Новый подход к молекулярной диагностике бифидобактерий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Пиксасова, Ольга Владимировна

• Пиксасова, Ольга Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пиксасова, Ольга Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Морфология бифидобактерий.

1.2. Физиолого-биохимические характеристики бифидобактерий.

1.2.1. Отношение к кислороду.

1.2.2. Оптимум температур.

1.2.3. Оптимум кислотности.

1.2.4. Содержание Сахаров в среде и метаболизм бифидобактерий.

1.2.5. Амилазы бифидобактерий.

1.2.6. Протеазы бифидобактерий.

1.2.7. Состав клеточной стенки.

1.2.8. Образование экзополисахаридов.

1.2.9. Поверхностные протеины.

1.2.10. Образование бактериоцинов.

1.2.11. Устойчивость к желудочно-кишечному стрессу.

1.3. Таксономия бифидобактерий.

1.4. Экология и использование бифидобактерий.

1.5. Бифидобактерий как пробиотики и их использование в медицине.

1.5.1. Болезни желудочно-кишечного тракта и их профилактика с использованием бифидобактерий.

1.5.1.1. Воспалительные заболевания кишечника и синдромы ЖКТ.

1.5.1.2. Превентивная терапия диареи.

1.5.1.3. Инфекция, вызванная Helicobacter pylori, и возможные осложнения.32'

1.5.2. Пробиотики и лечение холестеролемии.

1.5.3. Рак.

1.5.4. Использование пробиотиков при коррекции атопических заболеваний.

1.5.5. Пробиотики и иммунитет слизистых оболочек.

1.6. Выделение штаммов.

1.6.1. Накопительные среды для бифидобактерий.

1.6.2. Селективные среды для бифидобактерий и используемые антибиотики.

1.6.2.1. Мупироцин.

1.6.2.2. Ципрофлоксацин.

1.7. Идентификация бифидобактерий.

1.7.1. Информация, используемая в бактериальной таксономии.

1.7.2. Методы типирования ДНК.

1.7.3. Методы, основанные на рестрикции ДНК.~.

1.7.4. Методы, основанные на полимеразной цепной реакции.

1.7.5. Секвенирование ДНК.

1.7.6. Сравнительная характеристика некоторых молекулярных методов типирования бактерий.

1.7.7. Методы видового типирования бифидобактерий.

1.7.8. Ген фруктозо-6-фосфат-фосфокетолазы бифидобактерий как молекулярная мишень.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Культуры бактерий, использованные в данном исследовании.

2.2. Питательные среды.

2.2.1. Подбор состава питательной среды.

2.2.2. Проверка селективности ципрофлоксацина в отношении микроорганизмов, не относящихся к группе бифидобактерий.

2.2.3. Проверка селективности мупироцина в отношении микроорганизмов, не относящихся к группе бифидобактерий.

2.2.4. Определение наиболее перспективного природного источника устойчивых форм бифидобактерий.

2.2.5. Приготовление растворов и красителей.

2.3. Выделение чистых культур бифидобактерий.

2.4. Хранение штаммов.

2.5. Анализ устойчивости бифидобактерий к кислороду (тест на аэротолерантность)

2.6. Определение активности фруктозо-6-фосфат-фосфокетолазы бифидобактерий.

2.7. Определение продуктов метаболизма бифидобактерий при помощи газовой хроматографии.

2.8. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH).

2.9. Молекулярные методы идентификации бифидобактерий.

2.9.1. Выделение ДНК.

2.9.2. Родоспецифическая полимеразная цепная реакция.

2.9.3. Видоспецифическая мультиплексная полимеразная цепная реакция.

2.9.4. Рестрикционный анализ.

2.9.5. Секвенирование ДНК.-.

2.9.6. Учет результатов секвенирования и филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖЕНИЕ.

3.1 Питательные среды, использованные при подборе условий культивирования.

3.1.1 Проверка сред.

3.1.2 Изменение морфологии клеток и колоний.

3.2 Аэротолерантность.

3.3 Тест на фруктозо-6-фосфат-фосфокетолазу и определение продуктов метаболизма бифидобактерий.

3.4 Результаты проведения флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) для штаммов бифидобактерий.-.-.

3.5 Молекулярные методы.

3.5.1 Родоспецифическая ПЦР.

3.5.2 Результаты рестрикционного анализа (ARDRA) и сравнение данных с результатами мультиплексной видоспецифическойПЦР.

3:5.3 Секвенирование и филогенетический анализ последовательностей генов 16S рРНК и xfp.

ВЬШОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новый подход к молекулярной диагностике бифидобактерий»

Бифидобактерии являются одними из наиболее широко используемых в производстве пробиотиков. Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) человека представляет собой комплексную экосистему, которая содержит представителей трех доменов живого: эукариоты, бактерии и археи. В норме в кишечнике преобладают бактероиды, молочнокислая микробиота (бифидобактерии и лактобактерии), анаэробные стрептококки, кишечная палочка, энтерококки и другие микроорганизмы. Концентрация микроорганизмов в толстом кишечнике человека достигает 10п

1 л

10 клеток на 1 г содержимого (Huys et al., 2008). Самые многочисленные и представители полезной микробиоты - это бифидобактерии. Вырабатывая молочную и уксусную кислоту, они препятствуют размножению патогенных микроорганизмов. Молочная кислота создает идеальную среду для работы кишечника. Бифидобактерии стимулируют перистальтику, предупреждая запоры и поносы, повышают иммунитет организма, разлагают некоторые канцерогены и вырабатывают витамины. Колонизация микробами ЖКТ человека начинается немедленно с появлением ребенка на свет и протекает под влиянием таких факторов, как питание ребенка (грудное или искусственное кормление), гигиенические условия. Одними из первых микробных колонизаторов, заселяющих кишечник ребенка, являются бифидобактерии. Однако в течение жизни численность бифидобактерии постепенно сокращается под воздействием процессов старения, стрессов и неправильного питания (Huys et al., 2008).

Согласно современной систематике известно 29 видов бифидобактерий. Большинство из описанных к настоящему времени видов бифидобактерий были выделены из ЖКТ млекопитающих, насекомых и птиц. Некоторые виды бифидобактерий, как, например, Bifidobacterium bifidum, В.breve и B.Iongiim subsp. longiim, считается, относятся к видам истинно «человеческого» происхождения. Другие — B.gallinarum, B.angulatum vi B.cimiculi — описаны как виды «животного» происхождения (Felis and Dellaglio, 2007). Некоторые виды чрезвычайно близки между собой, как, например, B.pullorum и B.gallinarum (Yin et al., 2005), другие были реклассифицированы до подвидов, как, например, B.longum subsp. infantis (German etal., 2008) или

B.animalis subsp. lactis (Ventura et ai, 2004). Представители бифидобактерий обладают разными свойствами. Многие считают, что бифидобактерии хорошо растут и развиваются в кисломолочных продуктах. На самом же деле только три вида, B.bifidum, B.Iongtim subsp. infantis и B.animalis, обладают доказанной способностью расти в молочной среде (Храмцов и др., 2003).

Бифидобактерии используются как добавка к пищевым продуктам в качестве важного компонента «функционального питания». Пробиотическое действие бифидобактерий включает в себя снижение риска возникновения инфекционных заболеваний (в том числе, бактериальной и вирусной диареи), облегчение течения хронических воспалительных заболеваний (в том числе, паучита и язвенного колита), улучшение различных аспектов физиологического состояния (в том числе, снижение уровня холестерола в крови и коррекция непереносимости лактозы) и, наконец, снижение вероятности развития зубного кариеса, аллергии, астмы и даже рака. Благодаря столь разнообразному спектру лечебно-профилактического действия бифидобактерий, на выделение из естественных природных источников и анализ новых штаммов отпущены значительные ресурсы, как со стороны коммерческих, так и научных организаций. Важно не только понять и изучить пробиотическое действие бифидобактерий, но также и накопить библиотеку штаммов, которые бы обладали этими свойствами. Поэтому работы по выделению и накоплению культур, обладающих пробиотическим потенциалом, важны и требуют приложения надёжных и быстрых методов их обнаружения и идентификации. Идентификация любого штамма всегда начинается с описания его физиолого-биохимических характеристик. Однако не всегда среди этих признаков есть такой, который позволит с уверенностью определить систематическое положение культуры хотя бы на уровне рода. Широко известен полиморфизм бифидобактерий. Далеко не так много штаммов демонстрируют образование клеток классической вилочковидной «бифидо»-формы, как это принято считать. Они часто похожи на прямые палочки, коккобациллы, образуют скопления и даже цепочки клеток. Невысокая скорость роста и неустойчивость ко многим факторам стресса, среди которых низкая кислотность среды и контакт с кислородом воздуха, затрудняет культивирование бифидобактерий в лабораторных условиях и выделение их в чистую культуру. Поэтому необходим метод анализа, позволяющий установить наличие или отсутствие бифидобактерий в образце. Высокочувствительные молекулярные методы, такие как, например, ПЦР, позволяют определять бифидобактерии в образце исходного субстрата, в накопительной и, конечно, в чистой культуре. В последние годы активно развивается область молекулярных методов в идентификация микроорганизмов. Большинство методов молекулярного анализа, как показывает опыт, пока основывается на гене малой субъединицы рибосомальной РНК бактерий, 16S рРНК, но не всегда этого оказывается достаточно. Различные исследования предлагают новые альтернативные генетические мишени для идентификации бифидобактерий, такие как гены atpD

