Изучение вариабельности генов гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа A на специализированном биологическом микрочипе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Фесенко, Евгений Евгеньевич

• Фесенко, Евгений Евгеньевич
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Фесенко, Евгений Евгеньевич

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Характеристика вирусов гриппа А

Классификация

Структура вириона

Организация генома и функции вирусных белков

Жизненный цикл вируса гриппа А

Особенности патогенеза и клиники

Эпидемиология вирусов гриппа А и межвидовая трансмиссия

Методы определения подтипа вируса гриппа А

Иммунологические методы

Молекулярно-генетические методы

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и «real-time» ПЦР 33 Изотермальная реакция транскрипционно-опосредованной амплификации нуклеиновых кислот (NASBA)

Петлевая изотермальная амплификация (LAMP) 38 Чувствительность и специфичность амплификационных методов

ДНК микрочипы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение вариабельности генов гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа A на специализированном биологическом микрочипе»

Вирусы гриппа типа А (ВГА) активно циркулируют в природных резервуарах, вызывая инфекцию у человека, диких и домашних птиц, многих видов млекопитающих. Для человека опасность этой инфекции обусловлена существованием множества подтипов ВГА и его чрезвычайной изменчивостью. Основными факторами, определяющими патогенность и вирулентность вирусов гриппа, являются поверхностные антигены -гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA).

К настоящему моменту серологически выделяют 16 вариантов НА (HIHI 6) и 9 вариантов NA (N1-N9). Вирусы с различными сочетаниями НА и NA могут быть обнаружены в популяциях диких водоплавающих птиц, являющихся естественным резервуаром инфекции. В отличие от птиц, в человеческой популяции до недавнего времени* циркулировали, штаммы, ассоциированные лишь с тремя вариантами гемагглютинина (Hl, Н2, НЗ) и двумя вариантами нейраминидазы (N1, N2). Однако в последнее десятилетие отмечены случаи заражения человека не свойственными для человеческой популяции подтипами ВГА: H7N7, H7N3, H9N2 и H5N1. Ранее считалось, что эти подтипы не представляют серьезной опасности для людей и в случае заражения могут вызвать у них лишь конъюнктивит и легкое недомогание, в редких случаях - слабовыраженный респираторный синдром. Однако в 1997 г. вирусы подтипа H5N1 явились причиной чрезвычайно тяжелых форм заболевания среди людей - в Гонконге из 18 заболевших человек шестеро погибли, причем, все они заразились от цыплят [1]. В 2003 году вспыхнула новая эпизоотия, вызванная вирусом H5N1 (или т.н. «птичьим гриппом»), которая продолжается и сегодня. Согласно данным ВОЗ, с момента начала эпизоотии заразились уже 411 человек, 256 из которых погибли. При этом впоследние годы происходило непрерывное расширение ареала циркуляции штаммов «птичьего» гриппа, увеличился видовой спектр хозяев, возникла устойчивая тенденция повышения патогенности циркулирующих штаммов. Случаи передачи ВГА подтипа Н5Ш от человека к человеку пока не зарегистрированы, однако, совместная циркуляция штаммов человеческого гриппа и птичьего гриппа повышает вероятность обмена вирусными сегментами между этими штаммами и возникновения нового варианта вируса, способного передаваться от человека к человеку, как это происходило в 1918, 1957 и 1968 годах при пандемиях "испанки", "гонконгского" и "азиатского" гриппа. Возможно, именно этим обусловлено возникновение вирулентного для человека штамма вируса «свиного» гриппа подтипа НШ1, уже унесшего жизни более 100 человек (к апрелю 2009 г.).

Появление штаммов, обладающих выраженным пандемическим потенциалом, а также не снижающийся уровень заболеваемости обуславливают необходимость поиска новых высокочувствительных и надежных экспресс-методов определения вирусного подтипа для прогнозирования эпидемий, осуществления эпидемиологического контроля, своевременного создания соответствующих вакцин.

