Разработка средств диагностики высоковирулентного штамма вируса гриппа A подтипа H5N1 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат наук Аканина, Дарья Сергеевна

• Аканина, Дарья Сергеевна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Аканина, Дарья Сергеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список использованных сокращений

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Описание заболевания

2.2. Общая характеристика вируса гриппа

2.3. Эпидемиология вируса гриппа А подтипа H5N1

Передача вируса

Клинические проявления

Патогенез

2.4. Способы диагностики вируса гриппа

2.4.3. Иммуноферментный анализ

2.4.4. Молекулярные методы

2.4.4.1. Полимеразная цепная реакция

2.4.4.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени

3. Материалы и методы

3.1. Материалы

3.2. Методы

4. Результаты

4.1. Разработка тест-системы для обнаружения и дифференциации РНК вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР

4.1.1. Подбор праймеров, оптимизация условий проведения ПЦР

4.1.2. Определение специфичности ПЦР тест-системы

4.1.3. Определение чувствительности ПЦР тест-системы

4.1.4. Конструирование генно-инженерного положительного контроля для ПЦР тест-системы

4.2. Разработка тест-системы для обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР в реальном времени

4.2.1. Подбор праймеров, оптимизация условий проведения ПЦР

4.2.2. Определение специфичности тест-системы на основе ПЦР в реальном времени

4.2.3. Определение чувствительности разработанной тест-системы на основе ПЦР в реальном времени

4.2.4. Конструирование генно-инженерного положительного контроля для тест-системы на основе ПЦР в реальном времени

4.3. Разработка теста для количественного определения вируса гриппа А подтипа H5N1

4.3.1. Использование количественного теста для определения накопления рекомбинантного вируса гриппа А/ H5N1, полученного методом обратной генетики

4.4. Участие в международной интеркалибрации WHO External Quality Assessment Programm (EQAP)

4.5. Использование разработанных тест-систем для выявления вируса

гриппа А подтипа H5N1

4.6. Разработка тест-системы на основе непрямого ИФА для обнаружения антител к неструктурному белку вируса гриппа NS1

4.6.1. Создание рекомбинантного белка NS1 вируса гриппа

4.6.2. Проведение непрямого ИФА с рекомбинантным белком NS1

5. Обсуждение результатов

6. Выводы

7. Библиография

8. Приложения

Список использованных сокращений

ПЦР - полимеразная цепная реакция РНК - рибонуклеиновая кислота ИФА - иммуноферментный анализ НА - гемагглютинин NA - нейраминидаза КЭ - куриные эмбрионы АГ - антиген

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота РСК - реакция связывания комплемента РТГА - реакция торможения гемагглютинации ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфат

ОТ/ПЦР - полимеразная цепная реакция с предшествующей реакцией обратной транскрипции

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени

кДНК - комплементарная дезиксирибонуклеиновая кислота

ЕФ - европейская фармакопея

ФСП - фармакопейная статья предприятия

СТО - стандарт организации

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭИД - эмбриональная инфекционная доза

п.н. - пара нуклеотидов

ПААГ - полиакриламидный гель

мАТ - моноклональные антитела

ВЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ЯМР - ядерный магнитный резонанс ВОЗ - всемирная организация здравоохранения

WHO - world health organization (всемирная организация здравоохранения)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка средств диагностики высоковирулентного штамма вируса гриппа A подтипа H5N1»

1. Введение

Актуальность проблемы.

Вирус гриппа А подтипа H5N1 - высоко патогенный вирус «птичьего гриппа» - впервые инфицировал человека в 1997 году во время вспышки болезни среди птиц в Гонконге (Claas et.al.,1998; Shortridge et al.,1998). В 2003 и 2004 годах этот вирус распространился из Азии в Европу и Африку и циркулировал среди домашних птиц во многих странах, что привело к сотням случаев заболевания людей, в том числе и со смертельный исходом (Guan et al., 2009). Вспышки болезни среди домашних птиц оказывают серьезное воздействие на экономику и международную торговлю в пораженных странах. Продолжающаяся циркуляция вирусов H5N1 среди домашних птиц, особенно там, где этот вирус является эндемическим, по-прежнему представляет угрозу для общественного здравоохранения (Menno D. de Jong, 2006; WHO, 2011), так как эти вирусы обладают не только способностью вызывать тяжелое заболевание у людей, но и преодолевать межвидовой барьер (Каверин Н.В., 2003; Webster et al., 2007; Manz et al., 2013).

