Безопасность, иммуногенность и профилактическая эффективность вакцинных штаммов вируса гриппа А/Н5N1 с удаленными факторами патогенности: белками NS1 и PB1-F2 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат биологических наук Романовская-Романько, Екатерина Андреевна

• Романовская-Романько, Екатерина Андреевна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Романовская-Романько, Екатерина Андреевна

СОДЕРЖАНИЕ

1.ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Вирусы гриппа A H5N1 - потенциальные возбудители пандемии

2.1.1. Структура вируса гриппа A H5N1

2.1.2. Особенности репродукции гриппа птиц A H5N1 15 2. 1.3. Эпидемиология вируса гриппа A H5N1. Угроза пандемии, вызванной вирусом гриппа A H5N1

2.1.4. Иммунный ответ при гриппозной инфекции

2.1.5. NS1 белок вируса гриппа: ингибитор врожденного и адаптивного иммунитета

2.1.6. Белок PB1-F2. Новый фактор патогенности вируса гриппа 34 А.

2.1.7. Метод «обратной генетики» вируса гриппа. 37 2.2. Вакцинопрофилактика гриппа

2.2.1. Подготовка H5N1 кандидатов в вакцинные штаммы

2.2.2. Современные подходы к разработке H5N1 вакцин

2.2.3. Разработка гриппозных вакцин с использованием методов обратной генетики

2.2.4. Новый подход к созданию пандемической гриппозной вакцины. Живая гриппозная вакцина с удаленной генетической 52 последовательностью, кодирующей белок NS1 .

3.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 5

3.1 Клеточные культуры

3.2 Вирусы

3.3 Вирусологические методы

3.4 Лабораторные животные

3.5 Иммунологические методы

3.6 Молекулярно-генетические методы

3.7 Методы статистической обработки данных

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1 Получение и характеристика реассортантных H5N1 delNSl кандидатов в вакцинные штаммы

4.1.1 Получение реассортантных H5N1 delNSl штаммов

4.1.2 Рост H5N1 delNSl штаммов на культуре клеток Vero

4.2 Безопасность и профилактическая эффективность H5N1 delNSl кандидатов в вакцинные штаммы при применении у мышей

4.2.1 Выделение H5N1 delNSl штаммов из респираторного

тракта и трансмиссия в другие органы

4.2.2 Динамика изменения массы тела мышей, иммунизированных H5N1 delNSl штаммами

4.2.3 Формирование кросс-реактивной защиты у мышей,

иммунизированных кандидатом в вакцинные штаммы VN1203delNSl. 1Ъ

4.2.4 Иммуногенностъ кандидата в вакцинные штаммы VN1203delNSl на мышиной модели

4.2.5 Профилактический эффект иммунизации кандидатом в вакцинные штаммы VN1203delNSl при гриппозной инфекции у мышей

4.3 Безопасность и профилактическая эффективность кандидата в вакцинные штаммы VN1203delNSl на модели яванских макак

4.3.1 Развитие клинических симптомов у макак,

иммунизированных штаммом VN1203delNSl

4.3.2 Выделение штамма VN1203delNSl из респираторного тракта вакцинированных животных. Трансмиссия в другие органы

4.3.3 Иммуногенностъ штамма VN1203delNSl на модели яванских макак

4.3.4 Протективная эффективность штамма VN1203delNSl на модели яванских макак

4.4 Влияние отсутствия эксперессии белка PB1-F2 на характеристики H5N1 delNSl вакцинного штамма

4.4.1 Влияние отсутствия экспрессии белка PB1-F2 на вирулентность H5N1 реассортантного вирусного штамма

4.4.2 Влияние отсутствия экспрессии белка PB1-F2 на способность H5N1 реассортантного вирусного

штамма, вызывать летальную инфекцию у мышей

4.4.3 Влияние отсутствия экспрессии белка PB1-F2 на ростовые характеристики H5N1 delNSl штаммов на культуре клеток Vero

4.4.4 Влияние отсутствия экспрессии белка PB1-F2 на иммуногенностъ H5N1 delNSl штаммов. 97 4.5.4.Влияние отсутствия экспрессии белка PB1-F2 на профилактическую эффективность H5N1 delNSl штаммов

5. ОБСУЖДЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Э Оптическая плотность

НА Гемагглютинин

М01 Множественность инфекции

ЫА Нейраминидаза

Ж)У Вирус болезни Ньюкасла

а.к. Аминокислота

АПК Антигенпрезентирующие клетки

ВОЗ Всемирная Организация Здравоохранения

вРНК Вирусная РНК

ДК Дендритная клетка

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота

днРНК Двунитевая РНК

жвг Живая гриппозная вакцина

ивг Инактивированная гриппозная вакцина

ил Интерлейкин

ИНФ Интерферон

ИФА Иммуноферментный анализ

кРНК Комплементарная РНК

мРНК Матричная РНК

мяРНК Малая ядерная РНК

НК Натуральный киллер

онРНК Однонитевая РНК

ОРС Открытая рамка считывания

ОТ-ПЦР Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

п.О. Пара оснований

Пре-мРНК Предшественник мРНК

РКЭ Развивающиеся куриные эмбрионы

РМН Реакция микронейтрализации

РНК Рибонуклеиновая кислота

РНП Рибонуклеопротеин

РТГА Реакция торможения гемагглютинации

ТИД50 Тканевая инфекционная доза 50%

ТМБ Тетраметилбензидин

Тх Т-хелпер

ФБР Фосфатно-буферный раствор

ФИО Фактор некроза опухоли

ЭИД50 Эмбриональная инфекционная доза 50%

ЭЛД50 Эмбриональная летальная доза 50%

ЭФ Электрофорез

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Безопасность, иммуногенность и профилактическая эффективность вакцинных штаммов вируса гриппа А/Н5N1 с удаленными факторами патогенности: белками NS1 и PB1-F2»

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Циркуляция высоко патогенных вирусов гриппа А/Н5М1 среди птиц, с периодическими инфекциями людей, продолжается с 1997 года. Высокий уровень смертности (>60%) обусловил необходимость создания эффективной вакцины, для предотвращения потенциальной пандемии, вызванной вирусами «птичьего гриппа».

Одной из основных проблем при создании вакцин против «птичьего гриппа» является недостаток информации об антигенных свойствах возможного пандемического штамма. Это требует либо создания резерва штаммо-специфических вакцин из вирусов - потенциальных возбудителей пандемии, которые смогут защитить население от антигенно различающихся вирусов, либо создания подходящего варианта вакцины из актаульных штаммов в чрезвычайно короткий промежуток времени от начала пандемии.

В настоящее время существует большое количество стратегий для создания пандемических противогриппозных вакцин, каждая из которых имеет свои преимущества и недостатки. Так, применяемые в настоящее время традиционные инактивированные гриппозные вакцины (ИГВ) характеризуются тем, что вызывают выработку системных антител, однако не стимулируют локальный ^А и цитотоксический иммунный ответ. В результате, данные вакцины не способны обеспечивать широкую защиту от антигенно различающихся дрейф-вариантов вируса. Кроме этого, ИГВ, полученные на основе Н5Ш вирусов, демонстрируют низкую иммуногенность, вследствие чего, для формирования протективного иммунного ответа требуется введение в состав вакцины высоких доз антигена, двойной иммунизации и применения различных адъювантов. При подготовке к пандемии живые аттенуированные вакцины имеют ряд преимуществ. В отличие от ИГВ живые интраназальные гриппозные вакцины (ЖГВ) индуцируют местный и системный иммунный ответ, обеспечивая более широкий спектр защиты против дрейф-вариантов вирусов гриппа (Кис1епко е/ а1, 1996; Векке et а1, 2007). Интраназальный

способ введения вакцины является более предпочтительным, по сравнению с инъекционной формой, с физиологической и медицинской точек зрения, особенно у детей (Levine, 2003).

В последнее время во многих исследованиях показана возможность и перспективность использования рекомбинантных вирусов, с усеченным или содержащим замены в белке NS1, в качестве живых-аттенуированных противовирусных вакцин (Egorov et al, 1998; Talon et al, 2000; Fer ko et al, 2004; Falcon et al, 2005; Quinlivan et al, 2005; Solorzano et al, 2005; Baskin et al, 2007; Vincent et al, 2007; Richt et al, 2009). Подобные вакцинные штаммы получают с помощью методов «обратной генетики» и предназначены для интраназального применения. Вирусные штаммы за счет нарушения основной функции полноразмерного NS1 белка, как антагониста системы интерферонов 1-го типа, теряют способность к полноценной репликации в организме хозяина, но могут реплицироваться до высоких титров на соответствующих ИФН-дефицитных системах, таких как клетки Vero, что обеспечивает эффективное производство вакцины (Talon et al, 2000; Romanova et al, 2009). Отсутствие целой генетической последовательности, кодирующей белок NS1, обеспечивае т таким штаммам генетическую стабильность, а отсутствие распространения вируса после вакцинации обеспечивает высокий уровень безопасности вакцины. В то же время, несмотря на отсутствие репликации, delNSl вакцинные вирусы являются достаточно иммуногенными, вследствие повышенной продукции цитокинов в месте апликации вакцины. Местное высвобождение цитокинов, таких как интерфероны первого типа, стимулирует местный иммунитет на слизистых, опосредованный секреторными антителами класса IgA, цитотоксический иммунитет, а также системный В - и Т- клеточный иммунный ответ, обеспечивая перекрестную защиту без использования адъювантов (Talon et al, 2000; Ferko et al, 2004; Stasakova et al, 2005).

Результаты доклинических исследований delNSl кандидатов в вакцинные штаммы против эпидемических вирусов гриппа A (H1N1, H3N2) и В

продемонстрировали их безопасность и профилактическую эффективность на экспериментальных моделях мышей, хорьков и приматов (Wressnigg et al., 2009; Nakowitsch et al., 2011). Перспективность использования delNSl гриппозных вакцин у людей была показана в ходе I фазы клинического исследования моновакцины на основе штамма вируса гриппа А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) (Wacheck et al., 2010). Использование вирусных штаммов с усеченным NS1 сегментом генома является перспективным подходом к разработке пандемических гриппозных вакцин против вируса гриппа A/H5N1.

Цель исследования. Разработка вакцинных кандидатов против высоко патогенного вируса гриппа A/H5N1 на основе вирусных штаммов с удаленной геномной последовательностью, кодирующей белок NS1. Задачи исследования

1. С помощью методов «обратной генетики» получить рекомбинантпые вакцинные штаммы вируса гриппа A/H5N1 различных клайдов с удаленной геномной последовательностью, кодирующей белок NS1 (delNSl).

2. Охарактеризовать рекомбинантные H5N1 delNSl вакцинные штаммы in vitro по следующим параметрам: репродуктивность в клеточных культурах, генетическая стабильность и антигенные свойства.

3. Оценить безопасность и иммуногенные свойства H5N1 delNSl вакцинных штаммов на моделях мышей и приматов при интраназальном введении.

4. Оценить протективные свойства H5N1 delNSl вакцинных штаммов вируса гриппа при экспериментальной гриппозной инфекции у мышей и приматов.

5. Изучить влияние удаления фактора патогенности - белка PB1-F2 на безопасность, иммуногенную активность и протективные свойства delNS 1 вакцинных штаммов.

Научная новизна работы

С помощью методов «обратной генетики» впервые были получены вакцинные штаммы с удаленной геномной последовательностью, кодирующей белок NS1 (delNSl), относящиеся к различным клайдам вируса гриппа A/H5N1. Впервые получены данные о способности H5N1 вакцинных штаммов к эффективному росту на культуре клеток Vero и их генетической стабильности при длительном пассировании. Получена новая информация о безопасности и иммуногенной активности delNSl кандидатов в вакцинные штаммы при применении у животных. Впервые показаны кросс-протективные свойства delNSl штаммов в отношении различных антигенных вариантов вируса гриппа A/H5N1. Показана возможность повышения иммуногенной активности delNSl вирусных штаммов путем дополнительной модификации генома, приводящей к отсутствию экспрессии вирусного белка PB1-F2 - фактора ингибирования системы интерферонов.

Практическая значимость работы

В результате проведенных исследований показано, что использование штаммов вируса гриппа A/H5N1, имеющих делецию последовательности, кодирующей белок NS1 (delNSl), в качестве интраназальной вакцины может служить перспективным подходом в решении задач разработки нового поколения пандемических противогриппозных вакцин. Результаты, полученные в ходе проведенных доклинических исследований, использованы для проведения клинического исследования I фазы вакцинного кандидата VN1203 delNSl на основе штамма А/Вьетнам/1203/04 (H5N1). Основные положения, выносимые на защиту

1. Рекомбинантные штаммы вируса гриппа A/H5N1, имеющие делецию геномной последовательности, кодирующей белок NS1, являются генетически стабильными при длительном пассировании на культуре клеток Vero и обладают высоким уровнем репродуктивной активности.

2. H5N1 delNSl вакцинные штаммы обладают аттенуированным фенотипом и являются безопасными при интраназальном применении у мышей и приматов.

3. Интраназальная иммунизация животных (мышей и приматов) H5N1 delNSl вакцинными штаммами приводит к формированию кросс-реактивного иммунного ответа и обеспечивает защиту от инфекции, вызванной вирусами гриппа A/H5N1 различных клайдов.

4. Отсутствие экспрессии белка PB1-F2 - антагониста системы интерферонов -не снижает ростовых характеристик и приводит к увеличению безопасности и иммуногенной активности H5N1 delNSl вакцинного штамма.

Личный вклад автора состоит в самостоятельном планировании и проведении всех лабораторных исследований, статистической обработке и анализе полученных результатов. Реассортантные вирусные штаммы получены, проанализированы и апробированы в доклинических исследованиях лично автором. Экспериментальное заражение приматов высоко патогенным вирусом гриппа A/H5N1 выполнено сотрудниками филиала ФГУ «48 ЦНИИ МИНОБОРОНЫ РОССИИ» - «ВЦ». Апробация материалов диссертации

Материалы диссертационной работы доложены на Международном симпозиуме «Emerging diseases: tick-transmitted and influenza» (Новосибирск,

2007), на Международной конференции «Preparedness to the influenza pandemic - an international outlook» (Санкт-Петербург, 2007), на Ежегодной отчетной конференции по международному европейскому проекту «Fluvacc» (Вена,

2008), на Международной вирусологической конференции Retroscreen «Medical, Scientific and Historical Lessons from the Great Avian (H1N1) "Spanish" Influenza Pandemic of 1918: The 90th Anniversary» (Лондон, 2008), также представлены на Международной научной конференции «Противогриппозные вакцины нового поколения» (Санкт-Петербург, 2009), международной конференции «Options for the Control of Influenza VII» (Гонконг, 2010), второй

международной конференции «Fundamental and applied problems of medical

primatology» (Сочи, 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 патент и 11 тезисов докладов. Принята к печати 1 статья в журнале, входящем в список ВАК. Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, включая 13 таблиц и 29 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, 4-х глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы содержит 195 источников на русском и английском языках.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Вирусы гриппа A/H5N1 - потенциальные возбудители пандемии.

