Разработка методики генотипирования бифидобактерий на основе двухлокусного секвенирования с целью видовой идентификации штаммов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Субботина, Марина Евгеньевна

• Субботина, Марина Евгеньевна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Субботина, Марина Евгеньевна

Введение 3

Список сокращений

Глава 1. Обзор литературы 6

Раздел 1.1. Характеристика объекта: бифидобактерии, их 6-20 свойства и значимость для нормальной жизнедеятельности человека

Раздел 1.2. История генотипирования. Эволюционная 21систематика. Таксономия бактерий

Раздел 1.3. Становление бифидофлоры кишечника у детей 42-50 раннего возраста

Цель и задачи исследования. '

Глава 2. Материалы и методы исследования 52

Раздел 2.1. Материалы 52

Раздел 2.2. Методы исследования 59

Глава 3. Результаты и обсуждение 70

Раздел 3.1 Разработка методики видового типироваиия 70-84 бифидобактерий на основе двухлокусного секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и tal.

Раздел 3.2 Применение разработанной методики двухлокусного 84-92 секвенирования для видовой идентификации 21 коллекционного штамма бифидобактерий.

Раздел 3.3 Применение разработанной методики для видового 92-100 типироваиия 30 изолятов бифидобактерий из кишечника 11 детей раннего возраста.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка методики генотипирования бифидобактерий на основе двухлокусного секвенирования с целью видовой идентификации штаммов»

Бактерии рода Bifidobacterium являются важным компонентом индигенной микрофлоры кишечника человека и теплокровных животных. Они обеспечивают колонизационную резистентность в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, обладают иммуномодулирующим действием, синтезируют аминокислоты, витамины (К, РР и группы В), биотин, летучие жирные кислоты, ферменты, участвующие в процессах пищеварения и обмена веществ.

В связи с широким спектром положительных свойств Bifidobacterium spp. часто используются в качестве пробиотиков при коррекции дисбиотических нарушений ЖКТ. Их применение особо значимо для современных детей раннего возраста ввиду дефицита или полного отсутствия кишечной бифидофлоры и изменения ее видового состава по сравнению с данными 60-80-х годов XX века даже при исключительно грудном вскармливании. Поэтому достоверная идентификация наиболее физиологичных для человека 5 видов бифидобактерий: В. adolescentis, В. bifidum, В. breve, В. infantis и В. longum, являющихся основой большинства про- и синбиотических препаратов для человека и сельскохозяйственных животных, очень актуальна как для производителей такого рода препаратов, так и для ветеринарной и медицинской практики, в особенности для педиатрии и детской диетологии.

В настоящее время видовая идентификация бифидобактерий основывается на фенотипических критериях: морфологических и биохимических признаках, антагонистической активности и устойчивости к антибиотикам. Но эти признаки являются зачастую нестабильными, неоднозначными и очень сходными у представителей близкородственных видов. Поэтому в дополнение к традиционным культуральным методам крайне актуальной становится задача разработки методики генотипирования бифидобактерий на уровне вида, в особенности для различения видов В. infantis и В. longum.

Филогения домена Bacteria построена на анализе последовательностей информационного гена 16S рибосомальной РНК (16S рРНК). Однако возможности данной мишени на уровне ниже рода ограничены, поскольку с ее помощью нельзя различить генетически близкородственные виды бактерий. Поэтому возникает необходимость разработки альтернативных подходов, одним из которых является двухлокусное секвенирование - дополнение филогении на основе гена 16S рРНК анализом последовательностей одного из операционных генов (house-keeping genes), кодирующих наиболее значимые для исследуемого таксона белки клеточного метаболизма.

Двухлокусное секвенирование имеет множество преимуществ по сравнению с другими методами видовой идентификации. Во-первых, данный метод выявляет изменения в информационном и операционном генах, эволюционирующих медленно и, вероятно, являющихся нейтральными для отбора, что позволяет различать штаммы бактерий разных видов по длительно сохраняющимся изменениям в геноме. Во-вторых, результаты секвенирования являются однозначными, достоверными, воспроизводимыми и сопоставимыми в рамках разных лабораторий, что позволяет на основе секвенированных аллелей создавать глобальные, общемировые базы данных, анализировать их и передавать через Интернет исследователям разных стран. Таким образом, применение двухлокусного секвенирования, а в перспективе и мультилокусного секвенирования (MLST) на основе нескольких операционных генов, в анализе штаммов бактерий открывает новые перспективы в исследованиях как молекулярно-биологического, эволюционного, филогенетического, так и эпидемиологического, популяционно-генетического направления.