9 января 2014 года ВОЗ сообщила о подтверждённом случае заболевания гриппом, вызванным вирусом A/H5N1 в Канаде у человека, приехавшего из Пекина, Китай. Всего в мире с 1997 года зарегистрировано 649 случаев заболевания людей гриппом, вызванным вирусом H5N1, 385 из которых закончилось смертью. Таким образом, смертность от гриппа, вызванным вирусом H5N1 составляет почти 60% (WHO, 2014). В нашей стране пока не зарегистрировано ни одного случая заболевания человека гриппом, вызванным вирусом H5N1. Первая вспышка «птичьего гриппа» среди домашней птицы в России произошла в июле 2005 года в Новосибирской области (Львов и др., 2005) и была связана с миграцией водоплавающих птиц из Азиатских стран на территорию нашей страны.

Все вышесказанное указывает на необходимость быстрой идентификации и типирования вирусов гриппа А не только для облегчения наблюдения за пандемическим потенциалом вируса «птичьего гриппа», но и для улучшения контроля и лечения инфицированных пациентов (Sakurai, 2012). ). В последние годы, методы молекулярной диагностики, рекомендованные ВОЗ, играют ключевую роль в выявлении и типировании вирусов гриппа (Alexander, 2008, Thanh et al., 2010). Совокупность чувствительных и специфичных современных отечественных тест-систем для качественного и количественного выявления генома вируса гриппа H5N1 на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени, а также методов выявления антител к данному вирусу могут существенно облегчить экологический мониторинг с целью предупреждения возможной пандемии (С.А. Russell, 2012.).

Цели и задачи исследования

Целью исследования была разработка и усовершенствование методов лабораторного выявления вируса гриппа А подтипа H5N1 и антител к нему.

1. Разработать и оптимизировать молекулярно-генетический метод обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 и дифференциации его от других подтипов вируса гриппа А и других вирусов на основе ПЦР, проверить чувствительность и специфичность и на основании этих данных создать «Тест-систему для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР» и нормативную документацию к ней (СТО и Инструкцию по применению);

2. Разработать и оптимизировать молекулярно-генетический метод обнаружения и количественного определения вируса гриппа А подтипа H5N1 и дифференциации его от других подтипов вируса гриппа А и других вирусов на основе ПЦР в реальном времени, проверить его чувствительность и специфичность;

3. Разработать генно-инженерные положительные контроли на основе плазмиды pGEM-T Easy, содержащие клонированные участки генома вируса гриппа А подтипа H5N1;

4. Показать возможность использования метода количественного определения содержания РНК вируса гриппа А подтипа H5N1 для контроля на стадиях получения рекомбинантных вирусов гриппа методом обратной генетики.

5. Показать возможность использования разработанных тест-систем для обнаружения и дифференциации высоковирулентного вируса гриппа А подтипа H5N1 в биологических образцах от птиц, собранных в различных регионах РФ;

6. Получить рекомбинатный белок NS1 на основе вектора рЕТ32Ь+ с последующей химической трансформацией штамма Е. Coli BL21trxB(DE3)pLysS, накоплением и выделением методом метало-хелатной аффинной хроматографией с использованием Ni-NTA агарозы.

7. Разработать методику обнаружения антител к рекомбинантному неструктурному белку NS1 вируса гриппа А подтипа H5N1 на основе непрямого ИФА.

Научная новизна работы

Созданы отечественные тест-системы на основе ПЦР и ПЦР-РВ для диагностики вируса гриппа А подтипа H5N1 с учетом генотипов вируса, циркулирующих на территории Российской Федерации. Достигнута высокая эффективность применения молекулярно-генетических методик мониторинга вируса гриппа А подтипа H5N1 среди диких и домашних птиц в различных районах РФ. Разработанные тест-системы являются универсальными и позволяют детектировать все известные на сегодняшний день генотипы вируса гриппа А подтипа H5N1.

Получен Российский патент № 2361924 «Способ обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1».

Разработки могут быть использованы в лабораториях Научно-исследовательских институтов в целях изучения эволюции вируса гриппа А подтипа H5N1 для предупреждения возможной пандемии.

