Бесклеточная система транскрипции-трансляции с использованием экспрессируемого синтетического гена ингибитора рибонуклеаз тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Хаустов, Сергей Анатольевич

• Хаустов, Сергей Анатольевич
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Хаустов, Сергей Анатольевич

Список условных сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Бесклеточные белоксинтезирующие системы

1.1.1. История создания

1.1.2. Бесклеточные системы транскрипции-трансляции

1.1.3. Получение и состав

1.1.4. Энергетический обмен

1.1.5. Роль катионов

1.1.6. Различные типы систем

1.1.7. Реакторы для проведения биосинтеза белка

1.1.8. Получение "чистой" белоксинтезирующей системы 20 1.2. Технологии получения искусственных генов " "

1.2.1. Искусственные гены в современной молекулярной биологии

1.2.2. Метод Кораны - история синтез первого гена

1.2.3. Получение генов из частично комплементарных олигонуклеотидов

1.2.4. Стадии синтеза генов

1.2.5. Использование специализированных компьютерных программ

1.2.6. Развитие технологии синтеза олигонуклеотидов

1.2.7. Микросинтез олигонуклеотидов с использованием пико-чипов

1.2.8. Способы объединения олигонуклеотидов

1.2.8.1. Ферментативное объединение олигонуклеотидов

1.2.8.2. Попарное объединение дуплексов с использованием ДНК-лигазы

1.2.8.3. Синтез с помощью "якорных" и "линкерных" олигонуклеотидов

1.2.8.4. Множественное объединение олигонуклеотидов 37 1.2.8.4. "Серийное клонирование"

1.2.8.5. "Репаративная достройка"

1.2.8.6. Объединение олигонуклеотидов с использованием ПЦР

1.2.8.7. Получение генов на микрочипах

1.2.9. Способы объединения синтетических сегментов

1.2.9.1. Объединение с помощью ПЦР

1.2.9.2. Объединение с помощью ДНК-лигазы

1.2.9.3. Использование эндонуклеаз рестрикции типа IIS

1.2.10. Способы коррекции ошибок

1.2.10.1. Применение эндонуклеаз, узнающих неспаренности цепей ДНК

1.2.10.2. "Фильтрация совпадений"

1.2.10.3. "Общее слияние"

1.2.10.4. Гибридизация с "селекционными" олигонуклеотидам

1.2.11. Синтез вирусных геномов и мегакластеров генов

1.2.12. Синтез генома микроорганизма

1.2.13. Другие проекты по синтезу геномов

1.2.14. Этические проблемы получения искусственного организма 50 1.3. Объект исследования - плацентарный ингибитор рибонуклеаз

2. Экспериментальная часть

2.1. Материалы и оборудование

2.2. Методы

2.2.1. Модификация нуклеотидной последовательности гена ИР

2.2.2. Условия ПЦР амплификации ДНК

2.2.3. Химико-ферментативный синтез ДНК

2.2.4. Скрининг рекомбинантных клонов с помощью ПЦР

2.2.5. Удаление мутаций с использованием ПЦР

2.2.6. Очистка ДНК с помощью препаративного электрофореза

2.2.7. Ферментативные реакции и их детектирование

2.2.8. Обработка препаратов Т5 ДНК-нуклеазой

2.2.9. Получение генетических конструкций

2.2.9.1. Клонирование синтетических сегментов гена ИР

2.2.9.2. Получение генетической конструкции pRI

2.2.9.3. Получение генетических конструкций pRI-His и pRI-Nus

2.2.9.4. Получение генетических конструкций pET-RN и pET-ANG

2.2.9.5. Получение генетических конструкций pRI-RN и pRI-ANG

2.2.10. Получение компетентных клеток E.coli

2.2.11. Трансформация компетентных клеток Е.coli

2.2.12. Выделение плазмидной ДНК из E.coli

2.2.13. Получение S30 экстракта E.coli

2.2.14. Транскрипция РНК in vitro

2.2.15. Выделение тотальной РНК E.coli

2.2.17. Экспрессия рекомбинантных генов в E.coli

2.2.17.1. Аналитическая экспрессия

2.2.17.2. Препаративная экспрессия

2.2.17.3. Ко-экспрессия гена ИР с генами шаперонов

2.2.18. Синтез белков в БСТТ на основе Е. coli

2.2.18.1. БСТТ в формате "batch"

