были получены мутанты с измененной чувствительностью к щжлогексимиду и криптоплеурину, мутанты с дефектной сборкой рибосом при пониженной температуре и т.д. В некоторых случаях в результате таких работ удалось не только идентифицировать рибосом-ный компонент, ответственный за измененный фенотип, но и локализовать в нем мутационное изменение. Так, при изучении спонтанных мутантов, устойчивых к ингибитору бежового синтеза - циклогексимиду, было обнаружено, что рибосомный белок большой субчастицы L 23 (YL 24) обладает измененной электрофоретической подвижностью. Устойчивость к антибиотику появлялась в результате точечной мутации в структурномгене этого белка ( Stocklein and Piepersberg, 1970) расположенном в хромосоме УП вблизи от маркера met 13. Мутации устойчивости к циклогексимвду проявляли полудоминантный характер. Далее была проведена очистка мутантной и родительской формы белка Ъ 29 (УЬ 24) и их структурная характеристика, которая показала наличие одной аминокислотной замены в мутантной форме белка (замена глюташша на лизин или глю-таминовую кислоту)(stocklein et al., I981). Позднее было обнаружено, что устойчивость к циклогексишщу может проявляться в результате, по крайней мере, четырех мутаций по структурному гену белка Ъ 29 ( YL 24). Б результате мутаций рибосомный белок может приобретать более выраженные основные свойства (фенотип высокой устойчивости к антибиотику), становится более кислым (низкая устойчивость к антибиотику) или не изменять заряда (как низкая, так и высокая устойчивость к антибиотику)( Stocklein et al., ).

Кауфер с соавторами в лаборатории Дж.Ворнера (Kaufer et al., 1983), проведя клонирование гена СУН2, кодирующего рибосомный белок Ъ 29 (YL 24), определили полную нуклео-тидную последовательность гена. Ген 0УН2 состоит из I 082 нуклеотидов и содержит интрон размером 510 нуклеотидов. Поскольку в экспериментах по клонированию использовалась как мутантная аллель, так и аллель дикого типа, автором этого исследования удалось выяснить природу мутации, приводящей к фенотипу устойчивости к цшслогексшлиду. Оказалось, что свойство устойчивости появляется в результате трансверсии С на G что приводит к замене глютаминовой кислоты на глю-тамин в положении 37 белка Ъ 29. Таким образом, эти данные подтвердили предварительный вывод о природе аминокислотной замены в белке, сделанный Штокляйном с соавторами (stockleinet al.I98I) на основании сравнения триптических гидролиза-тов мутантной формы этого белка и белка из дикого типа.

Другие рибосомные мутанты дрожжей с измененной чувствительностью к антибиотикам исследованы менее детально. Так, при изучении мутантов S.cerevisiae устойчивых к ингиби-бору транслокации - криптоплеурину, были обнаружены изменения свойств малой 40 s рибосомной субчастицы. Ген, ответственный за фенотип устойчивости к антибиотику, локализуется в хромосоме Ш вблизи от локуса типа спаривания (Skoger-son et а.1973). Предполагается, что устойчивость к криптоле-урину связана с изменением рибосомного белка малой субчастицы (Sanchez et al., 1979).

В лаборатории Дж.Дэвиса были получены мутанты, устойчивые к другому ингибитору белкового синтеза - триходермину, который действует на стадию терминации трансляции ( Schindler et al., 1974, цитировано по McLaughlin 1974). Устойчивость в этом случае была обусловлена мутационным изменением 60s рибосомной субчастицы.

Недавно в работе Гриц с соавт.( Gritz et al., 1982) при использовании в качестве мутагена нитрозогуанидина были выделены температурочувствительные рецессивные мутанты дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Для трех из таких мутантов были обнаружены изменения электрофоретической подвижности рибосомного белка большой субчастицы YL 25 (номенклатура Отака и Осава, Otaka and Osawa 1981), которые обуславливали фенотип температурочувствительности. Выделенные мутанты обладали повышенной чувствительностью к антибиотикам: гигромицину В, G 418 и мшр мишенью действия для которых является рибосома. Кроме того, в клетках этих штаммов наблюдается нарушение процессинга РНК, а такжедефицит малой рибосомной субчастицы; эти дефекты проявляются не только при рестриктпвной, но и при пермиссивной температуре. Авторы предполагают, что мутация у изолированных Hts -мутантов локализуется в гене, кодирующем фермент модификации рибосомного белка. Однако, причины множественного проявления такой мутации остаются неизвестными.

Оригинальный подход для выделения рибосомных мутантов дрожжей был использован Бейлисом и Винопалом ( Bayliss and Vinopal, 1971). Эти исследователи получили мутант S.cerevisiae чувствительный к стрептомицину и одновременно обладающий свойством холодочувствительности, у которого были изменены некоторые свойства рибосом. Хотя обычно дрожжи не обладают чувствительностью к стрептомицину, рибосомы мутанта были чувствительны к высоким концентрациям этого антибиотика in vitro. Кроме того, у мутанта оказалась холодочувстви-тельной одна из стадий сборки рибосом; в результате при пониженной температуре в них накапливались РНП-частицы с коэффициентом седиментации 28 s а 60 s и 40 s субчастицы в этих условиях не синтезировались ( Bayliss and Ingraham 1974).

Холодочувствительные мутанты дрожжей с измененными рибосомами были описаны также в работе Синга и Мени ( Singh and Manney 1974); некоторые из таких мутантов одновременно обладали повышенной чувствительностью к щпслогексимиду.

Сходные холодочувствительные мутанты с измененной чувствительностью к щгклогексимиду были описаны ташке для гриба Podospora anserina ( Crouzet and Begueret, 1978). / мутантов Podospora также был нарушен биогенез рибосомной субчастицы.

Мутантов дрожжей с температурочувствительной трансляцией к настоящему времени известно очень немного. Детальныймолекулярный механизм, обуславливающий чувствительность белкового синтеза к повышенной температуре, был выяснен лишь в одной работе {I'linberg et al., 1982). Продуктом мутантного гена prtl оказался в этом случае не компонент рибосомы, а белок, участвующий в инициации трансляции. Поскольку тем-пературочувствптельным этапом в этом случае являлось образование инициаторного комплекса между eli-2 метионил-тРНК^, u-IP и 40 s субчастицей, было высказано предположение о том, что продуктом мутантного гена является фактор инициации eiF-2. Предполагается, что в результате мутации взаимодействие eIF-2 с метионил-тРШС- и не изменяется, однако, нарушается его способность связываться с малой рибосомной субчастицей ( Weinberg 7982).

Организация и экспрессия митохондриального геномаИсследование митохондриального генома является за последние годы одним из наиболее бурно развивающихся направлений молекулярной биологии и молекулярной генетики. Интенсивные исследования генетической системы митохондрий обусловлены несколькими причинами. Во-первых, геном митохондрийfiотносительно невелик: его размеры колеблются от 10 х 10 до 70 х Ю6 у разных организмов ( Locker and Rabinowitz 1979), что дает возможность получить исчерпывающую характеристику его структурной организации. Другой причиной" активных исследований в этой области является возможность получения мутантов как по митохондриальным, так и по тем ядерным генам, продукты которых взаимодействуют с продуктами митохондриального генома. И наконец, внутренняя мембрана митохондрий, построенная из продуктов ядерного и митохондриального генома, является удобной системой для изучения механизма сборкимембраны; возможности исследований в этой области расширяются, благодаря сочетанию физико-химических и генетических подходов.

Митохондриалъные геномы высших и низших эукариот довольно существенно различаются. Так, митохондриальная ДНК животных имеет размер около 5мкм, что соответствует молекулярной массе 10 дальтон, в то время как ДНК из митохондрий дрожжей имеет примерно в 5 раз большие размеры.

Рис. 2. Генетическая карта митохондриальной ДНК дрожжей.

Тем не менее, набор белковых продуктов в митохондриях животных и дрожжей весьма сходен. Размер митохондриальных рибосом и рРНК у высших и низших эукариот также различается. Митохондриальные рибосомы дрожжей имеют коэффициент седиментации 73 s и содержат 21 s и I4S рРНК, в то время, как в ми тохондриях животных обнаруживаются 55 s рибосомы, содержащие 16 S И 12S рРНК (Locker, Rabinowitz 1979). Несмотря на структурные различия митохондрий из различных организмов, их функциональные свойства весьма сходны. Большая часть белков митохондрий кодируется ядерными генами и синтезируется на цитоплазматических рибосомах. К их числу относится несколько сотен белков внутренней митохондрпальной мембраны и матрикса, ферменты репликации, рекомбинации и транскрипции митоховдриальной ДНК.

Продуктами митохондриальных генов является 9-10 гидрофобных полипептидов внутренней мембранылрибосомный белок var 1 а также рРНК и тРНК.

В настоящее время хорошо исследовано субъединичное строение основных функциональных м структурных компонентов митохондрпальной мембраны, а также организация кодирующее их генов. Так, цктохромоксидаза штохондриь. дрозшеП представляет собой олигомерннй комплекс, построенный из семи полипептидов с молекулярной массой 40 ООО, 33 ООО, 23 ООО, 14 ООО, 12 700 и 4 500 ( Shatz 1979).

Чувствительная к олпгомнцину АТРаза состоит из девяти полипептидов, четыре из которых, обладающие гидрофобными свойствами, транслируются в митохондриях, а пять - в цитоплазме ( Locker, Rabinowitz 1979). Из комплекса цжтохро-ма Ъ лишь один полипептид кодируется в митохондриях (Locker, Rabinowitz 1979).

Поскольку биогенез митохондрии включает в себя сборку полипептидных продуктов как ядерных, так и штохондриальных геномов, чрезвычайно удобным подходом к изучению структурно-функциональной характеристики этих органелл является изучение эффекта мутаций по ядерным и митохондриальным генам, кодирующим структурные компоненты митохондрий.

Для изучения эффекта ядерных мутаций на сборку и функциональные свойства митохондрий были получены дыхательно недостаточные pet мутанты, неспособные расти на нефермен-тируемых субстратах (глицерине, этаноле и т.д.). Были получены, в частности, также дыхательно недостаточные мутанты, в которых нарушена интеграция двух субъединиц цитохромоксидазы, синтезируемых в митохондриях, хотя синтезируемые в цитоплазме субъединицы этого комплекса при этом не претерпевали видимых изменений (Elmer et al., 1973). Мэзон с соавт. ( Mazon et al., 1979) получили коллекцию условных дыхательно недостаточных мутантов дрожжей, дефектных по сборке или функционированию внешней мембраны митохондрий. Использование, в частности, температурочувствительных мутантов, в которых обратимо нарушены некоторые этапы сборки мембран, позволяет идентифицировать промежуточные этапы биогенеза (Mazon et al., 1979).

Систематическое исследование биогенеза митохондрий с использованием Hts -мутантов по ядерным генам было проведено в лаборатории Швейцера ( Michaelis et al., 1982). Этой группой исследователей было выделено 228 различных температурочувствительных pet -мутантов, распределяющихся в 184 комплементационные группы. Для большей части мутантов изменений в продуктах митохондриальной трансляции обнаружено не было. Однако, у 10% мутантов наблюдалось отсутствиемитохондриального синтеза белка, а в небольшой группе мутантов происходило подавление синтеза лишь некоторых мито-хондриально кодируемых продуктов. Влияние ядерных мутаций на субъединицу Ш цитохромоксидазы ( Sbner et al., 1973) и субъединицу 9 АТРазы ( Tzagoloff et al., 1975) было обнаружено ранее.

Наиболее часто ядерные мутации оказывают влияние на субъединицу I цитохромоксидазы; было обнаружено 49 групп комплементации, оказывающих влияние на образование этого белка. Поскольку ген для этого белка обладает мозаичной структурой ( Tzagoloff et al., 1980) можно полагать, чтоэкспрессия и регуляция этого гена осуществляется за счет сложных взаимоотношений между продуктами ядерного и мито-хондриального генома.

Можно сделать вывод, что хотя сам факт влияния ядерных мутаций на биосинтез и пост-трансляционные модификации продуктов митохондриального генома не вызывает сомнений, механизм их действия в основном остается неизвестным. Изучение митохондрий (прежде всего, митохондрий из низших эукариот) является удобным подходом не только к выяснению механизма сборки мембран. Исследования последних лет показали, что митохондриальный геном является той системой, на которой могут эффективно решаться такие принципиально важные вопросы, как структурная организация г экспрессия генома, а также эволюция генетического кода.

Проблема структурной организации и экспрессии што-хондриального генома стала привлекать особое внимание исследователей после того, как было установлено, что многие гены митохондрий, кодирующие как РИТС, так и белки, являются мозаичными.

Как указывалось выше, мутации по интрону 12 обладают плейотропным эффектом, блокируя как образование апоцитохрома, так и синтез субъединицы I цитохромоксидазы (молекулярная масса 40 ООО дальтон), являющейся продуктом локуса oxi3. Позднее были обнаружены еще два участка в гене СОВ, мутации по которым блокируют синтез обоих белков. Вместе с тем, влияние мутаций по интрону 12 на синтез двух других митохонд-риально кодируемых субъединиц цитохромоксидазы не обнаружено ( Church et al., 1979). С другой стороны, мутации по гену oxi 3, который также обладает мозалчной структурои, влияют на синтез как собственного продукта, так и апоцитохрома Ъ.

Таким образом, пнтроны этих генов могут выполнять важнута функцию в сплайсинге предшественников мРНК для обоих генов, кодируя фермент - матюразу. Видимо, такая структурная организация генов, кодирующих два метаболически родственных фермента (апоцитохром и субъединицу I цитохромоксидазы) выполняет регуляторную функцию, координируя экспрессию этих двух генов ( De Ъа Salle et al. 1982).

Система ген-белок для матюразы представляет чрезвычайно интересный регуляторный механизм: катализируя сплайсинг интрона, фермент разрушает собственную кодирующую последовательность, выполняя тем самым ауторегуляторную функцию (Borst and Grivell 1981).

Проанализировав влияние мутаций по участкам гена СОВ, расположенным на границе экзонов с интронами, Деля Саль с соавторами выдвинули интересную гипотезу о роли митохондриальных рибосом в механизме сплайсинга (De Ъа Salle et al., 1982). IIo мнению этих исследователей, рибосома " узнает" некую сигнальную последовательность в молекуле пре-мРНК, что может способствовать корректному сплайсингу. В пользу такого предположения свидетельствует несколько косвенных наблюдений, одно из которых заключается в наличии комплементарных последовательностей длиной 12 нуклеотидов между пре-мРНК и рРНК малой субчастицы митохондрий.

Другой класс мутаций с условно-температурншл проявлением, вызывающих дыхательную недостаточность клеток, был описан Сингом с соавторами ( Singh, et al., 1978). Мутанты проявляли повышенную устойчивость к эритромицину и холодр-чувствительность роста на неферментируемых источниках углерода. Оба эти фенотипические проявления были обусловлены одной мутацией в локусе пьг которая картируется, видимо, в гене 21s рРНК большой рибосомной субчастицы. При выращивании клеток мутанта в непермиссивпых условиях соотношения 50S :37S субчастиц резко уменьшалось, что сопровождалось снижением количества двух рибосомных белков большой субчастицы. Авторы полагают, что мутационное изменение 21S рРИК приводит к дефекту сборки большой рибосомной субчастлцы, вследствии чего и происходит нарушение белкового синтеза при непермпссивных условиях.