Вирусы гриппа относятся к семейству Orthomyxoviridae, к его единственному роду Influenza. В настоящее время внутри данного рода выделяются три типа вирусов гриппа: А, В и С. Вирусы гриппа различных типов отличаются друг от друга рядом признаков: количеством сегментов генома, гексагональной структурой выступов поверхности, кругом возможных хозяев, а также антигенными различиями внутренних белков (NP и М), не дающими перекрестных межтиповых серологических реакций (Сох, 1999). Несмотря на то, что вирусы гриппа В и С достаточно широко циркулируют в человеческой популяции, только вирусы гриппа А способны вызывать пандемии, представляя, таким образом, серьезную опасность для человечества. Вирусы гриппа А были изолированы не только от человека, но и от птиц и различных видов животных: свиней, лошадей и морских млекопитающих. Однако источником и природным резервуаром всех вирусов гриппа типа А считаются водоплавающие птицы, у которых большинство вирусных штаммов не вызывают смертельных заболеваний, что свидетельствует об их оптимальном уровне адаптации к данному хозяину (Webster et ai, 1992, Львов, 2006).

Разделение вирусов типа А на подтипы основано на антигенных свойствах двух поверхностных гликопротеинов - гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). В настоящее время известно 16 подтипов НА и 9 подтипов NA вирусов гриппа А, циркулирующих среди позвоночных. Различия аминокислотных последовательностей участков НА, отвечающих за антигенность, между различными подтипами составляет 30% и более (Rohm et al, 1996).

Одной из особенностей вирусов гриппа является их быстрая изменчивость, вследствие чего появляются штаммы, способные обходить существующий в человеческой популяции иммунитет. Высокий уровень

изменчивости связан либо с возможностью генетической реассортациия между различными субтипами вируса во время смешанной инфекции, либо с высокой скоростью накопления точечных мутаций в геноме вируса. Эти явления являются основными причинами антигенного «шифта» и «дрейфа».

Вирусы всех существующих подтипов НА и НА типа А были выделены от птиц в то время, как среди млекопитающих циркулирует лишь ограниченное число подтипов вируса гриппа А (Каверин, 2003; Са1с1е1 а1., 2007). В человеческой популяции циркулируют вирусы с тремя подтипами НА (Н1, Н2, НЗ) и два ИА (N1 и N2). Эти варианты формируют три основных подтипа вируса гриппа А характерных для человека: НШ1, Н21Ы2 и НЗШ. В истории 20 века известны три пандемии, вызванные вирусами этих субтипов: в 1918 году -субтипом НШ1, в 1957 году - субтипом Н2Ы2 и в 1968 году - субтипом НЗТ\12. Эти пандемические штаммы были либо продуктами генной реассортации между вирусами гриппа человека и птиц, так в случае Н2Ы2 и НЗШ штаммов птичьи гены НА и полимеразы 1 (РВ1) привнесены в человеческую популяцию, либо являлись мутантной формой вируса птиц, что имело место в случае пандемического штамма НШ1 (Вгомт1ее е? а1, 2001; Яе\(Л е? а\., 2004).

2.1.1 Структура вируса гриппа А/Н5М1.

Вирусные частицы обладают икосаэндрической симметрией, в вирусной популяции встречаются вирионы от круглой до филаментозной формы (80-120 нм). Каждый вирион имеет липидную оболочку, получаемую от плазматической мембраны клетки-хозяина, в состав которой входят три типа вирусных трансмембранных белков: гемагглютинин (НА), нейраминидаза (КА), и матричный белок (М2). Под липидной оболочкой вируса находится слой из кодируемого вирусом белка М1 и ассоциированного с рибонуклеопротеиновым комплексом (РНП) - носителем генома. В состав РНП входят белки полимераз: РВ1, РВ2, РА и нуклеопротеин (№>) (Рис. 1).

(матриксный белок)

РВ1, РВ2,рА (полимеразныи комплекс)

(неструктурный белок) NSj

NP(нуклеокапсид)

Липидный бислой

NA (нейраминидаза) -НА (гемагглютинин) (ионный канал)

NS2 (NEP)

Рис. 1. Структура вируса гриппа А. Схематическое изображение (А), трехмерная модель вириона (Б) и электронная микрофотография вирусных частиц (В).

Геном вируса гриппа представлен восемью фрагментами однонитевой линейной антисмысловой РНК ((-)онРНК), кодирующими 10-12 вирусных белков в зависимости от штамма вируса (Chen and Krug, 2000) (Таблица 1). Первые 12 нуклеотидов 3'-конца и 13 нуклеотидов 5'-конца каждого сегмента являются консервативными областями генов, обладают способностью к гибридизации друг с другом, образуют шпилечные структуры и содержат промоторные участки для РНК-зависимых полимераз (Hsu et al., 1987; Baudin et al, 1994).

Геном вируса гриппа А, обозначения и функции белков (Baigent and McCauley, 2003) Таблица 1

Геномный сегмент Белок Свойства и функции

РВ1 2341 п.о. PB1-F2 87 а.к. Неструктурный белок, локализуется в мембране митохондрий, ядре, цитоплазме. Является индуктором апоптоза, регулятором полимеразной активности. Возможны неизвестные функции.

N40 Неструктурный белок, локализуется преимущественно в цитоплазме, является укороченной версией РВ1 (экспрессия начинается с 5 AUG кодона), не имеет транскриптазной активности, однако взаимодействует с РВ2 и полимеразным комплексом. Функции не известны (Wise et al., 2009).

РВ1 75 7а. к. 96 кДа Внутренние белки, формируют гетеротримерный полимеразный комплекс, взаимодействует с NP и вирусной вРНК, участвует в транскрипции и репликации вРНК. РВ 1 - связывание и отторжение кэп-структур клеточных мРНК. РВ2 - инициация транскрипции, энодонуклеазная активность. РА -элонгация мРНК.

РВ2 2341 п.о. РВ2 759 а.к. 87 кДа

РА 2233 п.о. РА 716 а. к. 85,5 кДа

НА 1778 п.о. НА 550 а.к. 220 кДа Поверхностный гликопротеин, гомотример. Осуществляет прикрепление к рецепторам на поверхности клетки хозяина и является главной антигенной детерминантой.

NP 1565 п.о. NP 498 а.к. 55 кДа Внутренний белок; ассоциирован с полимеразным комплексом и вРНК. является главным компонентом нуклеокапсида, участвует в репликации вРНК, созревании и упаковке вирусных частиц.

NA 1413 п.о. NA 454 а.к 240 кДа Поверхностный гликопротеин, гомотетрамер. Обладает ферментативной активностью, отщепляет терминальные остатки сиаловых кислот от гликоконьюгатов, осуществляет разрушение рецепторной связи НА. Является антигенной детерминантой.

М 1027 п.о. Ml 252 а. к. 28 кДа Внутренний белок. Взаимодействует с РНП зрелой вирусной частицы для формирования нуклеокапсида; участвует в репликации и сборке вириона; координирует транспорт внутри ядра.

М2 97 а.к. 15 кДа Внутренний белок. Формирует ионный канал.

NS 890 п.о. NS1 230 а.к. 25 кДа Неструктурный белок. Осуществляет различные регуляторные функции, является онтогонистом противовирусного ответа.

NS2 (NEP) 121 а.к. 14кДа Неструктурный белок. Медиатор экспорта РНП из ядра.

NEG8 ОРС белка открыта в 2009 году (167-216 кодонов). Неструктурный белок, влияет на ядерно-цитоплазматический транспорт. Функции не известны (Clifford et al., 2009).

2.1.2 Особенности репродукции гриппа птиц A/H5N1.

Вирусные частицы адсорбируются на поверхности эпителиальных клеток (Lowen and Palese, 2007) посредством взаимодействия НА вируса с остатками сиаловой кислоты рецепторов клеточной мембраны (Рис 2-1). Причем вирусы гриппа птиц и человека отличаются по рецепторной специфичности (Auewarakul et al., 2007). Так, вирусы гриппа человека преимущественно связываются с гликопротеиновыми рецепторами, в которых остатки сиаловых кислот связаны с олигосахаридами связью а-2,6 (SAo;-2,6gal), в то время как вирусы птиц в основном узнают связь SAce-2,3gal (Rogers and Paulson, 1983, Matrosovich et al., 2000).

Рис. 2. Цикл репликации вируса гриппа А (Basier and Aguilar, 2008).

Недавно было показано, что рецепторная специфичность вирусного штамма определяет анатомическую область репликации вируса в организме хозяина и, кроме того, может влиять на способность вируса к трансмиссии (Shinya et al., 2006). Проникновение вируса в клетку обычно осуществляется по

механизму рецептор-опосредованного эндоцитоза. Низкий уровень pH внутри эндосомы активирует интегрированный в бислой липидов вирусной оболочки белок М2, который формирует ионный канал, закачивает протоны внутрь вирусной оболочки. Закисление среды приводит к конформационным изменениям НА. Для таких структурных перестроек тример НА предварительно должен быть расщеплен в специфическом сайте (сайте расщепления, кливедж-сайте). Расщепление предшественника молекулы НА (НАО) приводит к образованию двух молекул НА1 и НА2, связанных дисульфидными мостиками, и способствует высвобождению пептида слияния (фъюжн-пептида), который встраивается в эндосомальную мембрану и обеспечивает процесс слияния мембран (Shaw and Рálese, 2007). Поскольку сайт расщепления НАО может быть специфичен для различных протеаз (в зависимости от штамма), то специфичность сайта расщепления влияет на тканевой тропизм вируса и патогенез вирусной инфекции. Большинство высокопатогенных вирусов A/H5N1 обладают серией положительнозаряженных аминокислот в кливедж-сайте НА, которые расщепляются повсеместно присутствующими протеазами типа фурина. В результате чего, такие вирусы способны развивать летальную системную инфекцию в организме хозяина. Поскольку низкопатогенные вирусы не имеют данной последовательности, они производят только локализованную инфекцию в респираторном или кишечном тракте (или обоих), где присутствуют трипсиноподобные протеазы, что отражается в слабой или асимптоматичной инфекции. На клеточной культуре вирусы гриппа, не имеющие полиосновный сайт расщепления НА, могут расти только в присутствии экзогенных протеаз, обеспечивающих расщепление предшественника НА, в то время как вирусы с полиосновным сайтом растут и без добавления трипсина (Hatta and Kawaoka, 2002). После высвобождения пептида слияния происходит слияние мембран вируса и эндосомы, и РНГГ комплекс (8 сегментов РНК, связанных с NP, белками полимеразного комплекса и Ml) выходит в цитоплазму клетки (Takeda et al., 2002). Выходу

генома вируса в цитоплазму предшествует диссоциация РНП комплекса от M1 белка. Далее РНП транспортируются в ядро, где происходят репликация РНК, транскрипция и сборка вирусного потомства (Рис. 2-2).

Вирусная геномная РНК не обладает свойствами матричной РНК, мРНК вируса гриппа синтезируется собственной РНК-полимеразой, состоящей из 3-х функциональных субъединиц (PA, РВ1 и РВ2). В ядре инфицированной клетки, в процессе синтеза мРНК вируса гриппа происходит ее взаимодействие с транскрибирующим механизмом клетки-хозяина (Рис. 2-3). Для инициации синтеза мРНК необходимы 5'-кэпированные праймеры, генерирование которых обеспечивается белком РВ2, который в полимеразном комплексе обладает функциями эндонуклеазы и отщепляет 5'-концевые фрагменты размером 15-18 нуклеотидов от предшественников клеточных мРНК (Brownlee and Sharps, 2002; Kawaguchi et al., 2005). Поскольку вирусные мРНК на своих 5'-концах содержат последовательности клеточного происхождения и не имеют комплементарных последовательностей к нуклеотидам на 5'-концах сегментов вРНК, они не могут служить подходящими матрицами для синтеза вРНК. Поэтому после того, как РНП проникают в клеточное ядро, начинаются процессы как праймер-зависимой РНК транскрипции (синтез мРНК из вРНК), так и праймер-независимой репликации (перевод (-) цепи вРНК в (+) цепь кРНК). В свою очередь, сформированные кРНК служат матрицами для синтеза вирусных РНК (Park et al., 2003).

Белки NP, NS1 и NEP (NS2) транспортируются в клеточное ядро, где обеспечивают контроль синтеза вирус-специфических мРНК и репликации фрагментов вРНК. На поздней стадии инфекции белок NS1 обеспечивает регуляцию сплайсинга транскриптов генов M и NS, что приводит к накоплению белков М2 и NS2 (NEP). Одновременно осуществляется транспорт мРНК PB 1, РВ2, РА и NP в цитоплазму, где происходит трансляция этих белков. После трансляции эти белки транспортируются в клеточное ядро и участвуют в образовании рибонуклеоида- предшественника вирусных частиц, лишенного

оболочки (Рис. 2-4). Белки Ml и NS2 (NEP) после трансляции также транспортируются в клеточное ядро, для взаимодействия с вирусным РНП (нуклеоидом). NS2 (NEP) белок контролирует выход РНП из ядра в цитоплазму, а белок Ml, находящийся у мембран со стороны цитоплазмы, через белок NP инициирует самосборку нуклеоида путем взаимодействия с цитоплазматическими доменами НА и NA (Рис. 2-6). На этой стадии происходит почкование вирусов, с участием NA, от модифицированных участков клеточной мембраны, так называемых rafts-микродоменов (Рис. 2-7). Эти микродомены плазматической мембраны, характеризующиеся повышенным содержанием холестерина и сфинголипидов и пониженной текучестью липидного бислоя, играют важную роль в процессе почкования вирионов потомства и в процессе проникновения вируса в клетку (Carrasco et al., 2004; Schroeder et al., 2005). Показано, что использование подобных участков мембраны характерно не только для вируса гриппа, но и для других оболочечных и безоболочечных вирусов, например, HIV-1, парамиксовирусы, рабдовирусы, ротавирусы и др. (Опо and Freed, 2005), а применение препаратов, влияющих на структуру и свойства rafts-микродоменов, в значительной степени влияет на репродукцию различных вирусов. 2. 1.3. Эпидемиология вируса гриппа A/H5N1. Угроза пандемии, вызванной вирусом гриппа A H5N1.

В настоящее время основным источником патогенного H5N1 вируса являются дикие птицы. Показано, что наиболее часто вирусом гриппа II5N1 инфицируются кряквы (Anas platyrhynchos), и их сезонная миграция способствует дальнейшему географическому распространению вируса, затрагивая, в том числе, и европейские страны (Olsen et al., 2006). Эти птицы, будучи инфицированными, не имеют клинических проявлений, но способны выделять вирус в течение 7 дней. Мертвые птицы и их экскременты, содержащие большое количество вируса, служат источником инфекции для других животных, включая тех, которые ранее рассматривались как устойчивые

к вирусу гриппа (домашние кошки, тигры и леопарды) (Kuiken et al., 2004). В течение последних 14 лет была доказана персистенция высокопатогенных вирусов гриппа A/H5N1 в организме диких птиц в Южном Китае с периодическими эпизоотиями в соседних странах таких, как Вьетнам и Индонезия (Smith et al., 2006; Chen et al., 2006a).