Список сокращений, используемых в тексте

16S рРНК - 16S рибосомальная РНК tal -трансальдолаза (transaldolase)

FHHMB - Federal Human Host Microflora Bank - Государственная коллекция микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора

RNCIM - Russian National Collection of Industrial Microorganisms -Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов Государственного научного центра ГосНИИгенетика

АТСС (American Type Culture Collection) - американская коллекция типовых культур

DSM (Deutsche Sammlung von Microorganismen and Zellkulturen) - немецкая коллекция микроорганизмов

JCM (Japan Culture Collection of Microorganism) - японская коллекция микроорганизмов

PCR - DGGE (polymerase chain reaction - denaturing gradient gel -electrophoresis) - ПЦР - денатурирующий градиентный гель - электрофорез. dNTP - дезоксирибонуклеозидтрифосфаты ddNTP — дидезоксирибонуклеозидтрифосфаты . ЖКТ - желудочно-кишечный тракт ПЦР - полимеразная цепная реакция ПААГ - полиакриламидный гель ЭФ - электрофорез

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Субботина, Марина Евгеньевна

выводы

1. Разработана методика двухлокусного видового типирования бактерий рода Bifidobacterium на основе секвенирования фрагментов генов 16S рибосомальной РНК и трансальдолазы (tal). Методика может быть использована при видовой идентификации коллекционных и производственных штаммов, а также в ветеринарных и медицинских целях.

2. В результате генотипирования 21 коллекционного штамма бифидобактерий подтверждена видовая принадлежность восьми штаммов. Четыре штамма по обеим мишеням идентифицированы иначе, чем по фенотипическим признакам. Семь штаммов охарактеризованы как природные рекомбинанты, сохранившие эту особенность при длительном культивировании, два штамма - как генетически неоднородные.

3. Использование в типировании бифидобактерий однокопийного гена tal с применением метода клонирования амплифицированных фрагментов ДНК позволило выявить природные рекомбинанты и штаммы, начавшие дифференцировку.

4. Показано, что у клинически здоровых детей раннего возраста бифидофлора представлена видами В. bifidum (36%), В. pseudocatenulatum (29%), В. adolescentis (21%), В. angidatum (7%), В. longum (7%). У детей, не имевших собственной культивируемой бифидофлоры, после стимуляции синбиотиком Бифидум-Мульти-1 идентифицированы следующие виды бифидобактерий: В. ruminantium (50%), В. breve (19%), В. longum/B. pseudocatenulatum (13%), В. bifidum (6%), В. adolescentis (6%), В. pseudocatenulatum (6%).

5. Установлено, что препарат Бифидум-Мульти-1 стимулирует развитие собственной бифидофлоры грудных детей, ранее не имевших культивируемой бифидофлоры. Прослежена смена первично стимулированного вида В. ruminantium видом В. longum/B. pseudocatenulatum и закрепление вида В. breve в кишечной микрофлоре в течение двух месяцев после окончания синбиотикотерапии.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Миннауки ЖС-13.4/002. «Ферменты для молекулярной биологии и генетической инженерии» №02.435.11.3007 от 20.04.05.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Карзанова М.Е., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы // Доклады РАСХН.- 2006.- № 5.- С. 9-12.

2. Воронина О.Л., Кунда М.С., Субботина М.Е., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. Анализ видового разнообразия бифидофлоры и влияние синбиотика «Бифидум-Мульти-1» на становление и развитие бифидобактерий у детей раннего возраста // Вопросы детской диетологии.- 2008.- Том 6.- № 5.- С. 59-64.

Статья в сборнике:

1. Воронина О.Л., Субботина М.Е., Лунин В.Г. и др. Дифференцирование видов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы // Материалы Международного конгресса "Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты" (в рамках 9-го Международного Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург - Гастро-2007).- СПб.- 2007.- Клиническое питание.- № 1-2.- С. А31.

Тезисы докладов:

1. Воронина О.Л., Субботина М.Е., Лунин В.Г. и др. Дифференцирование видов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы // Материалы Международного конгресса "Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты" (в рамках 9-го

Международного Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург - Гастро-2007).- СПб.- 2007.- Клиническое питание.- № 1-2.- С. А31.

2. Субботина М.Е. Генотипирование бифидобактерий // Тез. докл. Российской школы — конф. «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 100-летию со дня рождения С. И. Алиханяна.- Пущино.- 2006.- С. 209-211.

3. Воронина О.Л., Субботина М.Е., Лунин В.Г. Выбор мишеней для генотипирования бифидобактерий // Тез. докл. междунар. конф. Вычислительная филогенетика и геносистематика «ВФГС' 2007», к 50-летию становлении отечественной филогенетики и геносистематики.- М.: Товарищество научных изданий КМК.- 2007.- С. 38-43.