В работе Сора и уайа (Sor and Faye, 1979) описаны довольно сходные мутанты дрожжей по ядерным генам. В некоторых мутантах наблюдалось снижение количества малой (37 S ) рибосомной субчастицы и соответствующей 16s рРНК, а также уменьшение содержания трех рибосомных белков малой субчастицы (S3 S4 и S15 ). 7 других температурочувствительных мутантов мутации были локализованы в гене, кодирующем рРНК большой субчастицы; у таких мутантов было понижено содержание большой 50 s субчастицы и соответствующей рРНК (Sor and Faye 1979).

Холодочувствительные мутанты по гену 23 S рРНК, дефектные по биосинтезу белка в митохондриях, были описаны также Девенишем с соавт.( Devenish et al.,I377). J таких мутантов было понижено содержание большой субчастицы митохондриальных рибосом. Дефицит большой рибосомной РНК митохондриальных рибосом может свидетельствовать о том, что модифицированная рРНК хуже взаимодействует с рибосомными белками и вследствии этого подвергается расщеплению.

Для понимания структурной организации митохондриального генома представляет интерес также исследование супрессорных мутаций. Корузи и Цаголоф ( Coruzzi, Tzagoloff, 1980) исследовали нонсенс-мутанты по гену апоцитохромаb дрожжей. Среди полученных ревертантов были обнаружены рецессивные мутанты по ядерным генам, у которых происходило восстановление, хотя и неполное, апоцитохромаЪ и, как следствие, -реверсия к дыхательной компетентности. Иначе говоря, мутации по структурному гену апоцитохрома b супрессировались продуктом ядерного гена, причем супрессия осуществлялась на уровне митохондрпальной трансляции. Поскольку тРНК, кодируемые ядерным геномомjне транспортируются в митохондрии ( Bonitz et al., 1980), очевидно, что супрессия в данном случае не была обусловлена влиянием цитоплазматических супрессорных тРНК на митохондриальную трансляцию. Рецессивная природа этих супрессорных мутаций свидетельствует о том, что они затрагивают некий белковый продукт, участвующий в трансляции, наиболее вероятно - рпбосомный белок или фактор терминации ( Coruzzi and Tzagoloff 1980).

Позднее были исследованы ядерные и митохондриальные информационные супрессоры мутаций по интрону ЪохЗ гена апоцитохрома Ъ дрожжей. Такие ядерные супрессоры обычноявляются рецессивными; исходя из этого признака, можно полагать, что они кодируют белок, принимающий участие в ми-тохондриальной трансляции (наиболее вероятно - рибосомный белок малой субчастицы). Митохондриальные супрессоры обладали аллельной, но не генной специфичностью и проявляли омнипотентный характер. Они, по мнению авторов, являются генами, кодирующими тРНК или рРНК малой субчастицы ( Krus-zewska, 1982).

Более детально был исследован механизм супрессии нонсенс (охр) кодонов в митохондриальном гене oxil дрожжей. Мутации, супрессирующие действие нонсенсов этого типа, были локализованы в гене 15 S рРНК. Охр-кодоны в других генах также супрессировались этими мутациями, что позволило отнести такую супрессию к типу информационной (Fox and staempfli 1982). Следует сказать, что нонсенс-супрессия, обусловленная мутациями по рибосомной РНК, пока обнаружена только для митохондрий дрожжей. Б связи с этим следует отметить следующее. 3 настоящее время определена полная нук-леотидная последовательность 15 S рРНК митохондрий дрожжей (Sor and Fukuhara 1980). Для нее обнаружено несколько участков гомологии с 16 s рРНК из E.coli ; кроме того, 15 s митохондриальная рРНК может образовывать вторичную структуру, сходную с вторичной структурой рРНК малой субчастицы. Поэтому дальнейшее изучение механизма супрессии, обусловленной мутациями по митохондриальной I5S pPIffi дрожжей, гложет представлять интерес для понимания функционирования рибосомы в более широком плане.

Как указывалось выше, около SD% белков и ферментов митохондрий кодируется ядерными генами, синтезируется на цитоилазматических рибосомах и затем транспортируется вмитохондрии. Было давно установлено, что белки, выполняющие сходные функции в цитоплазме и митохондриях, структурно различаются и являются продуктами разных генов. Однако, такой вывод был сделан на основании чисто биохимических исследований и, как показывают некоторые недавние исследования, может быть неверен. Так, Хупер с соавторами (Hopper et al., 1982) обнаружила, что мутации в ядерном гене тш 2 дрожжей S.cerevisiae изменяют фермент тРНК-(уридин-5)-метилтрансферазу, функционирующий как в цитоплазме, так и в митохондриях. Сходный вывод был сделан и для другого тРНК-модифицирующего фермента - тРНК (гуаноо озин о-) д 1-м е т ил тр ан с ф ер аз ы (ген ТШ 1). 3 результате мутаций по генам ТШ1 или ТШ2 изменяются как цитоплаз-матические, так и митохондриальные тРНК. Авторы на основании полученных результатов предполагают, что один п тот же фермент может функционировать в обоих клеточных ком-пар тментах. Такое предположение, основанное на убедительных экспериментальных фактах, противоречит общепризнанной точке зрения, согласно которой ферменты, осуществляющие аналогичные функции в цитоплазме и митохондриях, всегда кодируются разными генами.

При исследовании митохондрий впервые были получены данные о том, что генетический код не является универсальным, как это предполагалось ранее. Особенности генетического кода митохондрий из разных организмов суммированы в таблице 7.

Пожалуй,наиболее удивительным отклонением генетического кода митохондрий от обычного кода является то, что один из трех нонсенс-кодонов - UGA в митохондриях кодирует триптофан; это справедливо как для митохондрий шеТаблица 7.

Особенности генетического кода митохондрий из разныхорганизмовКодоныОбычный кодМитохоцдриальный коддрожжи: Млекопитающие:Neurospora crassauga терминатор триптофан триптофан триптофанCUN лейцин лейцин треонин лейцинaua изолейцин метионин изолейцинag а,agg аргинин терминатор аргининкопитающих, так и для митохондрий грибов ( Gray 1982). Хотя в других отношениях генетический код митохондрий из разных организмов несколько различается, общим свойством митохондриального кода является то, что одна изоакцепторная тРНК способна распознавать все кодоны в тех четырехкодоновых семействах, которые соответствуют одной аминокислоте (например, GUN соответствует валину, UGN - серину, GGN -пролину, AGN треонину, GGN - аданину, g-g-n - глицину, GGN - аргинину). Б результате для трансляции митохондриального кода достаточно всего лишь 23-24 различных тРНК. Мито-хондриальные тРНК обладают некоторыми специфическими структурными свойствами, прежде всего, в антикодоновой области. Так, например в митохондриях дрожжей треониновая тРНК, распознающая триплет cua потенциально обладает также "лей-циновым" антикодоном ( uag )( Li and Tzagoloff 1979). По-видимому, митохондриальный код эволюционировал из универсального в направлении упрощения.

Баррел с соавторами ( Barrel et al., 1980), проанализировав последовательность нуклеотидов в составе митохондрпальной ДНК человека и сопоставив ее с данными по набору митохондриальных ДНК, пришел к выводу о том, что те изоак-цепторные формы тРНК, которые обслуживают семейства кодонов, всегда содержат и (или модифицированный U ) в вобл-поло-жении. У тех тРНК, которые не обслуживают семейства кодонов, в вобл-положении антикодона находится лишь U или G (или их модифицированные формы). Единственным исключением из этого правила является тРНК"лет, содержащая в этом положении С. По-видимому, это справедливо и для митохондриального генома дрожжей ( Bonitz et al., 1980), и нейроспоры ( Hrckman et al., 1980).

Чрезвычайно интересная информация, которая пока не нашла своего объяснения, была недавно получена Фаррелли и Бутовым (Farrelly and Butow 1983). Эти исследователи в составе хромосомной ДНК дрожжей обнаружили последовательности нуклеотидов, гомологичные митохондриальным генам: var 1 соЪ также митохондриальному ориджину репликации. Авторы предполагают, что такие ядерные псевдогены произошли из митохондриальных генов около 25 миллионов лет тому назад. Имеет ли наличие таких последовательностей в ядерном геноме какую-либо функциональную нагрузку остается пока неясным.

Дрожжи как объект исследования методами генной инженерии После того, как были разработаны методы генной инженерии (в основном, на кишечной палочке -Escherichia coli )j а затем в 1976 году проведено клонирование фрагментов дрожжевой ДНК, стало очевидным, что дрожжи являются исключительно удобной моделью для исследования молекулярной организации эукариотических клеток с помощью генно-инженерныхподходов. Во-первых, это обусловлено тем, что дрожки являются хорошо охарактеризованным с генетической точки зрения объектом; для них, в частности, имеются сотни мутантных ло-кусов, что удобно для проведения эксп ерш-ленто в по трансформации. Во-вторых, дро:кжи обладают относительно небольшим геномом (примерно 15 миллионов пар оснований), который всего лишь в 3 раза больше, чем геном кишечной палочки. Это облегчает идентификацию клонированных генов с помощью скрининга полученных клонов. Дрожки, кроме того, удобны тем, что их клетки возможно с высокой эффективностью трансформировать с помощью ДНК, а также тем, что многие гены дрожжей экспрес-сируются в клетках Е. coli и, следовательно, дрожжевые гены могут комплементировать мутации в кишечной палочке.

Впервые возможность трансформации эукариотических клеток геном, кодирующим белок, была показана именно на дрожжах. Струль с соавторами ( Struhl et al., 1976) клонировали локус his 3, кодирующий фермент имидазолглпцерофосфатдегид-ратазу. Наиболее сложным в этой работе оказался не собственно процесс трансформации и селекции, а доказательство того, что перенесенный в клетки кишечной палочки фрагмент ДНК действительно содержит структурный ген имидазолглицерофос-фатдегидратазы дрожжей. Такое доказательство было получено лишь несколько позднее с использованием амбер мутанта дрожжей по гену his 3. Содержащий такой мутантный ген фрагмент ДНК дрожжей комплементировал мутацию his В Е. coli лишь в штаммах кишечной палочки, содержащих амбер супрессоры ( Struhl et al.,1979).

При клонировании гена LEU 2 дрожжей наиболее сложной частью работы также оказалось доказательство того, что комплементация соответствующей мутации е. coli происходит заюзсчет экспрессии структурного гена дрожжей. В этом случае такого рода доказательства были получены при физическом картировании комплементирующего фрагмента и локализации его в третьей хромосоме дрожжей. Кроме того, доказательство включало в себя сравнение интенсивности гибридизации фрагмента, содержащего предполагаемый ген LEU 2 с ДНК из клеток гаплоида, диплоида и штаммов с разным количеством хромосомы Ш ( п+1 и 2п-1 ) ( Hicks and Fink 1977).

Для идентификации белковых продуктов дрожжей, образующихся в клетках E.coli в результате трансформации фрагментами дрожжевой ДНК, часто используется и иной подход, основанный на использовании антител к белкам дрожжей. Этот метод был использован, в частности, при клонировании гена 3-фос-фоглицераткиназы дрожжей ( Hitzeman et al., 1979).

Иной подход для доказательства экспрессии и идентификации продуктов клонированных генов дрожжей заключается в выделении с помощью молекулярной гибридизации мРНК для клонированного гена с последующей ее трансляцией в бесклеточной системе белкового синтеза. Этот метод был использован при клонировании нескольких генов рибосомных белков (Wool-ford et al., 1979), а также гистоновых генов дрожжей ( Hereford et al., 1979). Для выделения специфических мРНК в таких случаях обычно используется метод гибридизации с образованием R -петель или иные приемы гибридизации (Woolford and Rosbach 1979); изолированную таким образом глРНК транслируют в бесклеточной системе белкового синтеза с последующей идентификацией белкового продукта методом электрофореза в полиакриламидном геле.

Существует также возможность идентификации клонированных генов дрожжей с использованием комплементации в мутантах дрошеЁ после проведения трансформации дрожжевых клеток ( Hinnen et al., 1978). В первых опытах по трансформации дрожжевых клеток в качестве селективного маркёра использовали leu 2 а в качестве вектора - плазмиду Col е 1(Hinnen et al., 1978). Однако, частота трансформации дрож— "7жей оставалась низкой (около ±/10 на регенерирующий сферо-пласт), до тех пор пока в вектор, используемый для трансформации не был введен фрагмент 2ju ДНК дрожжей, обеспечивающий автономную репликацию плазмиды. После этого процедура трансформации дрожжей стала обычно проводится по следующей схеме: получение фрагментировалной ДНК из дрожжей данного типа; включение ее в тот или иной вектор, содержащий фрагмент 2ju днк дрожжей или иного репликатора и необходимые маркёры, облегчающие селекцию; трансформация клток с помощью такого вектора с "вставками" дрожжевой ДНК; выделение ДНК из Е.coli и последующая трансформация мутантов дрожжей полученной таким образом ДНК.

Зонирование генов существенно расширяет возможности экспериментаторов, работающих в области молекулярной биологии и молекулярной генетики. Одно из достоинств этого метода заключается в возможности выделения индивидуальных генов (часто с прилегающигж к ним участками. ДНК) с последующим определением в них последовательности нуклеотидов.

Хотя генно-инженерные подходы стати широко использоваться относительно недавно, тем не менее, с их помощью у.же получена значительная информация об организации генома и структуре гена из эукариотических клеток, прелие всего, из дрожжей. Так, при использовании этих методов было установлено впервые для эукариот, что гены тРНК могут обладать мозаичной структурой и содержать обращенные последовательности нуклеотидов (так называемые IS -элементы). Это было сначала доказано для тпрозиновой ( Goodman et al., 1977) и фенилаланиновой тРНК ( Valenzuela et al., 1978). Позднее было установлено, что IS -элементы присутствуют во многих, но не во всех генах тРНК дрог-шей ( Olson 1982). Интересные данные были получены, в частности, о структуре генов дрожжей, кодирующих разные пзоакцепторные нормы сериновых тРНК. Так в гене тРИК|^ (локус SUP-RL 11 ) содержитсяIS -элемент длиной в 19 пар оснований, а в гене тРИК^^ (локус suy 5) is -элемента не обнаруживается, хотя эти два гена различаются лишь тремя нуклеотидшми парами в Радирующей последовательности ( Olson 1981). Этаже закономерность была обнаружена и для генов тРНК из других эукариот: многие, но не все такие гены содержат is-элементы (Olson, 1981).

Позднее is-элементы были обнаружены также и в структурных генах дрожжей, кодирующих белки. Так мозаичная структура была доказана для гена актина ( Gallwitz and Sures 1980); кроме того, было установлено, что этот ген представлен в дрожжевом геноме в виде одной копии ( Ng and Abelson, 1980). Эти работы имели большое теоретическое значение, поскольку из них следовало, что простейшие эукариоты - дрожжи - обладают механизмом сплайсинга, известным ранее для высших организмов. Обнаружение сплайсинга у дрожжей послужило толчком для исследования тонкой структуры гена и механизмов генной экспрессии. Так, в частности, была получена характеристика структуры мозаичного гена актина из пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae ( Gallv/itz, 1982). В составе актинового гена обнаружен один интрон с размером 309 пар оснований. Оказалось, что удаление большей части интрона с помощью нуклеазы BAL-31 не влияет на механизм сплайсинга,1U6В то же время, удаление лишь одного тимидинового остатка, расположенного во втором положении интрона, приводит к нарушению сплайсинга и накоплению предшественника мРНК ( Gallwitz, 1982). Делеционные мутанты по гену актина были получены также с использованием методов генной инженерии: ген актина в составе плазмиды рУА208 обрабатывался эндонуклеазой bal- 31, лигировался с помощью ДНК-лигазы фага Т4 и клонировался в клетках е.coli. Нуклеотидная последовательность на границе интрона и экзона в гене актина сходна с нуклео-тидной последовательностью на экзон-интронной границе в генах высших эукариотических организмов. Максимальная.длина последовательности на экзон-интронной границе, необходимой для корректного сплайсинга, составляет около 17 нуклеотидов от 5 конца границы { Gallwitz 1982).