К общепринятым методам определения вирусного подтипа относится иммунологический анализ, которому предшествуют стадии выделения вируса на куриных эмбрионах или на культуре ткани. Данный подход рассматривают в качестве «золотого стандарта», продолжительность которого составляет от 3 до 7 дней, требуемых для культивирования вируса. Молекулярно-генетические методы, основанные на обратной транскрипции и амплификации последовательностей генов гемагглютинина и нейраминидазы, характеризуются более высокой чувствительностью, а результаты идентификации вирусного подтипа могут быть получены втечение 3-6 часов. К настоящему времени предложен ряд методов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот, но из-за трудностей, связанных с количеством одновременно идентифицируемых в реакции мишеней, число подтипов, определяемых в одном анализе, остается весьма ограниченным.

Целью данной работы являлось изучение вариабельности генов гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа А и разработка на основе полученных данных специализированного биологического микрочипа для молекулярного субтипирования ВГА, который позволял бы в сжатые сроки идентифицировать широкий спектр подтипов ВГА.

В работе отражены следующие результаты:Впервые создан специализированный биологический микрочип, позволяющий проводить молекулярное субтипирование 15 вариантов гемагглютинина и 2 вариантов нейраминидазы ВГА. Процедура определения вирусного подтипа не требует выполнения предварительных стадий культивирования вируса, а результаты анализа могут быть получены в течение 10 часов. С помощью разработанного подхода выполнен анализ вирусных нуклеиновых кислот, содержащихся в 123 полевых образцах, выделенных из клинического материала, полученного от диких и домашних птиц во время эпизоотий. На выборке, включающей 41 полевой образец, собранный в районе эпизоотии, специфичность и чувствительность метода составили соответственно 100% и 76%. Аналитическая чувствительность составила 10 ЭИД50/мл. Полученные характеристики позволили успешно применить разработанный метод для определения подтипа вируса, вызвавшего эпизоотию. Необходимое оборудование установлено в» Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского и используется дляопределения этиологического агента эпизоотий и эпидемиологического мониторинга вирусов гриппа, циркулирующих в природных резервуарах.

Показано, что предложенный подход обладает высокой специфичностью, и может рассматриваться как универсальный инструмент для будущих разработок, нацеленных на генотипирование вирусов, характеризующихся высокой изменчивостью.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Фесенко, Евгений Евгеньевич

ВЫВОДЫ

1. На основе анализа 3,5 тысяч депонированных в базы данных последовательностей генов гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа А определены консервативные участки, пригодные для субтипирования широкого спектра различных подтипов ВГА. Подобраны специфичные праймеры для одновременной амплификации фрагментов генов поверхностных гликопротеинов.

2. Проанализировано 23 новых флуоресцентно меченных производных 2,-дезоксиуридин- 5"-трифосфата и определены 4 наиболее перспективных соединения для маркирования анализируемой молекулы-мишени.

3. Разработан биологический микрочип, позволяющий идентифицировать 15 вариантов гемагглютинина (Н1-Н15) и 2 варианта нейраминидазы (N1, N2) вируса гриппа А.

4. С помощью разработанного подхода выполнен анализ вирусных нуклеиновых кислот, содержащихся в 123 полевых образцах, выделенных из клинического материала, полученного от диких и домашних птиц во время эпизоотий.

5. На выборке из 41 образца определены специфичность и чувствительность предложенного метода идентификации вирусного подтипа (100% и 76%, соответственно). Аналитическая чувствительность метода составила