4. Воронина О.Л., Кунда М.С., Субботина М.Е., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. Бифидофлора детского кишечника - индикатор изменения экологической обстановки // Международный междисциплинарный симпозиум «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине».- Судак, Украина.- 2008.- С. 32-34.

5. Субботина М.Е., Кунда М.С., Воронина О.Л. Использование схемы двухлокусного типирования для идентификации штаммов бифидобактерий, изолированных у детей раннего возраста // Тез. докл. Международной школы — конф. «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвящённой 40-летию ГосНИИгенетика,- Пущино.- 2008,- С. 173-174.

6. Карзанова М.Е. Генотипирование бифидобактерий // Тез. докл. VI молодежной научн. конф. «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии».- М.- 2006.- С. 9-10.

7. Субботина М.Е. Сопоставление результатов идентификации штаммов бифидобактерий на основе анализа фрагментов последовательностей операционного и информационного генов // Тез. докл. VII молодежной научн. конф. «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии».- М.- 2007,- С. 48-50.

Заявки на патенты:

1. Жиленкова О.Г., Воронина O.JL, Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин A.B., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №

2008128539 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium breve OV-12, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств».

2. Жиленкова О.Г., Воронина O.JL, Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин A.B., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №

2008128540 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium bifidum OV-19.».

3. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин A.B., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №

2008128541 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium bifidum OV-7.».

4. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин A.B. Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №

2008128542 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium longum OV-20.».

5. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин A.B., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №

2008128543 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium pseiidocatenulatum OV-17.».

6. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин A.B., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №

2008128544 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium angulation OV-15.».

7. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин A.B., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №

2008128545 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium pseiidocatenulatum OV-2.».

Благодарности

Работа была выполнена совместно с сотрудниками лаборатории биологии бифидобактерий Аделаидой Михайловной Амерхановой (зав. лаб.) и Ольгой Геннадьевной Жиленковой (н.с.), которыми были проведены все этапы работы с чистыми культурами коллекционных штаммов бифидобактерий и получения изолятов бифидобактерий, выделенных из кишечника детей раннего возраста.

Секвенирование последовательностей фрагментов генов 16S рРНК и tal изолятов бифидобактерий из кишечника детей раннего возраста было выполнено при участии м.н.с. лаборатории биологически активных наноструктур ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН Кунда Марины Сергеевны.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Субботина, Марина Евгеньевна, 2009 год

1. Белозерский А.Н. Нуклеиновые кислоты и их связь с эволюцией, филогенией и систематикой организмов: Пленарная лекция // Второй всесоюзный биохимический съезд.- Ташкент, 1969.- С. 38.

2. Ботина С.Г., Цыганков Ю.Д. Суходолец В.В. Идентификация промышленных штаммов молочнокислых бактерий методами молекулярно-генетического типнрования // Генетика, 2006.- Т. 42.- № 12.- С. 1621-1635.

3. Гуринович Г.В., Кудряшов Л.С., Патракова И.С. Пробиотики и пробиотические продукты. М.: ВНИИ мясной промышленности им. В.М. Горбатова, 2002.

4. К 100-летию со дня рождения академика А.Н. Белозерского // Успехи биологической химии.- 2005.- Т. 45.- С. 455-462.

5. Кафарская Л.И., Ефимов Б.А., Постникова Е.А., Донских Е.Е. Особенности становления микрофлоры у детей раннего возраста // Детские инфекции.-2006.-№1.-С. 6-11.

6. КольманЯ., Рем К.-Г. Наглядная биохимия.- М.: Мир, 2004.- С. 256-259.

7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование.- М.: Мир, 1984,- С. 84,333-334.

8. Миндлин С.З., Петрова М.А., Басс И.А., Горленко Ж.М. Происхождение, эволюция и миграция генов лекарственной устойчивости // Генетика.- 2006.Т. 42.-№ 11.- С. 1495-1511.

9. МУК 4.2.577-96. Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов.- М.: МЗ РФ.- 1998.

10. МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам.- М.: МЗ РФ.- 2004.

11. Осипов Г. Невидимый орган микрофлора человека // http://www.rusmedserv.eom/microbdiag/invisibleorgan.htm#bl

12. Примроуз С., Тваймен Р. Геномика. Роль в медицине.- М.: БИНОМ. Лаборатория знаний.- 2008.- С. 58-59.