Другим важным наблюдением, сделанным благодаря опытам по клонированию генов и определению их первичной структуры, является доказательство различий в использовании набора кодонов для разных генов. Зто было, в частности^обнаружено для двух генов глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы, с одной стороны, и генов изо-I- и изо-2-цптохромов с - с другой стороны ( Olson, 1981). Возможно, что различия в частоте использования кодонов связаны с регуляцией эффективности трансляции.

Немалый вклад эксперименты но клонированию генов внесли и в понимание механизма сплайсинга. Была, например, доказана высокая филогенетическая консервативность системы сплайсинга, поскольку ферментативная система из шпорцевой лягушки Xenopus катализировала корректный сплайсинг предшественников тРНК из дрожжей (Olson 1981).

Благодаря успехам в экспериментах по клонированиюгенов появилась возможность определения первичной структуры многих генов дрожжей и прилегающих к ним участков. Это позволило выявить некоторые общие черты строения генов и высказать предположения об их функциональной значимости. Так, важная информация была получена в результате клонирования гена 3-фосфоглицераткиназы (3-ФГК) дрожжей. Этот ген былклонирован при помощи плазмиды рВ1 с использованием методап.иммунологического скрининга ( Hitzeman;'et al., 1980). В составе гена обнаружена рамка считывания длиной I 251 пар оснований, кодирующая 416 аминокислотных остатков; интрон в ее составе не содержится ( Hitzemarm et al., 1982). Интересно, что набор кодонов, используемых в этом гене, чрезвычайно ограничен: из 61 возможного значащего кодона в нем используется главным образом 25. Между участком начала транскрипции и трансляции располагается 36 нуклеотидов, а между кодоном-терминатором и участком окончания транскрипции - 86-93 нуклеотида. На расстоянии 145 нуклеотидов от инициирующего трансляцию кодона обнаружена последовательность TATAIATAAA, которая, видимо, является участком связывания РНК-полимеразы II. Наличие такой или сходной с ней последовательности (например, последовательности Гольдберга-Хогнесса ТАТААА) характерно для генов высших эукариот, а также для их вирусов. Правда, в гене 3-ОГК эта последовательность находится на большем расстоянии от начала гена, чем последовательность Гольдберга-Хогнесса у высших организмов.

Большое значение имело использование методов генной инженерии и для выяснения организации генов рибосомной РНК. Так, было выяснено, что в отличие от высших организмов, в клетках дрожжей гены 5S РНК располагаются между генами 5,8 s 18 s и 25 s рРНК, причем геп для каждой из этих РНК входит в виде одной копии в повтор рДНК с размером 10 ки-лобаз. Удивительным оказалось то, что транскрипты 5 s РНКи больших рРНК транскрибируются с разных цепей ДНК (Philip-psen et al., 1978). Позднее было установлено, что гены рДНК существуют в виде тандемных повторов по 100-150 копий, которые локализуются в хромосоме ХП дрожжей ( Petes 1979).

Другим направлением, в котором использование клонирования генов оказалось весьма информативным, является анализ мутаций по структурным генам. Выделение аллели дикого типа методами генной инженерии позволяет использовать его для получения соответствующего мутантного гена методами ДНК-ДНК гибридизации; такой подход был использован, в частности, при анализе генов тРНК, кодирующих тирозиновые нонсенс-суп-рессоры: sup3 амбер ( Rothstein 1979), sup4 4-охр ( Goodman et al., 1977), sup,б-охр ( Wallace et al., 1980), a также сериновые супрессоры: sum 5-oxp ( Olson 1981). После определения нуклеотидной последовательности мутантных генов было установлено, что супрессия нонсенс-кодонов осуществляется благодаря замене нуклеотида во 2-ом или 3-м положении антикодона тРНК. Курьян с соавторами детально исследовали свойства вторичных внутривенных мутаций, которые оказывают влияние на эффективность супрессии за счет тирозпновой тРНК sup 4-охр ( Kurjan et al., 1980). После повторного клонирования таких мутантных генов и определения их первичной структуры было установлено, что все вторичные мутации являются точечными и включают в себя транзиции, трансверсии и делеции одной пары оснований. Они локализуются по всей длине кодирующей части гена, начиная от последней пары оснований в 3-конце и до пары оснований, располагающейся в?третьем положении от 5 -конца кодирующей части гена.

Недавно в экспериментах по клонированию из дрожжей SchizosaccharomyceG pombe был выделен ген сериновой тРНКsup 3, являющийся эффективным супрессором триплета UG-A (Hottinger et al., 1982). Банк генов для этих целей был получен на основе гибридной плазмиды YRp17 являющейся производным плазмиды YRp12При трансформации клеток пекарских дрожжей S.cerevisiae были получены клоны, содержащие плазмиду со вставкой суп-рессорного гена; трансформанты появлялись с невысокой частотой, что свидетельствовало о присутствии супрессорного гена в неинтегративной плазмиде. Б опытах по определению нуклео-тидной последовательности вставки было установлено, что она содержит помимо тРШ^Ц1 вторую тРНК, обладающуюспецифичностью к метионину. Две молекулы тРНК разделены короткой последовательностью, содержащей всего семь нуклеотидов. Примечательной особенностью этой работы является то, что в ней доказана активность супрессора из s.pombe в другом виде дрожжей - s.cerevisiae ( Hottinger et al., 1982). Следовательно, ген сериновой тРНК не только нормально транскрибируется, но и процессируется в родственном виде дрожжей. Из этих данных можно заключить, что контрольные сигналы транскрипции гена сериновой тРНК из S. ротЪе распознаются гетерологичной РгК-полимеразой Ш из клеток S.cerevisiaeБ настоящее время интенсивно проводятся эксперименты по клонированию генов, кодирующих рибосомные белки дрожжей. Одним из приемов, используемых для таких экспериментов, является получение мутантов по рибосомному белку с характерным фенотипическим проявлением. Так Орид и Уориер (Pried and.Warner I981) получили на основе плазмиды рТСЫ банк дрожжевых генов из мутанта, обладающего устойчивостью к ингибитору элонгации белкового синтеза - триходермпну. Далее с помощью такого банка была проведена трансформация родительских клеток, чувствительных к антибиотику, и отобраны устойчивые клоны. Такие клоны содержали плазмиду со вставкой дрожжевой ДНК размером 13,5 килобаз; после субклониро-ванпя размер вставки был уменыпем до 3,2 килобаз. Г состав фрагмента ДНК дрожжей входил ген рибосомного белка L3 мутация по которому и придает клеткам свойство устойчивости к триходермпну.

Ларкин и Булфорд ( Larkin and V/oolford 1933) провели эксперименты по клонированию аллели дикого типа гена CRY1, предающего клеткам дробей свойство устойчивости к антпбиоJ3тику криптоплеурину, а также рецессивной аллели cry 1 Продуктом этих генов оказался рибосомный белок малой субчастицы - 59. Ген CRY1 расположен вблизи от локуса типа спаривания L1AT в хромосоме Ш. По генетическим данным, расстояние между генами CRY1 и IvlAT равно 2,2 сантиморга-нал, а физическое расстояние рассчитано равным 21 тысяче пар оснований. С помощью метода блоттиига авторы доказали, что в геноме дрожжей содержится лишь один ген CRY1. ;,з составе гена, вцдрпло, содержатся нитроны, суммарная длина последовательности нуклеотидов в интронах рассчитана равной 330. Генов, кодирующих другие рибосомные белки, вблизи от гена CRY1 обнаружено не было, что может свидетельствовать об отсутствии кластера, кодирующего рибосомные белки в районе расположения гена CRY1Данные об организации генов, кодирующих рибосомные белки дрожжей, которые были получены с помощью клонирования, представлены в главе о рибосомных белках. Следует сказать, что благодаря большому методическому арсеналу, используемому в настоящее время в экспериментах по клонированию, возможности их использования чрезвычайно разнообразны и, крометого, постоянно расширяются. Так, например, весьма информативным для понимания молекулярных механизмов сложных клеточных процессов является следующий подход: клонирование генов, продукты которых необходимы для нормального протекания того или иного процесса (спаривания, споруляции, инициации митотического цикла и т.п.), с последующей трансляцией специфичной для гена мРНК в бесклеточной системе. К полученному in vitro продукту гена могут быть получены антитела, которые возможно использовать для изучения внутриклеточной локализации продукта, исследования его функций и т.п.

Другим многообещающим направлением, развивающимся благодаря успехам генной инженерии, является проведение мутагенеза изолированного гена in vitro с последующим введением его в клетку и исследования функциональных свойств. С помощью такого подхода была, в частности, получена информация по структуре промоторов РНК-полкмеразы П и Ш ( Cordenet al.,1980; Sakonju, 1980), а также по функциональной роли интронов ( Gruss and Khoury 1980).

Поскольку механизмы экспрессии генов в клетках дрожжей и высших эукариот во многом сходны, в перспективе дрожжевые клетки могут быть использованы для изучения экспрессии и регуляции генов высших организмов. Хотя первые попытки экспрессии генов млекопитающих (например, гена -глобина кролика) в клетках дрожжей оказались безуспешными из-за отсутствия нормальной транскрипции ( Beggs et al., 1980), тем не менее, следует признать, что неудача этих попыток обусловлена скорее не принщшиальными, а чисто методическими сложностями, которые могут быть преодолены.

Учитывая быстрые успехи генно-инженерных подходов в решении вопросов, касающихся структурной организации генома и его экспрессии, молено надеяться, что в ближайшем будущем будет решен вопрос о физическом картировании всего дрожжевого генома. Такая возможность представляется реальной в связи с относительно небольшими размерами генома дрожжей и низким содержанием в нем повторяющихся последовательностей. Значительный прогресс может быть достигнут и в таких вопросах, как эффект положения гена, генетическая нестабильность, локализация и роль повторяющихся последовательностей ДНК и т.д. Выяснение этих вопросов может сыграть важную роль в понимании более общих биологических проблем и при исследовании более сложно организованных высших эукариотических организмов.

Данные по клонированию гена СУН2, кодирующего рибосомный белок Ъ 29 (YL 24) приведены в главе "Строение и функционирование рибосом эукариот", а также "Рнбосомные мутанты эукариот".

МАТЕРИАЛЫ и МЕТОДЫВыращивание клеток дрожжей на твёрдой питательной среде.

Твёрдая полная питательная среда (УАРБ) содержала в г/л : пептона - 20, дрожжевого экстракта - 10, глюкозы -20, агара - 20.

Для проверки ауксотрофных потребностей мутантов проводили выращивание на среде sd лишённой одной или нескольких добавок. Проверку на дыхательную недостаточность проводили на средах, содержащих вместо глюкозы 2% глицерин или этанол.

Выращивание клеток дрожжей на жидкой питательной среде.

Жидкие питательные среды содержали те же компоненты, что и твёрдые, за исключением агара.

Разрушение клеток.

Клетки дрожжей разрушали разными методами в зависимости от тех целей, для которых их использовали. При выделении полисом и рибосом клетки обычно разрушали в дезинтеграторе SCP (LKB, Швеция) или дезинтеграторе фирмы В rawn (ФРГ) с охлаждением. Для выделения митохондрий, а также для получения сферопластов в опытах по трансформации клеток использовали ферментативный препарат зимолиазу 60 ООО ИЛИ 5 ООО ИЗ Arthrobacter luteus ( Zymolyase 60 ООО, 5 000, Seikagaku Kogyo, Go Ltd. ), руководствуясь при этом рекомендациями, предлагаемыми фирмой-производителем. Для получения пост-рибосомной надосадочной жидкости и её последующего использования в качестве источника фактора диссоциации или рН-5-фракции обычно использовали разрушение в прессе Хьюза из замороженного состояния.

Выделение полисом и рибосом.

Определение скорости белкового синтеза в интактных клетках.

Определение скорости синтеза РНК в интактных клетках.

Определение кинетики распада полщжбосом.

Сравнение количества связанной с 80s рибосомами пептидил-тРНК по образованию пептидил-^-пуромицина.

Количественная оценка связанной с -рибосомами пептидил-тРНК.

Определение акцепторной специфичности связанной с рибосомами тРНК.

Определение размеров новосинтезированного пептида, связанного с рибосомами в виде пептидил-тРНК.

Определение способности к диссоциации на субчастицы рибосом. связанных с пептидил-тРНК.

Т4Определение поли-и -зависимого включения С фенилаланина в бесклеточной системе, реконструированной из рибосомных субчастиц.

Изучение влияния пуромицина на поли-и -зависимое включениефенилаланина. катализируемое 80S рибосомами родительского штамма и Hts -ревертанта.

Изучение эффекта паромомицина на супрессию нонсенс мутаций in vivo.

Определение кинетических констант в реакции деацилирования метионил-тРНКм|ТПолучение гомогенных препаратов метионил-, изолейцил-и фенилаланил-тРНК-синтетаз из E.coli проводили, как описано в работах ( Cassio, Y/aller, 1971; Fayat et al., 1974 ) В экспериментах использовали очищенную тРНКфет( Blanquet et al., 1973 ), акцептирующую 1,6 нмолей метионина на единицу оптической плотности AggQ. Аминоацилирование тРНК проводили с использованием С метионина, имеющего удельную радиоактивность 53 мкюри/ммоль (Комиссариат Атомной энергии, Сакле, Франция). За ходом реакции ферментативного деацилирования следили по исчезновению в реакционной смеси нерастворимой в ТХУК С аминоацил-тРНК. Перед проведением экспериментов по определению скорости ферментативного деацилирования измерялась скорость спонтанного деацилирования ^С метионил-тРНКМфТ в присутствии 5 мМ MgCIg или спермидина. Остальные детали эксперимента описаны в работе (Sourgoutchov et al., 1974).

Я 14Далее из клеточных экстрактов, содержащих Н или урацил, отбирали аликвоты объёмом 1 мл, смешивали их и наносили на градиенты концентрации сахарозы (6 - 41%, (w/v ), содержащей 0,05 М трис-HCI-, р5 мМ McjC^ и 0,5 М КС£. Разделение субчастиц проводили в роторе sw 27 в течение 14 час при 23 000 об/мин. После окончанифентри-фугирования собирали фракции объёмом 1 мл и переносили их в сцинтиляционные флаконы, содержащие по 9 мл диоксано-вого сцинтиллятора. Определение радиоактивности проводили на счётчике радиоактивности Марк—II. Для определения отношения субчастиц кривые переносили на картон, после чего вырезали и взвешивали пики. Отношение поглощения 60s и 40 s субчастиц для стехиометрической смеси рассчитано равным 2,2 : 1.

Определение содержания свободных рибосомных субчастид у штаммов, несущих супрессорные субчастиды.

В экспериментах по определению действия ингибиторов трансляции азид натрия в концентрации 1 мМ добавляли к растущей культуре за 15 мин до сбора клеток, циклогексимид в концентрации 30 мМ - за 5 мин до сбора клеток. Центрифугирование проводили в градиенте концентрации сахарозы в течение 14 час при 20 ООО об/мин в опытах с азидом натрия и в течение 7 час при 24 ООО об/мин в опытах с циклогексимид ом.

