Генотипирование штаммов бактерий рода Bifidobacterium и рода Legionella на основе секвенирования нескольких фрагментов генома тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Кунда, Марина Сергеевна

• Кунда, Марина Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кунда, Марина Сергеевна

Введение

Цель и задачи исследования.

Список сокращений

Глава 1. Обзор литературы

Раздел 1.1. Бифидобактерии

Раздел 1.2. Легионеллы

Раздел 1.3. Идентификация и классификация 32 микроорганизмов с использованием молекулярно-генетических методов.

Раздел 1.4. Серологические методы

Глава 2. Материалы и методы исследования

Раздел 2.1. Материалы

Раздел 2.2. Методы исследования

Глава 3. Результаты и обсуждение

Раздел 3.1 Определение видовой принадлежности бактерий 70 рода Bifidobacterium, выделенных из кишечника детей раннего возраста

Раздел 3.2 Генотипирование бактерий рода Legionella

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генотипирование штаммов бактерий рода Bifidobacterium и рода Legionella на основе секвенирования нескольких фрагментов генома»

Дифференциация штаммов и видов , микроорганизмов - актуальная задача микробиологии и эпидемиологии. Методы идентификации бактерий, основанные на фенотипических признаках, ПЦР, фрагмент-анализе в большинстве случаев не характеризуются высоким значением коэффициента дифференциации, воспроизводимостью, требуют применения в каждом эксперименте референсных штаммов. Генотипирование на основе секвенирования фрагментов генома микроорганизмов свободно от указанных недостатков, что открывает более широкие возможности в идентификации штаммов.

Анализ последовательности 16S рДНК, проведенный Woese С. [123, 124], Stackebrandt Е. [103] и другими исследователями, стал основой филогении доменов Bacteria uArchaea. Однако возможности данной мишени ограничены, поскольку с ее помощью нельзя различить генетически близкородственные виды и штаммы одного вида бактерий. Для решения этого вопроса были разработаны другие подходы, например, метод генотипирования на основе мультилокусного секвенирования (multilocus sequencing, MLST) [77]. В настоящее время протоколы MLST используют для генотипирования 25 различных групп микроорганизмов. Один из них для штаммов бактерий вида Legionella pneumophila был разработан представителями Европейской рабочей группы по легионеллезу (EWGLI, European Working Group for Legionella Infections).

Преимущества MLST заключаются в том, что, во-первых, оперируя «housekeeping» генами, эволюционирующими медленно и являющимися селективно нейтральными, этот метод различает штаммы по длительно сохраняющимся изменениям в геноме. Во-вторых, в рамках описываемого подхода можно создавать базы данных о штаммах на основе секвенированных аллелей, анализировать их и прогнозировать вирулентность, резистентность к антибиотикам и другие значимые свойства изолятов. В связи с вышесказанным, применение MLST для анализа штаммов бактерий открывает новые перспективы в исследованиях как молекулярно-биологического, так и эпидемиологического направления.

Нестабильность экологической обстановки в условиях техногенной цивилизации вызывает существенные изменения в составе микробиома человека и видовом разнообразии потенциально опасных микроорганизмов в окружающей среде. В качестве моделей для изучения популяционного и динамического разнообразия бактерий на основе секвенирования нескольких локусов генома и выработки последующих рекомендаций по экологическому и эпидемиологическому мониторингу нами были выбраны микроорганизмы - представители внутренней среды организма человека (род Bifidobacterium) и окружающей среды (род Legionella).

Бактерии рода Bifidobacterium - важный компонент микрофлоры кишечника детей раннего возраста. Они участвуют в утилизации пищевых субстратов, синтезируют витамины (витамин К, пантотеновую кислоту, витамины группы В), способствуют защите от патогенных микроорганизмов, обладают иммуномодулирующим действием. Присутствие В: infantis в ЖКТ с первых дней развития ребенка оказывает положительное влияние на формирование всех систем организма. Изменения в составе бифидофлоры приводят к проявлению аллергических реакций. Своевременная коррекция видового состава с помощью синбиотических препаратов и оценка ее эффективности может быть проведена только на основе информации о первоначальном и последующем состоянии бифидофлоры ребенка. Для выполнения такого исследования необходим метод секвенирования нескольких локусов генома.