13. Рыбальченко О.В. Бифидобактерии, их значение и использование. Учебное пособие // СПбГУ 2003.

14. Современная микробиология: Прокариоты / Под ред. Й. Ленглера, Г. Древса, Г. Шлегеля.- М.: Мир, 2005.- Т. 2.- С. 148-205.

15. Чем грозит нарушение микрофлоры кишечника // http://www.jogurt.well24.lv/ru/doctor.html

16. П.Чемерис А.В., Ахунов Э.Д., Вахитов В.А. Секвенирование ДНК // http ://www. anrb. га/molgen/ chemeri s .html

17. Шендеров Б.А. Микробиоценозы человека и функциональное питание // http://www.disbak.ru/php/contentphp?id=1052

18. Шендеров Б.А. Нормальная микрофлора и ее роль в поддержании здоровья человека // http://www.gastroportal.ru/php/content.php?id=l 880

19. Шкопоров А.Н., Ефимов Б.А. Володин Н.Н., Кафарская Л.И. Бифидобактерии: традиционный взгляд и современные генетические исследования // Вопросы практической педиатрии.- 2007.-Т.2 № 5,- С. 7679.

20. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия.- Новосибирск: Сибирское университетское издательство, 2004. С. 36-55.

21. Abbad Andaloussi S., Talbaoni H., Marczak R., Bonaly R. Isolation and characterization of exocellular polysaccharides produced by Bifidobacterium longum II Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1995.-V. 43.- P. 995-1000.

22. Adams M.R. and Hall C.J. Growth inhibition of foodborne pathogens by lactic and acetic acids and their mixtures // Int. J. Food Sci. Technol.- 1988.- V. 23.- P. 287292.

23. Ahn J.B. Hwang H.J. and Park J.H. Physiological responses of oxygen-tolerant anaerobic Bifidobacterium longum under oxygen // J. Microbiol. Biotechnol.-2001.- V. 11.-P. 443-451.

24. Backhed F., Hornef M. Toll-like receptor 4-mediated signaling by epithelial surfaces: necessity of threat? // Microbes Infect. 2003.- V. 5(11).- 951-959.

25. Begley M., Hill C., Gahan C. G. M. Bile salt hydrolase activity in probiotics // Appl. Environ. Microbiol.- 2006,- V. 72 (3).- P. 1729-1738.

26. Belozersky A.N., Spirin A.S. A correlation between the composition of deoxyribonucleic and ribonucleic acids //Nature.- 1958.- 182 (4628).- P. 132-133.

27. Benno Y., Sawada K., Mitsuoka T. The intestinal microflora of infants: composition of fecal flora in breast-fed and bottle-fed infants // Microbiol. Immunol.- 1984.- V. 28.- P. 975-986.

28. Berg R.D. The indigenous gastrointestinal microflora // Trends Microbiol.- 1996.-V. 4.- P. 430-445.

29. Biavati B., Castagnoli P., Crociani F., Trovatelli L.D. Species of the Bifidobacterium in the feces of infants // Microbiologica.- 1984.- V. 7 (4).- P. 341345.

30. Biavati B., Castagnoli P., Trovatelli L.D. Species of the genus Bifidobacterium in the feces of human adults // Microbiologica.- 1986.- V. 9 (1).- P. 39-45.

31. Biavati B. and Mattarelli P. Bifidobacterium ruminantium sp. nov. and Bifidobacterium merycicum sp. nov. from the rumens of cattle // Int. J. Syst. Bacteriol.- 1991.-V. 41.-P. 163-168.

32. Biavati B., Mattarelli P. and Crociani F. Bifidobacterium saeculare a new species isolated from faeces of rabbit // Syst Appl Microbiol.- 1991.- V. 14.- P. 389-392.

33. Biavati B., Scardovi V. and Moore W.E.C. Electrophoretic patterns of proteins in the genus Bifidobacterium and proposal of four new species // Int. J. Syst. Bacteriol.-1982.- V. 32.- P. 358-373.

34. Biavati B., Vescovo M., Torriani S., Bottazzi V. Bifidobacteria: history, ecology, physiology and applications //Ann. Microbiol.- 2000.- 50.- P. 117-131.

35. Breed R.S., Murray E.G.D., Smith N.R., eds. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7th edn., Williams & Wilkins, Baltimore.- 1957.

36. Brodie E.L., DeSantis T.Z., Moberg Parker J.P. et al. // PNAS.- 2007.- V. 104 (1).-P. 299-304.

37. Candela M., Vitali B., Matteuzzi D., Brigidi P. Evaluation of the rrn operon copy number in Bifidobacterium using real-time PCR // Lett. Appl. Microbiol.- 2004.-V. 38.-P. 229-232.