2.2.18.2. Диализная БСТТ открытого типа

2.2.19. Выделение ИР из телец включения

2.2.19.1. Выделение ИР растворением в 8 М мочевине

2.2.19.2. Хроматографическая очистка ИР в денатурирующих условиях

2.2.19.3. рН-зависимая ренатурация ИР

2.2.20. Выделение ИР из клеточного экстракта E.coli

2.2.21. Определение концентрации и чистоты нуклеиновых кислот

2.2.22. Определение концентрации общего белка

2.2.23. Определение концентрации GFP по интенсивности флюоресценции

2.2.24. Электрофоретический анализ белков

2.2.25. Точное определение активности ИР

2.2.26. Оценка активности ИР с помощью электрофореза

2.2.27. Определение количества мРНК GFP с помощью ПЦР-РВ 83 3. Результаты исследования и их обсуждение

3.1. Оптимизация кодонового состава гена ИР

3.2. Разработка стратегии синтеза генов, содержащих высокогомологичные повторы

3.3. Анализ мутаций, возникших при синтезе ДНК

3.4. Исправление мутаций

3.5. Корректирование и клонирование синтетических ДНК

3.6. Получение полноразмерного гена ИР

3.7. Экспрессия гена ИР в Е. coli

3.7.1. Экспрессия гена ИР в составе pRI в Е. coli

3.7.2. Ко-экспрессия гена ИР с генами шаперонов

3.7.3. Ко-экспрессия гена ИР с генами рибонуклеазы А и ангиогенина

3.8. Выделение ИР

3.8.1. Выделение ИР из телец включения

3.8.2. Разработка схемы очистки ИР из клеточного экстракта

3.9. Определение активности ИР

3.10. Экспрессия гена ИР в БСТТ на основе Е. coli

3.11. Получение БСТТ с использованием гена ИР 114 Заключение 119 Выводы 120 Список публикаций, выполненных по теме диссертации 121 Список литературы 122 Благодарности

Список условных сокращений

АТФ - аденозин-5'-трифосфат ББС - бесклеточная белоксинтезурующая система БСА - бычий сывороточный альбумин БСТТ - бесклеточная система транскрипции-трансляции ГТФ - гуанозин-5'-трифосфат дАТФ - дезоксиаденозин-5'-трифосфат дГТФ - дезоксигуанозин-5'-трифосфат ДМСО - диметилсульфоксид дНТФ - смесь четырех дезокси-нуклеозид-5' -триф осфатов ДТТ - дитиотрейтол дТТФ - дезокситимидин-5'-трифосфат ДТЭ - дитиоэритритол дЦТФ -дезоксицитидин-5'-трифосфат е.а. - единица активности ИПТГ - изопропил-P-Dтиогалактопиранозид ИР - ингибитор рибонуклеаз кДНК - комплементарная ДНК н.о. - нуклеотидный остаток НТФ - смесь четырех нуклеозид-5'трифосфатов о.е. - оптическая единица п.н. - пара нуклеотидов ПААГ - полиакриламидный гель ПЦР - полимеразная цепная реакция ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакця в режиме реального времени ПЭГ - полиэтиленгликоль Трис - трис(гидроксиметил)аминометан ТХУ - трихлоруксусная кислота УТФ - уридин-5'-трифосфат ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид ЦТФ - цитидин-5'-трифосфат ЭДТА - этилендиаминтетраацетат Ап — поглощение при длине волны п нм GFP - зеленый флуоресцентный белок Н2О mQ — деионизованная вода Hepes - Ы-(2-гидроксиэтил)пиперазин