Исходно, вирусы гриппа птиц не способны инфицировать людей, однако, при определенных условиях, межвидовой барьер может быть преодолен. Так, долгое время считалось, что промежуточными хозяевами в процессе появления новых вирусных штаммов в человеческой популяции являются свиньи, поскольку эти животные восприимчивы как к вирусам гриппа птиц, гак и человека. И одновременная двойная инфекция свиней может быть источником новых штаммов вируса гриппа, в том числе тех, которые могут представлять пандемичекую угрозу человеческой популяции (Сох, 1999). Первый зафиксированный случай преодоления межвидового барьера вирусом гриппа A/H5N1 произошел в 1997 году, когда, при вспышке птичьего гриппа в Гонконге среди цыплят, были доказаны случаи инфицирования людей непосредственно от больной птицы без предварительной адаптации в свиньях. В результате этой вспышки было зафиксировано 18 случаев инфицирования людей, 6 из которых закончились смертельным исходом (Subharao et al., 1998). Инфицирование людей вирусом «птичьего гриппа» H5N1 произошло вследствие близкого контакта с инфицированной птицей, при очень высокой вирусной нагрузке. Однако, дальнейшего распространения инфекции от человека к человеку не последовало благодаря низкой трансмиссивной способности этого вируса, не смотря на то, что человеческая популяции является полностью наивной по отношению к H5N1 вирусам (Katz et al., 1999). Быстрое уничтожение всего поголовья домашней птицы в Гонконге полностью остановило вспышку. Однако из-за того, что этот вирус был способен инфицировать, но не убивал водоплавающих птиц, он продолжил циркулировать среди гусей и уток Юго-Восточного Китая, претерпевая

различные мутации (Cauthen et al, 2000; Guan et al, 2002). В результате этого в 2002 году в Гонконге появился новый антигенный вариант H5N1 вируса, высокопатогенный как для диких, так и домашних водоплавающих птиц. В результате этой эпизоотии два человека было инфицировано (1 случай оказался смертельным), а вирус далее распространился по азиатской территории, затронув такие страны как Вьетнам, Тайланд, Камбоджию, Индонезию, Китай, Японию, Лаос, Малазию и Южную Корею (Тат, 2002). Распространение высокопатогенного вируса нанесло огромный урон сельскому хозяйству этих регионов, погибло и было уничтожено в профилактических целях более 140 миллионов птиц. Однако, меры предпринятые в Китае, Тайланде и Вьетнаме не смогли предотвратить циркуляцию вируса H5N1, что привело к масштабной гибели различных видов диких птиц, а также нескольким смертельным случаям вирусной инфекции среди людей, имевших непосредственный контакт с инфицированной птицей. Предполагаются единичные случаи передачи инфекции от человека к человеку, однако, доказательств эффективного распространения в настоящий момент не найдено (Tran et al, 2004; Ungchusak et al, 2005).

Летом 2005 года в провинции Цинхай (Qinghai) в Западном Китае зарегистрировали массовую гибель перелетных птиц, вызванную высокопатогенным вирусом гриппа А подтипа H5N1 относящимся ко 2-му субклайду 2 клайда. Эта область являлась местом размножения более, чем 100 000 перелетных птиц, 189 видов, мигрирующих в южную Азию, Индию, Сибирь, Австралию и новую Зеландию (Chen et al, 20066). В процессе этой эпизоотии погибло более, чем 3000 птиц, и вирус гриппа H5N1 распространился на территории Казахстана, Монголии, Хорватии, Румынии, России, Украины, Германии, Турции, Азербайжана, Ирака, Египта, Нигерии и Судана. Случаи инфицирования людей, начиная с 2003 года, были зафиксированы во Вьетнаме, Тайланде, Китае, Турции, Индонезии, Азербайджане, Камбоджии, Египте, Пакистане и Ираке и других странах.

В конце июля 2005 г. в Российской Федерации была зарегистрирована первая вспышка гриппа Н5Ы1 среди домашних птиц в Сибири. В начале августа появились сообщения о вспышках в граничащих с Россией районах Казахстана. Почти одновременно с этим появились сообщения о выявлении вируса Н5Ы1 у погибших перелетных птиц в Монголии. На территории России в 2006 году заболевание птиц зарегистрировано в 90 населенных пунктах на территории 11 субъектов Южного и трех субъектов Сибирского федеральных округов Российской Федерации, в январе - феврале 2007 г. обнаружены очаги инфекции Н5Ы1 среди домашней птицы в 9 районах Московской области, Калужской области и Краснодарском крае. В Республике Казахстан в Павлодарской, Акмолинской, Каргандинской и Северо-Казахстанской областях были отмечены 7 очагов данного заболевания среди птиц в 2005 г. В течение месяца заболевание распространилось практически на всю северную и центральную территории Казахстана. Благодаря принятым комплексным мерам удалось своевременно предотвратить дальнейшее распространение болезни, локализовать очаги гриппа птиц и предупредить в стране случаи заболевания людей.

По данным ВОЗ на 10 октября 2011 года число случаев инфицирования людей вирусом Н5Ш составляет 566, из которых 332 закончились летальным исходом (данные получены с официального сайта ВОЗ /Щ)://и>я>н>. м1юАп1/съг/(1Ьеа*(^(тшг тАиеп711/сош&у>/т^ 103 14/еп).

Несмотря на появление и быстрое распространение нового подтипа вируса гриппа А/НШ1 антигенно близкого вирусу гриппа свиней, вызывающего значительную заболеваемость населения практически во всех странах мира, угроза развития пандемии, вызванной высоко патогенными вирусами подтипа Н5Ш, продолжает оставаться крайне актуальной. В связи с тем, что новые случаи инфицирования людей продолжают постоянно возникать, Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) рекомендует создавать резервные запасы Н5Ш гриппозных вакцин.

2.1.4. Иммунный ответ при гриппозной инфекции.

Для устойчивости к вирусной инфекции и развитию заболевания требуются как мукозальный, так и системный иммунный ответ, причем основным фактором в формировании устойчивости к естественной инфекции являются антитела, секретируемые локально в верхнем дыхательном тракте. Показано, что основную роль в предотвращении повторной инфекции играют нейтрализующие антитела, синтезирующиеся антиген-специфическими В-клетками памяти, в то время как освобождение (клиренс) от вируса опосредуется клеточным иммунитетом.

Врожденный иммунитет против гриппозной инфекции. Основными компонентами врожденной иммунной системы считаются такие компоненты как макрофаги, ИНФ-а/р и другие цитокины и НК клетки, обеспечивающие защитные воспалительные процессы. Некоторые компоненты, входящие в состав слизи респираторного тракта, также обладают протективным действием. Вещества, содержащие N-ацетилнейраминовую кислоту, являются похожими или идентичными рецепторам для НА вируса гриппа, что значительно уменьшает способность вирусов инфицировать клетки хозяев, за счет связывания вирусных частиц.

Одним из наиболее важных элементов противовирусного врожденного иммунитета является система ИНФ-а/р. Большинство типов клеток, включая эпителиальные клетки респираторного тракта и ДК, синтезируют ИНФ-а/(3, в ответ на вирусную инфекцию (Рис.3). Уровень ИНФ-а/р в верхнем и нижнем дыхательных путях быстро увеличивается после инфицирования и прямо коррелирует со степенью вирусной репликации в организмах хорьков, мышей и людей. После высвобождения из инфицированой клетки, ИНФ-а/р связывается со своими рецепторами, находящимися на поверхности секретирующих и соседних клеток, таким образом, устанавливается противовирусное состояние, которое характеризуется продукцией многих белков, ингибирующих способность вируса реплицироваться (Palese and García-Sastre, 2002; Honda et

al., 2005). Многие вирусы, в том числе и вирус гриппа, пытаются избежать действия ИНФ-а/(3 системы, путем производства ИНФ-антагонистов.

Альвеолярные макрофаги обеспечивают лизис инфицированных клеток, через апоптоз-зависимый фагоцитоз и секретируют такие белки как ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а и ИЛ-12, приводящие к активации НК клеток. В свою очередь, цитокины ИЛ-1, ФНО-а и ИЛ-6 приводят к развитию лихорадки и повышение фебрильного ответа, степень которых коррелирует с уровнем вирусного выделения у людей и животных. НК клетки, которые выявляются среди легочных лифмоцитов через 48 часов после вирусной инфекции, продуцируют ИНФ-у и ограничивают вирусное распространение за счет лизиса вирус-инфицированных клеток путем формирования пор с привлечением перфорина. Система комплемента также опосредует защиту против вирусной инфекции (Hauge et al., 2007).

Адаптивный иммунитет против гриппозной инфекции. Адаптивный иммунный ответ опосредуется специфическими секреторными IgA антителами (SIgA) и ЦТЛ (CD8+ цитотокическими Т лимфоцитами), в результате активности которых происходит элиминирование вируса из организма после инфицирования (Рис. 3). Основными индукторами адаптивного иммунного ответа являются АПК: ДК и макрофаги. Экзогенные вирусные антигены (инактивированные вирусные частицы, интактные вирусы и апоптотические и инфицированные клетки) захватываются АПК путем эндоцитоза. После этого пептиды вирусного антигена связываются с клеточными молекулами МНС класса I или класса II, и эти комплексы представляются на повехности антиген-презентирующих клеток. После этого АПК мигрируют в лимфотические узлы, где они презентируют патоген-специфические антигены Т-клеткам. Кроме этого, ДК способствуют антивирусному иммунному ответу, секретируя ИНФ-а/(3, в ответ на вирусную инфекцию. АПК, наряду с другими цитокинами, секретируют ИЛ-12, который необходим для развития клеток-хэлперов 1 типа (Txl), и ИЛ-1(3, одного из наиболее важных цитокинов, обеспечивающего связь между врожденным и приобретенным иммунитетом (Banchereau et al., 1998; Mellman et al., 2001).

вирус гриппа

Врожденный иммунный ответ

Адаптивный иммунный ответ

ккд

эпителиальная клетка (ИНФ-а)

(ИНФ-Р) Цг'Т

Блок вирусной репликации

Л '9е

^ »901

полимерный |дА

Л №23

Нейтрализация

ИНФ у

Блок вирусной репликации

Лизис

инфицированной клетки

Рис. 3. Защитные механизмы, индуцируемые гриппозной инфекцией у мышей (Татига е! а1, 2004).

Предшественники вирус-специфических CD4+ Т-клеток, из которых дифференцируются клетки типов Тх1 и Тх2, и CD8+ Т-клеточные предшественники для ЦТЛ узнают молекулы МНС II или МНС I в комплексе с пептидными антигенами на поверхности АПК, соответственно. На мышиной модели было показано, что клетки Тх1 секретируют ИНФ-у и ИЛ-2 и способствуют продукции IgG2a, путем образования антител-формирующих клеток, тогда как клетки Тх2 секретируют ИЛ-4 и ИЛ-5 и стимулируют анитела-формирующие клетки на производство IgA, IgGl и IgE. ИЛ-2, выделяемый Txl, усиливает также пролиферацию CD8+ ЦТЛ. Антитела, продуцируемые во время этих процессов, способствуют нейтрализации вирусов за счет связывания с вирусными антигенами. Клетки Txl опосредуют развитие гиперчувствительности замедленного действия, секретируя ИНФ-у, что приводит к ингибированию вирусной репликации. В свою очередь, ЦТЛ распознают пептиды, образованные из вирусного антигена в комплексе с МНС I на вирус-инфицированных клетках, и разрушают эти клетки посредством экзоцитоза гранул, содержащих перфорин и гранзимы. На этой стадии ИНФ-у, секретируемый НК клетками и CD8+T клетками не играет основную роль, для целенаправленного лизиса клеток (Tamura and Kurata, 2004).

Клеточно-зависимый иммунитет имеет существенное значение в выздоровлении от гриппозной инфекции и может предотвращать ассоциированные с гриппом осложнения, но он не вносит значительный вклад в предупреждение инфекции. Гриппоспецифичные клеточные лимфоциты выявляются в крови и секретах нижнего респираторного тракта инфицированных индивидуумов. Лизис инфицированных клеток является ЦТЛ-опосредованным. Процесс цитолиза может также осуществляться ЦТЛ при содействии гриппоспецифических антител и системы комплемента. У инфицированных или вакцинированных индивидуумов первичный цитотоксический ответ проявляется в крови после 6-14 дней и исчезает к 21 дню. ЦТЛ обладают кросс-реактивными свойствами по отношению к штаммам

внутри одного типа вируса в культурах in vitro, причем были изолированы ЦТЛ, распознающие внутренние негликозилированные белки (М, NP, РВ2). ЦТЛ клетки памяти (вторичный ответ) обладают кросс-реактивной специфичностью, сходной с первичным ответом ЦТЛ, а их количество начинает возрастать с 3 дня после реинфекции и достигают пикового уровня на 14 день, а затем опускаются до базового уровня к 6 месяцам. Уровень ЦТЛ памяти не коррелирует с риском инфицирования или развитим заболевания при экспериментальной гриппозной инфекции, но коррелиирует с уровнем вирусного клиренса из респираторного тракта (Сох et al., 2004; Maines et а/.., 2008).

У иммунизированных животных предсуществующие специфические SIgA и IgG, являющиеся результатом активности B-клеток памяти, вовлечены в вирусную элиминацию за счет формирования комплексов «вирус-Ig» в скором времени после повторного инфицирования. В носовых секретах содержатся преимущественно IgA изотипы антител к НА и NA вируса гриппа, однако, во время первичной инфекции в носовых смывах могут быть выявлены иммуноглобулины всех основных классов (A,G,M). SIgA антитела, которые секретируются на слизистую респираторного тракта путем трансэпителиального транспорта димерных IgA антител, а также IgM, синтезирующиеся на ранних сроках инфекции, являются основными нейтрализующими антителами, направленными против мукозальных антигенов. Они обеспечивают защиту не только против гомологичной вирусной инфекции, но также кросс-защиту против инфекции, вызванной дрейф-вариантами вирусов. Антитела IgG, которые проникают из сыворотки на слизистую путем диффузии, обеспечивают защиту против гомологичной вирусной инфекции. Антитела этого класса широко представлены на альвеолярном эпителии и предотвращают развитие гриппозной пневмонии. У иммунизированных животных, продукция специфических IgA и IgG клетками памяти возрастает после повторной инфекции по сравнению с первичной. Эти

антитела играют роль в элиминации вируса, начиная с 3 дня после ре-инфекции. В эпителиальных клетках инфицированных животных, специфические dSIgA (димеры SIgA) в процессе трансэпителиального транспорта способны предотвращать сборку вирусных частиц за счет связывания вновь синтезированных вирусных белков внутри клетки. Местный IgA-ответ, стимулированный естественной инфекцией, длится 3-5 месяцев. IgA также является преимущественным изотипом антител в секретах слизистых после повторной инфекции, а в крови вирус-специфические IgA сохраняются также на высоком уровне (Kalia et al., 2006; Buchy et al., 2010).

Считается, что уровень сывороточных анти-НА антител является основной величиной, коррелирующей с защитой против гриппа. У людей защитный сывороточный антительный (титр антигемагглютинирующих антител >40) ответ наблюдается примерно в 80% случаев после естественной инфекции. В-клетки, продуцирующие все три основных класса Ig, могут быть выявлены в течение 10-14 дней у индивидуумов, перенесших гриппозную инфекцию. Пик синтеза IgA и IgM наблюдается через две недели после инфицирования, затем уровень антител начинает снижаться, тогда как для IgG максимум синтеза наблюдается через 4-6 недель. Антитела классов IgG и IgM являются доминирующими при первичной инфекции, IgG и IgA преобладают при вторичном.

Характер иммунного ответа на вирусы гриппа говорит о том, что стратегически важным для контроля за этой инфекцией является создание мукозальных вакцин, способных индуцировать SIgA антитела и обеспечивать формирование кросс-защиты. В этом случае сывороточные антитела класса IgG предотвращают летальную гриппозную пневмонию, а ЦТЛ обеспечивают широкую защиту против различных субтипов вируса (Tamura and Kurata, 2004; Kalia et al., 2006).