Впервые показана возможность использования метода количественного определения содержания РНК вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР в реальном времени для контроля получения рекомбинантного вируса гриппа H5N1 методом обратной генетики.

Показана возможность применения непрямого ИФА для обнаружения антител к неструктурному белку NS1 вируса гриппа А подтипа H5N1 для дифференциации инфицированных и вакцинированных инактивированной вакциной птиц.

Практическая значимость

Для «Тест-системы для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР» разработаны СТО 42418073-0001-2007 и Инструкция по применению от 21. 05. 2009 №1-4.7/02562, которые утверждены в Министерстве Сельского хозяйства РФ. Данная тест-система сертифицирована во Всероссийском Государственном Центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГБУ «ВГНКИ»), сертификат соответствия № РОСС 1Ш.ФВ01.Н26634.

Разработанные тест-система и методики на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени использованы при проведении Международной интеркалибрации WHO External Quality Assessment Programm (EQAP) по молекулярной диагностике гриппа в 2007-2011 г.г. Получен международный сертификат от 31. 10. 2011 г.

Сконструированные генно-инженерные положительные контроли, содержащие фрагменты генома вируса гриппа А подтипа H5N1, могут быть использованы в лабораторных и коммерческих тест-системах для качественного и количественного контроля определения генома высоковирулентного вируса гриппа А подтипа H5N1 в научных и клинических лабораториях.

Разработанные методики и «Тест-система для диагностики вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР» используются в региональных ветеринарных лабораториях, в диагностических лабораториях Роспотребнадзора и Минсельхоза РФ для проведения мониторинга вируса гриппа А подтипа H5N1. Тест-системы могут также быть использованы для проведения научно-практических занятий в Университетах и Институтах Министерства Образования РФ.

Основные положения, выносимые на защиту.

Разработанный молекулярно-генетический метод обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 и дифференциации его от других подтипов вируса гриппа А и других вирусов на основе ПЦР характеризуется аналитической чувствительностью 102 - 103 ЭИД50/мл, специфичностью 100% и позволяет определять возбудителя в биологическом материале.

Разработанный молекулярно-генетический метод обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 и дифференциации его от других подтипов вируса гриппа А и других вирусов на основе ПЦР в реальном времени характеризуется аналитической чувствительностью 10 - 102 ЭИД50/мл, специфичностью 100% и позволяет определять возбудителя в биологическом материале.

Разработаны генно-инженерные положительные контроли на основе плазмиды pGEM-T Easy и клонированных фрагментов генома вируса гриппа А подтипа H5N1, которые могут быть использованы в тест-системах для качественного и количественного контроля определения генома высоковирулентного вируса гриппа А подтипа H5N1.

Разработанный метод количественного определения содержания РНК вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР-РВ может быть использован для контроля накопления рекомбинантного вируса гриппа A/H5N1, полученного методом обратной генетики.

Разработанные тест-системы на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени

могут быть использованы при эпидемиологическом обследовании

9

территорий с целью изучения циркуляции вируса гриппа А подтипа H5N1 среди диких и домашних птиц в различных районах РФ.

Синтезирован рекомбинантный белок NS1 на основе вектора рЕТ32Ь+ с последующей химической трансформацией штамма Е. Coli BL21trxB(DE3)pLysS, очищенный метало-хелатной аффинной хроматографией с использованием Ni-NTA агарозы для использования его в качестве специфического компонента в ИФА.

Методика обнаружения антител к рекомбинантному неструктурному белку вируса гриппа NSlHa основе непрямого ИФА может быть использована для дифференциального выявления вакцинированных инактивированной вакциной и инфицированных птиц.

Апробация работы.

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на конференциях, конгрессах, съездах:

Международной научной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 2006); итоговой конференции СНО медицинского факультета РУДН «Клинические и теоретические аспекты современной медицины (Москва, 2007г); IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007» (Москва, 2007); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной памяти профессора Ю.М. Кубицкого «Современные проблемы медико-криминалистических, судебно-химических и химико-токсикологических экспертных исследований» (Москва, 2007); научно-практической конференции с международным участием «Современные проблемы инфекционной патологии человека» (Минск, 2012).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 18 научных работ, в том числе 8 статей в журналах, входящих в перечень периодических изданий, рекомендуемых ВАК, 1 патент РФ.