Электрофорез белков рибосом в полиакриламидном геле.

Одномерный электрофорез проводили в градиенте концентрации акриламида 10-25% в присутствии 2% додецилсульфа-та натрия с использованием буферной системы Лэмли (Laemmli 1970 ). Другие детали электрофореза описаны в работе ( Stocklein and Piepersberg, 1980).

Равноосный диализ проводили по методу Штокляйна и Пиперсберга ( Stocklein and Piepersberg,1980)} используя ДЛЯ qэтой цели Н циклогексимид с удельной радиоактивностью 1,2 кюри/ммоль в интервале концентраций 0,22 - 1,79 мкМ. Во все образцы для равновесного диализа вводили надосадо-чную жидкость в концентрации (по белку) 0,8 мг/мл. Надо-садочную жидкость получали после центрифугирования пост-митохондриального экстракта при 105 ООО cj, в течение двух часов.

Изучение механизма дыхательной недостаточности.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Сургучев, Андрей Павлович

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1). Исследован механизм рецессивной супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae . Использование температурочувствительных (Hts-) штаммов дрожжей, несущих рецессивные супрессорные мутации supl и sup2 , позволило установить, что температурочувствительным этапом является трансляция. В непермиссивных условиях в клетках Hts -супрессорных штаммов происходит ингибирование белкового синтеза,обусловленное распадом полисом и накоплением 80s рибосом, связанных с пептидил-тРНК. Эти данные свидетельствуют об участии продуктов генов-супрессоров в терминации белкового синтеза. Сравнение свойств рибосомных субчастиц из супрессорного и родительского штамма в поли-U -зависимой системе белкового синтеза показало, что различия в свойствах рибосом обусловлены большой 60S рибосомной субчастицей.

2). В экспериментах с использованием супрессорных штаммов, чувствительных к пониженной температуре (Lts -мутанты) обнаружено влияние непермиссивной температуры на сборку большой 60s рибосомной субчастицы, что свидетельствует о локализации продуктов генов-супрессоров в 60 s субчастице.

3). Проведено изучение класса супрессорных мутантов, зависимых от антибиотика циклогексимида. В опытах по равновесному диализу обнаружены различия в значении Ка для связывания циклогексимида с 80 s рибосомами и 60S субчастицами для супрессорных и родительских штаммов. Обнаружены различия в спектрах кругового дихроизма для рибосом из циклогексимид-зависимого и родительского штаммов. В присутствии циклогексимида спектры рибосом из супрессорного штамма изменяются таким образом, что становятся идентичными спектрам рибосом из родительского штамма. Эти результаты свидетельствуют об изменении структуры рибосомы в супрессорных штаммах дрожжей. Наиболее вероятно, что мутационное изменение влияет на конформацию большой рибосомной субчастицы.

4). В опытах по определению уровня ошибок трансляции в поли-U -зависимой системе белкового синтеза установлено, что рибосомы из супрессорных штаммов дрожжей характеризуются повышенным уровнем неоднозначности трансляции, Наибольшие различия в уровне рибосомной неоднозначности проявляются в присутствии антибиотиков паромомицина и неомицина, а также при повышенной концентрации M<j?+. Эти результаты позволяют заключить, что в основе супрессии лежит механизм повышенной рибосомной неоднозначности.

5). При электрофоретическом анализе рибосомных белков в полиакриламидном геле обнаружено изменение подвижности рибосомных белков в штаммах, несущих супрессорные мутации. В мутантах по гену s^pi молекулярная масса белка с изменённой электрофоретической подвижностью составляет 26 000-28 ООО, в мутантах по гену sup2 23 000-25 000.

6). На основе космиды рЗОЗО получен банк генов дрожжей дикого типа, использованный для клонирования гена supl .

В опытах по трансформации выделена космида PYS1 , содержащая фрагмент дрожжевой ДНК с геном supl .Построена рестрикционная карта космиды и вставки ДНК дрожжей; размер вставки определён равным 7 килобазам.

7). Проведено субклонирование вставки ДНК дрожжей, содержащей ген supl . в результате получен набор плазмид с разными частями фрагмента. В опытах по определению способности таких плазмид комплементировать с геном supl определены границы гена в первоначально клонированном фрагменте.

8). При использовании меченого по фосфору препарата плазмиды рРВМ 8 в качестве гибридизационной пробы обнаружили три клона Esherichia coli , содержащих ген supl в банке генов дрожжей на основе плазмиды °V-13 .Рестрик-ционные карты вставок дрожжевой ДНК в плазмидах pis2 pYS3 и pYS4 , изолированных из этих клонов, совпадает с картой вставки в исходной космиде pYSl

9), Методом гибридизационной селекции на плазмидах рРЕМ 8, рРВМ 10 и рРВМ 14 выделили мРНК, специфичную для гена SUP1 . При трансляции такой мРНК в бесклеточных системах белкового синтеза из ретикулоцитов кролика и проростков пшеницы образуется полипептид с молекулярной массой

26 ООО - 28 ООО. По электрофоретической подвижности этот полипептид идентичен рибосомному белку L9 , обладающему изменённой электрофоретической подвижностью в супрессорных штаммах по гену supl . Эти данные позволяют сделать вывод о том, что продуктом гена supl является рибосомный белок Ь9

10). Мутации по генам supl и sup2 могут приводить к дыхательной недостаточности клеток, В таких дыхательно недостаточных штаммах уменьшено содержание митохон-дриально кодируемых цитохромов. Общая интенсивность синтеза белка в митохондриях таких мутантов также понижена по сравнению с родительскими штаммами. В опытах с использованием дыхательно-недостаточных мутантов с условным проявлением установлено, что снижение интенсивности белкового синтеза в митохондриях мутантов обусловлено различиями в свойствах митохондриальных рибосом. Высказывается предположение о том, что в состав цитоплазматических и митохондриальных рибосом входят общие белки, изменяющиеся в результате супрессорных мутаций и кодируемые генами supl и sup2

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одной из основных задач настоящей работы являлось выяснение механизма рецессивной супрессии у дрожжей, впервые обнаруженной советским генетиком профессором С.Г.Инге-Вечтомо-вым (Инге-Вечтомов, 1964). На первом этапе экспериментального исследования при использовании условно-летальных штаммов дрожжей, несущих супрессорные мутации, удалось установить, что рецессивная супрессия реализуется на уровне трансляции, причём продукты генов-супрессоров принимают участие в этапе терминации белкового синтеза. Далее эксперименты с использованием чувствительных к пониженной температуре, а также зависимых от циклогексимида супрессорных мутантов позволили предположить, что продуктами генов-супрессоров являются некие компоненты рибосомы. Данные по "широкой кодоновой специфичности супрессоров послужили указанием в пользу того, что супрессия может реализоваться за счёт повышенной рибосомной неоднозначности. Такое предположение было подтверждено в экспериментах по определению уровня рибосомной неоднозначности in vitro .при использовании в качестве матрицы полиуридиловой кислоты в бесклеточной системе белкового синтеза был обнаружен более высокий уровень ошибок функционирования рибосом из супрессорных штаммов по сравнению с рибосомами из родительских клеток. Различия в уровне ошибок трансляции становились более выраженными в присутствии агентов, стимулирующих ошибки бежового синтеза на рибосомном этапе: аминогликозидных антибиотиков неоглицина и паромомицина, а также при повышении концентрации 2+ ионов Mg . Результаты по определению уровня ошибок в бесклеточной системе бежового синтеза подтверждались экспериментами, проведёнными in vivo , до выяснению взаимодействия эффектов супрессорных мутаций и действия антибиотика паромомицина. Оказалось, что эти два фактора обладают синергическим действием, в результате чего расширяется специфичность действия супрессоров по отношению к нонсенс-мутациям разного типа. Поскольку мишенью для паромомицина является рибосома, а механизм действия этого антибиотика заключается в повышении уровня ошибочной трансляции ( Palmer et al., 1979 ), можно было заключить, что супрессорные мутации также обладают эффектом повышения неоднозначности белкового синтеза.

Таким образом, все полученные экспериментальные данные согласовывались с предположением о том, что продуктами генов супрессоров являются рибосомные белки, контролирующие точность трансляции.Обнаружение изменений в электрофоретической подвижности рибосомных белков из штаммов, несущих рецессивные супрессорные мутации, подтверждало такое предположение. Однако, окончательный вывод о природе продуктов генов supl и sup2 был сделан лишь после проведения экспериментов по клонированию гена SUP1 с последующим получением мРНК, специфичной для этого гена и её трансляцией в бесклеточной системе бежового синтеза.В' этих экспериментах было установлено, что продуктом гена SUP1 является полипептид, идентичный по электрофоретической подвижности и молекулярной массе рибосомному бежу с изменённой подвижностью.

Следует сказать, что супрессоры в эукариотических клетках, механизм действия которых обусловлен рибосомной мутацией, были обнаружены нами впервые. К настоящему времени известен лишь один хорошо документированный пример супрессии у эукариот, для которого установлено, что в его основе лежит мутация по рибосомному белку, приводящая к повышенной неоднозначности трансляции ( Ishiguro et al., 1981;

Masurekar et al., в ряде других работ тлеются косвенные свидетельства в пользу аналогичного механизма ( Picard-Bennoun,1981).

Помимо выяснения молекулярного механизма рецессивной супрессии полученный экспериментальный материал позволяет сделать выводы, имеющие более общее значение :

1). Благодаря использованию широкого круга мутантов с плейо-тропным проявлением супрессорной мутации удалось установить, в каких функциях участвуют рибосомные белки, являющиеся продуктами генов supl и sup2 , Так, белок ци-топлазматических рибосом, являющийся продуктом гена supl ,участвует в определении точности функционирования рибосомы, в сборке рибосомной субчастицы, в диссоциации рибосом на субчастицы. Кроме того, мутации по этому белку влияют на чувствительность клеток к антибиотику паромомицину, а также на функционирование митохондриального аппарата трансляции. Мутации по гену sup2 обладают, в основном, близким набором плейотропных проявлений, что позволяет предположить сходство функциональной роли, выполняемой продуктами генов SUP1 и sup2 Следует отметить, что данные по функциональной роли белков эукариотических рибосом до настоящего времени в литературе практически отсутствовали.

2). Исследование дыхательной недостаточности супрессорных мутантов показало существование связи между аппаратом белкового синтеза цитоплазмы и митохондрий. Изменение свойств цитоплазматических и митохондриальных рибосом в результате мутаций по генам supl и sup2 послужило основанием для вывода о наличии общих белков в составе рибосом цитоплазмы и митохондрий. Эти белки могут принимать участие в координации белкового синтеза в этих клеточных компартаментах. До недавнего времени считалось, что белки и ферменты, осуществляющие аналогичные функции в цитоплазме и митохондриях, всегда кодируются разными генами. Первым фактом, ставящим под сомнение универсальность такой концепции, являлась работа Хупер с соавт., в которой было установлено, что мутация по ядерному гену ТШ 2 дрожжей изменяют свойства фермента тРНК-(уридин-5)- метилтрансферазы как в цитоплазме, так и в митохондриях ( Hooper et al„1982). Данных же о наличии общих рибосомных белков в цитоплазматических и митохондриальных рибосомах в литературе до сих пор не имелось.

Итак, в настоящей работе удалось получить ответы на основные вопросы, касающиеся механизма рецессивной супрессии и идентификации генов-супрессоров и их продуктов. Однако, это, на наш взгляд, не означает исчерпания научной проблемы, а наоборот, ставит целый ряд вопросов, требующих своего решения, а также создаёт возможности для применения полученных результатов для некоторых прикладных целей.

Так, клонирование супрессорного гена, кодирующего рибосомный белок, создало возможность для выделения промотора этого гена. Поскольку клетки дрожжей синтезируют рибо-сомные белки в больших количествах, такой промотор, присоединённый к структурной части любого гена, может вызывать активный синтез полипептидного продукта, необходимого, например, для медицинских целей. В настоящее время количество клонированных генов с активными промоторами крайне ограничено.

Другим направлением для дальнейших исследований, на наш взгляд, является доказательство наличия общего белка для рибосом митохондрий и цитоплазмы и его выделения из митохондриальных рибосом. Предположение относительно с существования такого общего компонента, сделанное в настоящей работе, основано на целом ряде косвенных наблюдений и, на наш взгляд, требует более прямой экспериментальной проверки. Целесообразность продолжения работы в этом направлении объясняется несколькими причинами. Во-первых, такой общий компонент аппарата митохондриального и цитоплазматического белкового синтеза может выполнять важную роль в координации синтеза компонентов рибосомы и в функционировании аппарата трансляции в этих двух клеточных компартаментах. Данные о наличии общего компонента, входящего в состав ци-топлазматических и митохондриальных рибосом, в литературе до настоящего времени отсутствовали. Во-вторых,сравнение структуры митохондриального и цитоплазматического белка, являющегося продуктом одного ядерного гена, может представлять значительный интерес для понимания механизма процессинга полипептида при прохождении его через митохондриаль-ную мембрану. Кроме того, представляет интерес сравнение функциональной роли рибосомного белка, являющегося продуктом одного гена, но входящего в состав структурно различных рибосом в двух клеточных компартаментах.

Третье направление возможных исследований может быть связано с выявлением функциональной гомологии генов supl и sup2 и их продуктов. Сходный спектр плейотропных проявлений мутаций по - генам supl и sup2 5 а также близкие значения молекулярной массы белков-продуктов этих генов свидетельствуют о сходном строении и функциональной роли двух генов и соответствующих им продуктов. С другой стороны, возможность получения летальных мутаций по одному из генов при сохранении второго гена интактным доказывает отсутствие полной взаимозаменяемости между продуктами генов supl и sup2 .Нам представляется вероятным, что гены supl и sup2 произошли от общего предшественника и, сохранив целый ряд общих структурных и функциональных характеристик, тем не менее, приобрели в ходе эволюции некоторые уникальные свойства.

Кроме того, обнаружение класса мутантов с повышенным уровнем рибосомной неоднозначности, создаёт возможность для исследования вопроса о физиологической роли ошибок трансляции. Очевидно, что в штаммах, несущих рецессивные супрессорные мутации, эффект таких мутаций неспецифичен по отношению к нонсенс-триплетам, а приводит к общему повышению ошибок белкового синтеза. Несмотря на это, клетки сохраняют высокую жизнеспособность и, следовательно, повышение в определённой степени уровня ошибок трансляции не является летальным. Более детальное исследование физиологической роли неоднозначности белкового синтеза может быть проведено на мутантах с разной эффективностью супрессии.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Сургучев, Андрей Павлович, 1984 год

1. Бачинский А.Г. Математический анализ неоднозначности матричных процессов как фактор адаптации. В сб. ^'Исследования по генетике" (Издательство ЛГУ, Ленинград), 1981, вып.9, стр. 147-155

2. Инге-Вечтомов С.Г. Реверсии к прототрофности у дрожжей, нуждающихся в аденине. Вестник ЛГУ, 1964, сер.биол., №9,вып.2, стр.117-125

3. Инге-Вечтомов С.Г.£имаров Б.В. Связь супрессии и межа-ллельной комплементации В локусе adeg у Saccharomyces cerevisiae . Исследования по генетике, 1967, т.3,стр. 127-148 (Издательство Ленинградского государственного университета)

4. Инге-Вечтомов С.Г. Антисупрессия. Генетика, 1967, J&9, стр.I76-I8I

5. Инге-Вечтомов С.Г., Андрианова В.М. Рецессивные супер-супрессоры у дрожжей. Генетика, 1970, т.6, Ml, стр. I03-II5

6. Инге-Вечтомов С.Г.,Кожин С.А.,Симаров -Б.В., Сойдла Т.Р. Неоднозначность действия гена. Исследования по генетике, 1971, сб.4, стр.13-35 (Издательство Ленинградского университета).