2.1.5. NS1 белок вируса гриппа: ингибитор врожденного и адаптивного иммунитета.

Белок NS1, строение и локализация. NS ген является восьмым самым маленьким сегментом вируса гриппа А. Этот геномный сегмент определяет формирование двух типов мРНК в инфицированной клетке: одни являются коллинеарными вРНК и кодируют белок NS1, другие - формируются путем альтернативного сплайсинга мРНК NS1 и транслируются в белок NEP (121 а.к.) (Lamb and Krug, 2003). Оба участка мРНК имеют 56 общих нуклеотидов на 5'-конце, в результате чего NS1 и NEP имеют 10 общих N-терминальных аминокислот. (Рис.4). Длина NS1 белка варьирует у различных вирусных штаммов и составляет 230-237 а.к. (26 кДа) (Palese, 2007). Тем не менее, в естественных условиях нередко встречаются вирусы гриппа A, NS1 белки которых имеют усеченный С-терминальный конец (-15-30 аминокислот) (Suarez and Perdue, 1998).

NS I

1 I 890

NS1 мРНК(

230 AK

■ A<n)

NEPMPHK*-TL_ J 121 AK LA,„

Рис. 4. Схематическое изображение NS гена вируса гриппа и его специфических мРНК транскриптов (Garsia-Sastre et al., 1998).

NS1 является неструктурным белком, который экспрессируется в большом количестве на ранних стадиях вирусной инфекции. Распределение NS1 белка в инфицированных клетках варьирует у различных штаммов и зависит от нескольких факторов: штамма вируса; уровня экспрессии NS1; типа и полярности клетки, а также времени, прошедшего от момента заражения (Li et al, 1998; Newby et al, 2007)..

Белок NSI имеет модульную организацию, когда различные домены отвечают за различные функции. Два важных домена описаны в NSI. N-терминальный структурный домен (РНК-связывающий домен, 73 а.к.),

содержащий 3 a-спиральных участка, несущий сигнал ядерной локализации (NLS1) и распознающий днРНК, и С-терминальный эффекторный домен (164 а.к.), который осуществляет взаимодействие с ядерными белками клетки-хозяина и отвечает за ядерно-цитоплазматический транспорт зрелых мРНК в инфицированных клетках (Qian et al., 1994). Также NS1 несет один ядерный сигнал для экспорта в цитоплазму (NES) (Yoshida et al., 1981; Greenspan et al., 1988; Li et al., 1998). Функционирует белок в виде димеров, которые образуются за счет формирования ионных связей (Bornholdt and Prasad, 2006; Lin et al., 2007).

Иммуhomoдулирующие функции NS1 белка. Попав в организм хозяина, вирус подавляет механизмы врожденного иммунитета: ингибирует индукцию ИНФ в инфицированных клетках и препятствует формированию механизмов противовирусной защиты в клетках, соседних с инфицированными (Wathelet et al., 1998; Talón et al., 2000; Wang et al., 2000; Noah et al., 2003). Однако, эффективность и механизм, с помощью которого блокируется ИНФ ответ, является штаммоспецифичным (Наутап et al., 2007).

Полученные к настоящему времени данные на доступных in vivo моделях свидетельствуют о том, что основной функцией NS1 является антагонизм противовирусному ответу, опосредованного IFN-a/p. Белок NS1 является многофункциональным белком, выполняющим множество различных функций, которые способствуют полноценной вирусной репликации и вирулентности в ходе инфекции. Подавление механизмов противовирусной защиты осуществляется в результате многофакторных взаимодействий различных функциональных доменов NS1 белка с сигнальными системами инфицированных вирусом гриппа клеток и осуществляются на транскрипционном, пост-транскрипционном и трансляционном уровнях (Fernandez-Sesma, 2007) (Таблица 2).

Таблица 2

Иммуномодулирующие функции белка NS1 в инфицированных клетках

Ингибирование системы ИНФ:

• Связывание днРНК

• Ингибирование активации внутриклеточных сигнальных молекул RIGI

• Ингибирование транскрипционных факторов (IRF3, NFkB, АР-1, Jun)

• Ингибирование антивирусных белков (OAS/RNAse L, PKR)_

Ингибирование клеточной трансляции и РНК процессинга:

• Связывание фактора eIF3a для предпочтительной трансляции вирусных мРНК

• Вмешательство в процессинг клеточных мРНК и ингибирования экспорта

_клеточных мРНК из ядра_

Ингибирование апоптоза:

• Активация PI3K (связывание р85бета) Ингибирование активации ДК:

• Ингибирование экспрессии костимулирующих молекул, хемокиновых рецепторов провоспалительных цитокинов и хемокинов и CD4 Т (Txl) клеточного

_праймирования дендритными клетками_

Антагонист ИНФ. Создание вирусов гриппа А, неспособных экспрессировать NSI (delNS), или экспрессирующих усеченные формы NS1, выявило ключевую роль этого белка в блокировании синтеза ИФН иммунной системой хозяина (Egorov et al, 1998; Garcia-Sastre et al, 1998; Kochs et al, 2007). DelNS 1 вирусы индуцируют синтез больших количеств ИФН в зараженной клетке, вследствие чего, являются аттенуированными в ИФН-компетентных системах. Показано, что NS1 белок ингибирует обе ветви ИНФ пути: индукцию производства ИНФ и установление противовирусного состояния путем ИНФ-1 сигналинга (Ершов Ф.И., Киселев О.И., 2005) (Рис.5). Белок NS1 связывается с вирусными днРНК, делая их невидимыми в инфицированной клетке, и ингибирует активацию протеинкиназы R (Bergmann et al, 2000; Li et al., 2006), таким образом, препятствуя ингибированию трансляции белков в инфицированной клетке и откладывая апоптоз. Белок NS1 ингибирует также способность внутриклеточных сенсоров (RIG-1) выявлять вирусные РНК и запускать ИНФ путь. Белок NS1 способен ингибировать активацию и перенос в ядро важных

Вирус гриппа А

ДЦРНК

ООО

ДЦРНК

дцРНК

Прямое _ ограничение противовирусного ответа

PACT

Ограничение индукции ИФН

NFkBKIRF3.

elF2a J СРНКаза Ü

ААААА

Аппарат экспорта мРНК из ядра

Ускорение трансляции вирусных мРНК

>АВР1

elF4GI

ААААА ААААА

Пост-транскриптационный блок созревания клеточных нРНК (Н., ИФН. ISG и.т.д)

PABPII i NS1

Активация PI3K

3 пре-мРНК

Ограничение апоптоза ?

транскрипционных факторов (IRF3, NFkB, АР-1 и др.) необходимых для продукции ИНФ-а//3 или для индукции провоспалительных цитокинов в большинстве типов клеток.

Другие ^нкг/ии.С-терминальный эффекторный домен белка NS1 ингибирует созревание и экспорт хозяйских клеточных антивирусных мРНК путем связывания с факторами SPCF (специфический фактор полиаденилирования и расщепления) и РАВ II (Ро1у(А)-связывающий белок II) (Nemeroff et al., 1998; Chen et al., 1999, Li et al.,2001).

Взаимодействия с неизвестными функциями (nsi) (nso (nsi) (nsi)

ШуклеолинА íñsltl íns1-bp) (ppzj

Рис. 5. Схематическая диаграмма, отображающая множественные функции NS1 в инфицированной клетке (Haie et al., 2008). (а) Пре-транскриптационное ограничение индукции ИФН-(3. (б) Угнетение противовирусных функций PKR и OAS/РНКазы L. (в) Пост-транскриптационный блок созревания и экспорта из ядра всех клеточных мРНК. (г) Ускорение трансляции вирусных мРНК. (д) Активация PI3R. Внизу обозначены взаимодействия, функции и/или локализация которых неизвестна.

Связываясь с этими мишенями, белок NS1 препятствует инициации клеточного антивирусного ответа на пост-транскрипционном уровне (Noah et al., 2003). Связывание NS1 с фактором РАВ II, который облегчает элонгацию олиго(А)-последовательностей мРНК, нарушает его способность правильно достраивать поли-А-хвосты пре-мРНК внутри ядра клетки хозяина и блокирует экспорт этих пре-мРНК из ядра. Таким образом, основной функцией С-терминального домена является ингибирование сплайсинга клеточных пре-мРНК, полиаденилирования и ядерно-цитоплазматического транспорта зрелых клеточных мРНК в инфицированных клетках. Это приводит к "выключению" хозяйского белкового синтеза в процессе вирусной гриппозной инфекции (Nemeroff et al., 1998; Chen and Krug, 2000).

Показано также, что N-терминальный домен NS1 белка способен взаимодействовать с ро1у(А)-участками клеточных пре-мРНК, блокируя их транспорт в цитоплазму (Nemeroff et al., 1998; Qiu et al., 1995). Это приводит к увеличению концентрации клеточных пре-мРНК внутри ядра инфицированной клетки.

Другой функцией белка NS1 является ингибирование сплайсинга клеточных пре-мРНК, что обусловлено способностью этого белка связываться со сплайсосомной мяРНк, U6 мяРНК, ключевым компонентом каталитического центра в сплайсосоме (Lu et al., 1995; Qiu et ai, 1995; Wang and Krug, 1998).

Stasakova и коллеги показали, что NS1 через N-терминальный домен контролирует активацию каспазы-1, таким образом, подавляя созревание про-HJIl-ß, про-ИЛ-18- и каспаза-1-зависимый апоптоз в первично инфицированных человеческих макрофагах. Это приводит к тому, что вирус-индуцированный эндоцитоз откладывается. Точные механизмы этого эффекта пока не ясны (Stasakova et al., 2005).

Было показано, что N-терминальный домен NS1 белка способствует увеличению трансляционной активности вирусных мРНК, обеспечивая их предпочтительное связывание с полисомальным комплексом. NS1 белок

взаимодействует с клеточным фактором инициации трансляции eIF4GI, в результате чего происходит более эффективное взаимодействие рибосом с 5'-терминальными последовательностями вирусных, а не клеточных мРНК (Aragón et al., 2000).

Кроме ИНФ 1 типа, белок NS1 регулирует синтез провоспалительных цитокинов в инфицированных макрофагах. Причем не только N-терминальная часть отвечает за ингибирование продукции ИЛ1-(3 и ИЛ-18 (как было указано выше), но также важна С-терминальная часть для регуляции синтеза ФНО-а, ИЛ-6, CCL3 и MIP-1 a (de la Luna et al, 1995; Marión et al, 1997; Park and Katze, 1995).

Как следствие выше перечисленных взаимодействий, в первично инфицированных клетках индукция интерферонов первого типа и других клеточных мРНК, кодирующих белки с антивирусной активностью, ингибируется (Talón et al, 2000; Wang et al, 2000), а вирус-индуцированный апоптоз задерживается (Takizawa et al, 1996).

Ингибирование активации дендритных клеток белком NS1. На человеческих ДК недавно было показано, что NS1 значительно ингибирует способность этих клеток активировать Тх1-опосредованный иммунный ответ. Среди генов ДК, подвергающихся влиянию NS1 белка, находятся гены различных провоспалительных цитокинов и хемокинов (ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-12р35, ИЛ-23р40, ИЛ-8, RANTES, MlPlbeta), ИНФ-а/р, хемокиновые рецепторы (ССК7) и костимулирующие молекулы (МНС II, CD86). Важно, что ДК, инфицированные вирусом, экспрессирующим NS1 белок, гораздо слабее индуцируют выработку ИНФ-у наивными Т-клетками, по сравнению с ДК, инфицированными вирусом с удаленным NS1 белком. Механизм, благодаря которому белок NS1 оказывает влияние на созревание ДК, требует дальнейшего изучения (Fernandez-Sesma et al, 2006).

Поскольку NS1 не входит в состав вириона, он может быть перспективной мишенью для генетических манипуляций, которые в данном

случае не приведут к изменению структуры вириона на белковом уровне (Lamb and Krug, 2001; Krug et al., 2003). А удаление последовательности, кодирующей белок NS1, и отсутствие экспрессии белка NS1, приводит к потере вирусом способности ингибировать ИНФ систему хозяина, что является перспективным подходом к аттенуации вирусных штаммов.

2.1.6. Белок PB1-F2. Новый фактор патогенности вируса гриппа А.

Одним из атрибутов гриппозной инфекции является индукция апоптоза инфициованных клеток, сопровождающегося такими характерными признаками как конденсация хроматина, фрагментация ДНК, сжатие клеток и активация каспаз (Hinshaw et al., 1994; Brydon et al., 2003). Апоптоз, с одной стороны, является первичным антивирусным ответом, с другой стороны, также выгоден вирусу на поздних стадиях цикла репликации (Balachandran et al., 1998; Castelli et al., 1998; Lin et al., 2002). Показано, что вирусными компонентами, индуцирующими апоптоз, являются NA, вирусные одно и двунитевые РНК и неструктурный белок NSI (Morris et al., 1999; Schultz-Cherry et al., 2001). Тем не менее, роль NS1 в вирус-индуцированном апоптозе обсуждается, поскольку мутантные вирусы, дефицитные по NS1 белку, также являются сильными индукторами апоптоза (Zhirnov et al., 2002).

В 2001 году в результате тотального сканирования антигенных пептидов вируса гриппа А, которые могли бы быть закодированы альтернативными рамками считывания, был обнаружен новый вирусный белок, участник вирус-индуцированного апоптоза (Chen et al., 2001). Этот белок, названный PB1-F2, закодирован альтернативной ОРС в РВ1 геномном сегменте и являлся белком, состоящим у большинства человеческих и птичьих изолятов из 87а.к. (Zell et al., 2007). Трансляция этого нового белка начинается со 120 нуклеотида в РВ1 геномном сегменте и инициируется рибосомальным сканированием, при котором 40S субъединица рибосомы после загрузки прямо перед 5' кэпированным участком сканирует мРНК в поисках AUG триплета для инициации трансляцию. В случае, если рибосома узнает AUG в альтернативной

рамке считывания, это может привести к формированию новых полипептидов (Coleman, 2007) (Рис.6).

РВ1

1 atg с.ЛТ gtc аат ccg ас с тта стт ттс ттл ала gtg cca gca саа аат gct ata AGC аса 60 1mdvnpti. 1. flkvpaqna1 пт ?п

iwmsirpyfs*K€QHKMI • A q

г>- PB1-F2

61 act ттс сст tat act gga gac сст сст тас agc фт ПГ.Г. дсл gga аса 'jga та: а'"'' at

АСС

21tfpytgdppys н g т г: т g г г м 4u

21 l 3 l i l е т l l т а |и с q к q D т р w

121 gat act gt£_-aac agg аса cat cag тас тса gaa aag gga aga tgg аса аса аас асс аа

41 с т TGA V n р т н 0 y к g r w т n

41 i l s т g н i s т а к r £ d а 9 в т р К

181 act gga gca ccg саа стс аас ccg атт gat ggg сса ctg сса gaa gac аат с. а а сел ас.т

61 т с а р q ь n р 1 □ g р l р F. d n Е р

61 ь * Н r N S т R м а н с К Т м N V

241 ggt тат gcc саа аса gat tgt gta ttg gag gcg atg gct ттс стт gag gaa тсс cat сст

ai g t а Q Т 0 С v L Е а М а f l б е н р

в1 V м р К Я I V Y w R R W L S L R N р I L

301 ggt атт ттт gaa аас tcg tgt атт gaa acg atg gag gtt gtt cag саа АСА CGA СГЛ GAC

101 g 1 г е N s : е т м е v о т r v

101 v Г ь К Т R v l К R W R L F s К н е | *

Рис. 6. Схематическое изображение специфических транскригггов РВ1 гена вируса

гриппа (Mazur et al., 2008). Инициирующие кодоны трансляции белков РВ1 и PB1-F2 показаны черными стрелками. Открытая рамка считывания белка PB1-F2 выделена рамкой.