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 166 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения собственных результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 148 источников. Работа содержит 11 таблиц и 30 рисунков, 4 приложения.

2. Обзор литературы

2.1. Описание заболевания.

Вирус гриппа А широко распространен в природе и способен вызывать эпидемии, пандемии и эпизоотии (Слёпушкин А.Н., 2001). Вирус гриппа А отличается высокой степенью вариабельности, особенно это касается поверхностных гликопротеинов вириона: гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). Известно 15 антигенных подтипов гемагглютинина (HI-HI5) и 9 подтипов нейраминидазы (N1-N9). От диких птиц изолированы вирусы со всеми известными сочетаниями поверхностных белков, при этом инфекция у диких птиц протекает в виде энтерита, без видимых признаков заболевания. Это указывает на высокую степень адаптации вирусов гриппа А к диким птицам, которые являются естественными хозяевами вирусов гриппа (Zambón М. С., 1999). Вирус сохраняется в воде в течение длительного времени (6-8 месяцев), а водно-фекальный путь инфицирования является основным механизмом поддержания персистенции вируса гриппа в природе (WHO,2005).

В 20 веке отмечены четыре пандемии: 1918 (H1N1), 1957 (H2N2), 1968 (H3N2) и 1977 (H1N1), причем две (1957 и 1968 гг.) как и пандемия 20092010 годов вируса гриппа свиней H1N1 были обусловлены новыми реассортантными вирусами (ВОЗ, 2005; Львов Д.К., 2010; Даниленко Д.М., 2011; Игнатьева A.B., 2011).

За последние 45 лет описано свыше 50 эпизодов возникновения эпизоотий среди домашних животных в ряде случаев сопровождающихся заболеванием людей, подчас с высокой смертностью.

Вирусы H5N1 периодически выделялись от кур и других видов птиц. В 1997 году в Гонконге отмечена вспышка заболевания, обусловленная прямой передачей вируса гриппа птиц H5N1 от кур человеку (Subbarao К., 1998; Claas Е.С., 1998; de Jong J.C., 1997.).

Это был первый подтвержденный случай передачи вируса гриппа от птиц человеку. В результате заболело 18 человек, 6 из которых умерли. Второй подобный эпизод отметили в 2003 г. в Гонконге, когда из пяти инфицированных людей двое умерло.

Начиная с 2003 года высокопатогенный вирус гриппа А подтипа H5N1 начинает распространяться благодаря диким и домашним птицам через Азию по Европе и Африке и заражать людей, контактировавших с домашними птицами (Webster R.G., 2006; Gambotto А., 2008; Maines T.R., 2005.).

С 2005 года вспышки заболевания гриппом птиц H5N1 фиксировались во многих странах Азии и ближнего востока. На сегодняшний день в Индонезии произошел, в общей сложности, 191 случай заболевания людей птичьим гриппом A(H5N1), из которых 159 случаев закончились смертельным исходом. Из этого числа 8 случаев (все смертельные) произошли в 2012 году. По данным на конец мая 2012 года в Камбодже отмечен 21 случай заражения людей вирусом птичьего гриппа, 19 из которых с летальным исходом. Из 168 подтвержденных случаев заболевания в Египте, 60 закончились смертельным исходом (ВОЗ, 2013).

Отмечается также заражение людей вирусом гриппа H7N7 (Belser J.А., 2009). Так, в 1996 году, вирус гриппа птиц H7N7 был изолирован в Канаде от женщины с конъюнктивитом. Отмечено инфицирование людей вирусом гриппа H7N7 во время вспышки гриппа птиц в Нидерландах (Koopmans М., 2004; Fouchier R.A., 2004.).

Для вируса гриппа птиц и его реассортантов отмечали частые случаи преодоления видового барьера (Brown I.H., 2008; Yassine Н.М., 2013). Зарегистрированы вспышки заболевания свиней, обусловленные вирусами гриппа птиц H1N1, лошадей H3N8, китов (H7N7, H5N5 и H4N6, H13N2 и H13N9), норок (H10N4). Отмечены случаи инфицирования домашних птиц (кур, индюков) вирусами гриппа, циркулирующими среди диких птиц, особенно водоплавающих.