7. Инге-Вечтомов С.Г.,Андрианова В.М. Новый тип суперсупрес-соров у дрожжей. В кн."Молекулярные механизмы генетических процессов", Издательство "Наука", Москва,1972, стр. 189-195

8. Ларионов В.Л.,Гришин А.В.,Паршкова Т.А. и Трауготт М.Н. Индукция экстрахромосомной рДНК у дрожжей-сахаромицетов. Молекулярная биология, 1981, т.15,вып.I, стр.124-131

9. Миронова Л.Н.,Инге-Вечтомов С.Г.,Лызлова Л.В., Фоминых Е.С., Сургучёв А.П., Смирнов В.Н. Генетический контроль1.трансляции терминирующих кодонов у дрожжей. Исследования по генетике", 1976, т.7, стр.45-58

10. Спирин А.С., Гаврилова Л.П. "Рибосома", Издательство "Наука", Москва, 1971

11. Тер-Аванесян М.Д., Инге-Вечтомов С.Г. Локализация мутаций ВО II хромосоме дрожжей Saccharomyces cerevisiae

12. Генетика, 1974, т.10, стр.117-121

13. Тер-Аванесян М.Д., Инге-Вечтомов С.Г. Взаимодействие доминантных И рецессивных супрессоров у дрожжей Saccharomyces cerevisiae . Генетика,1980, Т.16, стр. 86-94

14. Тер-Аванесян М.Д., Сойдла Т.Р. Механизмы терминации трансляции. Молекулярная биология, 1981, т.15, вып. 3, стр. 485-516

15. Allen S.H. and Wong K.P. A comparative study of the hydrodynamic shape, conformation and stability of E. coli ribosomal subunits in reconstitution buffer. Arch.Biocem. Biophys., 1979,v.195, pp.112-120

16. Alwine J.G., Kemp D.J. and Stark E.R. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper hybridization with DNA probes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, v.74, 53505354

17. Amesz w.j.C., Bevers E.M. and Bloemers h.p.j. Dissociation of yeast ribosomes; the effects of hydrostatic pressure and KGL. Mol.Biol.Reports, 1973, v.1, pp.33-39

18. Atkins J.F. Is UAA or UGA part of the recognition signal for ribosomal initiation? Nucl.Acids Res., 1979, v.7, pp.Ю35-Ю41

19. Baldwin A.N. and Berg P. Transfer-RNA-induced hydrolysis of valyladenilate bound to isoleucyl-RNA synthetase. J.Biol. Chem., 1966, v. 241, pp. 839- 845

20. Barrell B.G., Anderson S., Baubier A.T. Different pattern of codon recognition by mammalian mitochondrial tRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, v.77, pp.3164-3166

21. Bayliss F.T. and Ingraham J.L. A mutation in S.cerevisiae conferring streptomycin and cold sensitivity by affecting ribosomes. J.Bacteriol., 1974, v.118, pp.319-325

22. Bayliss F.T. and Vinopal R.T. Selection of ribosomal mutants by antibiotic suppression in yeast. Science, 1971, v.174, pp. 1339-1341

23. Beaudet A.L., Gaskey C.T. Mammalian peptide chaintermination. II. Codon specificity and GTPase activity of release factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1971, v.68, pp.619-624

24. Bechmann H., Haid A., Schweyen R. J., Mathews S. and Kaudewitz P. Expression of the "split gene" COB in yeast mtDNA. Translation of intervening sequences in mutant strains. J.Biol.Chem., 1981, v.256, pp.3525-3531

25. Beggs J.D., van den Berg J., van Vyen A., Weisman C. Abnormal expression of chromosomal rabbit^-globin gene. Nature, 1980, v.283, pp.835-840

26. Beller R.J. and Lubsen N.H. Effect of polypeptide chain lenght on the dissociation of ribosomal complexes. Biochemistry, 1972, v.11, pp.3271-3276

27. Bennetzen J.L. and Hall B.D. The primary structure of the Saccharomyces cerevisiae gene for alcohol dehydrogenase I. J.Biol.Chem., 1982, v.257, pp.3018-3025

28. Berry C.H.J., Ibrahim M.A.K.,Coddington A. Characterisation of ribosomes from drag resistant strains of Schizo-saccharomyces pombe in a poly U directed cell free protein synthesising system. Иol.Gen.Genet., 1978, v.167, pp.217-225

29. Blanquet S.,Iwatsubo M. and Waller J.-P. The mechanism of action of methionyl-tRNA synthetase from E.coli. Eur.J .Biochem., 1973, v.36, pp.2.13-226

30. Baan R.A., Keller P.B., Dahlberg A.E. Isolation of euka-ryotic initiation factor 2 from yeast Saccharomyces cerevisiae. J.Biol.Chem., 1981, v.256, pp.1063-1066

31. Bollen A., Cabeson Т., Wilde M., Willaroel R., Herzog A. Alteration of ribosomal protein S17 by mutation linked to neamine resistance in Escherichia coli. I. General properties of nea A mutants. J .Iviol.Biol., 1975, v.99, pp.795-806

32. Bollen G.H.P.M., Eager W.H. , Planta R.J. High resolution mini-two-dimensional gel electrophoresis of yeast ribosomal proteins. A standard nomenclature for yeast ribosomal proteins. i4ol.Biol.Reports, 1981, v.8, pp.37-44

33. Bollini R., Soffientini A.N., Bertani A., Lanzani G.A. Some molecular properties of the elongation factor EF1 from embryons. Biochemistry, 1974, v.13, pp.5421-5425

34. Bonitz S.G., Berlani R., Coruzzi H., Li G., Macino F.G., NobregaM.P., Nobrega B.E., Thalenfeld B.E. and Tzago-loff A. Codon recognition rules in yeast mitochondria. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1980, v.77, pp.3167-3170

35. Bonnet J. and Ebel J.-P. Correlation of aminoacylation errors: evidence for a non-significant role of the ami-noacyl-tRNA synthetase catalyzed deacylation of amino-acyl-tRNA's. FEBS Lett., 1974, v.39, pp.259-264

36. Bonnet J., Giege. R. and Ebel J.-P. Lack of specificity in the aminoасу1-tRNA synthetase catalyzed deacylation of aminoacyl-tRNA. FEBS Lett., 1972, v.27, pp.139-143

37. Borst P. and Grivell L.A, The mitochondrial genome of yeast. Cell, 1978, v.15, pp.705-723

38. Borst P. and Grivell L.A. One gene's intron is another gene's exon. Nature, 1981, v.285, pp.439-440

39. Bos J.L., Heyting C.,Borst P., Arnberg A.C., van Bruggen E.F.J. An insert in the single gene for the large ribosomal RNA in yeast mitochondrial DNA. Nature, 1978, v.275, pp.336-538

40. Bossi L. Context effects: translation of UAG codon by suppressor tRNA is affected by the sequence following UAG in the message. J .Nol.Biol., 1983, v.164, pp.73-87

41. Boyen A., Piette J., Cunin R. and Glansdorff N. Enhancement of translation efficiency in Escherichia coli by mutations in a proximal domain of messenger RNA.

42. J Лol.Biol., 1982, v.162, pp.715-720

43. Bray G.A. Simple efficient liquid scintillation counter. Analyt.Biochem.,1960, v.1, pp.279-285

44. Brot N. , Tate W.P. , Caskey C.T. and Weissbach H. The requirement for ribosomal proteins L7 and L12 in peptidechain termination. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1974, v.71, pp.89-92

45. Buetovz D.E. and Wood W.M. The mitochondrial translation system. In Roodyn D.B. (ed.) Subcellular biochemistry, 1978, v.5, pp.1-85

46. Cabezon Т., Herzog A., De Wilde №., Villaroel R. and Bollen A. Cooperative control of translational fidelity by ribosomal proteins in E.coli. Mol.Gen.Genet., 1976, v.144, pp.59-62

47. Cannon M., Schindler D., Davies Л. Methylation of proteins in 60S ribosomal subunits from Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett., 1977, v.75, pp.187-191

48. CapecchiK.R. and Klein H.A. Realease factors mediating termination of complete proteins. Nature, 1970, v.226, pp.1029-ЮЗЗ

49. Cardelli J.and Pitot H.C. Isolation and characterisation of rat liver free and membrane-bound polysome messenger ribonucleaprotein particles. Biochemistry, 1977, v.16, pp.5127-5134

50. Caskey С.Т. Peptide chain termination. In 'Molecular mechanism of protein biosynthesis", 1977, (eds.VIeisbach H. and Pestka S.), pp.443-465

51. Caskey C.T., Bosch L. and Konecki D.S. Release factor binding to ribosorne required an intact 16S rRNA 3' terminus. J.Biol.Chem.,1978, v.252, pp.4435-4437

52. Caskey C.T., Tompbius R., Scolnick E., Caryk T. and Niren-berg К. Sequential translation of trinucleotide codons for initiation and termination of protein synthesis. Science, 1968, v.162, pp.135-138

53. Cassio D. and Waller J.-P. Modification of methionyl-tRNA synthetase by proteolytic cleavage and properties of the trypsin-modified enzyme. Eur.J.Biochem., 1971, v.20,pp.283-300

54. Celis J.E., Hooper M.I. and Smith J.D. Amino acid acceptor stem of E.cali suppressor tRNA"^r is a site of synthetase recognition. Nature Hew Biol.,1973, v.244, pp.261-264

55. Chaug A.C.Y. and Cohen S.N. Constraction and characterisation of amplifiable multicopy DNA cloning ehicles derived from P15A cryptic miniplasmid. J.Bacteriology, 1978, v.134, pp.1141-1156

56. Chatoo B.B., Palmer E., Ono B. and Sherman E. Patterns of genetic and phenotypic suppression of lys 2 mutations in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 1979, v.93, pp.67-79

57. Chevalier M.-R., Bloch J.-C. and Lacroute E. Transcriptional and translational expression of a chimeric bacterial-yeast plasmid in yeasts. Gene, 1980, v.11, pp.11-19

58. Church G.M. and Gilbert W. Yeast mitochondrial intron products required in trans for RNA splicing. In 'Mobilization and reassembly of genetic information". Eds. Scott W.A. et al., New York: Academic Press, 1980, pp.379

59. Church Sl^imski P.P. and Gilbert W. Pleiotropic mutations within two yeast mitochondrial cytochrome genes block mRNA processing. Cell, 1979, v.18, pp.1209-1215

60. Coppin-Raynal E. Ribosomal suppressors and antisuppressors in Podospora anserina: resistance to cycloheximide. J .Bacterid., 1977, v. 131, pp.876-883

61. Coppin-Raynal E. Ribosomal control of translational fidelity in Podospora anserina: a suppressor and an antisu-pressor affecting the parornomycin-induced misreading in vitro. Current Genetics, 1982, v.5, pp.57-63

62. Corden J., Wasylyk В., Buchwalder A., Sasson-Corsi P., Kedinger C. and Chambon P. Promoter sequences of eukaryo-tic protein-coding genes. Science, 1980, v.209, pp.1406-14

63. Coruzzi G., Trembath M.K. and Tzagloff A. The isolation of mitochondrial and nuclear mutants of Saccharomyces cerevisiae with specific defects in mitochondrial functions. Methods in Enzymilogy, 1979, В VI, pp.95-106

64. Coruzzi G. and Tzagoloff A. Assembly of the mitochondrial membrane system: nuclear suppession of cytochrom b mutation in yeast mitochondrial UNA. Genetics, 1980, v.95, pp. 891-903

65. Crick F.H.C. Codon-anticodon pairing: the wobble hypothesis. J .Mol.Biol. , 1966, v. 19, pp.548-555

66. Crick F.H.C., Barnett L. , Brenner S. and Watts-Tobin R.J. The general nature of the gcnetic code. Nature, 1961, v.192, pp.1227-1230

67. Crouzet I,ri. and Begucret J. Gold sensitivity of a double mutant strain combining two ribosomal mutations in the ascomycete Podospora anserina. Mol.Gen.Genet., 1978, v.165, pp.293-298

68. Gulbertson M .R., Underbrink KJi. and Pink G.R. Frame-shift suppression in S.cerevisiae. II. Genetic properties of group II suppressors. Genetics, 1980, v.95, p.833

69. Cummins C.M., Gaber R.F., Culbertson M .R., Mann R. and Fink G.R. Frameshift suppression in Saccharomyces cerevisiae. III. Isolation and genetic properties of group III suppressors. Genetics, 1980, v.95, pp.855-875

70. Dasmahapatra B. and Chakraburtty K. Protein synthesis in yeast. I. Purification and properties of elongation factor 3 from Saccharomyces cerevisiae. J.Biol.Chem., 1981, v.256, pp.9999-Ю004

71. Dasmahapatra В., Skogerson L. and Chakraburtty K. Protein synthesis in yeast. II. Purification and properties of the elongation factor 1 from Saccharomyces cerevisiae. J.Biol.Chem., 1981, v.256, pp.10005-;0011

72. Datta A., Dellaro C.D., Sierra J .M. and Ochoa S. Role of 3•:5'-cyclic-AMP-dependent protein kinase in regulation of protein synthesis in reticulocyte lysates. Proc.Natl. Acad.Sci. USA, 1977, v.74, pp.1463-1467

73. Davidoff-Abelson R. and Mindich L. A mutation that increases the activity of nonsense suppressors in Escherichia coli. Mol.Gen.Genet., 1978, v.159, pp.161-169

74. Davies J., Gilbert W. and Gorini L. Streptomycin, suppression and the code. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1964, v.51,p.883

75. Davies B.D., Tai P.C., Wallace B.J. Complex interactions of antibiotics with ribosomes. In"Ribosomes(eds. Nomuraet al. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1974, pp. 771-789

76. DeLa Salle H., J acq C. and Slonimslci P.P. Critical sequences within mitochondrial introns: pleiotropic mRNA matu-rase and cis-dominant signals of the box intron controlling reductase and oxidase. Cell, 1982, v.28,pp.721-732

77. Douglas К., Finkelstein D. and Butow R.A. Analysis of products of mitochondrial protein synthesis in yeast: genetic and biochemical aspects. Methods in Enzymology, (eds. Fleischner S., Packer L.} v.56, pp.58-65

78. Drews J., Bednarik K. and Grasmuk H. Elongation factor I from krebs II mouse ascite cells. Purification, structure and enzymatic properties. Eur«J.Biochem., 1974, v.41,pp. 217-227

79. Dudock В., Di Peri C., Scileppi K. and Reszelback R. The yeast phenylalanyl-tRNA synthetase recognition site: the region adjacent to the dihydrouridine loop. Proc.Natl. Acad.Sci. USA, 1971, v.68, pp.681

80. Ebel J.P., Giege R., Bonnet J., Kern D., Befort N., Bol-lack C., Fasiolo P., Gangloff J. and Dirheimer G. Factors determining the specificity of the tRNA aminoacylation reaction. Biochimie, 1973, v.55, pp.547

81. Ebner E., Mennucci L. and Schatz G. Mitochondrial assembly in respiration-deficient mutants oi; Saccharomyces cerevisiae. J.Biol.Chem., 1973, v.248, pp.5360-5368

82. Edelmann P. and Gallant J. Mistranslation in E.coli. Cell, 1977, v.10, pp.131

83. Eldred E.W. and Shimmel P. Rapid deacylation by isoleucyl-tRNA synthetase of isoleucine-specific transfer RNA ami-noacylated with valine. J.Biol.Chem., 1972, v.247, p.2961