Ventura et al, 2004), tuf (Ventura and Zink, 2003), recA (Kullen et al., 1997; Ventura and Zink, 2003), groEL (Jian et al., 2001; Ventura et al., 2006), dnaJ (Ventura et al., 2006), purF (Ventura et al., 2006), rpoC (Ventura et al., 2006), dnaB (Ventura et al., 2006), xfp (Ventura et al., 2006; Yin et al., 2005) и clpC (Ventura et al., 2005; Ventura et al., 2006) или межгенные области, используемые для видовой идентификации или мониторинга штаммов бифидобактерий, выделяемых из различных природных источников. Совокупность различных тестов, а также использование нескольких генетических мишеней, позволяет получить достоверную информацию о систематическом положении штамма, и даже о его эволюционном пути внутри группы подобных культур. Однако мультипараметрические исследования всегда лимитированы стоимостью проведения анализов. Таким образом, разработка, с одной стороны, простого, а с другой — быстрого, достоверного и недорогого метода идентификации штаммов является одним из приоритетных направлений прикладной микробиологии.

Цель и задачи исследования. Целью работы стало разработка нового подхода к детекции и идентификации штаммов бифидобактерий на уровне рода и вида с использованием в качестве молекулярной мишени гена фруктозо-б-фосфат-фосфокетолазы бифидобактерий, являющимся уникальным ферментом данной группы микроорганизмов.

В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи:

1. На основе полимеразной цепной реакции с парой праймеров в области гена xfp разработать родоспецифический тест к Bifidobacterium spp.

2. Определить специфичность данного теста в отношении бифидобактерий и показать отсутствие ложных положительных результатов с ДНК бактерий других родов.

3. Разработать метод видовой идентификации бифидобактерий на основе рестрикционного анализа фрагментов амплификации гена xfp.

4. Оценить степень вариабельности амплифицируемого участка гена xfp, с точки зрения его потенциального использования в качестве генетической мишени для идентификации изолятов бифидобактерий на основании сравнения последовательности данного участка.

5. Подобрать технологию длительного хранения штаммов бифидобактерий с сохранением активности культуры.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Пиксасова, Ольга Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Подобрана оптимальная питательная среда для устойчивого культивирования бифидобактерий. В качестве селективного компонента наиболее эффективно использование антибиотика мупироцина в конечной концентрации его 100 мкг/мл.

2. Установлено, что бифидобактерии хорошо переносят лиофильное высушивание без внесения дополнительных криопротекторных веществ, так как разработанная обогащенная бифидум-среда сама выступает в качестве криопротектора.

3. Пара праймеров Bifl64 и Bif662 к гену 16S рРНК бифидобактерий обладает специфичностью к бифидобакгериями на уровне рода и может быть использована для анализа.

4. На основе родоспецифической ПЦР с праймерами в области гена xfp , был разработан молекулярный тест для идентификации бифидобактерий, и была доказана его высокая специфичность.

5. На основе рестрикции амплифицируемого участка гена xfp был разработан видоспецифический тест для идентификации бифидобактерий, который позволяет идентифицировать виды B.adolescentis, B.longum, B.bifidum, B.animalis и подвиды B.longum subsp. longum и B.longum subsp. infantis, B.animalis subsp. animalis и B.animalis subsp. lactis.

6. На основании секвенирования участка гена xfp, амплифицируемого в новой родоспецифической ПЦР, был проведен сравнительный анализ путем построения молекулярного выравнивания и филогенетического дерева.