2.2. Общая характеристика вируса гриппа

Возбудители вируса гриппа - РНК-содержащие вирусы, относящиеся к роду вирусов гриппа А и В, семейства Orthomyxoviridae. Высокая контагиозность и исключительная изменчивость поверхностных белков вирусов гриппа явились причинами их повсеместного распространения (de Jong M.D., 2006). На данный момент вирусы представлены согласно номенклатуре 16 подтипами гемагглютинина и 9 нейраминидазы (Поздеев O.K., 2009).

Вирусы семейства Orthomyxoviridae имеют особое сродство к мукополисахаридам и гликопротеидам (в частности, с клеточными рецепторами, содержащими сиаловую кислоту) (Webster R.G., 1992). Кроме того, имеют сходные биологические свойства, а именно: способность агглютинировать эритроциты, наличие нейраминидазы, легкость культивирования в КЭ и тропизм к органам дыхания. Вирусы имеют принципиальные различия по внутриклеточной локализации АГ, по чувствительности к препаратам, затрагивающим синтез белков и нуклеиновых кислот и по генетическим свойствам.

Согласно Международной номенклатуре, любой штамм вируса гриппа рода А обозначается по следующей схеме: род/источник изоляции/место изоляции/собственный номер изолята /год изоляции/формула вида -серотипы гемагглютинина и нейраминидазы. Для штаммов, изолированных от человека, источник изоляции не пишется; для всех других штаммов год изоляции обозначается 2-мя последними цифрами.

Семейство ортомиксовирусов (от греч. Orthos - правильный, прямой и туха - слизь) включает три рода: вирусы гриппа А и В, вирусы гриппа С и подобные вирусы.

гемагглютинин

Ионный кана.

капсид

нейраминида^а

РНК

Липндная оболочка

Рисунок 1. Схематическая структура вируса гриппа.

Вирионы представляют собой частицы плеоморфной, чаще округлой формы, диаметром 80-120 нм (рисунок 1) (Mosley V. М., 1946). Они состоят из фрагментированного нуклеокапсида спиральной симметрии диаметром 915 нм и липопротеидной оболочки, на поверхности которой имеются выступы длиной 10,0-13,5 нм. Иногда обнаруживают филаментозные частицы длиной до 4 мкм, молекулярная масса вирионов 250 МД, плавучая плотность в сахарозе 1,19 г/см3, коэффициент седиментации нефиламентозных вирионов 700-800S (Fauquet С. М., 2005).

Вирусы чувствительны к жирорастворителям, детергентам, формальдегиду, p-пропиолактону, быстро инактивируются при прогревании (56°С), УФ облучении и рН среды ниже 5.

Геном вируса состоит из 8 сегментов однонитевой РНК размерами: РВ1 - 2341 нуклеотид (н.), РВ2 - 2341 н., РА - 2233 н., НА - 1778 н„ NP - 1565 н., NA - 1413 н., М - 1027 н. и NS - 890 нуклеотидов. Число нуклеотидов

колеблется у разных штаммов вируса гриппа А. Указанные белки имеют молекулярную массу: 96 000Д (РВ1), 87 000Д (PB2), 85 ОООД (РА), 50 00060 000Д (NP), 48 000-63 000Д (NA), 63 000Д (НА). Два гена кодируют по два белка: М1 (27 000Д) и М2 (15 000Д), NS1 (25 000Д) и NS2 (12 000Д). Естественно, что у разных вирусов эти величины варьируют. Таким образом, 8 фрагментов РНК кодируют синтез 10 белков (Stamboulian D., 2000). Каждый фрагмент РНК вируса содержит одинаковую последовательность из 13 нуклеотидов на 5'-конце и 11-12 нуклеотидов на З'-конце. Установлена кодирующая функция каждого фрагмента РНК. У вируса гриппа А три больших фрагмента РНК (1-й, 2-й, 3-й) кодируют белки полимеразного комплекса (РВ1, РВ2, РА), 3 промежуточных по размеру фрагмента РНК (4-й, 5-й и 6-й) кодируют нуклеопротеин и поверхностные гликопротеины и 2 малых фрагмента РНК (7-й и 8-й) - матриксные белки и 2 неструктурных белка. Кодирующие зоны генов на каждом малом фрагменте РНК частично перекрываются (Steinhauer D. А., 2002). Вирионная РНК ортомиксовирусов не является инфекционной. В вирионах обнаружено 7 белков, 4 из которых (РВ1, РВ2, PA, NP) связаны с нуклеокапсидом, а 3 (НА, NA, М1) входят в состав липопротеидной оболочки, причем 2 из них (НА и NA) являются гликопротеинами. Гликопротеины образуют 2 вида выступов наружной оболочки вирионов. Выступы 1-го вида образованы гемагглютинином (НА) с молекулярной массой 75-80 кД (около 500 аминокислот). Каждый выступ состоит из 3-х молекул НА, которые организованы в палочкообразную структуру. НА ответственен за адсорбцию и проникновение вирионов в клетку и гемагглютинирующую активность (ГА-активность) вируса (Velkov Т., 2013). AT к НА нейтрализуют инфекционность вируса и подавляют его ГА-активность. Выступы 2-го типа образованы нейраминидазой (NA) с молекулярной массой 60-70 кД (450-470 аминокислот). Каждый выступ состоит из 4-х молекул NA, которые организованы в грибообразную структуру. На поверхности вириона имеется примерно 500 выступов, из