10" ЭИДзо/мл.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность моим научным руководителям Владимиру Михайловичу Михайловичу и Ольге Николаевне Озолинь. Я искренне признателен Дмитрию Кирееву, активному участнику экспериментов, за помощь в работе, Дмитрию Грядунову, Сергею Лапе - за поддержку и ценные замечания при обсуждении результатов и рукописи диссертации, Александру Васильевичу Чудинову - за синтез модифицированных нуклеозидтрифосфатов, Сергею Панькову, Эдуарду Яковлевичу Крейндлину - за подготовку микрочипов для проведения экспериментов, Сергею Суржикову - за синтез олигонуклеотидов, Александру Сергеевичу Заседателеву - за помощь и поддержку.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанный метод идентификации подтипа вируса гриппа А на биологическом микрочипе является чувствительным, специфичным инструментом многопараметрического анализа, позволяющим получать воспроизводимые результаты. Его дальнейшее развитие и внедрение в лабораторную практику будут способствовать улучшению эпидемиологического контроля вирусов гриппа, что особенно актуально в условиях появления штаммов, обладающих выраженным пандемическим потенциалом. Гибридизационный анализ на биочипе обладает рядом преимуществ, как перед иммунологическим методом (высокая скорость анализа, отсутствие стадии культивирования, не требует набора эталонных иммунных сывороток), так и перед группой методов, основанных на ОТ-ПЦР (больший спектр определяемых подтипов). Безусловным преимуществом анализа подтипа ВГА на биочипе по сравнению с прямым секвенированием генов поверхностных гликопротеинов является низкая себестоимость.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Фесенко, Евгений Евгеньевич, 2009 год

1. Claas Е.С., Osterhaus A.D., Van Веек R., et al. Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus // Lancet. 1998. — Vol.351.-P.472-477.

2. Fauquet С. M., Mayo M. A., Maniloff J., et al. Virus taxonomy, eighth report //

3. Elsevier. -2005. P. 681-693.

4. Fouchier R. A. M., Bestebroer Т. M., Herfst S., et al. Detection of influenza Aviruses from different species by PCR amplification of conserved sequences in the matrix gene // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P. 4096-4101.

5. Webster R.G., Bean W.J., Gorman O.T., et al. Evolution and ecology ofinfluenza A viruses // Microbiol. Rev. -1992.-Vol.56(l). -P.152-179.

6. Compans R.W., Meier-Ewert H., Palese P. Assembly of lip id-containingviruses // J. Supramol. Struct. -1974. -Vol.2(2-4). -P.496-511.

7. Chu C.M., Dawson I.M., Elford W J. Filamentous forms associated with newlyisolated influenza virus // Lancet—1949.-P.602-603.

8. Steinhauer D.A., Skehel J.J. Genetics of influenza viruses //Annu. Rev. Genet.-2002. -Vol.36: -P.305-332.

9. Momose F., Basler C. F., O'Neill R. E., et al. Cellular splicing factor RAF2p48/NPI-5/BATl/UAP56 interacts with the influenza virus nucleoprotein and enhances virus RNA synthesis // J. Virol. 2001. - Vol. 75. - P. 18991908.

10. Martin K., and Helenius A. Nuclear transport of influenza virus nucleoproteins.

11. The viral matrix protein (Ml) promotes export and inhibits import // Cell. -1991.-Vol. 67.-P. 117-130.

12. Ruigrok R. W., Barge A., Durrer P., et al. Membrane interaction of influenzavirus Ml protein // Virology. 2000. - Vol. 267. - P. 289-298.

13. Roberts P. C., Lamb R. A., and Compans R. W. The Ml and M2 proteins ofinfluenza A virus important determinants in filamentous particle formation // Virology. 1998. - Vol. 240. - P. 127-137.

14. Ciampor F., Bayley P.M., Nermut M.V., et al. Evidence that the amantadineinduced, M2-mediated conversion of influenza A virus hemagglutinin to the low pH conformation occurs in an acidic trans Golgi compartment // Virology-1992. —Vol. 188(1). -P.14-24.

15. Hughey P.G., Roberts P.C., Holsinger L.J., et al. Effects of antibody to theinfluenza A virus M2 protein on M2 surface expression and virus assembly // Virology-1995. -Vol.212(2).-P.411-421.