Ы'-(2-этансерная кислота) КО Ас - ацетат калия Mg(OAc)2 - ацетат магния Pipes — 1,4-пиперазинэтансерная кислота SDS - додецилсульфат натрия ТАЕ - Трис-ацетат-ЭДТА буфер ТВЕ - Трис-борат-ЭДТА буфер Т5 ДНК-нуклеаза - D15 З'-экзонуклеаза бактериофага Т

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Бесклеточная система транскрипции-трансляции с использованием экспрессируемого синтетического гена ингибитора рибонуклеаз»

Экспрессия рекомбинантных генов в бесклеточных системах транскрипции-трансляции (БСТТ) становится все более востребованным способом получения белков. Отсутствие механизмов клеточного контроля и возможность манипулировать составом реакционной смеси (добавление редуцирующих агентов, детергентов, ингибиторов протеаз и рибонуклеаз) делают белоксинтезирующие системы единственным возможным способом получения многих белков. Этот подход позволяет решить проблемы, которые могут возникнуть при экспрессии in vivo: цитотоксичность, агрегация, протеолиз, неправильное образование S-S связей. Бесклеточный синтез универсален в геномных исследованиях для скрининга большого количества белков с неизвестными функциями, белковой инженерии in vitro, для получения белков, содержащих тяжелые и радиоактивные изотопы, неприродные аминокислоты.

Технологии бесклеточного белкового синтеза постоянно совершенствуются, предлагаются новые высокоэффективные системы для препаративного получения белков (до 3 мг/мл) с высокой степенью чистоты (до 80%). Это стало возможно благодаря разработке реакторов (обменных и проточных), в которых происходит пополнение компонентов и удаление интермедиатов; оптимизации реакционной смеси (использование клеточного экстракта различной концентрации, добавление деградирующих аминокислот); поиска более эффективных источников регенерации АТФ и ГТФ (пируват оксидаза/флавинадениндинуклеотид, пируват дегидрогеназа/никотинамидадениндинуклеотид); выделения экстракта из мутантных штаммов Escherichia coli, лишенных активностей протеаз и рибонуклеаз.

Другой подход к совершенствованию БСТТ направлен на уменьшение содержания компонентов клеточного экстракта в пользу очищенных составляющих: тРЬПС, РНК-полимераз, ко-факторов транскрипции и трансляции. Это позволяет избежать присутствия нежелательных примесей, более тонко регулировать состав реакционной смеси, изучать функции любого из факторов трансляции. Единственным компонентом, получение которого сегодня невозможно без использования живых клеток — это рибосомы. Работы по созданию искусственной рибосомы начались с попытки получения рекомбинантных рибосомальных белков малой субъединицы рибосомы E.coli, однако это оказалось безуспешным из-за низкого уровня экспрессии генов, что связано с особенностями кодонового состава и наличием устойчивых вторичных структур мРНК. Как ни странно, но кодоновый состав генов таких важных для клетки компонентов, как рибосомальные белки оказался неоптимальным при суперэкспрессии даже в ктетках E.coli, из которых были получены эти гены. Использование БСТТ также не позволило добиться увеличения выхода белков.

Решение этих проблем стало возможно благодаря развитию технологии химико-ферментативного синтеза генов. С его помощью удалось получить оптимизированные гены всех белков 30S субъединицы рибосомы и экспрессировать их в БСТТ с высоким уровнем продукции. Работа по объединению рибосомальных РНК и белков с образованием функциональной рибосомы не окончены. Можно также ожидать, что в ближайшие годы будут синтезированы гены всех белковых компонентов, участвующих в БСТТ, что позволит получать создать систему искусственного происхождения.