которых около 100 образованы нейраминидазой и 400 - гемагглютинином. В

16

вирионах содержится 70% белка, 18-37% липидов, 5% углеводов и 1% РНК. Углеводы и лиииды имеют клеточное происхождение.

Процесс репликации вируса гриппа в восприимчивой клетке состоит из следующих стадий (рисунок 2):

Вирус связывается с поверхностным белком или липидом, обладающим сродством к сиаловой кислоте и с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза проникает в клетку (1). Везикула подвергается ацидификации и мембрана вируса сплавляется с мембраной везикулы (вакуоли). При этом в цитоплазму выходят вирусные нуклеокапсиды (2). Вирусные нуклеокапсиды, содержащие отрицательно полярную геномную РНК увеличивают копии белка ЫР и белки Р транспортируются в ядро (3). Отрицательно полярная РНК копируется с помощью РНК полимеразы вириона в вирусную мРНК, используя 5,-концы пре-мРНК и РНК как праймеры для инициации синтеза (4). Матричная РНК транспортируется в цитоплазму (5), в то же время происходит транскрипция участка мРНК, кодирующего N82 и М2 (6), в рибосоме, прикрепленной к эндоплазматическому ретикулуму (ЕР) транслируются с мРНК вирусные мембранные белки (НА ,КА, М2) (7), далее эти белки участвуют в процессе секреции клетки хозяина, подвергаясь гликолизу (8). Остальная мРНК транслируется в рибосомах, находящихся в цитоплазме (9).

Рисунок 2. Внутриклеточный цикл репродукции вируса гриппа А.

Белки PA, РВ1, PB2, и NP входят в ядро (10), где они катализируют синтез полноразмерной положительно цепочечной РНК (11) и отрицательно цепочечной вирионной РНК (12), обе РНК синтезируются в ядре. Какое-то количество вновь синтезированной отрицательно цепочечной РНК вовлекается в каскад синтеза РНК (13). Белок Ml, связываясь с вновь синтезированной отрицательно цепочечной мРНК, останавливает синтез вирусной мРНК и, совместно с белком NS2, способствуют выходу новых нуклеокапсидов в цитоплазму (14). Белки НА и NA транспортируются к поверхности клетки (15) и встраиваются в клеточную мембрану (16). Вирионные нуклеокапсиды, связанные с белком Ml (17) и с белком NS2, транспортируются к поверхности клетки и связываются с участками клеточной мембраны, содержащими белки НА и NA (18). Вирионы отпочковываются от плазматической мембраны клетки-хозяина (19) (S.J.Flint, 2000.).

Впервые вирус гриппа А был изолирован в 1931 г. от свиней Ричардом Шоупом в США, в 1933 г. - от человека Кристофером Эндрюсом и Вильямом Смитом в Англии. В 1955 г. вирус гриппа А был изолирован от кур в Германии В. Шефером и от лошадей в Чехословакии Бэлой Тумовой, в 1961 г. вирус был изолирован Бэккером от диких птиц - крачек Sterna hirundo в ЮАР. В последующие годы вирусы гриппа были изолированы Гремом Лэвером в Австралии, Робертом Вэбстером в США, Дмитрием Львовым в СССР. Позднее и другие исследователи в разных странах показали широчайшее распространение известных в настоящее время вирусов гриппа А среди различных представителей диких животных, главным образом, птиц водного и околоводного комплексов (Beare AS, 1991).