38. Charteris W.P., Kelly P.M., Morelli L., Collins J.K. Antibiotic susceptibility of potentially probiotic Bifidobacterium isolates from the human intestinal tract // Lett. Appl. Microbiol.- 1998.- V. 26.- P. 333-337.

39. Crociani F., Matteizzi D., Ghazvinizadeh H. Species of the genus Bifidobacterium found in human vagina // Zentralbl. Bacteriol. Parasitenkd. Infektionskr. Hyg. Abt. 1 Orig. Reihe A.- 1973.- V. 223.- P. 298-302.

40. Crociani F., Biavati B. Alessandrini A. et al. Bifidobacterium inopinatum sp. nov. and Bifidobacterium denticolens sp. nov., two new species isolated from human dental caries // Int. J. Syst. Bacteriol.- 1996.- V. 46.- P. 564-571.

41. Dehnart J. Untersuchungen über die gram positive Stuhlflora des Brustmilchkinder // Zentrabi. Bakteriol. Parasitenkd. Infektionskr. Hyg. Abt. I. Orig. Reihe A.- 1957.- Y. 169.- P. 66-79.

42. De Simone C., Ciardi A., Grassi A. et al. Effect of Bifidobacterium bifidum and Lactobacillus acidophilus on gut mucosa and peripheral blood B lymphocytes // Immunopharmacol. Immunotoxicol.- 1992.- V. 14(1-2).- P. 331-340.

43. De Vries W., Gerbrandy S.J., Stouthamer A.H. Carbohydrate metabolism in Bifidobacterium bifidum II Biochim. Biophys. Acta.- 1967.- 136.- 415-425.

44. Dong X., Xin Y., Jian W. et al. Bifidobacterium thermacidophilum sp. nov., isolated from an anaerobic digester // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.- 2000.- V. 50.-P. 119-125.

45. Fanaro S, Chierici R, Guerrini P, Vigi V. Intestinal microflora in early infancy: composition and development // Acta Paediatr. Suppl. 2003.- V 91 (441).- P. 4855.

46. Fox G. E., Wisotzkey J. D., Jurtshuk P. How close is close: 16S rRNA sequence identity may not be sufficient to guarantee species identity // Int. J. Syst. Bacteriol.- 1992.- V 42.- P. 166-170.

47. Gavini F., Pourcher A-M., Neut C. et al. Phenotypic differentiation of bifidobacteria of human and animal origin // Int. J. Syst. Bacteriol.- 1991.- V 4.- P. 548-557.

48. Gibson G.R., Wang X. Regulatory effects of bifidobacteria on the growth of other colonic bacteria // J. Appl. Bacteriol.- 1994.- V 77.- P. 412-420.

49. Gill S. R., Pop M., DeBoy R.T. et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome // Science.- 2006.- V 312.- P. 1355-1359.

50. Gomes A.M.P. and Malcata F.X. Bifidobacterium spp. and Lactobacillus acidophilus: biological, biochemical, technological and therapeutical properties relevant for use as probiotics // Trends Food Sei. Technol.- 1999.- V 10.- P. 139— 157.

51. Goodfellow M., O'Donnel A.G. Handbook of new bacterial systematics / Eds Goodfellow M., O'Donnel A.G. L.: Acad. Press Ltd.- 1993.- P. 3-54.

52. Gootlieb M., Chavko M. Silver staining of native and denatured eucaryotic DNA in agarose gels // Analytical Biochemistry.- 1987.- V 165.- P. 33-37.

53. Gore C., Munro K., Lay C. et al. Bifidobacterium pseudocatenulatum is associated with atopic eczema: a nested case-control study investigating the fecal microbiota of infants // J. Allergy. Clin. Immunol.- 2008.- V 121 (1).- P. 135-40.

54. Grill J.P., Perrin S., Schmeider F. Bile salt toxicity to some bifidobacterial strains: role of conjugated bile salt hydrolase and pH // Edge J. Microbiol.- 2000.- V 46 (10).-P. 878-884.

55. Gurtler V„ Mayall B.C. Genomic approaches to typing, taxonomy and evolution of bacterial isolates // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.- 2001.- V 51.- P. 3-16.

56. Hadadji M., Behama R., Saidi N. et al. Identification of cultivable Bifidobacterium species isolated from breast-fed infant feces in West-Algeria // African Journal of Biotechnology.- 2005.- V 4 (5).- P. 422-430.