84. Elias P., Lustig F. , Axberg Т., Akesson Б. and Lager-kvist U. Reading of the lysine codons in the MS2 coat protein cistron during protein synthesis in vitro. FEBS Lett., 1979, v.98, pp.145-151

85. Engel"berg-Kulka H. UGA suppression by normal in Escherichia coli: codon context effects. Nuc.Acids Res., 1981, v.9, pp.983-991

86. Engelberg-Kulka H., Deckel L., Israeii-Reches M. and Belfort M. The requirement of nonsense suppression for the development of several phages. Mol.Gen.Genet., 1979, v.170, pp.155-159

87. Farrell P.J., Sen G.G., Dubois M.F., Ratner L., Slattery E. and Lenguel P. Interferon action: two distinct patheways for inhibition of protein synthesis by double-stranded RITA. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1978, v.75, pp.5893-5897

88. Farrelly F. and Butow R.A. Rearranged mitochondrial genes in the yeast nuclear genome. Nature, 1983, v.301, pp.296301

89. Fayct G., Blanquet S., Dessen P., Batelier G. and Waller J.-P. The molecular weight and subunit composition of phenylalanyl-tKNA synthetase from Escherichia coli K-12. Biochimie, 1974, v.56, pp.35-41

90. Feinberg В., McLaughlin C.S. and Moldave K. Analysis of temperature-sensitive mutant ts 187 of Sacharomycrs cerevisiae altered in a component required for the initiation of protein synthesis. J.Biol.Chem.,1982, v.257,pp.10846-10851

91. Fersht A.R. and KaethnerM.M. Enzyme hypersensitivity, Rejection of threonine by the valyl-tRNA synthetase by misacylation and hydrolytic editing. Biochemistry, '1976, v.15, p.3342

92. Pluck К.1ч., Salser W. and Epstein R.H. The influenceof the reading context upon the suppression of nonsense codons. Mol.Gen.Genet., 1977, v.151, pp.137-149

93. Fox Т.Ю. and Staempfli 3. Suppressor of yeast mitochondrial ochre mutations that maps in or near the 155 ribosomal RNA gene of mtDNA. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1982, v.79, pp.1583-1587

94. Fried H.M. and Warner J.R. Cloning of yeast gene for tri-choderrain resistance and ribosomal protein L3. Proc.Natl. Acad.Sci. USA, 1981, v.78, pp.238-242

95. Friesen J.D., Iropak M. and An G. Mutations in the rplJ leader of Escherichia coli that abolish feedback regulation. Cell, 1982, v.32, pp.361-369

96. Gallwitz D. Construction of a yeast actin gene intron deletion mutant that is defective in splicing and leads to the accumulation of precusor RNA in transformed yeast cells. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1982, v.79, pp.3493-3497

97. Gallwitz D. and Sures J. Structure of a split yeast gene: complete nucleotide sequence of the actin gene in Saccharomyces cerevisiae. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1980, v.77, pp.2546-2550

98. GanosaM.C. Polypeptide chain termination in cell-free extracts of E.coli. Cold Spring Harbor Symp.truant.Biol. , 1966, v.31, pp.273-278

99. GanosaM.C. Novel factors in protein synthesis. Canad.J. Biochem., 1977, v.55, pp.267-281

100. GanosaM.C., Van der Meer J .P. , Debreceni N. and Phillips S.L. Mechanism of protein chain termination. Further characterization of a mutant defective in a new proteinsynthesis factor. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1973, v.70, pp.31-35

101. Gasior E., Herrera P., McLaughlin C.S. and Moldave K. The analysis of intermediary reactions involved in protein synthesis in a cell free extract of Saccharomyces cerevisiae that translates natural messenger MA. J.Biol. Chem., 1979, v.254, 3970-3976

102. Gavrilova L.P., Kostiashkina O.E., Koteliansky V.E., Rut-kevitch N.M. and Spirin A.S. Pactor-free ("non-enzymic") and factor-dependent systems of translation of polyuri-dylic acid by Escherichia coli ribosomes. J.Mol.Biol., 1976, v.101, 537-552

103. Gavrilova L.P. and Rutkevitch N.M. Ribosomal synthesis of polyleucine on polyuridylic acid as a template. PEBS Lett., 1900, v.120, pp.135-140

104. Gavrilova L.P. and Spirin A.S. Stimulation of "non-enzy-mic" translocation in ribosomes by p-chloromercuribenzoate. PEBS Lett., 1971, v.17, pp.324-326

105. Geller A.J. and Rich A. A UGA termination suppression tRNATrp active in rabbit reticulocytes. Nature, 1980, v.283, pp41-46

106. Gerlach W.L. Genetic properties of some amber-ochre super-suppressors in Saccharomyces cerevisiae. Mol.Gen.Genet.,1975, v.138, pp.53

107. Gerlach W.L. Mutational properties of supP amber-ochre supersuppressors in Saccharomyces cerevisiae. Mol.Gen. Genet., 1976, v.144, pp.213

108. Gestland R.P., WolfnerM., Grisafi P., Fiak G., Botstein D. and Rotu J.R. Yeast suppressors of UAA and HAG nonsense codons work efficiently in vitro via tPNA. Cell,1976, v.7, pp.381-390

109. Geyl D., Bock A. and Isono K. An improved method for twodimensional gel-electrophoresis: analysis of mutational-ly altered ribosomal proteins of Escherichia coli. hoi. Gen. Genetics , 1981, v.181, pp.309-312

110. Gieg6 R. , Kern 13. and Ebel J.-P. Incorect aminoacylation catalyzed by E.coli valyl-tRNA synthetase. PEBS Lett., 1972, v.15, 281-285

111. Gilbert J .M. and Anderson W.P. Isolation of dissociation factor. Methoas in Enzymology, 1971, v.20, pp.542

112. Glass R.E., Nene V. , Hunter M.G. Informational suppression as a tool for the investigation of gene structure and function. Biochem.J., 1982, v.203, pp.1-13

113. Goldman E., Holmes W.M., Hatfield G.W. Specificity of соleudon recognition by E.coli tRNA isoaccepting species determined by protein synthesis in vitro directed by phage RNA. J .Mol.Biol., 1979, v. 129, pp.567-585

114. Goldstein S. and Singal D.P. Alteration of fibroblast gene products in vitro from a subject with werner's syndrome. Nature, 1974, v.251, pp.719-721

115. Goodman H.M., Olson M.V. and Hall B.B. Nucleotide sequence of a mutant eukaryotic gene: the yeast tyrosine-inser-ting ochre suppressor sup4-0. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1977, v.74, pp.5453-5457

116. Gorenstein C. and Warner J.R. Synthesis and turnover of ribosomal proteins in the absence of 60S subunit assembly in Saccharomyces cerevisiae. Mol.Gen.Genet.,1977, v.157, pp.327-332

117. Gorini Ъ. The contrasting role of strA and ram geneproducts in ribosomal functioning. Cold Spring Symp. Quant. Biol.,1969, v.34,pp.101-109.

118. Gorini L.Informational suppression. Ann.Rev.Genet., 1970,v.4, pp.107-134.

119. Gorini L. Ribosomal discrimination of tRNAs. Nature New Biol., 1971, v.234, pp.261-264.

120. Gorini L. Streptomycin and misreading of the genetic code, in "Ribosomes" (Eds.M .Nomura et al.) Cold Spring Harbor Laboratory, 1974, pp.791-803.

121. Gorini L., Gundersen W.and Burger M. Genetics of regulation of enzyme synthesis in the arginine biosyn-thetic pathway of Escherichia coli. Cold Spring Symp. Quant. Biol., 1961, v.26, 173-189.

122. Gorini L. and Kataya E. Phenotypic repair by streptomycin of defective genotypes in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1964, v.51, pp.487-493.

123. Grant P.G.,Schindler D., Davies J.E. Mapping of tri-chodermin resistance in Saccharomyces cerevisiae : a genetic locus for a component of the 60S ribosomal subunit. Genetics, 1976,v.83, pp.667-673.

124. GrayM.W. Mitochondrial genome diversity and the evolution of mitochondrial DNA. Can.J.Biochem.,1982,v. 60, pp.157-171.

125. Greenberg J.R. Isolation of L-cell messenger RNA which lacks poly(adenylate). Biochemistry, 1976, v.15, pp. 3516-3523.

126. Gritz L.R., Miltin J.A., Cannon M., Littlewood В., Carter C.J., Davies J.E. Ribosomal structure, maturation of ribosomal RNA and drug sensitivity in temperature-sensitive mutants of Saccaromyces cerevisiae.2$е

127. Mol. Gen.Genet., 1982, v. 188, pp.384-391

128. Gross M.,Rabinovitz M. Control of globin synthesis in cell-free preparations of reticulocytes by formation of a translational repressor that is inactivated by hemin. Proc. Nat. Acad. Sci.USA, 1972, v. 69, pp.1565-1568

129. Gross M. and Mendelewski J. Additional evidence that the hemin-controlled translational repressor from rabit reticulocytes is a protein kinase. Biochem.Biophys. Res.Commun., 1977, v.74, pp.559-569

130. Gruss P. and Knoury G. Rescue of splicing defective mutant by insertion of an heterologous intron. Nature, 1980, v. 286, pp.634-637.

131. Hagenbuchle 0., Santer M., Steitz J.A. and Mans R. Conservation of the primary structure at the 3-end of 18S rRNA from eucaryotic cells. Cell, 1978, v.13, pp.551-563

132. Haid A., Grosch G., Schmelzer C., Schweyen R.J.,Kaudewitz P. Expression of the split gene COB in yeast mtDNA. Mutational arrest in the pathway of transcript splicing. Current Genetics, 1980, v.1, pp.155-161

133. HSall B. and Gallant J. Defective translation in RC cells. Nature New Biol., 1972, v.237, pp.131-134

134. Hanson D.K., LambM.R., Mahler H.R., Perlman P.S. Evidence for translated intervening sequences in the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae. J.Biol.Chem. 1982, v.257, pp.3218-3224

135. Hawthorn D.C. and Leupold U. Suppressor mutations in yeast. Curr Top.Microbiol.Immunol., 1974, v.64, pp.1-47

136. Hawthorn D. and Mortimer R. Suppressors in yeast. Genetics 1963, v.48, pp.618-692

137. Henriksen 0., Robinson E.A., Maxwell E.S. Interaction of guanosine nucleotides with elongation factor 2. I.Equilibrium dialysis studies. J.Biol.Chem., 1975, v.250, pp.720724

138. Hereford L., Fahrner K., Woolford J., RosbashM. and Ka-back D.B. Isolation of yeast histone genes H2A and H2B. Cell, 1979, v.18, pp.1261-1271

139. Herrington M.B. and GanozaM.C. Genetic characterizationof the ts- and suppression phenotypes of E.coli mutant N4316 J. Bacterid., 1977, v.129, pp.1141-1143

140. Hicks J. and Pink G.R. Identification of chromosomal location of yeast DNA from hybrid plasmid pYeleu 10. Nature, 1977, v.269, pp.265-267

141. Higo K. and Otaka E. Isolation and characterisation of fourteen ribosomal proteins from small subunits of yeast. Biochemistry, 1979, v. 18, pp.4191-4196

142. Hinnen A., Hicks J.B. and Pink G.R. Transformation of yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, v.75, pp.19291933

143. Hirashima A., Kaji A. Purification and properties of ri-bosome-releasing factor. Biochemistry, 1972, v. 11, pp. 4037-4044.

144. Hirsch D. Tryptophan transfer RNA as the UGA suppressor J.Mol. Biol., 1971, v.58, pp.459-468

145. Hitzeman R.A.,Chinault A.C., Kingsman A.J. and Carbon J.

146. N-UCLA Syrnp. Mol.Cell.Biol., 1979, v.14, pp. 57-68

147. Hitzeman R.A.,Clark L. and Carbon J. Isolation and characterization of the yeast 5-phosphoglicerokinase gene (PGK) by an immunological screening technique. J.Biol.Chem., 1980, v.255, 12073 12080

148. Hitzeman R.A., Hagie F.E., Hayflick J.S., Chen C.J., See-burg P.H. and Derynck R. The primary structure of the Saccharomyces cerevisiae gene for 3-phosphoglycerate kinase. Nucl. Acid Research, 1982, v.10, pp.7791-7007

149. Hofstetter H., Monstein H.I. and Weissman C. The read-through protein A is essential for the formation of viable Q-particles. Biochem.Biophis. Acta, 1974, v.374, pp.238251.

150. Hohn B. and Hinnen A. Cloning with cosmids in Escherichia coli and yeast. in"Genetic Engineering" (eds.Setlow J.K. and Hollaender A.), 1980, v.2, pp.169-182

151. Hopfield J.J., Yamane T. The fidelity of protein synthesis, in "Ribosomes" (eds. G.Chambliss et al.).University Park Press, 1980, pp.585-596

152. Hoopper A.K., Furukawa A.H., Pham H.D., Martin N.C. Defects in modification of cytoplasmic and mitochondrial tRNAs are caused by single nuclear mutations. Cell, 1982, v.28,pp.543-550

153. Ilan I. Release factor regulating termination of complete protein in eukaryotic organism. J .Mol.Biol., 1973, v.77, pp.437-448

154. Innanen V.T., Nicholls D.M. Isolation of release factor from mammalian liver and the use of rat liver ribosomes in the release assay. Biochim.Biophys.Acta, 1973, v.324, pp.533-544

155. Ishiguro J., Ono B.I., MasurekarM., McLaughlin C.S. and Sherman F. Altered ribosomal protein S11 from the SUP46 suppressor of yeast. J .Mol.Biol, 1981, v.147, PP.391-398

156. Itoh Т., Higo K. and Otaka E. Isolation and characterization of twenty three ribosomal proteins from large sub-units of yeast. Biochemistry, 1979, v.18, pp.5787-5793

157. Iwasaki K., Motoyashi K.,Nagata S., Kaziro Y. Purification and properties of a new polypeptide chain elongation factor EF-1 from pig liver. J.Biol.Chem., 1976, v. 251, pp.1843-1845

158. Jacq C., Lasowska J. and Slonimski P.P. Sur un nouveau mechanism de la regulation de 1'expression genetique. C.R.Hebd. Seances Acad. Sci. Ser.D. Sci.Nat., 1980, v. 290, pp.89-92

159. Janner F., Vogeli G. and Fluri R. The antisuppressor strain sin1 of Schizosaccharomyces pombe lacks the modification isopentenyladenosine in transfer RNA. J .Mol.Biol., 1980, v.139, pp.207-219

160. Jimenez A., Carrasco L., Vazquez D. Enzymic and non-enzy-mic translocation by yeast polysomes. Site of action of a number of inhibitors. Biochemistry, 1970, v.16, pp.42274730

161. Kaback D.B.Davidson N. Organisation of the ribosomal RNA gene cluster in the yeast Saccharomyces cerevisiae. J.Mol. Biol., 1980, v.138, pp.745-754

162. Kaltschmidt Ё. and Wittman H.G. Ribosomal proteins. VII. Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis for fingerprinting of ribosomal proteins. Ann.Biochem., 1970, v.36, pp.401-412

163. Kabat D. Direct method of measuring tRNA-binding to poly>ribosomes and to single ribosomes in cells of higher organisms. Anal.Biochem., 1971, v.39, pp.228-234

164. Kastelein R.A., Remaut E., Fiers W. and van Duin J. Lysis gene expression of RNA phage MS2 depends on a frame-shift during translation of the overlapping coat protein, gene. Nature, 1982,v.295, pp.35-41