Белок PB1-F2 является короткоживущим в цикле репликации, максимум его экспрессии наблюдается через 5 часов после инфицирования. Основным местом локализации этого белка являются внешняя и внутренняя мембраны митохондрий, куда белок встраивается благодаря основной амфипагичской спирали на С-концевом участке. Взаимодействуя с компонентами порового комплекса митохондрий ANT3 и VDAC1 белок PB1-F2 может играть роль в индукции митохондрия-опосредованного апоптоза, путем формирования неспецифических пор в липидном бислое мембран (Zamarin et al., 2005). Было показано, что PB1-F2 не индуцирует апоптоз сам по себе, но усиливает апоптоз в ответ на цитотоксические стимулы (Yamada et al., 2004; Zamarin et al., 2005).

Кроме типичной локализации PB1-F2 в мембране митохондрий, этот белок также выявляется в цитоплазме и ядре инфицированных клеток (Chen et al., 2001; Yamada et al., 2004). Различная локализация позволяет предположить, что белок может иметь различные функции. Белок PB1-F2 колокализуется и прямо взаимодействует с вирусной полимеразой РВ1, а недостаток PB1-F2 во время инфекции приводит к изменению локализации РВ1 и снижению полимеразной вирусной активности. Таким образом, PB1-F2 является

непрямым регулятором вирусной полимеразной активности путем взаимодействия с РВ1 (Mazur et al., 2008).

С другой стороны, было показано, что PB1-F2 белок не является необходимым для репликации вируса. Knockout PB1-F2 у лабораторных изолятов субтипа H1N1 не приводил к угнетению вирусной репликации в клеточной культуре, однако реассортанты H1N1 с удаленным PB1-F2 демонстрировали значительное снижение (50%) способности индуцировать апоптоз моноцитов и сниженную патогенность для мышей (Zamarin et al., 2006).

Преимущественно индуцируя гибель инфицированных АПК хозяина, но не эпителиальных, PB1-F2 может препятствовать презентации антигена при формировании адаптивного иммунного ответа, таким образом, способствуя увеличению патогенности вируса. Более того, показано, что единичная мутация в PB1-F2 высоко патогенных птичьих вирусов гриппа H5N1 и «испанки» А H1N1 способствует усилению патогенности. Вместе с тем, молекулярные основы роли PB1-F2 в патогенезе гриппозной инфекции до конца не ясны (Conenello and Palese, 2007).

Недавно PB1-F2 был идентифицирован как важный фактор патогенности в связи с той ролью, которую играет этот белок в развитии летальной вторичной бактериальной пневмонии. Помимо разрушения легочных эпителиальных клеток, продуцирующих слизь, другой возможной предпосылкой развития вторичной бактериальной инфекции является целевое элиминирование альвеолярных макрофагов белком PB1-F2 (McAuley et al., 2007). В результате специфической элиминации макрофагов приобретенный иммунный ответ замедляется и ослабляется. Это позволяет уменьшить клиренс вируса гриппа А из организма хозяина, что приводит к увеличению поражения хозяйской ткани и производству большего количества вирионов, способных увеличить трансмиссию.

Кроме этого, различные изыскания в области моделирования мутантных вирусов без PB1-F2, демонстрируют роль этого белка в регуляции ИНФ ответа, однако механизмы регуляции не расшифрованы полностью (Le Goffic et al., 2010). В 2011 году в работе Varga и соавторов показана роль белка PB1-F2, как ингибитора ИНФ-(3, опосредованно, через регуляцию белка MAVS (mitochondrial antiviral signaling protein) (Varga et al., 2011).

Таким образом, белок PB1-F2 рассматривается как один из дополнительных факторов появления новых пандемических штаммов в человеческой популяции. Все вышеизложенное предполагает, что усиленная патогенность вирусов, кодирующих этот белок, является следствием способности вируса снижать его собственную презентацию, уменьшать вирусный клиренс. Уменьшая численность иммуноцитов в месте внедрения и репликации вируса, патогенные вирусные штамммы могут ингибировать врожденный иммунный ответ и развитие специфического иммунитета (Gocnikova et al., 2007). В связи с тем, что удаление PB1-F2 может существенно аттунеуровать вирусный штамм из-за увеличения вирусного клиренса из инфицированных органов животных, этот подход может найти применение в качестве дополнительного фактора аттенуации при разработке живых гриппозных вакцин.

2.1.7. Метод «обратной генетики» вируса гриппа.

Впервые системы обратной генетики были разработаны для PITK-содержащих вирусов, имеющих геном позитивной полярности (Racaniello and Baltimore, 1981). Трансфекция полноразмерных РНК копий вирусов в эукариотические клетки приводила к экспрессии вирусных белков, началу вирусной репликации и сборке вирусных частиц в культуре.

Первый рекомбинантный штамм вируса гриппа был получен в 1989 году в лаборатории Peter Palese (Luytjes et al., 1989). В клетки, предварительно зараженные вирусом-помощником (температуро-чувствительным мутантом), методом трансфекции вводили функционально активные РНП-комплексы,

полученные из синтезированной in vitro РНК, очищенных белков полимеразного комплекса и NP белка вируса гриппа. Вирус-помощник при этом служил внутриклеточным источником NP белка, и белков полимеразного комплекса, а также вирусных РНК (Enami et al., 1991; Yasuda J et al., 1994). Селекция потомства, несущего модифицированный ген осуществлялось при пассировании при повышенной температуре.

В 1994 году Neumann G. предложил альтернативный подход, основанный на внутриклеточном синтезе вирусных РНК с помощью клеточной РНК-полимеразы I (Neumann, 1994). В отличие от мРНК транскриптов, получаемых с помощью РНК-полимеразы II, Poll - транскрипты не содержали кэпов и поли-А структур. Вскоре был синтезирован вирусный РНК сегмент с точными 5' и 3' концевыми последовательностями и в дальнейших исследованиях продемонстрировано, что такие геномные РНК-конструкции узнаются вирусным полимеразным комплексом и могут включаться в состав вновь образующихся вирусов. Используя данный подход, удалось заменить вирусный РНК сегмент, кодирующий нейраминидазу, на конструкцию, полученную в ходе синтеза гена NA с плазмиды (Pleshka et al.,1996). При этом синтезированные Poll транскрипты эффективно упаковывались в виде РНГ1 комплексов в ходе котрансфекции плазмид, кодирующих белки РНП комплекса (PA, РВ1, РВ2 и NP). Таким образом, была продемонстрирована возможность получения активных РНП-комплексов внутри клетки и показано, что РНП является минимальной репликативной единицей, необходимой для восстановления полимеразной активности вируса гриппа.

В 1999 году был разработан новый способ получения трансфектантов вируса гриппа, предусматривающий ко-трансфекцию набора из 12 плазмид, экспрессирующих в клетках набор всех геномных РНК фрагментов (8 poll плазмид) и необходимых для их транскрипции белков полимеразного комплекса вируса гриппа (4 pol II плазмиды) (Fodor et al., 1999; Neumann et al., 1999). В результате трансфекции соответствующих клеточных линий 8-ю

плазмидами, кодирующими геномные сегменты вируса, и 4 плазмидами, кодирующими вирусные белки, необходимые для репликации вируса, происходила регенерация инфекционного вируса гриппа. В данной системе все стадии процесса происходят in vivo, в подходящей клеточной линии; «спасение» вируса из плазмид отражает естественный путь репродукции вируса; отсутствует необходимость в вирусе-помощнике и системах селекции; отмечен высокий уровень выхода вируса; имеется возможность изучения функций белков РНП-комплекса.

В 2000 году Hoffmann с соавторами усовершенствовали данную систему воспроизведения инфекционного вируса, используя 8 плазмид, с которых одновременно происходит и транскрипция вирусных РНК, и экспрессия вирусных белков. В данной системе каждая из плазмид содержит кДНК копию одного из восьми геномных сегментов вируса гриппа, каждый из которых фланкирован последовательностями pol I (pi) промотора и терминатора (ti). Транскрипционная единица (poll РНК - транскрипт), в свою очередь, фланкирована последовательностями pol II промотора (рП) и поли-А участком (all) (Рис. 7, А). После трансфекции данных конструкций в клетки начинается синтез некэпированных poll - вирусных РНК транскриптов (минус-цепь) и кэпированных polll — мРНК, кодирующих вирусные белки. После трансляции белков полимеразного комплекса (РВ1, РВ2, РА) и NP белка, начинается транскрипция и репликация восьми минус-цепей вирусных РНК (Рис.7, Б).

Далее из вирусных рибонуклеопротеинов (РНП) и структурных белков происходит сборка новых вирусных частиц. При этом создаются условия для продукции большого количества полноценных частиц вируса гриппа А. В данной системе получения вирусов синтез мРНК и вРНК происходит с одной матрицы, но в разных направлениях, поэтому, как и in vivo, вначале синтезируется вРНК в цитоплазме, а дальнейший процесс повторяет ход натуральной инфекции.

/tvnHI K[>nI «ч/«Н1

•cgggttattggagacggtaccgjctcctccccccc gcccaataa -:tctgccatggcagaggaggggggg

t,

Б Двунаправленная pol l-pol II система транскрипции

белок

(+)мРНК «pJiüSL PnCMV _

* трансляция

(uaai

* pol II

вирусная кДНК

^ poly А

"llbgh

I poll

P,h

<uac)

(auij1

ppp (-)bPHK

Рис. 7. Карта плазмиды pHWll, используемой для клонирования кДНК последовательностей генов вируса гриппа (Hoffmann et al., 2000). (А) - карта плазмиды; (Б) - двунаправленная система транскрипции с плазмиды pHWl 1.

К настоящему времени создана система конструирования вирусов гриппа, предусматривающая использование всего 3-х и 4-х плазмидных ДНК (Neumann et al., 2007). Преимущество такой системы заключается в повышении эффективности трансфекции за счет уменьшения числа плазмидных ДНК, при этом создаются условия для использования клеточных линий, эффективность трансфекции которых понижена. К таким клеточным линиям относятся единственно сертифицированные для производства противовирусных вакцин, клеточные линии Vero и MDCK.

Использование систем обратной генетики позволило значительно облегчить и расширить возможности по созданию вакцинных штаммов в борьбе с пандемической угрозой.

2.2. ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКА ГРИППА

Вакцинация считается наиболее эффективным способом контроля за гриппозной инфекцией. Высокий уровень смертности (более 60%) и появление нескольких различных клайдов внутри субтипа H5N1 вирусов обусловило необходимость создания эффективной кросс-протективной вакцины для предотвращения возможной пандемии в человеческой популяции, полностью лишенной иммунитета к этому вирусу. Одной из основных проблем при создании вакцин против «птичьего гриппа» является недостаток информации

об антигенных свойствах возможного пандемического штамма. Это требует либо создания вакцины с перекрестно-реактивными свойствами, которая сможет защитить население от антигенно различающихся вирусов, либо создания вакцины из актуального штамма в чрезвычайно короткий промежуток времени - до 3-х месяцев от начала пандемии. В случае использования производственной схемы, основанной на куриных эмбрионах, из-за её долгосрочности и ограниченного количества субстрата, получение необходимого количества доз вакцины в условиях пандемии является трудновыполнимым. Вследствие этого многие компании делают попытки производства вакцин на перевиваемых клеточных линиях Vero и MDCK (Palache et al., 1997; Kistner et al., 2007; Гендон, 2011).

В настоящее время существует много стратегических подходов для создания противогриппозной вакцины, каждая из которых имеет свои преимущества и недостатки. При этом важным вопросом является выбор базовых вирусов, способных хорошо расти на культуре клеток, и наблюдение за антигенными изменениями в процессе размножения вируса на клеточной культуре.

2.2.1. Подготовка H5N1 кандидатов в вакцинные штаммы.

Разработка и распространение репрезентативных кандидатов в вакцинные штаммы подтипа H5N1, осуществляемая в 9 нескольких научных центрах Англии, США и Индии в рамках Всемирной Программы ВОЗ по гриппу, является одной из составных частей общей глобальной стратегии по подготовке к пандемии. Потенциальные вакцинные штаммы вируса гриппа H5N1 подготавливаются на основании данных географического распространения, эпидемиологии вирусов, а также их антигенных и генетических свойств.

Следует отметить, что вирус H5N1 быстро эволюционирует и, согласно новой редакции классификации филогенетических связей генов НА вирусов гриппа H5N1, представленной на рис. 8, подразделяется уже на 10 отличающихся друг от друга филогенетических клайдов (Brown et al., 2009).

Филогенетический анализ вирусов гриппа, выделенных от животных и людей с момента появления субтипа вируса A/H5N1 в Гонконге в 1997, свидетельствует о наличии десяти групп, или семейств родственных вирусов (клайды 0, 1-9) (Рис.8). Ранее, в 2004 году, ВОЗ рекомендовала использовать для производства пандемических вакцин вирусные штаммы, относящиеся к 1 клайду H5N1 (А/Вьетнам/1203/04, А/Вьетнам/1194/04, А/Гонконг/213/03). Однако, обнаруженные в 2005 - 2006 годах штаммы вируса гриппа H5N1 существенно отличались от штаммов этого вируса, выделенных в предыдущие годы, в том числе и от штамма А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1), используемого в России и ряде зарубежных стран для производства вакцины. В 2006 г. выбраны новые кандидаты в вакцинные штаммы на основе штаммов подобных вирусам гриппа А/Индонезия/2/2005; А/горный гусь/Цинхай/1 А/2005; А/Анхуи/1/2005.

В соответствие с этим были обновлены рекомендации ВОЗ по кандидатам в вакцинные штаммы H5N1 и представлены новые вирусные реассортанты, подготовленные методом обратной генетики и получившие одобрение регулирующих инстанций для производства гриппозных вакцин. Следует отметить, что некоторые выявленные в последнее время вирусы, относящиеся к клайду 2.2, эндемичные для Российской Федерации, по своим генетическим свойствам уже отличаются от современных эталонных штаммов (Киселев и др., 2008; Львов и др., 2008). В каждой отдельной стране решение о том, какой именно вирус будет использоваться для подготовки экспериментальных серий вакцин против вируса гриппа A/H5N1 и создания соответствующих резервных запасов должно приниматься на основе эпидемиологических данных и географического распространения циркулирующих вирусов гриппа H5N1 (Lipatov etal., 2007).