16. Fields Virology Fifth Edition /ed. by D. M. Knipe. -Lippincott Williams &1. Wilkins, 2007.-3,177p.

17. Connor R.J., Kawaoka Y., Webster R.G., et al. Receptor specificity in human,avian, and equine H2 and H3 influenza virus isolates // Virology -1994. -Vol.205(l). -P. 17-23.

18. Ito T., Couceiro J.N., Kelm S., et al. Molecular basis for the generation in pigsof influenza A viruses with pandemic potential // J. Virol. -1998. -Vol.72(9). -P.7367-7373.

19. Matrosovich M.N., Matrosovich T.Y., Gray T., et al. Human and avianinfluenza viruses target different cell types in cultures of human airway epithelium // Proc. Natl. Acad. Sci. USA -2004. -Vol. 101(13). -P.4620-4624.

20. Gambaryan A.S., Robertson J.S., Matrosovich M.N. Effects of egg-adaptationon the receptor-binding properties of human influenza A and B viruses // Virology-1999. —Vol.258(2). -P.232-239.

21. Mochalova L., Gambaryan A., Romanova J., et al. Receptor-binding propertiesof modern human influenza viruses primarily isolated in Vero and MDCK cells and chicken embryonated eggs // Virology -2003. -Vol.313(2). -P.473-480.

22. Glaser L., Stevens J., Zamarin D., et al. A single amino acid substitution in1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity // J. Virol. -2005. -Vol.79(17). -P. 11533-11536.

23. Stegmann T. Membrane fusion mechanisms: the influenza hemagglutininparadigm and its implications for intracellular fusion //Traffic. -2000-Vol.l(8). -P.598-604.

24. Cros J.F., Palese P. Trafficking of viral genomic RNA into and out of thenucleus: influenza, Thogoto and Borna disease viruses //Virus. Res. -2003. -Vol95(l-2). -P.3-12.

25. Krug R.M. Priming of influenza viral RNA transcription by cappedheterologous RNAs //Curr. Top. Microbiol. Immunol. -1981. -Vol.93. -P.125-149.

26. Barrett T., Wolstenholme A.J., Mahy B.W. Transcription and replicationofin?uenza virus RNA //Virology-1979. -Vol.98. -P.211-225.

27. Beaton A.R., Krug R.M. Transcrip-tion antitermination during in?uenzaviraltemplate RNA synthesis requires the nucleocapsid protein and the absence of a 50capped end // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1986. -Vol.83. -P.6282-86.

28. Bui M., Wills E.G., Helenius A., et al. Role of the influenza virus Ml proteinin nuclear export of viral ribonucleoproteins //J.Virol.-2000. -Vol.74(4). -P.1781-1786.

29. Hirayama E., Atagi H., Hiraki A., et al. Heat shock protein 70 is related tothermal inhibition of nuclear export of the influenza virus ribonucleoprotein complex //J.Virol. -2004. -Vol.78(3). -P. 1263-1270.

30. Schmitt A.P., Lamb R.A. Influenza virus assembly and budding at the viralbudozone //Adv.Virus.Res. -2005. -Vol.64. -P.383-416.

31. Doms R.W., Lamb R.A., Rose J.K., et al. Folding and assembly of viralmembrane proteins //Virology. -1993.-Vol. 193(2). -P.545-562.

32. Sugrue R.J., Belshe R.B., Hay A.J. Palmitoylation of the influenza A virus M2protein //Virology.-1990.-Vol. 179(1). -51-56.

33. Ono A., Freed E.O. Role of lipid rafts in virus replication //Adv.Virus.Res.2005.-Vol.64.-P.311-358.

34. Bourmakina S.V., Garcia-Sastre A. The morphology and composition ofinfluenza A virus particles are not affected by low levels of Ml and M2 proteins in infected cells //J.Virol. -2005.-Vol.79(12). -P.7926-7932.

35. Avalos R.T., Yu Z., Nayak D.P. Association of influenza virus NP and Mlproteins with cellular cytoskeletal elements in influenza virus-infected cells //J.Virol. -1997. -Vol.71(4). -P.2947-2958.