Еще одним направлением совершенствования БСТТ может быть использование экспрессируемых генов белков, участвующих в реакции. В этом случае в процессе транскрипции и трансляции происходит наработка необходимых факторов системы и их последующее участие в биосинтезе белка. Это неизбежно приведет к появлению систем нового поколения: саморегулирующихся, саморегенерирующихся и самовосполняющихся, поскольку при использовании данного подхода возможно постоянное пополнение компонентов реакции, запуск регулирующихся и каскадных процессов.

Ингибитор рибонуклеаз (ИР) - это неотъемлемый компонент БСТТ, функция которого заключается в защите РНК от ферментативного гидролиза. Традиционно ингибитор добавляют в реакционную смесь в виде очищенного белка, однако в процессе длительных реакций происходит его инактивация. Мы предположили, что использование ИР в виде экспрессируемого гена может привести к увеличению эффективности работы системы, поскольку в этом случае пополнение активного белка происходит за счет его постоянной продукции.

Целью данной работы было получение бесклеточной системы транскрипции-трансляции с использованием экспрессируемого синтетического гена ингибитора рибонуклеаз.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Хаустов, Сергей Анатольевич

ВЫВОДЫ

1. Разработана и применена новая стратегия получения синтетических ДНК, содержащих высокогомологичные повторы, на основе амплификации и объединения одноцепочечных молекул ДНК.

2. Оптимизированный синтетический ген ингибитора рибонуклеаз был экспрессирован в E.coli с выходом 1,5 мг/г биомассы, что на порядок больше, чем при экспрессии нативного гена.

3. Разработана новая схема очистки ингибитора рибонуклеаз без использования иммобилизованной рибонуклеазы А.

4. Получена бесклеточная система транскрипции-трансляции с использованием синтетического экспрессируемого гена ингибитора рибонуклеаз.

Список публикаций, выполненных по теме диссертации

1. Хаустов С.А., Матвиенко Н.И., Железная J1.A. (2008) Получение синтетических генов для молекулярно-биологических исследований на примере человеческого плацентарного ингибитора рибонуклеаз. Российский биомедицинский журнал, том 9, с. 49-62.

2. Хаустов С.А. Матвиенко Н.И., Железная JI.A. (2008) Синтез гена человеческого плацентарного ингибитора рибонуклеаз и его экспрессия в E.coli. Технологии живых систем, №3, с. 35-42.

3. Хаустов СА., Перевязова Т.А., Железная JI.A., Матвиенко Н.И. (2005) Сравнительная эффективность методов синтеза протяженных генов. Материалы III Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», часть 1, Москва, с. 136.

4. Ткачук А.П., Хаустов С.А. (2006) Клонирование, бактериальная экспрессия и исследование возможного применения в генно-инженерных целях D15 Т5 5',3'-экзонуклеазы бактериофага Т5. Материалы XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2006», том IV, МГУ, с. 225.

5. Ткачук А.П., Хаустов С.А. Матвиенко Н.И. (2006) Получение и изучение свойств D15 5',3'-экзонуклеазы бактериофага Т5. Материалы X Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» - Пущино, с. 55.

6. Ткачук А.П., Хаустов С.А. (2007) Получение и применение человеческого ингибитора рибонуклеаз в бесклеточной системе транскрипции-трансляции. Материалы XIV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов -2007», том IV, Изд-во МГУ, с. 136.

7. Хаустов С.А. (2007) Анализ случайных мутаций, возникших при получении искусственного гена rnhl. Материалы XI Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, с. 118.

Заключение

Нуклеотидная последовательность гена ИР была оптимизирована для высокоэффективной экспрессии в клетках E.coli и бесклеточных системах на ее основе. Для получения искусственного гена синтетические олигонуклеотиды были сконструированы и объединены с образованием сегментов гена ИР. Для объединения олигонуклеотидов была разработана новая стратегия с использованием стадий наработки и объединения одноцепочечных молекул ДНК.