БЛАГОДАРНОСТИ

Прежде всего автор выражает глубочайшую признательность своему научному руководителю д.б.н., профессору А.И. Нетрусову, без участия которого эта работа не могла быть выполнена. Я благодарна коллективу лаборатории физиологии и биохимии микроорганизмов кафедры микробиологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова за всестороннюю поддержку и лично Т.А. Чердынцевой, И.Б. Котовой, М.Д. Пименовой. Я чрезвычайно признательна коллективу Государственного научного центра Института медико-биологических проблем РАН, Институту инженерной иммунологии (Любучаны), лаборатории микробиологии факультета фармацевтических наук и биологии, университета Париж Декарт (Париж, Франция) за предоставление культур и образцов ДНК культур бифидобактерий, без которых нам бы не удалось изучить такое разнообразие видов. Я также благодарна моему коллеге А.Л. Брюханову за моральную и профессиональную поддержку. Выражаю сердечную признательность всем своим друзьям и родным за поддержку во время выполнения и написания диссертационной работы, за своевременную помощь и критику.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Пиксасова, Ольга Владимировна, 2009 год

1. Богданович Т.М. и Страчунский Л.С. Мупироцин: уникальный антибиотик для местного применения //КМАХ 1999, Том 1, N1, стр. 57-65.

2. Гудков А.В. Биологическая активность бифидобактерий в молоке / А.В. Гудков и др. //Молочная промышленность. 1984. -№ 1. - С. 21-23.

3. Дедыш С.Н. Исследование экологии метанотрофных бактерий с использованием молекулярных подходов // Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Т. 13. М.: Наука, 2006. С. 192-224.

4. Коршунов В.М., Буш Б., Ильченко АА и др. Влияние ципрофлоксацина на микробиоту желудочно-кишечного тракта в эксперименте и клинике. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1991. N5. С. 14-17.

5. Нетрусов АИ., Егорова М.А, Захарчук Л.М. Практикум по микробиологии. Уч. пособие для вузов. М., Академия, 2005, 610 с.

6. Самарцев А.А. Протеолитические ферменты пробиотических микроорганизмов микробные // Биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты. Сборник научных трудов. Минск: изд. И.П. Логинов, 2007. Т.1, стр. 65-77.

7. Субботина М.Е. Разработки методики генотипирования бифидобактерий на основе двухлокусного секвенирования с целью видовой идентификации штаммов. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва, 2009.

8. Храмцов АГ., Евдокимов И. А, Рябцева С.А., Половянова АВ., Мажуга Д В. 2003. Бифидофлора в продуктах питания // Вестник СевКавГТУ, серия «Продовольствие». 1: 1-9.

9. Abbad AS., Talbaoui Н., Marczak R. and Bonaly R. 1995. Isolation and characterization of exocellular polysaccharides produced by Bifidobacterium longum И Appl. Microbiol. Biotechnol. 43: 995-1000.

10. Abd El-Gawad I. A, El-Sayed E. M., Hafez S. A, El-Zeini H.M., and Saleh F.A. 2005. The hypocholesterolaemic effect of milk yoghurt and soy-yoghurt containing bifidobacteria in rats fed on a cholesterol-enriched diet // Int. Dairy J. 15: 37—44.

11. Ahn Y.T., Kim G.B., Lim K.S., Baek Y.J. and Kim H.U. 2003. Deconjugation of bile salts by Lactobacillus acidophilus isolates // Int. Dairy J. 13: 303-311.

12. Aso Y., Akaza H., Kotake Т., Tsukamoto Т., Imai K., and Naito S. 1995. Preventive effect of a Lactobacillus casei preparation on the recurrence of superficial bladder cancer in a double-blind trial // The BLP Study Group. Eur. Urol. 27:104-109.

13. Barrett E., Ross R. P., Fitzgerald G. F., and Stanton C. 2007. Rapid screening method for analysing the conjugated linoleic acid production capabilities of bacterial cultures // Appl. Environ. Microbiol. 73: 2333-2337.

14. Berthoud H., Chavagnat F., Haueter M. and Casey M.G. 2005. Comparison of partial gene sequences encoding a phosphoketolase for the identification of bifidobacteria // Lebensm. Wiss. Technol. 38: 101-105.

15. Biavati В., Sgorbati В., Scardovi V. 1992. The genus Bifidobacterium. In: Barlows, A., Truper, H.G., Dworkin, M., Harder, W. (Eds.), The Procaryotes. A Handbook on the Biology of Bacteria, Vol. 1. Springer, New York, pp. 816-833.

16. Biavati B. and Mattarelli P. 2006. The family Bifidobacteriaceae. In M. Dworkin, S. Falkow, E. Rosenberg, K.-H. Schleifer, and E. Stackebrandt (Eds.), The Prokaryotes (3: 322-382). New York, USA: Springer.