36. Bancroft C.T., Parslow T.G. Evidence for segment-nonspecific packaging ofthe influenza A virus genome //J.Virol. -2002. -Vol.76(14). -P.7133-7139.

37. Enami M., Sharma G., Benham C., et al. An influenza virus containing ninedifferent RNA segments //Virology. -1991. -Vol.l85(l). -P.291-298.

38. Comprehensive Virology: Reproduction of Large RNA Viruses //Fraenkel

39. Conrat H., Wagner R.R., -New York,NY:Plenum,1975. -P. 179-252.

40. Fujii Y., Goto H., Watanabe T., et al. Selective incorporation of influenza virus

41. RNA segments into virions //Proc.Natl.Acad.Sci.USA -2003. -Vol. 100(4). -P.2002-2007.

42. Watanabe T., Watanabe S., Noda T., et al. Exploitation of nucleic acidpackaging signals to generate a novel influenza virus-based vector stably expressing two foreign genes //J.Virol. -2003. -Vol.77(19). -P. 1057510583.

43. Fujii K., Fujii Y., Noda T., et al. Importance of both the coding and thesegment-specific noncoding regions of the influenza A virus NS segment for its efficient incorporation into virions //J.Virol. -2005. -Vol.79(6). -P.3766-3774.

44. Nayak D.P., Hui E.K., Barman S. Assembly and budding of influenza virus

45. Virus.Res. -2004. -Vol. 106(2). -P. 147-165.

46. Schmitt A.P., Lamb R.A. Influenza virus assembly and budding at the viralbudozone //Adv.Virus.Res. -2005. -Vol.64. -P.383-416.

47. Gomez-Puertas P., Albo C., Perez-Pastrana E., et al. Influenza virus matrixprotein is the major driving force in virus budding //J.Virol. -2000. -Vol.74(24).-P.l 1538-11547.

48. Luo C., Nobusawa E., Nakajima K. An analysis of the role of neuraminidase inthe receptor-binding activity of influenza B virus: the inhibitory effect of

49. Zanamivir on haemadsorption //J.Gen.Virol. -1999. -Vol.80(Pt 11). -P.2969-2976.

50. Palese P., Tobita K., Ueda M., et al. Characterization of temperature sensitiveinfluenza virus mutants defective in neuraminidase //Virology. -1974. -Vol.61 (2). -P.397-410.

51. Liu C., Eichelberger M.C., Compans R.W., et al. Influenza type A virusneuraminidase does not play a role in viral entry, replication, assembly, or budding //J.Virol. -1995. -Vol.69(2). -P. 1099-1106.

52. Wagner R., Matrosovich M., Klenk H.D. Functional balance betweenhaemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections //Rev.Med.Virol. -2002. -Vol.l2(3). -P.159-166.

53. Грипп: Руководство для врачей / под ред. Г. И. Карпухина. СПб.:1. Гиппократ, 2001. 360 с.

54. Chan Р. К. Outbreak of avian influenza A(H5N1) virus infection in Hong

55. Kong in 1997 // Clin. Infect. Dis. 2002. - Vol. 34, suppl. 2. - P. S58-S64.

56. Tam J. S. Influenza A (H5N1) in Hong Kong: an overview // Vaccine. 2002.-Vol. 20 suppl. 2. — P.77-81.

57. World Health Organization. WHO inter-country consultation: influenza

58. A/H5N1 in humans in Asia // WHO, Manilla, Philippines, 6-7 May 2005, document available at http://www. who.int54. de Jong M. D., Hien Т. T. Avian influenza (H5N1) // J. of Clin. Virol. 2006.-Vol. 35.-P. 2-13.

59. Stieneke-Grober A., Vey M., Angliker H., et al. Influenza virus hemagglutininwith multibasic cleavage site is activated by furin, a subtilisin-like endoprotease // EMBO Journal. 1992. - Vol. 11. - P. 2407-2414.