A/muscovy duck/Vietnam/41/2007

- A/Viet Nam; HN11242/2007 -A/muscovy duck /Vietnam / >6/ 2(K)7 A/muscovy dude/Victnam/51 /200"

- Л/muscovy duck/Vietn am/48/2007 A/muscovy duck/Vietnam/57/200"

-А/ muscovy duck/ Vietnam/ 54/ 2007

_ЛУ duck/Vietnam/17/2007

_г- А/ duck/Vietnam/ 18/2007

L A/muscovy dudi/Vietnam/'49/200" ■ A/China/ti 1X12/2006 iA/Shenzhen 406H/20

,-A/chickcn/Thailand/NP-172/2006

T—A/'Guangio / I / 2005

-1-A/muscovy duck/Vietn am /19/2007

A/lanan esc white-eye/HongKong/1018/2006

-A/chicken Malaysia/ >221/5)07

-A/liangsu/r/2007

А/common ihagpie/Hong Kong/645/2006

A/Anhui/1 /2005 - A/duck / Laos/129512006 Л/Guangzhou/1/2006

r A/duck/Guiyang/.1242/2005 JA/chicken/Guiy any/1055/2005 1—A/goose/Guiyang/1422/2005

2.3.4

2.3

A/ooose/Guan та /1116/ . A/duck/Vietnam/ 568/2 iuck/Hunan/1265, 2005

1116/2005

A/duä/Hunan/T 2iß/Ä*)S1X15 А/goosc/Guangxi/ 145/2005

— A/Juck/Yunnan/l 126/2006 A/duvk 'Guangn/89/2006

STiantou/810/05

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Романовская-Романько, Екатерина Андреевна

6. выводы

1. Рекомбинантные штаммы вируса гриппа А подтипа H5N1, имеющие делецию геномной последовательности, кодирующей белок NS1, являются генетически стабильными и способны расти до высоких титров (8,5 ^ТИД50) на культуре клеток Vero.

2. Интраназальная иммунизация животных (мышей и приматов) H5N1 delNSl вакцинными штаммами является безопасной и не приводит к развитию клинических симптомов инфекции.

3. Иммунизация животных (мышей и приматов) H5N1 delNSl вакцинными штаммами приводит к формированию перекрестно-реагирующих антител к различным клайдам вируса гриппа A/H5N1 и защищает животных от инфицирования различными антигенными вариантами вируса гриппа A/H5N1.

4. Отсутствие экспрессии белка PB1-F2 - антагониста системы интерферонов - в delNSl вакцинном штамме не приводит к снижению его ростовых показателей и повышает иммуногенную активность штамма.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Романовская-Романько, Екатерина Андреевна, 2011 год

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Александрова Г., Климов А. Живая вакцина против гриппа. - СПб., 1994,-

Из д. «Наука» .-151с.

2. Гендон Ю. 3. Живая холодоадаптированная гриппозная вакцина:

современное состояние // Вопр. вирусол. - 2011. - № 1. -С. 4-17.

3. Гендон Ю. Преимущества и недостатки инактивированной и живой вакцин

против гриппа // Вопр. вирусол. -2004. - № 4. - С. 4-12.

4. Григорьева Е., Дешева Ю., Донина С. и др. Сравнительная оценка

безвредности, иммуногенной активности и профилактической эффективности взрослого и детского вариантов живой гриппозной вакцины у школьников 7-14 лет // Вопр. вирусол. - 2002. - № 4. - С. 24-27.

5. Ершов Ф.И., Киселев О.И. Интерфероны и их индукторы (от молекулы до

лекарств). - М., 2005. - Изд. гр. «ГОЭТАР-Медиа». - 368 с.

6. Жданов В., Александрова Г., Гендон Ю. Живые гриппозные вакцины в

СССР: разработка, изучение и практическое использование // Жури, микробиол. - 1986. - №7. - С. 3- 13.

7. Каверин Н.В., Смирнов Ю.А. Межвидовая трансмиссия вирусов гриппа А и

проблема пандемий // Вопр вирус. - 2003. - №3. - С. 4-10.

8. Киселев О. И., Блинов В. М., Писарева М. М. и др. Изоляты вируса гриппа

подтипа Н5№, выделенные от домашней птицы в Курганской области в 2005 году: молекулярно-генетическая характеристика // Мол. биология. -2008. - Т.42. - № 1. - С. 78-87.

9. Львов Д. Популяционные взаимодействия в биологической системе: вирус

гриппа А-дикие и домашние животные- человек // Журн. микробиол. -2006. -№3. - С. 96-100.

10. Львов Д. К., Щелканов М. Ю., Власов Н. А. и др. Первый прорыв нового

для России генотипа 2.3.2 высоковирулентного вируса гриппа А/Н5]\П на Дальнем Востоке // Вопр. вирусол. - 2008. - № 5. - С. 4-9.

11. Найхин А.Н., Рекстин А.Р., Донина С.А., и др. Иммуномодулирующий

эффект липринола у людей, вакцинированных живой гриппозной вакциной // Медицинский Академический журнал. - 2003. - Т.З. - № 4. - С. 60-65.

12. Рекстин A.P., Дешева Ю.А., Jly X. и др. Гетеросубтипический иммунный

ответ и защита от высокопатогенныого вируса гриппа A(H5N1) у мышей, иммунизированных холодоадаптированным вирусом гриппа А/Ленинград/134/17/57(H2N2) // Медицинская иммунология. - 2005. - № 5-6.-С. 506-510.

13. Abramowicz М. FluMist: an intranasal live influenza vaccine // Med Lett Drugs. -

2003. - Vol. 45. - P. 65-66.

14. Alexandrova G., Budilovsky G., Koval T. et al. Study of live recombinant cold-

adapted influenza bivalent vaccine of type A for use in children: an epidemiological control trial // Vaccine. - 1986. - Vol.4. -P. 114-148.

15. Aragón Т., de la Luna S., Novoa I. et al. Eukaryotic translation initiation factor 4GI is a cellular target for NS1 protein, a translational activator of influenza virus // Mol Cell Biol. - 2000. - Vol. 20. - P. 6259-6268.

16. Auewarakul P., Suptawiwat O., Kongchanagul A. An avian influenza H5N1 virus that binds to a human-type receptor // J Virol. - 2007. - Vol.81(18). - P. 99509955.

17. Baigent S., McCauley J. Influenza type A in humans, mammals and birds:

determinants of virus virulence, host-range and interspecies transmission // Bioessays. - 2003. - Vol.25(7). -P. 657-671.

18. Balachandran S., Kim C., Yeh W. et al. Activation of the dsRNA-dependent

protein kinase, PKR, induces apoptosis through FADD-mediated death signaling // EMBO J. - 1998. - Vol. 17(23). - P. 6888-902.

19. Banchereau J., Steinman R.M. Dendritic cells and the control of immunity //

Nature. - 1998. - Vol.392(6673). - P. 245-252.

20. Baskin C.R., Bielefeldt-Ohmann H., García-Sastre A. et al. Functional genomic

and serological analysis of the protective immune response resulting from vaccination of macaques with an NS1-truncated influenza virus // J Virol. -

2007. - Vol.81(21). - P. 11817-11827.

21. Basler C.F. and Aguilar P.V. Progress in identifying virulence determinants of the

1918 HINland the Southeast Asian H5N1 influenza A viruses // Antiviral Res. -

2008. - Vol. 79(3). - P. 166-178.

22. Baudin F., Bach C., Cusack S. and Ruigrok R.W. Structure of influenza virus

RNP. I. Influenza virus nucleoprotein melts secondary structure in panhandle RNA and exposes the bases to the solvent // Embo J. - 1994. - Vol.13. - P. 31583165.

23. Belshe R.B., Gruber W., Mendelman P et al. Correlates of immune protection

induced by live, attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine // J Infect Dis. - 2000. - Vol. 181(3). - P. 1133-1137.

24. Bergmann M., Garcia-Sastre A., Carnero E. et al.. Influenza virus NS1 protein counteracts PKR-mediated inhibition of replication // In J Virol. - 2000. - P. 6203.

25. Bornholdt Z.A., Prasad B. X-ray structure of influenza virus NS1 effector domain // Nat Struct Mol Biol. - 2006. - Vol. 13(6). - P. 559-560.

26. Bresson J.L., Perronne C., Launay O. and Gerdil C. Safety and immunogenicity of an inactivated split-virion influenza A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) vaccine: phase I randomised trial // Lancet. - 2006. - Vol. 367. - P. 1657-1664.

27. Bright R., Carter D., Crevar C. et al. Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle //PLoS One. - 2008. - Vol.3(l). - e. 1501.

28. Bright R.A., Medina M.J., Xu X. and Perez-Oronoz G. Incidence of adamantane resistance among influenza A (H3N2) viruses isolated worldwide from 1994 to 2005: a cause for concern // Lancet. - 2005. - Vol.366. - P. 1175-1181.

29. Brown L, Capua I., Cattoli G et al. Continuing progress towards a unified

nomenclature for the highly pathogenic H5N1 avian influenza viruses: divergence of clade 2.2 virus // Influenza Other Resp. Viruses. - 2009. -Vol.3(2). - P. 59-62.

30. Brownlee G.G., Fodor E. The predicted antigenicity of the haemagglutinin of the

1918 Spanish influenza pandemic suggests an avian origin // Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. - 2001. - Vol. 356. - P. 1871-1876.

31. Brownlee G.G., Sharps J. The RNA polymerase of influenza a virus is stabilized by interaction with its viral RNA promoter // J Virol. - 2002. - Vol.76(14). - P. 7103-7113.

32. Brydon E., Smith H., Sweet C. Influenza A virus-induced apoptosis in bronchiolar epithelial (NCI-H292) cells limits pro-inflammatory cytokine release // J Gen Virol. - 2003. - Vol.84. - P. 2389-2400. 33. Buchy P., Vong S., Chu S. Kinetics of neutralizing antibodies in patients naturally infected by H5N1 virus // PLoS ONE. - 2010. - Vol.5(5). - e. 10864.

34. Carrasco M., Amorim M., Digard P. Lipid raft-dependent targeting of the influenza A virus nucleoprotein to the apical plasma membrane // Traffic. -2004. - Vol.5(12). - P. 979-992.

35. Castelli J., Wood K.A., Youle R.J. The 2-5A system in viral infection and apoptosis // Biomed Pharmacother. - 1998. - Vol.52(9). - P. 386-390.

36. Cauthen A.N., Swayne D.E., Schultz-Cherry S. and Perdue M.L. Continued circulation in China of highly pathogenic avian influenza viruses encoding the hemagglutinin gene associated with the 1997 H5N1 outbreak in poultry and humans // J Virol. - 2000. - Vol.74. - P. 6592-6599.

37. Chen H., Li Y., Li Z., Shi J. Properties and dissemination of H5N1 viruses

isolated during an influenza outbreak in migratory waterfowl in western China // J Virol. - 2006. - Vol.80. - P. 5976-5983 (6).

38. Chen H., Smith G.J., Li K.S., et al. Establishment of multiple sublineages of

H5N1 influenza virus in Asia: implications for pandemic control // Proc Natl Acad Sci USA.- 2006. - Vol. (8). - P. 2845-2850 (a).

39. Chen W., Calvo P., Malide D. et al. A novel influenza A virus mitochondrial

protein that induces cell death //Nat Med. - 2001. - Vol.7(12). - P. 1306-1312.

40. Chen Z. and Krug R.M. Selective nuclear export of viral mRNAs in influenza-

virus infected cells // Trends Microbiol. - 2000. - Vol. 8. - P. 376-383.

41. Chen Z., Li Y. and Krug R.M. Influenza A virus NS1 protein targets poly(A)-

binding protein II of the cellular 3'-end processing machinery // Embo J. - 1999. -Vol. 18.-P. 2273-2283.

42. Cheng X., Eisenbraun M., Xu Q. H5N1 vaccine-specific B cell responses in

ferrets primed with live attenuated seasonal influenza vaccines // PLoS ONE. -2009. - Vol.4(2). - e.4336.

43. Clifford M., Twigg J., Upton C. Evidence for a novel gene associated with human

influenza A viruses // Virol J. - 2009. - Vol.6. - P. 198.

44. Coleman J.R.The PB1-F2 protein of Influenza A virus: increasing pathogenicity

by disrupting alveolar macrophages // Virol J. - 2007. - Vol.4. - P. 9.

45. Conenello G.M., Palese P. Influenza A virus PB1-F2: a small protein with a big

punch // Cell Host Microbe. - 2007. - Vol.2(4). - P. 207-209.

46. Cox N., Subbarao K. Influenza // Lancet. - 1999. - Vol.354(9186). - P. 1277-

1282.

47. Cox R.J., Brokstad K.A. and Ogra P. Influenza virus: immunity and vaccination

strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines // Scand J Immunol. - 2004. - Vol. 59. - P. 1-15.

48. Curran M., Leroux-Roels I. Inactivated split-virion seasonal influenza vaccine

(Fluarix): a review of its use in the prevention of seasonal influenza in adults and the elderly // Drugs. - 2010. - Vol.70(12). - P. 1519-1543.

49. De Filette M., Ramne A., Birkett A., Lycke N. The universal influenza vaccine

M2e-HBc administered intranasally in combination with the adjuvant CTA1 -DD provides complete protection // Vaccine. - 2006. - Vol. 24. - P. 544-551.

50. de Jong M., Simmons C., Thanh T.T. et al. Fatal outcome of human influenza A

(H5N1) is associated with high viral load and hypercytokinemia// Nat Med. -2006. - Vol.12(10). - P. 1203-1207.

51. de la Luna S., Fortes P., Beloso A. and Ortin, J. Influenza virus NS1 protein

enhances the rate of translation initiation of viral mRNAs // J Virol. - 1995. -Vol. 69.-P. 2427-2433.

52. Desheva J., Lu X.H., Rekstin A.R. et al. Characterization of an influenza A

H5N2 reassortant as a candidate for live-attenuated and inactivated vaccines against highly pathogenic H5N1 viruses with pandemic potential // Vaccine. -2006. - Vol.24. - P. 6859-6866.

53. DiNapoli J.M., Nayak B., Yang L. et al. Newcastle disease virus-vectored

vaccines expressing the hemagglutinin or neuraminidase protein of H5N1 highly pathogenic avian influenza virus protect against virus challenge in monkeys // J Virol. - 2010. - Vol.84(3). - P. 1489-1503.

54. Ding H., Tsai C., Gutiérrez R. et al. Superior neutralizing antibody response and

protection in mice vaccinated with heterologous DNA prime and virus like particle boost against HPAI H5N1 virus // PLoS One. - 2011. - Vol.6(l). -e.16563.

55. Egorov A., Brandt,S., Sereinig S et al. Transfectant influenza A viruses with long

deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells // J Virol. - 1998. -Vol. 72. - P. 6437-6441.

56. Ehrlich H., Muller M., Oh H.M. et al. A clinical trial of a whole-virus H5N1

vaccine derived from cell culture // N Engl J Med. - 2008. - Vol.358. - P. 25732582.

57. Enami M. and Palese P. High-efficiency formation of influenza virus

transfectants//J Virol. - 1991. - Vol.65(5). - P. 2711-2713.

58. Falcon A.M., Fernandez-Sesma A., Nakaya Y. et al. Attenuation and

immunogenicity in mice of temperature-sensitive influenza viruses expressing truncated NS1 proteins // J Gen Virol. - 2005. - Vol.86. - P. 2817-2821.

59. Fan S., Gao Y., Shinya K. et al. Immunogenicity and protective efficacy of a live

attenuated H5N1 vaccine in nonhuman primates // PLoS Pathog. - 2009. -Vol.5(5). - e. 1000409.

60. Fan J., Liang X., Horton M.S., Perry H.C. Preclinical study of influenza virus A

M2 peptide conjugate vaccines in mice, ferrets, and rhesus monkeys // Vaccine. - 2004. - Vol. 22. - P. 2993-3003.

61. Ferko B., Stasakova J., Romanova J. et al. Immunogenicity and protection

efficacy of replication-deficient influenza A viruses with altered NS1 genes // J Virol. - 2004. - Vol. 78. - P. 13037-13045.