17. Candela M., Vitali В., Matteuzzi D., and Brigidi P. 2004. Evaluation of the rrn operon copy in Bifidobacterium using real-time PCR // Lett. Appl. Microbiol. 38: 229-232.

18. Carey С. M., Kirk J. L., Ojha S., and Kostrzynska M. 2007. Current and future uses of real-time polymerase chain reaction and microarrays in the study of intestinal microbiota, and probiotic use and effectiveness // Can. J. Microbiol. 53: 537—550.

19. Charteris W.P., Kelly P.M., Morelli L. and Collins J.K. 1998. Antibiotic susceptibility of potentially probiotic Bifidobacterium isolates from the human gastrointestinal tract // Lett. Appl. Microbiol. 26: 333-337.

20. Chevalier P., Roy D. and Ward P. 1990. Detection of Bifidobacterium species by enzymatic methods //J. Appl. Bacterid. 68: 619-624.s

21. Chung H.S., Kim Y.B., Chun S. L., and Ji G.E. 1999. Screening and selection of acid and bile resistant bifidobacteria // Int. J. Food Microbiol. 47: 25-32.

22. Cotter P. D., and Hill C. 2003. Surviving the acid test: responses of grampositive bacteria to low pH // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67: 429-453.

23. Creagh S., and Lucey B. 2007. Interpretive criteria for mupirocin susceptibility testing of Staphylococcus spp. using CLSI guidelines // Br. J. Biomed. Sci. 64: 1-5.

24. Cummins C.S., and Harris H. 1956. The chemical composition of the cell wall in some gram positive bacteria and its possible value as a taxonomic character // J. Gen. Microbiol. 14: 583-600.

25. Dittmann J., Mayer J. В., and Huber P. 1967. Zum Stoffwechsel des Bacterium bifidum H X. Bildung van Athanol. Z. Kinderheilk. 99: 115-118.

26. Doncheva N.I., Antov G.P., Softova E.B., and Nyagolov Y.P. 2002. Experimental and clinical study on the hypolipidemic and antisclerotic effect of Lactobacillus bulgaricus strain GB N 1 (48) //Nutr. Res. 22: 393^103.

27. Dong X., Xin Y., Jian W., Liu X., and Ling D. 2000. Bifidobacterium thermacidophilum sp. nov., isolated from an anaerobic digester//Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50: 119-125.

28. Eggerth A. H. 1935. The gram-positive nonspore-bearing anaerobic bacilli of human feces//J. Bacteriol. 30: 277-299.

29. El-Nezami H., Mykkanen H., Kankaanpaa P., Salminen S., and Ahokas J. 2000. Ability of Lactobacillus and Propionibacterium strains to remove aflatoxin B, from the chicken duodenum // J. Food Prot. 63: 549-552.

30. Felis G.E. and Dellaglio F. 2007. Taxonomy of lactobacilli and bifidobacteria // Curr. Iss. Intest. Microbiol. 8: 44-61.

31. Garrity G.M., Bell J.A., and Lilburn T.G. 2004. Taxonomic outline of the procaryotes. Bergey's manual of systematic bacteriology, 2nd edition, Release 5.0, Springer-Verlag, New York. DOI: http.//dx.doi.org/10 1007/bergeysoutline200405.

32. German J.B., Freeman S.L., Lebrilla C.B., Mills D A. 2008. Human milk oligosaccharides: evolution, structures and bioselectivity as substrates for intestinal bacteria //Nestle Nutritional Workshop Ser Pediatr Program, 62: 205-222.

33. Gill H.S. and Guarner F. 2004. Probiotics and human health: a clinical perspective // Postgrad Med J 80 516-526

34. Glockner F О , Amann R, Alfreider A., Pemthaler J., Psenner R., Trebesius K., Schleifer K.-H 1996 An in situ hybridization protocol for detection and identification of planctonic bacteria // Syst Appl. Microbiol. 19: 403-406.

35. Gueimonde M, Tolkko S., Korpimaki Т., and Salminen S. 2004. New real-time quantitative PCR procedure for quantification of bifidobacteria in human fecal samples // Appl. Environ. Microbiol. 70: 4165-4169.

36. Hamilton-Miller J.M.T. 2004. Probiotics and prebiotics in the elderly // Postgrad. Med. J. 80- 447-451.

37. Hartemink R., Кок В .J., Weenk G.H., Rombouts F.-M. 1996. RB agar, a new selective medium for bifidobacteria // J. Microbiol. Meth. 27: 33-43.