60. Rott R. The pathogenic determinan of influenza virus // Vet. Microbiol.1992.-Vol. 33.-P. 303-310.

61. Banks J., Speidel E. C., McCauley J. W., and Alexander D. J. Phylogeneticanalysis of influenza H7 haemagglutinin subtype influenza A viruses //Archives of Virology. 2000. - Vol. 145. - P. 1047-1058.

62. Rohm C., HorimotoT., Kawaoka Y., et al. Do hemagglutinin genes of highlypathogenic avian influenza viruses constitute unique phylogenetic lineages? //Virology. 1995. - Vol. 209. - P. 664-670.

63. Scholtissek C., Rohde W., Von Hoyningen V., Rott R. On the origin of thehuman influenza virus subtypes H2N2 and H3N2 //Virology. -1978. -Vol.87. -P. 13-20.

64. Orlich M., Gottwald H., Rott R. Nonhomologous recombination between thehemagglutinin gene and the nucleoprotein gene of an influenza virus //Virology. -1994. -Vol.204. -P.462-465.

65. Campbell C. H., Webster R. G. and Breese S. S. Fowl plague virus from man

66. J.of Infect.Diseases. 1970. - Vol.122. -P.513-516.

67. Taylor H. R. and Turner A. J. A case report of fowl plague keratoconjunctivitis

68. British J.of Ophthalmology. 1977. - Vol.61. - P. 86-88.

69. Webster R. G., Geraci J. R., Petursson G., and Skirnisson K. Conjunctivitis inhuman being caused by influenza A virus of seals //New England J. of Medicine. 1981. - Vol.304. - P.911.

70. Kurtz J., Manvell R. J. and Banks J. Avian influenza virus isolated from awoman with conjunctivitis //Lancet. 1996. - Vol.348. - P.901-902.

71. Beare A. S. and- Webster R. G. Replication of avian influenza viruses inhumans //Archives of Virology. 1991. - Vol.119. - P.37-42.

72. Peiris M., Yam Y. C., Chan K. H., et al. Influenza A H9N2: aspects oflaboratory diagnosis //J. of Clin. Microbiol. 1999. - Vol.37. - P.3426-3427.

73. Koopmans M., Fouchier R., Wilbrink B., et al. Update on human infectionswith highly pathogenic avian influenza virus A/H7N7 during an outbreak in poultry in The Netherlands // Eurosurveillance Weekly. 2003. - Vol.7. -P.1-5.

74. Tweed S.A., Skowroski D.M., David S.T., et al. Human illness from avianinfluenza H7N3, British Columbia //Emerg. Infect. Dis. -2004. -Vol.10. -P.2196-2199.

75. Stamboulian D., Bonvehi P. E., Nacinovich F. M., Cox N. Influenza //Infect.

76. Dis. Clin. North. Am. 2000 March. - Vol.14. - P. 141-166.

77. Woolcock P. R., Mcfarland M. D., Lai S., and Chin R. P. Enchanced recoveryof avian influenza virus isolates by a combination of chicken embryo inoculation methods //Avian Dis. 2001. - Vol.45. - P. 1030-1035.

78. World Health Organization. WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance // WHO, Geneva, 2002, document WHO/CDS/CSR/NCS/2002.5Rev. 1 available at http://www.who.int

79. Gavin P. J., Thompson R. B. Jr. Review of Rapid Diagnostic Tests for1.fluenza //Clin. And Appl. Immunol. Reviews. 2003. - Vol.4. - P. 151172.

80. Leonardi G. P., Leib H., Birkhead G. S., et al. Comparison of rapid detectionmethods for influenza A virus and their value in health-care management of institutionalized geriatric patients //J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol.32(l). — P.70-74.

81. Ray C. G., Minnich L. L. Efficiency of immunofluorescence for rapiddetection of common respiratory viruses //J. Clin. Microbiol. 1987. -Vol.25(2). -P.355-357.