2.3. Эпидемиология вируса гриппа А подтипа H5N1 Передача вируса

Вирус гриппа передаётся воздушно-капельным путём напрямую при вдыхании вирусных частиц или косвенно путём попадания вирусных частиц в верхние дыхательные пути или конъюнктиву слизистой оболочки. Подтверждены случаи передачи вируса гриппа A H5N1 от птицы к человеку, возможна также передача вируса из окружающей среды человеку и ограниченная, неустойчивая передача вируса от человека человеку.

В 1997 году впервые была зафиксирована передача вируса от птицы человеку, произошедшая через неделю после начала вспышки заболевания среди птиц (Mounts A.W. et al., 1999). В то время не существовало действительного риска, связанного с употреблением в пищу или приготовлением домашней птицы или заражения людей вирусом гриппа А H5N1. Заражение вирусом после разделывания домашней птицы было связано с серопозитивностью к вирусу гриппа A H5N1. В последнее время большинство заразившихся имели прямой контакт с домашней птицей, хотя не относились к числу людей, участвовавших в выбраковке больных птиц. Люди также заражались при ощипывании и приготовлении больных птиц, подготовке боевых петухов, при игре с домашними птицами, особенно с инфицированными утками, переносящими заболевание бессимптомно, при употреблении крови уток, а также недоваренной птицы. Передача вируса кошачьим наблюдалась при кормлении тигров и леопардов в зоопарке Таиланда зараженной курицей (Keawcharoen J. et al., 2004) и при таком же кормлении домашних кошек в эксперименте (Kuiken Т. Et al.2004).

Передача вируса гриппа A H5N1 от человека к человеку предположительно происходила в общежитиях и был зафиксирован один случай передачи вируса от матери ребёнку (Ungchusak К. et al., 2005). Не было выявлено ни одного случая передачи вируса воздушно-капельным путем от человека к человеку, однако при тесном контакте без мер

предосторожности передача вируса возможна. В 1997 году передача вируса от человека к человеку произошла, по-видимому, не через социальный контакт, малую эффективность такой передачи вируса доказывают и серологические исследования инфицированных работников здравоохранения. Серологические исследования во Вьетнаме и Таиланде не нашли доказательств бессимптомного инфицирования среди зараженных. В последнее время, благодаря активному эпиднадзору за контактами пациентов, с помощью ОТ-ПЦР были выявлены легкие формы заболевания. Выявлено больше инфекций у пожилых людей, а также увеличение числа и продолжительности заболевания в семьях во Вьетнаме, предположительно вызванные адаптацией местных штаммов вируса к человеку. Однако необходимы вирусологические и эпидемиологические исследования для подтверждения этих выводов. На сегодняшний день риск внутрибольничной передачи вируса среди медицинских работников низок, даже не используя меры предосторожности (Liem N.T. et al., 2005). Тем не менее, был зарегистрирован один случай тяжелого заболевания медсестры, контактировавшей с инфицированным пациентов во Вьетнаме.

Учитывая наличие вируса гриппа А H5N1 в окружающей среде также возможно инфицирование при проглатывании контаминированной воды во время плавания в водоёмах, при попадании воды в нос и на конъюнктиву глаза. Фактором риска также является использование необработанных фекалий птиц в качестве удобрения.

Клинические проявления.

Спектр клинических проявлений вируса гриппа А H5N1 основан на описаниях госпитализированных пациентов. Описание случаев заболевания вирусом гриппа А H5N1 позволяет выявить лёгкие случаи заболевания, субклинические, а также атипичные формы, такие как гастроэнтерит и

энцефалопития (M.D. de Jong, 2005). Большинство пациентов до заболевания были здоровыми детьми или взрослыми.