38. Hassinen J. В., Durbin G. Т., Tomarelli R. M., and Bemhart F. W. 1951. The minimal nutritional requirements of Lactobacillus bifidus II J. Bacteriol. 62: 771-777.

39. Hosoda M., Hashimoto H., He F., Morita HL, and Hosono A. 1996. Effect of administration- of milk fermented with Lactobacillus acidophilus LA-2 on fecal mutagenicity and microflora in the human intestine // J. Dairy Sci. 79: 745-749.

40. Hurwitz J. 1958. Pentose phosphate cleavage by Leuconostoc mesenteroides И Biochim. Biophys. Acta 28: 599-602.

41. Jett B.D., Huycke M.M., Gilmore M.S. 1994. Virulence of enterococci // Clin. Microbiol. Rev. 7: 462-478.

42. Jian W., Zhu L., and Dong X. 2001. New approach to phylogenetic analysis of the genus Bifidobacterium based on partial HSP60 gene sequences // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 633-1638.

43. Kalliomaki M., Salminen S., Arvilommt H., Kero P., Koskinen P., and Isolauri E. 2001. Probiotics in primary prevention of atopic disease: a randomized placebo-controlled trial //Lancet 357: 1076-1079.

44. Kandler O. 1970. Amino acid sequence of the murein and taxonomy of the genera Lactobacillus, Bifidobacterium, Leuconostoc and Pediococcus // Int. J. Syst. Bacterid. 20: 491-507.

45. Kim G.B., Miyamoto C.M., Meighen E.A., and Lee B.H. 2004. Cloning and characterization of the bile salt hydrolase genes (bsh) from Bifidobacterium bifidum strains // Appl. Environ. Microbiol. 70: 5603-5612.

46. Kitts C.L. 2001. Terminal restriction fragment patterns', a tool for comparing microbial communities and assessing community dynamics // Curr. Iss. Intest. Microbiol. 2: 17-25.

47. Klijn A., Mercenier A., Arigoni F. 2005. Lessons from the genomes of bifidobacteria // FEMS Microbiol. Rev. 29: 491-509.

48. Kullen M. J., Brady L.J., and O'Sullivan DJ. 1997. Evaluation of using a short region of the recA gene for rapid and sensitive speciation of dominant bifidobacteria in the human large intestine//FEMS Microbiol. Lett. 154: 377-383.

49. Lee D.-H., Zo Y.-G., and Kim S.-J. 1996. Nonradioactive method to study genetic profiles of natural bacterial communities by PCR-single-strand-conformation polymorphism// Appl. Environ. Microbiol. 62: 3112-3120.

50. Ljungh A., and T. Wadstrom. 2006. Lactic Acid Bacteria as Probiotics // Curr. Iss. Intest. Microbiol. 7: 73-90.

51. Malyoth G., and Bauer A. 1950. Beobachtungen am Bacterium bifidum II Z. Kinderheilkd. 68: 358-367.

52. Masco L., Huys G., De Brandt E., Temmerman R., and Swings J. 2005. Culture dependent and culture independent qualitative analysis of probiotic products claimed to contain bifidobacteria // Int. J. Food Microbiol. 102: 221- 230.

53. Masco L., Van Hoord K., De Brandt E., Swings J., and Huys G. 2006. Antimicrobial susceptibility of Bifidobacterium strains from humans, animals and probiotic products // J. Antimicrob. Chemother. 58: 85-94.

54. Matsuki Т., Watanabe K., and Tanaka R. 2003. Genus- and species-specific PCR primers for the detection and identification of bifidobacteria // Curr. Issues Intest. Microbiol. 4:61.69.

55. Miyake Т., Wanatabe K., Wanatabe Т., and Oyaizu H. 1998. Phylogenetic analysis of the Genus Bifidobacterium and related genera based on 16S rDNA sequences // Microbiol. Immunol. 42: 661-667.

56. Meile L., Rohr L.M., Geissmann T.A., Herensperger M. and Teuber M. 2001. Characterization of the D-xylulose 5-phosphate/D-fructose 6-phosphate phosphoketolase gene (xfp) from Bifidobacterium lactis II J. Bacterid. 183:2929-2936.

57. Nebra Y. and A.R. Blanch. 1999. A new selective medium for Bifidobacterium spp. // Appl. Environ. Microbiol. 65 (11): 5173-5176.

58. Nicholas R.O., Вепу V., Hunter P.A., Kelly J.A. 1999. The antifungal activity of mupirocin // J. Antimicrob. Chemother. 43(4): 579 -582.