82. Wittwer C. T., Herrmann M. G., Moss A. A. and Rasmussen R. P., Continuousfluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification //BioTechniques. -1997. -Vol.22. -P.134-138.

83. Morrison T. B., Weis J. J. and Wittwer C. T., Quantification of low-copytranscripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification //BioTechniques. -1998. -Vol.24. -P.954-958.

84. Didenko V., DNA Probes Using Fluorescence Resonance Energy Transfer

85. FRET): Designs and Applications. //Biotechniques. -2001. -Vol.31(5). -P. 1106—1121.

86. Watson D.E., Li B., TaqMan applications in genetic and molecular toxicology1.t. J. Toxicol. -2005. -Vol.24(3). -P.139-145.

87. Marras S.A., Tyagi S., Kramer F.R., Real-time assays with molecular beacons and other fluorescent nucleic acid hybridization probes //Clin. Chim. Acta. — 2006. —Vol.363(l-2). —P.48-60.

88. Lee C. W., Suarez D. L. Application of real-time RT-PCR for the quantitationand competitive replication study of H5 and H7 subtype avian influenza virus //J. Virol. Methods. 2004. - Vol.119. - P. 151-158.

89. Munch M., Nielsen L. P., Handberg K. J., and Jorgensen P. H. Detection andsubtyping (H5 and H7) of avian type A influenza virus by reverse transcription-PCR and PCR-ELISA //Arch. Virol. 2001. - Vol.146. - P.87-97.

90. Spackman E., Senne D. A., Myers T. J., et al. Development of a Real-Time

91. Reverse Transcriptase PCR Assay for Type A Influenza Virus and the Avian

92. H5 and H7 Hemagglutinin Subtypes //J. Clin. Microbiol. 2002. -Vol.40(9). -P.3256-3260.

93. Stone B., Burrows J., Schepetuik S., et al. Rapid detection and simultaneoussubtype differentiation of influenza A viruses by real time PCR //J. Virol. Methods. 2004. - Vol. 117. - P. 103-112.

94. Wright K. E., Wilson G. A. R., Novosad D. Typing and subtyping of influenzaviruses in clinical samples by PCR //J. of Clin. Microbiol. 1995. - Vol.33. -P.l 180-1184.

95. Takao S., Shimazu Y., Fukuda S., et al. Neuraminidase subtyping of humaninfluenza A virusesby RT-PCR and its application to clinical isolates //Jpn. J. Infect. Dis. 2002. - Vol.55. P.204-205.

96. Vabred A., Sapin G., Lezin B., et al. Comparison of three non-nested RT-PCRfor the detection of influenza A viruses //J. of Clin. Vir. 2000. - Vol. 17. -P.167-175.

97. Compton J., Nucleic Acid Sequence-Based Amplification //Nature. -1991.1. Vol.350.-P.91-92.

98. Lau L. T., Banks J., Aherne R., et al. Nucleic acid sequence-basedamplification methods to detect avian influenza virus //Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. - Vol.313. - P.336-342.

99. Moore C., Hibbitts S., Owen N., et al. Development and evaluation of a realtime nucleic acid sequence based amplification assay for rapid detection of influenza A //J. Med. Virol. 2004. - Vol.74. - P.619-628.

100. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA //Nucleic Acids Research. -2000. -Vol.28.

101. Poon L. L. M., Leung C. S. W., Chan K. H., et al. Detection of humaninfluenza A viruses by loop-mediated isothermal amplification //J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol.43. - P.427-430.

102. Jayawardena S., Cheung C.Y., Barr I., Chan Kwok H., Chen H., Guan Y.,

103. Peiris J. S. M., Poon L.L. Loop-mediated isothermal amplification for influenza A (H5N1) virus //Emerg. Infect. Dis. -2007. -Vol. 13(6). -P.899-901.