165. Kaufer N.F., Fried H.M., Schwinger W.F., JasinM. and Warner J.R. Cycloheximide resistance in yeast : the gene and its protein. Nucleic Acids Research, 1983, v»11,pp. 3123-3135

166. Klein H.A., CapecchiM.R. Polypeptide chain termination. Purification of the release factors R^ and Rg from Escherichia coli. J.Biol.Chem., 1971, v. 246, pp.1055-1061

167. Kohli J., Altruda P., Kwong Т., Fafalski A., Wetzel R., Soil D., Wahl G. and Leupold U. in "Transfer RNA" (eds. Soil D. et al.). Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1980, v.9B, pp.407-420

168. Kohli J. and Grosjean H. Usage of the three termination codons : compilation and analysis of the known eukaryotic and prokaryotic translation termination sequences. Mol. Gen. Genet., 1981, v.182, pp.430-439

169. Konecki D.S.,Aune K.C., Tate W.R., Gaskey C.T. Characterization of reticulocyte release factor. J.Biol.Chem., 1977, v.252, pp.4514-4520

170. Kreike J., Bechmann H., van Hemert F.J., Schweyen R.J.,

171. Kruiswijk Т., DeHey J.T. and Planta R.J. Modification of yeast ribosomal proteins. Phosphorylation. Biochem.J., 1978, v.175, pp.213-219

172. Kruiswijk T. and Planta R.J. Analysis of the proteins in yeast ribosomal subunits by two-dimentional polyacrylamide gel electrophoresis. Mol.Biol.Reports, 1974, v.1, pp.409413

173. Kruszewska A. Nuclear and mitochondrial informational suppressors of box 3 intron mutations in Saccharomyces cerevisiae. In:'Mitochondrial genes" (Eds.Slonimski P.P. et al.) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1982, pp.323-326

174. Kuhberger R., Piepersberg W., Petzet A., Buckel P. and Bock A. Alteration of ribosomal protein L6 in gentamicin resistant strain of Escherichia coli. Effect on fidelity of translation. Biochemistry, 1979, v.18, pp. 187-193

175. Kung H.P., Treadwell B.V., Spears C., Tai P.O. and Weissbach H. DNA-directed synthesis in vitro of £-galactosi-dase : requirement for a ribosome release factor. Proc. Natl.Acad.Sci.USA, 1977, v.74, pp.3217-3221

176. Kurjan J., Hall B.D. , Gillam S. and :.mithM. Mutation at the yeast sup4 tRNA^^r locus : DNA sequence changes in mutants lacking suppressor activity. Cell, 1980, v. 20, pp.701-709

177. Allostoric mechanism for codon-dependent tRNA selection on ribosomes. Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 1975, 72,4248-4251

178. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, v.227, pp.680-685

179. Lagerkwist U. "Two out of three" : an alternative method for codon reading. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, v. 75, pp. 1759-1762

180. Lake J.A., Sabatini D.D., Nonomura J. Ribosome structure as studied by electron microscopy, in "Ribosomes" (eds. Nomura M. et al.) Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York, pp.543-547

181. Lamb A.J., Clark-Walker G.D, and Linnene A.W. Biogenesis of mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1968, v.161, pp. 415-427

182. Lapoint J. and Soil D. Glutamyl-tRNA synthetase of Escherichia coli. J.Biol.Chem., 1972, v.247, p.4975

183. Larkin J.C. and Woolford J.L. Molecular cloning and analysis of the CRY1 gene : a yeast ribosomal protein gene. Nucleic Acids Research, 1983, v.11, pp.403-420

184. Lengyel P. The process of translation. In "Ribosomes" (Eds. Nomura et al.), 1974, pp. 13-52

185. Li M. and Tzagoloff A. Assembly of the mitochondrial mem. brane system : sequences of yeast mitochondrial valine and an unusual threonine tRNA gene. Cell, 1979, v.18, pp.47-53

186. Liebman S.W. and CavenaghM. An antisuppressor that acts on omnipotent suppressors in yeast. Genetics, 1980, v. 95, pp. 49-61

187. Liebman S.W. and CavenaghM №. 40S ribosomal protein from a Saccharomyces cerevisiae antisuppressor mutant exhibiting a unique two-dimentional gel pattern, Current Genetics 1981, v. 3, pp. 27-29

188. Liebman S.Y/., Stewart J.W. and Sherman I1. Serine substitution caused by an ochre suppressor in yeast.

189. J .Mol.Biol., 1975, v.94, pp.595-610

190. Linn S., Karis M. a.nd Holliday L. Leci'ease fidelity of DLA polymerase activity isolated from aging human fibroblasts. Proc.Natl.Acad. Sci. USA, 1976, v.73, pp.2818-2822

191. Locker J. and Rabinowitz. h. An overview of mitochondrial nucl eic cids and biogenesis. Methods in Enzymo-logy, 1979, v.LVI, pp. 3-16

192. Loftfield R.B. and Vanderjagt D. The frequeces of errors in protein biosinthesis. Biochem. J., 1972, v.128, p.1353

193. Lu P. and Rich A. The nature of the polypeptide chain termination signal. J.Mol.Biol., 1971, v.58, pp.513531

194. Lustig P., Elias P., Axberg T. Samuelson Т., Titta-wella I. and Lagerkvist U. Godon reading and trans-lational erro.rs. J.Biol.Chem., 1981, v.256, pp.26352643

195. Mahler E.R., Hanson В., Miller В., Lin B.D., Alexander N.J., Vincent R.D. and Perlman P.S. Regulatory aspects of mitochondrial biogenesis. In : "Biochemistry and genetics of yeast". (Eds. Bacila et al.) Lew York, Academic Press, 1978, pp.391-401

196. Marcus A. Tobacco mosaic virus ribonucleic acia-depen-dent aminoacid incorporation in a wheat embryo system in vitro. .Biol.Chem., 1970, v.245, pp.955-961

197. Mason Т., Schatz Cytochrome с oxidase from baKer's yeast. II. Site of translation of the protein components. J.Biol.Chem., 1973, v.248, pp.1355-1360

198. Masurekar Ivi., Palmer E., Gno B.I., Wilhelm J.M. and Sherman P. Misreading of the ribosomal suppressor SUP46 due to an altered 40S subunit in yeast. J.Mol. Eiol., 1981, v. 147, pp.381-390

199. Mason Т., Breitbart M., Meyers J. Temperature-sensitive mutations of Saccharomyces cerevisiae with defects in mitochondrial function. Methods in Enzymolo-gy, 1979, v. LVI, pp.131-139

200. McGready S.J. arid Cox B. Antisuppressors in yeast. Mol.Gen.Genet., 1973, v.124, p.305

201. McCready ana Cox B. Suppressor-specificity of antisuppressors in yeast. Genet. Res., 1976, v.28,p.129

202. McLaughlin C.S. Yeast ribosomes : genetics. In ^'Ribosomes" (Lomura M.et al.,eds.) 1974, Cold Spring harbor Laboratory, pp.815-828

203. Melan^on P.P. and Brakier-Gingras L. Characterization of mutants of Escherichia coli with increased control of translational fidelity. Mol.Gen.Genet., 1983, v. 189, pp.123-128

204. Mets L.J, and Bogorad L. Two-dimensional polyacryla-mide gel-electrophoresis : an improved method for ribosomal proteins. Analyt. Biochem.,1974, v.57,pp. 200-210

205. Meyerink J.H., Retdl J., Raufe H.A., Planta R.J., Van der Ende A.,and van Bruggen E.P.G. Genetic organisation of the ribosomal transcription units of the yeast S.carlsbergensis. hucl.Acids Res., 1978, v.5, pp.2801-2808

206. Milman J., G-oldstein J., Scolnick E., Caskey I. Peptide chain termination. III. Stimulation of in vitro termination. Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 1969, v.63,pp.183-190

207. Miller J.H. and Albertini А.и. Effects of surrounding sequence on the suppression of nonsense codons, J.Mol. Biol., 1983, v.164, pp.59-71

208. Mortimer R.k. and Hawthorn B.C. Genetic mapping in Saccharomyces. Genetics, 1966, v. 53, pp.165-173

209. Min Jou W., Haegeman U., Ysebaert M. and Piers W. Nucleotide sequence of the gene coding for the bacteriophage MS2 coat protein. Nature,1972, v.237, pp.82-88

210. Ninio J. A semi-quantitative treatment of missense and non-sense suppression in the strA and ram ribosomal mutants of E.coli. J.Mol.Biol., 1974, v.84, pp.297313

211. Nirenberg IVI.W. ana Mattaei J.H. The dependence of cell-free protein synthesis in Escherichia coli upon naturally occuring or synthetic polyribonucleotides. Proc. Natl.Acad. Sci USA, 1961, v.47, pp.1588-1602

212. Ng R. and Abelson J. Isolation and sequence of the gene for a.ctin in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 1980, v.77, pp.3912-3916

213. Norris A.T. ana Berg P. Mechanism of aminoacyl-tRLA synthesis: studies with isolated aminoac;yl-tRl\A synthetases. Proc. Natl.Acad. Sci. USA, v.52, pp.330-335

214. O'Parrell P.B. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J.Biol.Chem., 1975, v.250, 40074021

215. Ogawa K. and Laji A. Requirement fcr ribosome-releasing factor for the release of ribosoines at the termination codon. Europ. J.Biochem., 1975, v.58, pp.411-419

216. Olsson M.O. Analysis of rpsi) mutations in Escherichia coli. II. Physiology of some representative mutants. Molec. &en. Genet., 1979, v. 169, pp.259-270

217. Olson H.V. Applications of molecular cloning to Saccharomyces. In :"Genetic engineering.Principles and methods". 1981, v.3 (Eds. Setlow «Т.К. and Hollaenaer A.) Plenum Press, New York and London, pp.57-88

218. Olson M.V., Page Cr.S., Sentenac A., Loughney K., ivur-jan J., Beuditt J. and Hall B.D. In "Transfer RLA" (Eds.:Soil Б. et al.), 1980, v.9b, pp.267-280, Gold Spring Harbor Laboratory, Eew-York

219. Ono Б. -J.,Stewart J.V/. and Sherman P. serine insertion caused by the ribosomal suppressor SUP46 in yeast.J. Mol. Biol., 1981 j v. 147, pp. 373-380

220. Ono B. , Wills Li., Stewart J.W., l-esteland R.P. and Sherman P. Serine-inserting UAA suppression mediatedopr»by yeast tRLA' . <j .Mol.Biol., 1981, v. 150, pp.361373

221. Orgel L.E. The maintenance of the accuracy of protein synthesis ana its relevance to ageing :a correction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1970, v.67,p1476-1477

222. Orgel L.E. Ageing of clones of mammalian cells. Mature, 1973, v. 243, pp.441-445

223. Otaka E. and .Osawa S. Yeast ribosomal protein. 5. Correlation of several nomenclatures and proposal of a standard nomenclature. Mol. Gen. Genet., 1981, v. 181, pp.176-182

224. Ozeki H., Inokuchi H., Yamao P.,Kodaira M., Sakano H., Ikemura Т., Shimura Y. In : "Transfer RL.A : Biological aspects". CEds. Soil 1). et al.), 1980, pp.341-362

225. Pachraann V., Grouvall E., Ri0ler R., Hirsh R., Winterr meyer W., . nd Zachau H.G. On the specificity of interactions between tRLAs ana amino acyl-tRi\A synthetases. Europ.т -и-: ^ „v,л m'z •zn nCzi .nn л

226. Palmer E., Wilhelm J .M. and Sherman P. Phenotypic suppression of nonsense mutants in yeast by aminoglycoside antibiotics. Nature, 1979, v.277, pp.148-149.

227. Parker J. Mistranslated protein in Escherichia coli. J. Biol.Chem., 1981, v.256, pp.9770-9773.

228. Parker J. and Priesen J.D. "Two out of three" codon reading leading to mistranslation in vivo. Mol.Gen.Genet.,1980,v.177, 439-445

229. Parker J., Johnston T.C. and Borgia P.T. Mistranslation in cells infected with the bacteriophage MS2: direct evidence of lys for asn substitution. Mol.Gen.Genet.,1980, v.180, pp.275-281

230. Parker J., Pollard J.W., Priessen J.D. and Stanners C.P. Stuttering: high-level mistranslation in animal and bacterial cells. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1978, v.75, pp.10911095

231. Pearson N.J., Fried H.M. and V/arner J.R. Yeast use trans-lational control to compensate for extra copies of a ribosomal protein gene. Cell, 1982, v.29, pp.347-355

232. Pelham H.R.B. Leaky UAG termination codon in tobacco mosaic virus RNA. Nature, 1978, v.272, pp.469-471

233. Pelham H.R.B. and Jackson R.J. An effecient mRNA-dependent translation system from reticulocyte lysates. Eur.J.Biochem., 1976, v.67, pp.247-256

234. Pestka S. Peptidyl-puromycin synthesis on polyribosomes from Escherichia coli. Methods in Enzymology, 1974, v.30, pp.470-479

235. Pestka S. Peptidyl-puromycin synthesis on polyribosomes from rat liver or brain. Methods in Enzymology, 1974, v.30, PP.479-488

236. Petes T.D. Meiotic mapping of yeast ribosomal dezoxyribo-nucleic acid on chromosomal XII. J.Bacteriology, 1979, v.138, pp.185-192

237. Petes T.D. Yeast ribosomal DNA genes are located on chro-mosoma XII. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1979, v.76, pp.410-414

238. Petes T.D., Broach J. R. , Wensink P.O., Hereford L.I'i., Pink G.R. and Botstein D. Isolation and analysis of recombinant DNA molecules containing yeast DNA. Gene, 1978, v.4, 37-49

239. Philippsen P., ThPmasM., P^ramer R.A. and Davis R.W. Unique arrangement of coding sequences for 5S, 5,8S, 18S and 25S ribosomal RNA in S.cerevisiae as determined by R-loop and hybridization analysis. J.Mol.Biol., 1978, v.123, pp.387404

240. Phillips S.L., Schlessinger D. and Apirion D. Temperature dependent suppression of UGA and UAA codons in a temperature-sensitive mutants of Escherichia coli. Cold Spring Harbor Symp. Quant.Biol., 1969, v.34, pp.499-503

241. Phillips S.L., Schlessinger D and Aprion D. Mutants in E.coli ribosomes: a new selection. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1969, v.62, p.772

242. Picard-Bennoun M. Genetic evidence for ribosomal antisuppre-ssors in Podospora anserina. Mol.Gen.Genet., 1976, v.147, PP. 299-306

243. Picard-Bennoun M. and Begueret J. Genetics of cytoplasmic ribosomes in fungi. Trends in Biochem.Sci., 1981, v.6, pp. 272-274

244. Picard-Bennoun Fi. and Coppin-Raynal E. Une function ribo-somique essentielle: le controle de la fidfelitfe de la traduction. Physiol.veget., 1977, v.15, pp.481-489

245. Piepersberg W. , Geyl D., Hummel H. and Bock A. Physiologyand biochemestry of bacterial ribosomal mutants. In "Genetics and evolution of transcriptional and translational apparatus". Kodausha Scientific, Tokyo, 1980, pp. 359-377 (Eds. Osawa S. et al.)