59. Norris R. F., Flanders Т., Tomarelli R.M., and Gyorgy P. 1950. The isolation and cultivation of Lactobacillus bifidus. A comparison of branched and unbranched strains // J. Bacterid. 60: 681-696.

60. Nyren, P. 2007. The history of pyrosequencing // Methods Mol Biology, 373: 1-14.

61. Oatley J.T., Rarick M.D., Ji G.E., and Linz J.E. 2000. Binding of aflatoxin B1 to bifidobacteria in vitro // J Food Prat. 63: 1133-1136.

62. O'Brien P J., Glick M.C., and Zilliken F. 1960. Acidic amino-sugars from bacterial. Incorporation of l-14C.-a, P-methyl-N-acetyl-D-glucosaminide into muramic acid // Biochim. Biophys Acta 37: 357-360.

63. Ott S.J., Musfeldt M., Wenderoth D.F., HampeJ., Brant O., FolschU.R., Timmis K.N., Schreiber S. 2004. Reduction in diversity of the colonic mucosa associated bacterial microflora in patients with active inflammatory bowel disease // Gut 53- 685-693.

64. Pacher В., and Kneifel W. 1996. Development of a culture medium for detection and enumeration of bifidobacteria in fermented milk products // Int. Dairy J. 6: 43-64.

65. Payne W. J. 1973. Reduction of nitrogenous oxides by microorganisms // Bacterid. Rev. 37: 409-452.

66. Poupard J. A., Husain I., Norris R.F. 1973. Biology of the bifidobacteria // Bacterid. Rev. 37: 136-165.

67. Prasad J., Gill H., Smart J., and Gopal P.K. 1998. Selection and characterization of Lactobacillus and Bifidobacterium strains for use as probiotics // Int Dairy J. 8:9931002.

68. Rachman M., Noble W.C., Cookson B.D. 1987. Mupirocin resistant Staphylococcus aureus П Lancet 2: 387.

69. Rada V., and Petr J. 2000. A new selective medium for the isolation of glucose nonfermenting bifidobacteria from hen caeca// J. Microbiol. Meth. 43: 127-132.

70. Reid G., J. Jass, T. Sebulsky., J.K. McCormick. 2003. Potential Uses of Probiotics in Clinical Practice // Clin. Microbiol. Rev. 16: 658-672.

71. Reid G. 2006. Probiotics to prevent the need for, and augment the use of, antibiotics // Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 17: 291-295.

72. Rolfs A., Schuller I., Finckh U., and Weber-Rolfs I. Detection of single base changes using PCR//in PCR: Clinical Diagnostics and Research, A. Rolfs, I. Schuller, U. Finckh, and I. Weber-Rolfs, Eds., Springer, Berlin, Germany, 1992.

73. Ronaghi M., Karamohamed S., Pettersson В., Uhlen M., Nyren P. 1996. Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release// Analyt. Biochem. 242: 84.

74. Ryan S.M., Fitzgerald G.F., and van Sinderen D. 2006. Screening for and identification of starch- amylopectin-, and pullulan-degrading Activities in bifidobacterial strains // Appl. Environ. Microbiol. 72: 5289-5296.

75. Sakata S., Kitahara M., Sakamoto M., Hayashi H., Fukuyamam M., and Benno, Y. 2002. Unification of Bifidobacterium infantis and Bifidobacterium suis as Bifidobacterium longumf/Ш. J. Syst. Evol. Microbiol. 52: 1945-1951.

76. Sakata S., Ryu C.S., Kitahara M., Sakamoto M, Hayashi M., Fukuyama M., and Benno Y. 2006. Characterization of the genus Bifidobacterium by automated ribotyping and 16S rRNAgene sequences//Microbiol. Immunol. 50: 1—10.

77. Scardovi V. and Trovatelli L.D. 1965. The fructose-6-phosphate shunt as peculiar pattern of hexose degradation in the genus Bifidobacterium II Annali di Microbiologia ed Enzymologie 15: 19-29.

78. Scardovi V., Sgorbati В., and Zani G. 1971. Starch gel electrophoresis of fructose-6-phosphate phosphoketolase in the genus Bifidobacterium // J. Bacterid. 106: 1036-1039.

79. Scardovi V. 1986. Genus Bifidobacterium, p. 1418-1434. In P. H. A. Sneath, N. S. Mair, M. E. Sharpe, and J. G. Holt (ed.), Bergey's manual of systematic bacteriology, vol. 2. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Md.