62. Fernandez-Sesma A. The influenza virus NS1 protein: inhibitor of innate and

adaptive immunity // Infect Disord Drug Targets. - 2007. - Vol.7(4). - P. 336343.

63. Fernandez-Sesma A., Marukian S., Ebersole B. et al. Influenza virus evades

innate and adaptive immunity via the NS1 protein // J Virol. - 2006. -Vol.80(13). - P. 6295-6304.

64. Fodor E., Devenish L., Engelhardt O. G. et al. Rescue of influenza A virus from

recombinant DNA // J Virol. - 1999. - Vol. 73. - P. 9679-9682.

65. Gaidet N., Dodman T., Caron A. Avian influenza viruses in water birds, Africa //

Emerg Infect Dis. - 2007. - Vol. 13(4). - P. 626-629.

66. Gambotto A., Barratt-Boyes S., de Jong M., Neumann G., Kawaoka Y. Human infection with highly pathogenic H5N1 influenza virus // Lancet. - 2008. -Vol.371(9622). - P. 1464-1475.

67. Garcia-Sastre A., Egorov A., Matassov D. et al. Influenza A virus lacking the

NS1 gene replicates in interferon-deficient systems // Virology. - 1998. - Vol. 252. - P. 324-330.

68. Ge J., Deng G., Wen Z. et al. Newcastle disease virus-based live attenuated

vaccine completely protects chickens and mice from lethal challenge of homologous and heterologous H5N1 avian influenza viruses // J Virol. - 2007. -Vol.81(1). - P. 150-158. 69., Glueck R. Pre-clinical and clinical investigation of the safety of a novel adjuvant for intranasal immunization // Vaccine. - 2001. - Vol.20. - P. 542-544.

70. Gocnikova H., Russ G. Influenza a virus PB1-F2 protein // Acta Virol. - 2007. -

Vol.51(2). - P. 101-108.

71. Goji N., Nolan C., Hill H. et al.. Immune responses of healthy subjects to a single

dose of intramuscular inactivated influenza A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) vaccine after priming with an antigenic variant // J Infect Dis. - 2008. -Vol. 198(5). - P. 635-641.

72. Gorse G., Belshe R., Munn N.J. Superiority of live attenuated compared with

inactivated influenza A virus vaccines in older, chronically ill adults // Chest. -1991. - Vol. 100(4). - P. 977-984.

73. Govorkova E.A., Webby R.J., Humberd J. Immunization with reverse-genetics-

produced H5N1 influenza vaccine protects ferrets against homologous and heterologous challenge // J Infect Dis.- 2006. - Vol. 194(2). - P. 159-167.

74. Greenspan D., Palese P. and Krystal M. Two nuclear location signals in the

influenza virus NS1 nonstructural protein // J Virol . - 1988. - Vol. 62. - P. 3020-3026.

75. Gruber W.C. The role of live influenza vaccines in children // Vaccine. - 2002. -

Vol.20 Suppl 2. - P. S66-73.

76. Guan Y., Peiris J.S., Lipatov A.S. and Ellis T.M. Emergence of multiple

genotypes of H5N1 avian influenza viruses in Hong Kong SAR // Proc Natl Acad Sci USA.- 2002. - Vol.99. - P. 8950-8955.

77. Hale B.G., Randall R., Ortin J. and Jackson D. The multifunctional NS1 protein

of influenza A viruses // J Gen Virol. - 2008. - Vol.89. - P. 2359-2376.

78. Hasegawa H., Ichinohe T., Tamura S. and Kurata T. Development of a mucosal

vaccine for influenza viruses: preparation for a potential influenza pandemic // Expert Rev Vaccines. - 2007. - Vol.6(2). - P. 193-201.

79. Hatta M., Kawaoka Y. The continued pandemic threat posed by avian influenza

viruses in Hong Kong // Trends Microbiol. - 2002. - Vol.10. - P. 340-344.

80. Hauge S., Madhun A., Cox R. and Haaheim L.R. Quality and kinetics of the

antibody response in mice after three different low-dose influenza virus vaccination strategies // Clin Vaccine Immunol. - 2007. - Vol. 14(8). - P. 978983.

81. Haye K., Burmakina S., Moran T. et al.. The NS1 protein of a human influenza

virus inhibits type I interferon production and the induction of antiviral responses in primary human dendritic and respiratory epithelial cells // J Virol. -2009. - Vol.83(13). - P. 6849-6862.

82. Hayman A., Comely S., Lackenby A. et al. NS1 proteins of avian influenza A

viruses can act as antagonists of the human alpha/beta interferon response // J Virol. - 2007. - Vol.81(5). - P. 2318-2327.

83. Hinshaw V., Olsen C.W., Dybdahl-Sissoko N. and Evans D. Apoptosis: a

mechanism of cell killing by influenza A and B viruses // J Virol. - 1994. -Vol.68(6). - P. 3667-3673.

84. Hoelscher M.A., Garg S., Bangari D.S. Development of adenoviral-vector-based

pandemic influenza vaccine against antigenetically distinct human H5N1 strains in mice // Lancet. - 2006. - Vol.367(9509). - P. 475-481.

85. Hoffmann E., Webster R.G. Unidirectional RNA polymerase I-polymerase II

transcription system for the generation of influenza A virus from eight plasmids // J Gen Virol. - 2000. - Vol.81. - P. 2843-2847.

86. Honda K., Yanai H., Takaoka A. and Taniguchi T. Regulation of the type I IFN

induction: a current view //Int Immunol. -2005. - Vol. 17(11). - P. 1367-1378.

87. Horimoto T., Takada A., Fujii K. et al. The development and characterization of

H5 influenza virus vaccines derived from a 2003 human isolate // Vaccine. -2006. - Vol.24(17). - P. 3669-3676.

88. Hsu M. T., Parvin J. D., Gupta S., Krystal M., Palese P. Genomic RNAs of

influenza viruses are held in a circular conformation in virions and in infected cells by a terminal panhandle // Proc Natl Acad Sci USA.- 1987. - Vol. 84. - P. 8140-8144.

89. Jegerlehner A., Schmitz N., Storni T., Bachmann M.F. Influenza A vaccine based

on the extracellular domain of M2: weak protection mediated via antibody-dependent NK cell activity // J Immunol. - 2004. - Vol.172. - P. 5598-5605.

90. Kalia V., Sarkar S., Gourley T., Rouse B., Ahmed R. Differentiation of memory

B and T cells // Curr Opin Immunol. - 2006. - Vol. 18(3). - P. 255-264.

91. Karron R.A., Talaat K., Luke C. et al. Evaluation of two live attenuated cold-

adapted H5N1 influenza virus vaccines in healthy adults // Vaccine. - 2009. -Vol.27(36). - P. 4953-4960.

92. Katz J.M., Lim W., Bridges C.B. and Rowe T. Antibody response in individuals

infected with avian influenza A (H5N1) viruses and detection of anti-H5 antibody among household and social contacts // J Infect Dis. - 1999. - Vol. 180. -P. 1763-1770.

93. Kawaguchi A., Naito T., Nagata K. Involvement of influenza virus PA subunit in

assembly of functional RNA polymerase complexes // J Virol. - 2005. -Vol.79(2). - P. 732-744.

94. Kendal A.P. Cold-adapted live attenuated influenza vaccines developed in

Russia: can they contribute to meeting the needs for influenza control in other countries? // Eur J Epidemiol. - 1997. - Vol. 13(5). - P. 591-609.

95. Kistner O., Howard M., Spruth M. et al. Cell culture (Vero) derived whole virus

(H5N1) vaccine based on wild-type virus strain induces cross-protective immune responses // Vaccine. - 2007. - Vol.25(32). - P. 6028-6036.

96. Kittel C., Ferko B., Kurz M. et al. Generation of an influenza A virus vector

expressing biologically active human interleukin-2 from the NS gene segment // J Virol. - 2005. - Vol.79(16). - P. 10672-10677.

97. Kochs G., Garcia-Sastre A., Martinez-Sobrido L. Multiple anti-interferon actions

of the influenza A virus NS1 protein // J Virol. - 2007. - Vol.81(13). - P. 70117021.

98. Krug R. M., Yuan W., Noah D. L. and Latham A. G. Intracellular warfare

between human influenza viruses and human cells: the roles of the viral NS1 protein//Virology. - 2003. - Vol. 309. - P. 181-189.

99. Kuiken T., Rimmelzwaan G., van Riel D., van Amerongen G. Avian H5N1

influenza in cats // Science. - 2004. - Vol. 306. - P. 241.

100. Lamb R. A. and Krug R. M. Orthomyxoviridae: the viruses and their replication //

Fields Virology. - 2001. - Fourth Ed, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia. - P. 1487-1532.

101. Lambkin R., Oxford J., Bossuyt S. et al. Strong local and systemic protective

immunity induced in the ferret model by an intranasal virosome-formulated influenza subunit vaccine // Vaccine. - 2004. - Vol.22(31-32). - P. 4390-4396.

102. Le Goffic R., Bouguyon E., Chevalier C. et al. Influenza A virus protein PB1-F2

exacerbates IFN-beta expression of human respiratory epithelial cells // J Immunol. - 2010. - Vol.l85(8). - P. 4812-4823.

103. Leroux-Roels I., Bernhard R., Gérard P. et al. Broad Clade 2 cross-reactive

immunity induced by an adjuvanted clade 1 rH5Nl pandemic influenza vaccine // PLoS One. - 2008. - Vol.3(2). - e. 1665.

104. Levine M.M. Can needle-free administration of vaccines become the norm in

global immunization? // Nat Med. - 2003. - Vol.9(l). - P. 99-103.

105. Li S., Liu C., Klimov A. et al. Recombinant influenza A virus vaccines for the

pathogenic human A/Hong Kong/97 (H5N1) viruses // J Infect Dis. - 1999. -Vol. 179(5). - P. 1132-1138.

106. Li Y., Chen Z. Y., Wang W. et al. The 3'-end-processing factor CPSF is required

for the splicing of single-intron pre-mRNAs in vivo // Rna. - 2001. - Vol. 7. - P. 920-931.

107. Li Y., Yamakita Y. and Krug R. M. Regulation of a nuclear export signal by an

adjacent inhibitory sequence: the effector domain of the influenza virus NS1 protein // Proc Natl Acad Sci USA.- 1998. - Vol. 95. - P. 4864-4869.

108. Li Z., Song D., Zhang H. et al. Improved Humoral Immunity Against

Tuberculosis ESAT-6 Antigen by Chimeric DNA Prime and Protein Boost Strategy // DNA Cell Biol. - 2006b. - Vol. 25. - P. 25-30.

109. Lin C., Holland R. Jr., Donofrio J. et al. Caspase activation in equine influenza

virus induced apoptotic cell death // Vet Microbiol. - 2002. - Vol.84(4). - P. 357365.

110. Lin D., Lan J., Zhang Z. Structure and function of the NS1 protein of influenza A

virus // Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). - 2007,- Vol.39(3). - P. 155-162.

111.Lipatov A.S., Evseenko V.A., Yen H.L. Influenza (H5N1) viruses in poultry, Russian Federation, 2005-2006 // Emerg Infect Dis. - 2007. - Vol. 13(4). - P. 539-546.

112. Lowen A. and Palese P. Influenza virus transmission: basic science and

implications for the use of antiviral drugs during a pandemic // Infect Disord Drug Targets. - 2007. - Vol.7. - P. 318-328.

113. Lu J., Long J., Jia L. et al. Reassortment and modification of hemagglutinin

cleavage motif of avian/WSN influenza viruses generated by reverse genetics that correlate with attenuation // Acta Virol. - 2006. - Vol.50(4). - P. 243-249.

114. Lu Y., Wambach M., Katze M. G., Krug R. M. Binding of the influenza virus

NS1 protein to double-stranded RNA inhibits the activation of the protein kinase that phosphorylates the elF-2 translation initiation factor // Virology. - 1995. -Vol. 214. -P. 222-228.

115. Lu X., Edwards L., Desheva J. et al. Cross-protective immunity in mice induced

by live-attenuated or inactivated vaccines against highly pathogenic influenza A (H5N1) viruses // Vaccine. - 2006. - Vol.24. - P. 6588-6593.

116. Luytjes W., Krystal M., Enami M., Pavin J. D. and Palese P. Amplification,

expression, and packaging of foreign gene by influenza virus // Cell. - 1989. -Vol. 59. -P. 1107-1113.

117. Maines T., Szretter K., Perrone L. Pathogenesis of emerging avian influenza

viruses in mammals and the host innate immune response // Immunol Rev. -2008. - Vol.225(l). - P. 68-84.

118. Marion R. M., Aragon T., Beloso A., Nieto A. and Ortin J. The N-terminal half

of the influenza virus NS1 protein is sufficient for nuclear retention of mRNA and enhancement of viral mRNA translation // Nucleic Acids Res. - 1997. - Vol. 25. - P. 4271-4277.

119. Matrosovich M., Tuzikov A., Bovin N. et al. Early alterations of the receptor-

binding properties of HI, H2, and H3 avian influenza virus hemagglutinins after their introduction into mammals // J Virol. - 2000. - Vol.74(18). - P. 8502-8512.

120. Mazur I., Anhlan D., Mitzner D. et al. The proapoptotic influenza A virus protein

PB1-F2 regulates viral polymerase activity by interaction with the PB1 protein // Cell Microbiol. - 2008. - Vol. 10(5). - P. 1140-1152.

121. McAuley J., Hornung F., Boyd K. et al. Expression of the 1918 influenza A virus

PB1-F2 enhances the pathogenesis of viral and secondary bacterial pneumonia // Cell Host Microbe. - 2007. - Vol.2(4). - P. 240-249.

122. Mellman I. and Steinman R.M. Dendritic cells: specialized and regulated antigen

processing machines // Cell. - 2001. - Vol. 106(3). - P. 255-258.

123. Miyaki C., Quintilio W., Miyaji E., Botosso V., Kubrusly F., Santos F., Iourtov

D., Higashi H., Raw I. Production of H5N1 (NIBRG-14) inactivated whole virus and split virion influenza vaccines and analysis of immunogenicity in mice using different adjuvant formulations // Vaccine. - 2010. - Vol.28(13). - P. 25052509.

124. Morris S., Price G., Barnett J. et al. Role of neuraminidase in influenza virus-

induced apoptosis // J Gen Virol. - 1999. - Vol.80. - P. 137-146.

125. Mutsch M., Zhou W., Rhodes P. et al.. Use of the inactivated intranasal influenza

vaccine and the risk of Bell's palsy in Switzerland // N Engl J Med. - 2004,-Vol.350(9). - P. 896-903.

126. Nakowitsch S., Wolschek M., Morokutti A. et al. Mutations affecting the stability

of the haemagglutinin molecule impair the immunogenicity of live attenuated H3N2 intranasal influenza vaccine candidates lacking NS1 // Vaccine. - 2011.-Vol.29(19). - P. 3517-24.

127. Nemeroff M. E., Barabino S. M., Li Y., Keller W. and Krug R. M. Influenza virus

NS1 protein interacts with the cellular 30 kDa subunit of CPSF and inhibits 3'end formation of cellular pre-mRNAs // Cell. - 1998. - Vol. 1. - P. 991-1000.

128. Neumann G. and Kawaoka Y.Reverse genetics systems for the generation of

segmented negative-sense RNA viruses entirely from cloned cDNA // Curr Top Microbiol Immunol. - 2004. - Vol.283. - P. 43-60.

129. Neumann G., Fujii K., Kino Y., Kawaoka Y. An improved reverse genetics

system for influenza A virus generation and ist implications for vaccine production // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. - P. 16825 -16829.