57. Holland D.F. Generic index of the commoner forms of bacteria // J. Bacteriol.-1920.-V 5.-P. 191-229.

58. Hoyles L., Inganäs E., Falsen E., Drancourt M., Weiss N., McCartney A.L. and Collins M.D. Bifidobacterium scardovii sp. nov., from human sources // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.- 2002.- V 52.- P. 995-999.

59. InsT/Aclone™ PCR Product Cloning Kit. Technical Manual. Fermentas.- 2004.l.Jian W., Zhu L., Dong X. New approach to phylogenetic analysis of the genus

60. Bifidobacterium based on partial HSP60 gene sequences // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.- 2001.- V 51.- P. 1633-1638.

61. KuIlen M.J., Brady L.J., O'SulIivan D.J. Evaluation of using a short region of the recA gene for rapid and sensitive speciation of dominant bifidobacteria in the human large intestine // FEMS Microbiol. Lett.- 1997.- V 154.- P. 377-383.

62. Lauer E. Bifidobacterium gallicum sp. nov. isolated from human faeces // Int. J. Syst. Bacterid.- 1990.-V 40,-P. 100-102.

63. Lauer E. and Kandler O. DNA-DNA homology, murein types and enzyme patterns in the type strains of the genus Bifidobacterium II Syst. Appl. Microbiol.-1983,-V 4,- P. 42-64.

64. Leahy S.C., Higgins D.G., Fitzgerald G.F., van Sinderen N. Getting better with bifidobacteria // J. Appl. Microbiol.- 2005.- V 98.- P. 1303-1315.

65. Leblond-Bounget N., Philippe H., Mangin L, Decaris B. 16S rRNA and 16S to 23S internal transcribed spacer sequence analyses reveal inter- and intraspecific Bifidobacterium phylogeny // Int. J. Syst. Bacteriol.- 1996.- V 46.- P. 102-111.

66. Lee J.H., Yoon Y.H. Characteristics of cell wall hydrolyzing enzyme of Lactobacillus spp and Bifidobacterium spp. // Korean J. Anal. Sci.- 1998.- V 40.-P. 43-50.

67. Maiden M. C. J., Bygraves J.A., Feil E. et al. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms // Proc. Natl. Acad. Sci. USA (Microbiology).- 1998.- V 95.- P. 3140-3145.

68. Matsumoto M., Ohishi H. and Benno Y. H+jATPase activity in Bifidobacterium with special reference to acid tolerance // Int. J. Food Microbiol.- 2004.- V 93.- P. 109-113.

69. Matteuzzi D., Crociani F., Zani G. and Trovatelli L.D. Bifidobacterium suis n. sp.: a new species of the genus Bifidobacterium isolated from pigs feces // Z. Allg. Mikrobiol.- 1971.- V 11.- P. 387-395.

70. Mattö J., Malinen E., Suihko M.L., Alander M., Palva A., Saarela M. Genetic heterogeneity and functional properties of intestinal bifidobacteria // J. Appl. Microbiol.- 2004.- V 97.- P. 459-470.

71. McCartney A.L. Application of molecular biological methods for studying probiotics and the gut flora // British J.of Nutrition.- 2002.- V 88 (1).- P. 29-37.

72. Meile L., Ludwig W., Rueger U. et al. Bifidobacterium lactis sp. nov., a moderately oxygen tolerant species isolated from fermented milk // Syst. Appl. Microbiol.- 1997.- V 20.- P. 57-64.

73. Mevissen-Verhage E.A.E., Marcelis J. H./De Vos M. N. et al. Bifidobacterium, Bacteroides and Clostridium spp. in fecal samples from breast fed and bottle-fed infants with and without iron supplement // J. Clin. Microbiol.- 1987.- V 25.- P. 285-289.

74. Misra A.K., Kuila R.K. Antimicrobial substances from Bifidobacterium bifidum // Indian J. Dairy Sei.- 1995.- V 48.- P. 612-614.

75. SO.Mitsuoka T. Bifidobacteria and their role in human health // J. Ind. Microbiol.-1990.- V 6.- P. 263-268.

76. Mitsuoka T., Hayakawa K., Kimura N.The fecal flora of man. II. Communication: the composition of bifidobacterium flora of different age groups. Zbl. Bakt. Mikrobiol. Hyg. I. Abt. Orig. A.- 1974.- V 226,- P. 469-478.

77. Miyake T., Watanabe K., Watanabe T., Oyaizu H. Phylogenetic analysis of the genus Bifidobacterium and related genera based on 16S rDNA sequences // Microbiol. Immunol.- 1998.- V 42 (10).- P. 661-667.