80. Schramm M., Klybal V., and Racker E. 1958. Phosphorolytic cleavage of fructose-6-phosphate by fructose-6-phosphate phosphoketolase from Acetobacter xylinum II J. Biol. Chem. 233: 1283-1288.

81. Sgorbati В., Lenaz G. and Casalicchio F. 1976. Purification and properties of two fructose-6-phosphate phosphoketolases in Bifidobacterium II Antonie van Leeuwenhoek 42: 49-57.

82. Solano-Aguilar G., Dawson H., Restrepo M., Andrews K., Vinyard В., Joseph F. 2008. Urban detection of Bifidobacterium animalis subsp. lactis (ВЫ2) in the intestine after feeding of sows and their piglets // Appl. Environ. Microbiol. 74: 6338-6347.

83. Shu Q., Lin H., Rutherford K.J., Fenwick S.G., Prasad J., Gopal PK, Gill H.S. 2000. Dietary Bifidobacterium lactis HN019 enhances resistance to oral Salmonella typhimurium infection in mice // Microbiol. Immunol. 44: 213 — 222.

84. Talwalkar A, and Kailasapathy K. 2004. The role of oxygen in the viability of probiotic bacteria with reference to L.acidophilus and Bifidobacterium spp. // Curr. Issues Intest. Microbiol. 5: 1-8.

85. Thitaram S.N., Siragusa G.R., Hinton A.Jr. 2005. Bifidobacterium-selective isolation and enumeration from chicken caeca by a modified oligosaccharide antibiotic-selective agar medium // Lett. Appl. Microbiol., 41: 355.

86. Twomey D., Ross R.P., Ryan M., Meaney В., and Hill C. 2005. Lantibiotics produced by lactic acid bacteria: structure, function and applications // Antimicrob. Agents Chemother. 49: 2606-2611.

87. Veerkamp J. H., Lambert R., and Saito Y. 1965. The composition of the cell wall of Lactobacillus bifidus var. pennsylvanicus II Arch. Biochem. Biophys. 112:120-125.

88. Veerkamp J. H. 1969. Uptake and metabolism of derivatives of 2-deoxy-2-amino-D-glucose in Bifidobacterium bifidum var. pennsylvanicus // Arch. Biochem. Biophys. 129: 248-256.

89. Ventura M., and Zink R. 2002. Rapid identification, differentiation and proposed new taxonomic classification of Bifidobacterium lactis // Appl. Environ. Microbiol. 68: 6429-6434.

90. Ventura M., Fitzgerald G.F., and van Sinderen D. 2005 (1). Genetic and transcriptional organization of the clpC locus in Bifidobacterium breve UCC 2003 // Appl. Environ. Microbiol. 71: 6282-6291.

91. Ventura M., Canchaya C., Del Casale A., Dellaglio F., Neviani E., Fitzgerald G.F. and van Sinderen D. 2006. Analysis of bifidobacterial evolution using a multilocus approach // Int. J. Sys. Evol. Microbiol. 56: 2783-2792.

92. Ventura, M., Canchaya C., Tauch A., Chandra G., Fitzgerald G.F., Chater K.F., and van Sinderen D. 2007. Genomics of Actinobacteria: Tracing the evolutionary history of an ancient phylum // Microbiol. Molecular Biol. Rev. 71: 495—548.

93. Watson J. L., and McKay D.M. 2006. The immunophysiological impact of bacterial CpGDNA on the gut // Clin. Chim. Acta 364: 1-11.

94. Woese C. R. 1987. Bacterial evolution // Microbiol. Rev. 51: 221-271.

95. Wolin M. J. 1964. Fructose-l,6-diphosphate requirement of streptococcal lactic dehydrogenases // Science 146: 775-777.

96. Yamazaki S., Kaneko Т., Taketomo N., Kano K.and Ikeda T. 2002. 2-Amino-3-carboxy-l,4-naphthoquinone affects the end-product profile of bifidobacteria through the mediated oxidation of NAD(P)H // Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 72-78.

97. Youn S. Y., Seo J.M., and Ji G.E. 2008. Evaluation of the PCR method for identification of Bifidobacterium species//Lett. Appl. Microbiol. 46: 7-13.

98. Zhu L., Li W.and Dong X. 2003. Species identification of genus Bifidobacterium based on partial HSP60 gene sequences and proposal of Bifidobacterium thermacidophilum subsp.porcinum subsp. nov. //Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 16191623.