Бактерии рода Legionella - возбудители легионеллезной инфекции. Только за период с 1997 года по май 2008 год они стали причиной 51 вспышки болезни легионеров. Принимая во внимание эпидемиологическую опасность бактерий рода Legionella, в 2008 г. В РФ были усовершенствованы методы эпидемиологического надзора за легионеллезной инфекцией. Роспотребнадзором утверждены методические указания (МУК) по микробиологическому мониторингу систем, согласно которым особое внимание необходимо уделять искусственным водным системам с большим количеством циркулирующей теплой воды в сочетании с образованием водного аэрозоля [17]. Для выполнения требований МУК необходимы анализ популяционного разнообразия штаммов рода Legionella на территории РФ и оценка их эпидемиологической значимости.

Таким образом, представляется актуальным мониторинг видового разнообразия бифидо бактерий и популяционного разнообразия штаммов рода Legionella, выделенных на территории РФ на основе эффективного метода многолокусного секвенирования.

Цель исследования:

Оценить популяционное и динамическое разнообразие бактерий внутренней среды человеческого организма и окружающей среды на примере бактерий рода Bifidobacterium и Legionella с использованием метода мультилокусного секвенирования.

Задачи исследования:

1. Изучить видовое разнообразие бифидофлоры группы клинически здоровых детей раннего возраста

2. Проследить становление бифидофлоры детей раннего возраста после воздействия синбиотического препарата «Бифидум-Мульти-1»

3. На основе методов мультилокусного секвенирования и серотипирования с использованием моноклональных антител разработать систему ведения и контроля отечественной коллекции легионелл

4. Изучить популяционное разнообразие штаммов L. pneumophila в потенциально опасных водных системах РФ (градирнях и системах водоснабжения). Выявить характерные для штаммов РФ кластеры аллельных профилей и проследить взаимосвязь между ними.

5. На основе сравнения аллельных профилей выделенных штаммов РФ и клинических изолятов базы данных EWGLI, а также результатов серологического типирования оценить потенциальную опасность штаммов L. pneumophila для человека.

Список сокращений, используемых в тексте 16S рРНК - 16S рибосомальная РНК tal (transaldolase) - трансальдолаза

FHHMB - Federal Human Host Microflora Bank - Государственная коллекция микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора

АТСС (American Type Culture Collection) - американская коллекция типовых культур

DSM (Deutsche Sammlung von Microorganismen and Zellkulturen) - немецкая коллекция микроорганизмов

JCM (Japan Culture Collection of Microorganism) - японская коллекция микроорганизмов

EWGLI (European Working Group for Legionella Infections) - Европейская рабочая группа по легионеллезу

EULV - номер штамма в коллекции EWGLI dNTP - дезоксирибонуклеозидтрифосфаты ddNTP - дидезоксирибонуклеозидтрифосфаты ST ( Sequence Туре) - тип секвенирования ЖКТ - желудочно-кишечный тракт ПЦР - полимеразная цепная реакция ПААГ - полиакриламидный гель ЭФ - электрофорез УФ - ультрафиолет

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Кунда, Марина Сергеевна

ВЫВОДЫ:

1. В группе отобранных клинически здоровых детей раннего возраста, находившихся на грудном вскармливании и далее смешанном по возрасту, рожденных от клинически здоровых матерей, в культивируемой бифидофлоре отсутствуют бактерии вида В. infantis. В бифидофлоре преобладают бифидобактерии видов В. bifidum (36%), В. pseudocatenulatum (29%) и В. adolescentis (21%). У половины обследованных детей бифидофлора представлена двумя и более видами.

2. Синбиотический препарат «Бифидум-Мульти-1» стимулирует развитие собственной бифидофлоры у детей, ранее не имевших культивируемой бифидофлоры. Прослеженная в работе смена видового состава бифидобактерий в процессе становления бифидофлоры аналогична таковой, зарегистрированной при формировании сукцессионных рядов биоценоза кишечника детей в возрасте 3-12 недель.

3. На основе методов мультилокусного секвенирования и серотипирования с использованием моноклональных антител разработаны система и принципы ведения и контроля отечественной коллекции легионелл.

4. При мониторинге потенциально опасных водных объектов установлено генетическое единообразие штаммов систем водоснабжения из разных регионов страны; большое разнообразие аллельных профилей популяции штаммов градирен, среди которых выделено 2 основных кластера штаммов, относящихся к типами секвенирования 7 и 324. На основе филогенетического анализа продемонстрировано сходство аллельных профилей ряда штаммов градирен и систем водоснабжения РФ.