78. Op den Camp H.J.M., Oosterhof A., Veerkamp J.H. Cell surface hydrophobicity of Bifidobacterium bifidum subsp. pennsylvanicum II Antonie Van Leeuwenhoek.-1985.-V 51.-P. 303-312.

79. Rasic' J.L., Kurmann J.A. Bifidobacteria and their role. Microbiological, nutritional-physiological, medical and technological aspects and bibliography // Experientia Suppl.- 1983.- V 39.- P. 1-295.

80. Reddy B.S., Rivenson A. Inhibitory effect of Bifidobacterium longum on colon, mammary and liver carcinogenesis induced be 2-amino-3-methylimidazo4,5-fjquinoline, a food mutagen // Cancer Res.- 1993.- V 53(17).- P. 3914-3918.

81. Requena T., Burton J., Matsuki T. et al. Identification, detection, and enumeration of human Bifidobacterium species by PCR targeting the transaldolase gene // Appl. Environ. Microbiol.- 2002.- V 68 (5).- P. 2420-2427.

82. Reuter G. The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession. Current Issues in Intestinal Microbiology.-2001.-V 2 (2).- P. 43-53.

83. Reuter G. Vergleichende Untersuchungen über die Bifídus-Flora im Sauglingsund Erwachsenensthul. Zentralbl. 1-14. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. I. Abt. Orig. 1963.-V 191.-P. 486-507.

84. Rogosa M. Genus III, Bifidobacterium Orla-Jensen // Buchanan R.E., Gibbons N.E., eds, Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th edn., Williams & Wilkins, Baltimore.- 1974.- P. 669-676.

85. Roy D., Sirois S. Molecular differentiation of Bifidobacterium species with amplified ribosomal DNA restriction analysis and alignment of short regions of the Idh gene // FEMS Microbiol. Lett.- 2000.- V 191 (1).- P. 17-24.

86. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol.Evol.- 1987.- V 4,- P. 406-425.

87. Sakata S., Kitahara M., Sakamoto M., Hayashi H., Fukuyama M. and Benno Y. Unification of Bifidobacterium infantis and Bifidobacterium suis as Bifidobacterium longum II Int. J. Syst. Evol. Microbiol.- 2002.- V 52.- P. 19451951.

88. Sakata S., Ryu C.S., Kitahara M., Sakamoto M., Hayashi H., Fukuyama M., Benno Y. Characterization of the genus Bifidobacterium by automated ribotyping and 16S rRNA gene sequences // Microbiol. Immunol.- 2006.- V 50 (1).- P. 1-10.

89. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1977.- V 74.- P. 5463-5467.

90. Satokari R.M., Vaughan E.E., Akkermans A.D.L. et al. Bifidobacterial diversity in human feces detected by genus-specific PCR and denaturing gradient gel electrophoresis // Appl. Environ. Microbiol.- 2001.- V 67 (2).- P. 504-513.

91. Satokari R.M., Vaughan E.E., Smidt H. et al. Molecular approaches for the detection and identification of Bifidobacteria and Lactobacilli in the human gastrointestinal tract // System. Appl. Microbiol.- 2003.- V 26.- P. 572-584.

92. Scardovi V. Genus Bifidobacterium Orla-Jensen // Bergey's Manual of Systematic Bacteriology.- 1984.- V. 1. ed. Kreig, N.R. and Holt, J.G. Baltimore, MD: Williams and Wilkins.- P. 1418-1434.

93. Scardovi V. Genus Bifidobacterium Orla-Jensen 1924, 472dl // Sneath P.H.A., Mair N.S., Sharpe M.E., Holt J.G., eds, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Williams and Wilkins MD, Baltimore.- 1986.-V.2.- P. 1418-1434.

94. Scardovi V. and Crociani F. Bifidobacterium catenidatum, Bifidobacterium dentium, and Bifidobacterium angidatum: three new species and their deoxyribonucleic acid homology relationships // Int. J. Syst. Bacterial.- 1974.- V 24.- P. 21-28.

95. Scardovi V. and Trovatelli L.D. The fructose-6-phosphate shunt as peculiar pattern of hexose degradation in the genus Bifidobacterium II Ann. Microbiol.-1965.-V 15.-P. 19-29.

96. Scardovi V. and Trovatelli L.D. Bifidobacterium animalis (Mitsuoka) comb. nov. and the "minimum" and "subtile"' groups of new bifidobacteria found in sewage II Int. J. Syst. Bacterid.- 1974.- V 24,- P. 21-28.

97. Scardovi V. and Zani G. Bifidobacterium magnum sp. nov., a large, acidophilic Bifidobacterium isolated from rabbit faeces // Int. J. Syst. Bacterid.-1974.-V 24.-P. 29-34.