130. Neumann G., Shinya K., Kawaoka Y. Molecular pathogenesis of H5N1 influenza

virus infections // Antivir Ther. - 2007. - Vol.12. - P. 617-626.

131. Neumann G., Watanabe T., Ito H. et al. Generation of influenza A viruses entirely

from cloned cDNAs // Proc Natl Acad Sci USA.- 1999. - Vol. 96. - P. 93459350.

132. Neumann G., Zobel A., Hobom G. RNA polymerase I-mediated expression of

influenza viral RNA molecules // Virology. - 1994. - Vol.202(l). - P. 477-479.

133. Newby C., Sabin L., Pekosz A. The RNA binding domain of influenza A virus

NS1 protein affects secretion of tumor necrosis factor alpha, interleukin-6, and interferon in primary murine tracheal epithelial cells // J Virol. - 2007. -Vol.81(17). - P. 9469-9480.

134. Nicholson K., Colegate A., Podda A. et al. Safety and antigenicity of non-

adjuvanted and MF59-adjuvanted influenza A/Duck/Singapore/97 (H5N3) vaccine: a randomised trial of two potential vaccines against H5N1 influenza // Lancet. - 2001. - Vol.357(9272). - P. 1937-1943.

135. Noah J., Severson W., Noah D. et al. A cell-based luminescence assay is effective

for high-throughput screening of potential influenza antivirals // Antiviral Res. -2007. - Vol.73(l).-P. 50-59.

136. Olsen B., Munster V.J., Wallensten A. and Waldenstrom J. Global patterns of

influenza a virus in wild birds // Science. - 2006. - Vol.312. - P. 384-388.

137. Ono A. and Freed E.O. Role of lipid rafts in virus replication // Adv Virus Res. -

2005. - Vol.64. - P. 311-358.

138. Oster G., Weycker D., Edelsberg J. et al. Benefits and risks of live attenuated

influenza vaccine in young children // Am J Manag Care. - 2010. - Vol. 16(9). -P. 543-457.

139. Palache A.M., Brands R., van Scharrenburg G.J. Immunogenicity and

reactogenicity of influenza subunit vaccines produced in MDCK cells or fertilized chicken eggs // J Infect Dis. - 1997. - Vol.176 Suppl 1. - P. S20-23.

140. Palese P. and García-Sastre A. Influenza vaccines: present and future // J Clin

Invest. - 2002. - Vol.110(1). - P. 9-13.

141. Palese P. and Shaw M.L. Orthomyxoviridae. The viruses and their replication //

In: Fields Virology 5th Edition. Rnippe DM, Howley PH (Eds). Lippincott Williams and Wilkins, PA, USA. - 2007,- P. 1647-1689.

142. Park C., Bae S., Lee M. et al. Solution structure of the influenza A virus cRNA

promoter: implications for differential recognition of viral promoter structures by RNA-dependent RNA polymerase // Nucleic Acids Res. - 2003. - Vol.31(11). - P. 2824-2832.

143. Park Y. W. and Katze M. G. Translational control by influenza virus.

Identification of cis-acting sequences and trans-acting factors which may regulate selective viral mRNA translation // J Biol Chem. - 1995. - V. 270. -P. 28433-28439.

144. Pleschka S., Jaskunas R., Engelhardt O. G. et al. A plasmid-based reverse

genetics system for influenza A virus // J Virol. - 1996. -Vol. 70. - P. 41884192.

145. Puig-Barberá J., Diez-Domingo J., Varea A. et al. Effectiveness of MF59-

adjuvanted subunit influenza vaccine in preventing hospitalisations for cardiovascular disease, cerebrovascular disease and pneumonia in the elderly // Vaccine. - 2007. - Vol.25(42). - P. 7313-7321.

146. Qian X. Y., Alonso-Caplen F. and Krug R. M. Two functional domains of the

influenza virus NS1 protein are required for regulation of nuclear export of mRNA // J Virol. - 1994. - Vol. 68. - P. 2433-2441.

147. Qiu Y., Nemeroff M. and Krug R. M. The influenza virus NS1 protein binds to a

specific region in human U6 snRNA and inhibits U6-U2 and U6-U4 snRNA interactions during splicing // Rna. - 1995. - Vol. 1. - P. 304-316.

148. Quinlivan M., Zamarin D., García-Sastre A. et al. Attenuation of equine influenza

viruses through truncations of the NS1 protein // J Virol. - 2005. - Vol.79(13). -P. 8431-8439.

149. Racaniello V. and Baltimore D. Molecular cloning of poliovirus cDNA and

determination of the complete nucleotide sequence of the viral genome // Proc Natl Acad Sci USA. - 1981. - Vol.78(8). - P. 4887-4891.

150. Reid A.H., Taubenberger J.K. and Fanning T.G. Evidence of an absence: the

genetic origins of the 1918 pandemic influenza virus // Nat Rev Microbiol. -2004. - Vol. 2. - P. 909-914.

151. Richt J., García-Sastre A. Attenuated influenza virus vaccines with modified NS1

proteins // Curr Top Microbiol Immunol. - 2009. - Vol.333. - P. 177-195.

152. Rimmelzwaan G., Kuiken T., van Amerongen G. et al. Pathogenesis of influenza

A (H5N1) virus infection in a primate model // J Virol. - 2001. - Vol.75. - P. 6687-6691.

153. Rogers G. and Paulson J. Receptor determinants of human and animal influenza

virus isolates: differences in receptor specificity of the H3 hemagglutinin based on species of origin//Virology. - 1983. - Vol.l27(2). - P. 361-373.

154. Rohm C., Zhou N., Süss J. et al. Characterization of a novel influenza

hemagglutinin, HI5: criteria for determination of influenza A subtypes // Virology. - 1996. - Vol.217(2). - P. 508-516.

155. Romanova J., Krenn B., Wolschek M. et al. Preclinical evaluation of a

replication-deficient intranasal DeltaNSl H5N1 influenza vaccine // PLoS One. - 2009. - Vol.4(6). - e. 5984.

156. Rudenko L., Desheva J., Korovkin S., Mironov A., Rekstin A., Grigorieva E.,

Donina S., Gambaryan A., Katlinsky A. Safety and immunogenicity of live

attenuated influenza reassortant H5 vaccine (phase I-II clinical trials) // Influenza Other Respi Viruses. - 2008. - Vol.2(6). - P. 203-209.

157. Schroeder C., Heider H., Moncke-Buchner E. and Lin T.I. The influenza virus

ion channel and maturation cofactor M2 is a cholesterol-binding protein // Eur Biophys J. - 2005. - Vol.34(1). - P. 52-66.

158. Schultz-Cherry S., Dybdahl-Sissoko N., Neumann G. and Kawaoka Y., Hinshaw

V.S. Influenza virus nsl protein induces apoptosis in cultured cells //J Virol. -2001. - Vol.75(17). - P. 7875-7878.

159. Shaw ML. and Palese P. Orthomyxoviridae: The viruses and their replication. In:

Knipe, DM., editor. Fields Virology, vol.2. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins. - 2007. - p. 254.

160. Shinya K., Ebina M., Yamada S. et al. Avian flu: influenza virus receptors in the

human airway // Nature. - 2006. - Vol.440. - P. 435-436.

161. Smith G.J., Naipospos T.S., Nguyen T.D. and de Jong M.D. Evolution and

adaptation of H5N1 influenza virus in avian and human hosts in Indonesia and Vietnam // Virology. - 2006. - Vol. 70(11). - P. 7531-7541.

162. Smith L., Wloch M., Ye M. et al. Phase 1 clinical trials of the safety and

immunogenicity of adjuvanted plasmid DNA vaccines encoding influenza A virus H5 hemagglutinin // Vaccine. - 2010. - Vol.28(13). - P. 2565-7252.

163. Solórzano A., Webby R., Lager K., Janke B., García-Sastre A., Richt J.A.

Mutations in the NS1 protein of swine influenza virus impair anti-interferon activity and confer attenuation in pigs // J Virol. - 2005. - Vol. 79(12). - P. 75357543.

164. Stasakova J., Ferko B., Kittel C. et al. Influenza A mutant viruses with altered

NS1 protein function provoke caspase-1 activation in primary human macrophages, resulting in fast apoptosis and release of high levels of interleukins lbeta and 18 // J Gen Virol. - 2005. - Vol. 86. - P. 185-195.

165. Steitz J., Wagner R., Bristol T. et al. Assessment of route of administration and

dose escalation for an adenovirus-based influenza A Virus (H5N1) vaccine in chickens // Clin Vaccine Immunol. - 2010. - Vol.l7(9). - P. 1467-1472.

166. Stephenson I., Zambon M.C., Rudin A. and Colegate A. Phase I evaluation of

intranasal trivalent inactivated influenza vaccine with nontoxigenic Escherichia coli enterotoxin and novel biovector as mucosal adjuvants, using adult volunteers // J Virol. - 2006. - Vol.80. - P. 4962-4970.

167. Suarez D. and Perdue M.L. Multiple alignment comparison of the non-structural

genes of influenza A viruses // Virus Res. - 1998. - Vol.54(1). - P. 59-69.

168. Subbarao K., Klimov A., Katz J. and Regnery H. Characterization of an avian

influenza A (H5N1) virus isolated from a child with a fatal respiratory illness// Science. - 1998. - Vol. 279. - P. 393-396.

169. Takeda M., Pekosz A., Shuck K. et al. Influenza a virus M2 ion channel activity

is essential for efficient replication in tissue culture // J Virol. - 2002. -Vol.76(3). - P. 1391-1399.

170. Takizawa T., Ohashi K. and Nakanishi Y. Possible involvement of double-

stranded RNA-activated protein kinase in cell death by influenza virus infection // J Virol. - 1996. - V. 70. -P. 8128-8132.

171. Talon J., Horvath C. M., Polley R. et al.. Activation of interferon regulatory

factor 3 is inhibited by the influenza A virus NS1 protein // J Virol. - 2000. - V. 74. - P. 7989-7996.

172. Tam J.S. Influenza A (H5N1) in Hong Kong: an overview // Vaccine. -2002,-

Vol.20 Suppl 2.-P.S77-81.

173. Tamura S. and Kurata T. Defense mechanisms against influenza virus infection in

the respiratory tract mucosa // Jpn J Infect Dis. - 2004. - Vol.57(6). - P. 236-247.

174. Tao P., Luo M., Zhu D. et al. Virus-like particle vaccine comprised of the HA,

NA, and Ml proteins of an avian isolated H5N1 influenza virus induces protective immunity against homologous and heterologous strains in mice // Viral Immunol. - 2009. - Vol.22(4). - P. 273-281.

175. Tran T.H., Nguyen T.L., Nguyen T.D. and Luong T.S. Avian influenza A (H5N1)

in 10 patients in Vietnam // N Engl J Med. - 2004. - Vol. 350. - P. 1179-1188.

176. Treanor J.J., Campbell J.D., Zangwill K.M. and Rowe T. Safety and

immunogenicity of an inactivated subvirion influenza A (H5N1) vaccine// N Engl J Med. - 2006. - Vol.354. - P. 1343-1351.

177. Ungchusak K., Auewarakul P., Dowell S.F. and Kitphati R. Probable person-to-

person transmission of avian influenza A (H5N1) // N Engl J Med. - 2005. - Vol. 352. - P. 333-340.

178. Van Kampen K., Shi Z., Gao P. et al.. Safety and immunogenicity of adenovirus-

vectored nasal and epicutaneous influenza vaccines in humans // Vaccine. -2005.

- Vol.23(8). - P. 1029-1036.

179. Varga Z.T., Ramos .1, Hai R. et al. The influenza virus protein PB1-F2 inhibits

the induction of type i interferon at the level of the MAVS adaptor protein // PLoS Pathog. -2 011. - Vol.7(6). - e. 1002067.

180. Vincent A., Ma W., Lager K. et al. A. Efficacy of intranasal administration of a

truncated NS1 modified live influenza virus vaccine in swine // Vaccine. - 2007.

- Vol.25(47). - P. 7999-8009.

181. Wacheck V., Egorov A., Groiss F. et al.. A novel type of influenza vaccine:

safety and immunogenicity of replication-deficient influenza virus created by deletion of the interferon antagonist NS1 //J. Infect. Dis. - 2010. - Vol.201(3). -P. 354-362.

182. Wang W. and Krug R. MU6atac snRNA, the highly divergent counterpart of U6

snRNA, is the specific target that mediates inhibition of AT-AC splicing by the influenza virus NS1 protein // Rna. - 1998. - Vol. 4. - P. 55-64.

183. Wang X., Li M., Zheng H. et al. Influenza A virus NS1 protein prevents

activation of NF-kappaB and induction of alpha/beta interferon // J Virol. -2000. -Vol. 74. - P. 11566-11573.

184. Wathelet M. G., Lin C. H., Parekh B. S. et al. Virus infection induces the

assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo // Mol Cell. - 1998. mVoI. 1. - P. 507-518.

185. Webster R., Bean W., Gorman O., Chambers T., Kawaoka Y. Evolution and

ecology of influenza A viruses // Microbiol Rev. - 1992. - Vol.56(1). - P. 152179.

186. Wise H., Foeglein A., Sun J. et al. A complicated message: Identification of a

novel PB1-related protein translated from influenza A virus segment 2 mRNA // J Virol. - 2009. - Vol.83(16). - P. 8021-8031.

187. Wressnigg N., Voss D., Wolff T. et al. Development of live-attenuated influenza

B DeltaNS 1 intranasal vaccine candidate // Vaccine. - 2009. - Vol.27. - P. 28512857.

188. Yamada H., Chounan R., Higashi Y. et al. Mitochondrial targeting sequence of

the influenza A virus PB1-F2 protein and its function in mitochondria // FEBS Lett. - 2004. - Vol.578(3).- P. 331-336.

189. Yang P., Tang C., Luo D. et al. Cross-clade protection against HPAI H5N1

influenza virus challenge in BALB/c mice intranasally administered adjuvant-combined influenza vaccine//Vet Microbiol. - 2010. - Vol. 146(1-2). - P. 17-23.

190. Yasuda J., Bucher D., Ishihama A. Growth control of influenza A virus by Ml

protein: analysis of transfectant viruses carrying the chimeric M gene // J Virol.-1994. - Vol.68(12). - P. 8141-8146.

191. Yoshida T., Shaw M. W., Young J. F. and Compans R. W. Characterization of

the RNA associated with influenza A cytoplasmic inclusions and the interaction of NS1 protein with RNA//Virology. - 1981. - Vol. 110. - P. 87-97.

192. Zamarin D., García-Sastre A., Xiao X. et al. Influenza virus PB1-F2 protein

induces cell death through mitochondrial ANT3 and VDAC1 // PLoS Pathog. -2005. - Vol.l(l).-e. 4.

193. Zamarin D., Ortigoza M. and Palese P. Influenza A virus PB1-F2 protein

contributes to viral pathogenesis in mice // J Virol. - 2006. - Vol.80(16). - P. 7976-7983.

194. Zell R., Krumbholz A., Eitner A. et al.. Prevalence of PB1-F2 of influenza A

viruses // J Gen Virol. - 2007. - Vol.88. - P. 536-546.

195. Zhirnov O., Konakova T., Wolff T. and Klenk H. NS1 protein of influenza A virus down-regulates apoptosis // J Virol. - 2002. - Vol.76(4). - P. 1617-1625.