104. Suarez D.L., Amaresh D., Ellis E. Review of Rapid Molecular Diagnostic

105. Tools for Avian Influenza Virus //Avian. Diseases. -2007. -Vol.51. -P.201-208.

106. Tanigava M., Gotoh M., Machida M., Okada T., Oishi M. Detection andmapping of mismatched base pairs in DNA molecules by atomic force microscopy//Nucl. Acids Res. -2000. -Vol.28(9). -P.l-5.

107. Li J., Chen S., and Evans D. H. Typing and subtyping influenza virus using

108. DNA microarrays and multiplex reverse transcriptase PCR //J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol.39. - P.696-704.

109. Sengupta S., Onodera K., Lai A., and Melcher U. Molecular detection andidentification of influenza viruses by oligonucleotide microarray hybridization //J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol.41. - P.4542-4550.

110. Kessler N., Ferraris O., Palmer K., et al. Use of the DNA Flow-Thru chip, athree-dimensional biochip, for typing and subtyping of influenza viruses //J. Clin. Microbiol. 2004. - Vol.32. - P.2173-2185.

111. Lodes M., Suciu D., Elliott M. et al. Use of semiconductor-basedoligonucleotide microarrays for influenza a virus subtype identification and sequencing. //J. Clin. Microbiol. 2006. - Vol.44. - P. 1209-18.

112. Townsend M.B., Dawson E.D., et al. Experimental evaluation of the FluChipdiagnostic microarray for influenza virus surveillance //J. Clin. Microbiol. -2006. -Vol.44(8). -P.2863-71.

113. Dawson E.D., Moore C.L., Smagala J.A., et al. MChip: a tool for influenzasurveillance //Anal. Chem. -2006. -Vol.78(22). -P.7610-7615.

114. Wang Z., Daum L.T., Vora G.J. et al. Identifying influenza viruses withresequencing microarrays //Emerg. Infect. Dis. -2006. -Vol.12. -P.638-646.

115. Quan P.L., Palacios G., Jabado O J., et al. Detection of Respiratory Viruses and

116. Subtype Identification of Influenza A Viruses by GreeneChipResp Oligonucleotide Microarray //J.Clin.Microbiol. -2007. -Vol.45. -P.2359-2364.

117. Han X., Lin X., Liu B., et al. Simultaneously subtyping of all influenza Aviruses using DNA microarrays //J. Vir. Methods. -2008. -Vol.152. —P. 117121.

118. Huang Y., Tang H., Duffy S., et al. Multiplex assay for simultaneously typingand subtyping influenza viruses by use of an electronic microarray //J.Clin.Microbiol. -2009. -Vol.47(2). -P.390-396.

119. Gall A., Hoffmann B., Harder T., et al. Design and Validation of a Microarrayfor Detection, Hemagglutinin Subtyping, and Pathotyping of Avian Influenza Viruses //J.Clin.Microbiol. -2009. -Vol.47. -P.327-334.

120. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method forreconstructing phylogenetic trees //Mol. Biol. Evol. -1987. -Vol.4(4). — P.406-425.

121. Fouchier R. A. M., Bestebroer T. M., Herfst S., et al. Detection of influenza Aviruses from different species by PCR amplification of conserved sequences in the matrix gene //J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol.38. - P. 4096-4101.

122. Kuznetsova V.E., Vasiliskov V.A., Antonova O.V., Mikhailovich V.M.,

123. Zasedatelev A.S., Chudinov A.V. New indodicarbocyanine dyes for the biological microchip technology //Bioorg. Khim. -2008. -Vol.34(l). -P.141-144.

124. Yu H., Chao J., Patek D., Mujumdar R., Mujumdar S., Waggoner A.S. Cyaninedye dUTP analogs for enzymatic labeling of DNA probes. //Nucleic. Acids. Res. -1994. -Vol.22(15). -P.3226-3232.

125. Gryadunov D., Mikhailovich V., Lapa S. et al: Evaluation of hybridization onoligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis //Clin. Microbiol. Infect. -2005. -Vol.11. -P.531-539.