98. Scardovi V., Zani G., Trovatelli L.D. Deoxyribonucleic acid homology among the species of the genus Bifidobacterium isolated from animals // Arch. Microbiol.- 1970.- V 72.-318-325.

99. Shimamura S., Abe F., Ishibashi N. et al. Relationship between oxygen sensitivity and oxygen metabolism of Bifidobacterium species // J. Dairy Sci.-1992,-V75.-P. 3296-3306.

100. Simpson P.J., Ross, R.P., Fitzgerald, G.F. and Stanton, C. Bifidobacterium psychraerophilum sp. nov and Aeriscardovia aeriphila gen. nov., sp. nov. isolated from a porcine caecum // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.- 2004.- V 54.- P. 401-406.

101. Smehilova M., Vilkova E., Nevoral J. Comparison of intestinal microflora in healthy infants and infants with allergic colitis // Folia Microbiol. (Praha) 2008.-V 53 (3).-P. 255-258.

102. Stackebrandt E., Goebel B.M. Taxonomic note: a place of DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology // Int. J. Syst. Bacterid.- 1994.- V 44 (4).- P. 846-849.

103. Stackebrandt E., Rainey F.A., Ward-Rainey N.L. Proposal for a new hierarchic classification system, Actinobacteria classis nov. // Int. J. Syst. Bacterid.- 1997.- V 47.- P. 479-491.

104. Talwalkar A. and Kailasapathy K. Metabolic and biochemical responses of probiotic bacteria to oxygen // J. Dairy Sci.- 2003.- V 86.- P. 2537-2546.

105. Tissier H. "Recherches sur la flore intestinale des nourrissons (Etat normal et pathologique") // Thesis, ed. Georges Carre' et C. Maud, University of Paris.-1900.- Paris, France.- P. 253.

106. Trovatelli L.D., Crociani F., Pedinotti M. and Scardovi V. Bifidobacterium pullorum sp. nov. A new species isolated from chicken faeces and a related groupof bifidobacteria isolated from rabbit faeces // Arch. Microbiol.- 1974.- V 98.- P. 187-198.

107. Vanhoutte T., De Preter V., De Brandt E. et al. Molecular monitoring of fecal microboiota of healthy human subjects during administration of lactulose and Saccharomyces boulardii II Appl. Environ. Microbiol.- 2006.- V 72 (9).- P. 5990-5997.

108. Vaugien L., Prevots F., Roques C. Bifidobacteria identification based on 16S rRNA and pyruvate kinase partial gene sequence analysis // Anaerobe.- 2002.1. V 8 (6).- P. 341-344.

109. Ventura M. and Zink R. Rapid identification, differentiation, and proposed new taxonomic classification of Bifidobacterium lactis II Appl. Environ. Microbiol.- 2002.- V 68 (12).- P. 6429-6434.

110. Vilkova E., Nevoral J., Jencikova B. et al. Detection of infant faecal bifidobacteria by enzymatic methods // J. Microbiol. Methods.- 2005.- V 60 (3).-P. 365-373.

111. Vlkova E, Rada V, Bujnakova D, Kmet V.Enumeration, isolation, and identification of bifidobacteria from infant feces // Folia Microbiol. (Praha). 2004.1. V 49 (2).- P. 209-12.

112. Ward P., Roy D. Review of molecular methods for identification, characterization and detection of bifidobacteria// Lait.- 2005.- V 85.- P.23-32.

113. Watabe J., Benno Y. and Mitsuoka T. Bifidobacterium gallinarium sp. nov.: a new species isolated from the ceca of chickens // Int. J. Syst. Bacterid.- 1983.-V33.-P. 127-132.

114. Woese C.R. Bacterial Evolution // Microbiological Reviews.- 1987.- V 51 (2).-P. 221-271.

115. Woodcock D.M., Crowther PJ, Doherty J, et al. // Nucleic Acids Res.-1989.- V 17.- P. 3469-3478.

116. XLIO-Gold® Ultracompetent Cells for Large and Ligated DNA // http://www.stratagene.com/products/displayProduct.aspx?pid=282

117. Yildirim Z., Johnson M.G. Characterization and antimicrobial spectrum of bifidocin B, a bacteriocin produced by Bifidobacterium bifidum NCFB 1454 // J. Food Prot.- 1998.-V 61.-P. 47-51.

118. Zhu L., Li W. and Dong X. Species identification of genus Bifidobacterium based on partial HSP60 gene sequences and proposal of Bifidobacterium thermacidophilum subsp. porcinum subsp. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.-2003.-V 53.-P. 1619-1623.