246. Piepersberg V/., Bock A. and Wittmann H.G. Effect ofdifferent mutations in ribosomal protein S5 of Escherichia coli on translational fidelity. Holec. Gen.Genet., 1975, v.140, pp.91-100

247. Plapp P.P., Hayes L.C., Tilzer L. and Chiga M. Dissocia-bility and tRNA content of ribosomes produced by dime-thylnitrosamine and starvation. Nature, 1974, v.247, pp. 311-313

248. Poyton R.O. and Schatz G. Cytochrome с oxidase from baker*s yeast. J.Biol.Chem., 1975, v. 250, pp.762765

249. Poyton R.D. In "The genetics and biogenesis of mitochondria and chloroplasts" (Eds. Bticher et al.), North-Holland Publ., Amsterdam, 1976, p.207

250. Ratliffe J.C. and Caskey C.T. Immunological evidence for structural nomology between the release factor о Г E.coii.

251. Arch.Biochem. Biophys., 1977, v.181, pp.671-677

252. Reddington M.A. and Tate W.P. A polypeptide chainrelease factor from the undeveloped cyst of the brine shrimp, Artemia saiina. -^EBS Letters, 1979, v.Si, pp. 335-338

253. Roe В., Sirover M., Dudock B. Kinetics of homologous and heterologous aminoacylation with yeast phenylala-nyl-tRNA synthetaoe. Biochemistry, 1973, v.12, p.4146-4151

254. Rosset R., Gorini L. A ribosomal ambiguity mutation. J.Mol.Biol., 1969, v. 39, pp.95-112

255. Rothstein R. Deletions of a tyrosine tRKA gene in Saccharomyces cerevisiae. (jell, iy/9, v. 17, pp.185190

256. Ryoji M., Hsia K. and Kaji. Read-through translation. TIBS, 1983,v. ,pp.«8-yu

257. Sakouju S., Bogenhagen В. P, and Brown B.B. A cuntroi region m the center of the 5S RNA gene directs specific initiation of transcription. I. The 5 border of the region. Cell 1уе0, v. 19,pp.13-25

258. Salser W. The influence of the reaaing context upon the suppression of nonsense codons. Molec. Gen. Lfenet., 1969, v.105, 125-130

259. Sanchez L., Vasquez В., Jimfenez A. Genetics ana biochemistry of cryptopleurine resistance in the yeast Saccharomyces corevisiac. Moleс. Gen.uenet.,1977, v.156, pp.319-32b

260. Sanchez-Madrid p. ,Coude P., Vazquez 1). and Ballesta J.P.G. Acidic proteins from Saccharonij ces cerevisiae ribosomes. Biochem.Biophys. Res. Commun., 1У79, v.87, pp.2o1-2;?'i

261. Sanchez-Madrid P., Vidales P.J., Ballesta d.P.G. Effect of phosphorylation on the affinity и I' acidic proteins from Saccharomyces cerevisiae for the ribosomes. Europ. J. Biochem., 1981, v.114, pp.60y-o13

262. Sargan D.R., Gregory S.P. and Butterworth P.H.W. A possible novel interaction between the З'-end of 18S ribosomal RNA and 5'-leader sequence of many eukaryotic messenger RNAs. FEBS Letters, 1982, v.147, pp.133-136

263. Schlanger G., Freedman S.M. Ambiguity in a polypeptide-synthesizing extract from S.cerevisiae. J.Bacteriology,1973, v.115, pp.129-138

264. Schindler D., Grant P. and Davies J. Trichodermine resistance mutation affecting eucaryotic ribosomes. Nature,1974, v.248, pp.535-536

265. Schlessinger D. Genetic and antibiotic modification of protein synthesis. Ann. Rev.Genetic, 1974, v.8, pp.135-154

266. Schreier A.A. and Schimmel P.R. Transfer RNA synthetase catalyzed deacylation of aminoacyl-tRNA in the absence of AMP and pyrophosphate. Biochemistry, 1972, v.11, pp.15821589

267. Schreier M.H. and Staehelin T. in" Regulation of transcription and translation in eukaryotes."fed. by Bautz et alJ 24-- Mosbach Colloq., Springer-Verlag, Berlin and New York, 1973, 335-349

268. Sedlacek J., Fabry M., Rychlik J., Volny D. and Vitek A. The arrangement of nucleotides in the coding regions of natural templates. Mol.Gen.Genet., 1979, v.172, pp.31-36

269. Shakespeare V. and Buchanan J.H. Increased degradation rates of protein in aging human fibroblasts and in cells treated with an amino acid analog . Exp.Cell Research, 1976, v.100, pp.1-8

270. Shatz G. Biogenesis 'of yeast mitochondria: synthesis of cytochrom с oxidase and cytochrome c^. Methods in Enzymo-logy, 1979, v.LVI, pp.40-50

271. Sherman Р. and Slonimski P.P. Respiration-deficient mutant of yeast. II. Biochemistry. Biochem.Biophys.Acta, 1964, v.90, pp.1-15

272. Sherman P., Stewart J.W., Margoliash В., Parker J. and Campbell W. The structural gene for yeast cytochrome c. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1966, v.55, pp.1498-1504

273. Sherton C.C. and Wool J.G. Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis of eucaryotic ribosomal proeins. Methods in Enzymology, 1974, v.30, pp.354-367

274. Shine J. and Dalgarno L. The З'-teiminal sequence of Escherichia coli 16S ribosomal RNA: complementarity to nonsense triplets and ribosomal binding. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1974, v.71, pp.1342-1346

275. Singh A. and Manney T.R. Genetic analysis of mutations affecting growth of Saccharomyces cerevisiae at low temperature. Genetics, 1974, v.77, pp. 651-b59

276. Singh A., Mason T.L. and Zimmermann R.A. A cold-sensitive cytoplasmic mutation of Saccharomyces cerevisiae affecting assembly on the mitochondrial 50S ribosomal subunit. Mol. Gen.Genet., 1978, v.161, pp.143-151

277. Singh A., Ursic B. and Davies J. Phenotypic suppression and misreading in Saccharomyces cerevisiae. Nature, 1979, v.277, pp.146-148

278. Skogerson L., McLaughlin C. and Wakamate E. Modification of ribosomes in cryptopleuric resistant mutants of yeast. J.Bacteriology, 1973, v.116, pp.818-822

279. Skryabin K.G., Maxam A.M. , Petes T.D. and Hereford L. Location of the 5,8S rRNA gene of S.cerevisiae. J.Bacteriology, 1978, v.134, pp.306-309

280. Slobin L.J. and Moller W. Changes in form of elongation factor during development Artemia saiina. Nature, v.258, pp.452-454

281. Smirnov V.N., Kreier V.G., Lizlova L.V.,Andrianova V.M., Inge-VechtomoT S.G. Recessive super-suppression in yeast. Mol. Gen.Genet., 1974, v. 129, pp.105-121

282. Smirnov V.N., Surguchov A.P., Smirnov V.V., Berestetskaya Yu.V., Inge-Vechtomov S.G. Recessive nonsense-suppression in yeast: Involvement of 60S ribosomal subunit. Molec. Gen. Genet., 1978, v.163, pp.87-90

283. Sor E. and Paye G. Mitochondrial and nuclear mutations that affect the biogenesis of the mitochondrial ribosomes of yeast. II. Biochemical data. Mol. Gen. Genet., 1979, v. 177, pp.47-56

284. Sor P. and Pukuhara H. Sequence nucleotidique du gene de l'ARN ribosomique 15S mitochondrial de la levure. G.R. Acad. Sci. Paris, 1980, v.291, pp.933-936

285. Spremulli L.L., Ravel J.M. Characterization of elongation factor 1 from yeast. Arch.Biochem. Biophys., 1976, v.172, pp. 261-269

286. Steege D.A. and Soil D.G. Suppression. In : Biological regulation and development, 1979, v.1, pp.433-485 (ed. Goldberger R.P.) Plenum Publishing Corporation

287. Stocklein W., Jim&nez A., Littlewood В., Piepersberg W., Davies J. Multiple allelic states of the cyh2 gene cause low and high-level cycloheximide resistance in S.cerevisiae. Current Genetics, 1982, v.5, pp.157-160

288. Stocklein W. and Piepersberg "W. Altered ribosomal protein L29 in a cycloheximide-resistant strain of Saccharomyces cerevisiae. Current Genetics, 1980, v. 1, pp. 177183

289. Stoklein W., Piepersberg W. and Bock A. Amino acid replacement in ribosomal protein 124 of Saccharomyces cerevisiae causing resistance to cycloheximide. FEBS Letters, 1981, v.136, pp.265-268

290. Struhl K., Cameron J.R. and Bavies R.W. Functional genetic expression of eukaryotic ВЫА in E.coli. Proc.Natl.Acad. Sci. USA, 1976, v.73, pp.1471-1475

291. Struhl K., Bavies R.W. and Fink G.R. Suppression of a yeast amber mutation in E.coli. Nature, 1979, v.279, pp.78-79t,

292. Surguchov A.P., Berestefekaya Yu.V., Fominykch E.S., Pospe-lova E.M., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M .D. and Inge-Vech-tomov S.G. Recessive suppression in yeast S.cerevisiae is mediated by a ribosomal mutation. FEBS Lettaes, 1980, v.111 , pp.175-178

293. Sourgoutchov A., Blanquet S., Fayat G. and V/aller J.-P. Enzymatic deacylation of methionyl-tRNi^.e^ catalysed by methionyl, isoleucyl and phenylalanyl-tRNA synthetases. Eur.J.Biochem., 1974, v.46, 431-438

294. Sutton C.A., Ares M. and Hallberg R.L. Cycloheximide resistance can be mediated through either ribosomal subunit. Proc, Natl.Acad.Sci. USA, 1978, v.75, pp.3158-3162

295. Tate W.P., Caskey C.T. and Stoffler G. Inhibition of peptide chain termination by antibodies specific for ribosomal pro^ins. J.Mol.Biol., 1975, v.93, pp.375-389

296. Ter-Avanesyan M .D., Zimmerman J., Inge-Vechtomov S.G., Su-darikov A.B., Smirnov Y.N. and Surguchov A.P. Ribosomal recessive suppressors cause a respiratory deficiency in yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol.Gen.Genet., 1982, v.185,pp.319-323

297. Thomas D.Y., Scragg A.H. A yeast mutant with temperature sensitive mitochondrial ribosomes. Eur.J.Biochem., 1973, v.37, pp.585-588

298. Thompson R.G. A GTPase reaction accompanying the rejection of leucyl-tRNAg by UUU-programmed ribosomes. J.Biol.Chem., 1981, v.256, pp.81-86

299. Thompson R.C. and Stone P.J. Proofreading of the codon-anti-codon interaction on ribosomes. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1977, v.74, pp.198-202

300. Tzagoloff A., Akai A. and Neadleman R.B. Assembly of the mitochondrial membrane system. Characterization of nuclear mutants of S.cerevisiae with defects in mitochondrial ATPase and respiratory enzymes. J.Biol.Chem., 1975, v.250, pp.8228-8235

301. Tzagoloff A., Macino G. and Sefald W. Mitochondrial genes and translation products. Ann.Rev.Biochem., 1979, v.48, pp.419-441

302. Valenzuela P., Yenegas A., Weinberg P., Bishop R. and Rutter W.J. Structure of yeast phenylalanine tRNA genes: an intervening DNA segment within the region coding for the tRNA. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1978, v.75, pp.190-194

303. Van der Meer J.P. and GanozaM.C. Purification and characterization of a new factor which restores protein synthesis in a conditionally lethal mutant of Escherichia coli. Eur. J.Biochem., 1975, v.54, pp.229-237

304. Van der Zeist B.A.M., Kool A.J. and Bloemers Z.P.I. Isolation of active ribosomal subunits from yeast. Eur.J.Biochem., 1972, v.30, pp.15-25

305. Vazquez D. Inhibitors of protein biosynthesis. Springer Verlag (Berlin, Hei elberg, New York), 1979

306. Waldron G. and Cox B.S. Ribosomal proteins of yeast strains carrying mutations which affect the efficiency of nonsense suppression. Mol.Gen.Genet., 1978, v.159, pp.223-228

307. Wallace R.B., Johnson,Tanaka S., ScholdM., Itakura K. and Abelson J» Directed deletions of a yeast transfer RNA intervening sequence. Science, 1980, v.209, pp.1396-1400

308. Warner J.R., Tushinski R.J., Wejksnora P.J. Coordination of RNA and proteins in eukaryotic ribosome production. In: "Ribosomes. Structure, function and genetics" (Eds. Gham-bliss G. et al). University Park Press, Baltimore, 1979

309. Warner J.R. and Udem S.A. Temperature sensitive mutations affecting ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae. J .Mol.Biol., 1972, v.65, pp.243-257

310. Weber K. and OsbornM. The reliability of molecular weight determinations by dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. J.Biol.Chem., 1969, v.244, pp.4406-4412

311. WeigertM.G., Lanka E., Garen A. Amino acid substitutions resulting from suppression of nonsense mutations. J.Mol. Biol., 1965, v.14, pp.522-527

312. Weiner A.M. and Weber K. A single UGA codon functions as a natural termination signal in the coliphage coat protein cistron. J .Mol.Biol., 1973, v.80, pp.837-855

313. Weiss R. and Gallant J. Mechanism of ribosome frameshif-ting during translation of the genetic code. Nature, 1983, v.302, pp.389-393

314. Weissbach H. Soluble factors in protein synthesis. In : "Structure, function and genetics of ribosomes" (Eds. Chambliss G. et al.). University Park Press, Baltimore, 1979

315. Weiss Brummer В., Rodel G., Schweyen R.J. and Kaudewitz F. Expression of the split gene cob in yeast : evidence for a precusor of a "maturase" protein translated from intron 4 and preceeding exon. Cell, 1982, v. 29, pp.527536

316. Wolf H., Chinali G. and Parmeggiani A. Kirromycin, an inhibitor of protein biosynthesis that acts on elongation factor Tu. Proc. Natl.Acad.Sci. USA, 1974, v. 71, pp.49104914

317. Wool I. The structure and function of eukaryotic ribosomes. In :"Ribosomes. Structure, function and genetics"; (eds. Chambliss G. et al.) University Park Press, Baltimore, 1979, pp.797-823

318. Wo о If о rd J.L., Hereford L.M. and RosbashM. Isolation of cloned DNA sequences containing ribosomal protein genes from Saccharomyces cerevisiae. Cell, 1979, v. 18, pp. 1247-1259

319. Woolford J.L. and RosbachM. The use of R-looping for structural gene identification and mRNA purification. Nucleic Acid Res., 1979, v.6, pp.2483-2497

320. Yarus M. Intrinsic precision of aminoacyl-tRNA synthesis enhanced through parallel systems of ligands. Nature, 1972, v.239, pp.106-110

321. Yarus M. The relationship of the accuracy of aminoacyl-tRNA selection to that of translation. In:"Transfer RNA:structure, properties and recognition. (Ed.by P.Schimmel et al). Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1979

322. Yarus M. and Berg P. Recognition of tRNA by isoleucyl-tRNA synthetase. Effects of substrates on the dynamics of tRNA enzyme interaction. J .Mol.Biol., 1969, т.42, pp. 171-189

323. Zimmermann R.A., Garvin R.T. and Gorini L. Alteration of a 30S ribosomal protein accompanying the ram-mutation in Escherichia coli. Proc. Natl, Acad. Sci, 1971, v.69, pp. 2263-2267

324. Michel S., Traut R.R. and Lee J.C. Yeast ribosomal proteins : Electrophoretic analysis in four two-dimensional gel systems correlation of nomenclatures. Mol.Gen. Genet., 1983, v.191, 251-256

325. Molecular Cloninig. A laboratory manual.(Eds. Maniatis Т., Fritsch. and Sambrook J.) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1982