Синтетический сегмент АВ гена ИР, полученный с использованием разработанной нами стратегии синтеза генов, содержал большое число мутаций, которые присутствовали во всех проверенных клонах. Анализ мутаций показал, что их возникновение связано преимущественно с особенностями строения гена ИР. Сегмент АВ, не содержащий ошибок удалось получить только при использовании методов исправления мутаций. Нуклеотидная последовательность оставшейся части гена ИР была разбита на менее протяженные сегменты, которые были получены независимо.

Для коррекции возникающих при синтезе и лигировании ошибок ДНК была впервые использована Т5 ДНК-нуклеаза, в результате чего, число клонов, содержащих сегмент необходимой длины, увеличилось примерно в два раза. Клоны, содержащие сегменты гена ИР без мутаций были найдены и использованы для получения полноразмерного гена.

Синтезированный ген ИР был клонирован и экспрессирован в клетках E.coli, причем выход активного белка оказался на порядок выше, чем обычно удается получить при экспрессии нативного гена. Для выделения ИР из клеточного экстракта была разработана новая схема очистки без традиционно применяемой аффинной хроматографии с использованием иммобилизованной рибонуклеазы А, что позволило получить гомогенный белок без примесей рибонуклеазной активности. Для определения активности ИР был разработан новый простой и точный метод, основанный на ингибировании гидролиза РНК рибонуклазой А.

Искусственный ген ИР экспрессировали в БСТТ отдельно и вместе с геном GFP. Впервые показана возможность применения экспрессируемого гена ИР в БСТТ для защиты РНК от гидролизующего действия рибонуклеаз. Использование экспрессируемого гена ИР в БСТТ увеличивает количество мРНК и выход целевого белка.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Хаустов, Сергей Анатольевич, 2008 год

1. Бунина З.Ф., Крамаров В.М., Мазанов А.Л., Пачкунов Д.М., Смолянинов В.В., Матвиенко Н.И. BbvII новая сайт-специфическая эндонуклеаза из Bacillus brevis 80. Биоорганическая химия, 1983.9(11), 1578-1582.

2. Валишева И.Б., Крамаров В.М., Убиета Р.Х., Железная Л.А., Матвиенко Н.И. Получение тандемных повторов фрагментов ДНК с помощью сайт-специфической эндонуклеазы типа IIS-BbvII. Структура и биосинтез белков, Пущине, 1988. 2, 17-24.

3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. 1984, Москва, Мир.

4. Радько С.П., Ильина А.П., Бодоев Н.В., Арчаков А.И. Синтез искусственного генома как основа синтетической биологии. Биомедицинская химия, 2007. 53(3), 237-248.

5. Яковлев Г.И., Митькевич В.А., Макаров А.А. Ингибиторы рибонуклеаз. Молекулярная биология, 2006. 40(6), 962-970.

6. Alakhov J.B., Baranov V.I., Ovodov S. J., Ryabova L.A., Spirin A. S., Morozov; I J. Method of preparing polypeptides in cell-free translation system. 1995. United States Patent 5,478,730.

7. Au L.-C., Yang F.-Y., Yang W.-J., Lo S.-H., Kao C.-F. Gene synthesis by a LCR-based approach: high-level production of leptin-L54 using synthetic gene in Escherichia coli. Biochem. Biophys.Res. Commun., 1998. 248, 200-203.

8. Baedeker M., Schulz G.E. Overexpression of a designed 2.2 kb gene of eukaryotic phenylaianine ammonia-lyase in Escherichia coli. FEBS Letters, 1999. 457, 57-60.

9. Binkowski B.F., Richmond K.E., Kaysen J., Sussman M.R., Belshaw P.J. Correcting errors in synthetic DNA through consensus shuffling. Nucleic Acids Res., 2005.33(6), e55.

10. Blackburn P, Gavilanes J.G. The role of lysine-41 of ribonuclease A in the interaction with RNase inhibitor from human placenta. J. Biol. Chem., 1980.255(22), 10959-65.13.