Инкубационный период вируса гриппа A H5N1 более длинный, чем у других вирусов гриппа человека. В 1997 году клинические признаки заболевания появлялись через 2-4 дня после инфицирования, недавние исследования показывают такие же интервалы, но с разбросом до 8 дней (Hien Т.Т. et al., 2004). В случае передачи вируса в бытовых условиях инкубационный период составлял от 2 до 5 дней, однако верхний предел мог быть до 8-17 дней, что может быть связано с заражением через окружающую среду или при контакте с инфицированными животными.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Аканина, Дарья Сергеевна, 2014 год

ЛИТЕРАТУРА

каждую пробирку

масло по 5 мкл РНК (К+ и К"). Пробы вносят в

1. Breslauer et al // Proc. Natl. Acad. Sci USA. - 1986. - V.83. - P.3746.

2. Brown I.E., Harris P.A., Alexander D.J. Serological studies of influenza virus in pigs in Great Britain 1991-2//Epidemiol. Infect. - 1995. - Vol.114. - P.511-520.

3. Brown LH., Done S.H., Spencer Y.I, Cooley W.A., Harris P.A., Alexander D.J. Pathogenicity of swine influenza H1N1 virus antigenically distinguishable from classical and European strains. // Vet. Rec. - 1993. - Vol.132. - P.598-602.

4. Brown, I.H., Harris P.A., McCauley J.W., Alexander D.J. Multiple genetic reassortment of avian and human influenza A viruses in European pigs, resulting in emergence of an HIN2 virus of novel genotype. // J. Gen. Virol. - 1998. - Vol.79. - P.2947-2955.

№

5. Capua I, Alexander D.J. Avian influenza and human health. // Acta Trop. - 2002 - Vol.83. 1.

- P. 1-6. Review.

6. Castrucci M.R., Donatelli I., Sidoli L, Barigazzi G., Kawaoka Y., Webster R.G. Genetic reassortment between avian and human influenza viruses in Italian pigs. // Virology. - 1993. -Vol.193. - P.503-506.

7. Cauthen A.N., Swayne D.E., Schultz-Cherry S., Perdue M.L., Suarez D.L. Continued circulation in China of highly pathogenic avian influenza viruses encoding the hemagglutinin gene associated with the 1997 H5N1 outbreak in poultry and humans. // J.Virol. - 2000. - Vol.74.

- N 14. - P.6592-6599.

8. Li, Wang J., Smith G.J.D. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia // Nature. - 2004. - Vol.430. - P.209-213.

9. Payungporn S, Phakdeewirot P, Chutinimitkul S, Theamboonlers A, Keawcharoen J, Oraveerakul K, Amonsin A, Poovorawan Y. Single-step multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) for influenza A virus subtype H5N1 detection // Viral Immunol. 2004; 17 (4): 588-93.

10. Recommended laboratory tests to identify avian influenza A virus in specimens from humans "WHO Geneva "June 2005.

Формула изобретения

Способ обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1, предусматривающий проведение реакции обратной транскрипции с РНК вируса, совмещенной с реакцией амплификации на два гена, анализ реакционной смеси с помощью электрофореза в агарозном геле и выявление РНК штаммов вирусов гриппа А по результатам анализа, отличающийся тем, что в качестве праймеров для проведения совмещенной реакции обратной транскрипции и амплификации как в двух ПЦР, так и мультиплексной ПЦР, используются олигонуклеотиды из 20 и 22 звеньев F-H5 ACAAGGTCCGACTACAGCTT и R-H5 ATTGATTCCAATTTTACTCCAC, комплементарные не менее чем на 95% гену гемагглютинина, и олигонуклеотиды из 22 звеньев F-N1 CAGAACATTAATGAGTTGTCCT и R-Nl TCTCAGTATGTTGTTCCTCCAA, комплементарные не менее чем на 95% гену нейраминидазы, выявление в анализируемых

образцах продуктов ПЦР (фрагментов ДНК) размером 184 нуклеотидных пар при использовании праймеров, специфичных к гену гемагглютинина, и 213 нуклеотидных пар при использовании праймеров, специфичных к гену нейраминидазы, свидетельствует о наличии в исходном материале РНК вируса.

5'

Участок гена ИА

213 п.о.

Р-Н5

5'

Я-Н5

Участок ген НА

184 п.о.

Расположение специфических праймеров для определения РНК вируса гриппа А подтипа Н5Ш и дифференцирования от других подтипов вируса для гена нейраминидазы (А) и гена гемагглютинина (Б).