5. Наибольшую потенциальную опасность представляют штаммы градирен и автономной системы водоснабжения Московского региона со следующими типами секвенирования: 7, 59, 308, 320, 324, 498, 521, 522. Особая потенциальная опасность для штаммов с типами секвенирования 498 и 521 подтверждена с помощью серологического анализа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, результаты проведенного исследования послужили еще одним доказательством того, что типирование на основе секвенирования нескольких фрагментов генома является эффективным инструментом для выявления видового разнообразия микроорганизмов и позволяет различать штаммы в пределах одного вида.

При идентификации вида микроорганизмов количество используемых для секвенирования мишеней зависит от степени родства видов внутри рода. Близкородственные виды бифидобактерий не различимы по одной мишени как 16S рДНК, так и по фрагментам операционных генов. Только двухлокусное секвенирование позволило различить виды В. longum - В. infantis, В. catenulatum - В. pseudocatenulatum. Эффективность такой схемы подтвердило проведенное нами исследование видового разнообразия бифидофлоры клинически здоровых детей раннего возраста. Анализ штаммов бифидобактерий на основе двухлокусного секвенирования позволил также доказать стимуляцию развития собственной бифидофлоры детей синбиотиком «Бифидум-Мульти-1» и проследить смену видового состава бифидобактерий при последующем формировании биоценоза кишечника.

Дифференциация штаммов одного вида микроорганизмов требует, как отмечалось выше, более подробной схемы идентификации - MLST.

Применение протокола MLST, разработанного EWGLI., позволило нам разделить 97 штаммов L. pneumophila, выделенных на территории РФ в 2005 - 2008 гг. на 42 ST. Дифференцирующая способность выбранного протокола была подтверждена также анализом штаммов L. pneumophila панели №5 EWGLI.

Благодаря использованию вышеуказанного метода, мы показали высокую популяционную изменчивость штаммов градирен и установили возможность переноса штаммов этих объектов с аэрозолем воздуха в системы водоснабжения, подтвердив потенциальную опасность таких искусственных водных систем.

Точная идентификация штаммов посредством схемы MLST позволила проследить штаммы, характерные для грунтовых вод, на всей проанализированной территории РФ.

Применение многолокусного секвенирования предоставило возможность провести систематизацию коллекционного материала GICL и дополнить уже существующие характеристики штаммов данными об их генетическом разнообразии.

Большое значение для эпидемиологической характеристики выделенных штаммов имеет возможность апелляции к базе данных EWGLI, содержащей информацию о 2735 изолятах 35 стран мира. Наличие большого количества аналогов среди клинических изолятов у штаммов с ST 7, 320, 521 и 498 позволило предположить, что они являются потенциально опасными для здоровья населения.

Серологическая характеристика штаммов L. pneumophila с помощью Mab Дрезденской панели подтвердила потенциальную опасность штаммов GICL 50: Pyshma-24, GICL 119: Pyshma-67, GICL 100: Khimki-1 и GICL 104: Khimki-5. Использование дополнительной характеристики повысило коэффициент дискриминации штаммов в выполненном исследовании. Он составил 0,96 для всей проанализированной выборки.

Проведенная нами работа продемонстрировала многогранные возможности типирования на основе секвенирования нескольких фрагментов генома не только при идентификации видов и штаммов микроорганизмов рода Bifidobacterium и Legionella, но и при анализе полученных аллельных профилей, которые являются самостоятельным объектом исследования. i i i

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кунда, Марина Сергеевна, 2009 год

1. Алпеева И.С. Анионные пероксидазы и их применение в биоанализе. Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук. Москва, 2007.

2. Амерханова A.M., Лаврова А.Е., Дмитриева В.Г., Пырикова И.А., Зубкова Е.С., Жиленкова О.Г., Кураленко А.А. Опыт применения БАД к пище «Бифидобактерии мульти» в педиатрической практике. Вестник Российской АМН, 2005, 12: 30-32.

3. Антонов АС. Геномика и геносистематика. Природа. 1999,6: 19-26.

4. Белозерский АН. Нуклеиновые кислоты и их связь с эволюцией, филогенией и систематикой организмов. (Пленарная лекция). Второй всесоюзный биохимический съезд 1969.

5. Вылегжанина У. Джинн из трубы Российская газета. 2008, 4707. http://mv\v.rg.ru/2008/07/16/reg-ui-al/legionelez.html

6. Газарян И. Г., Хушпульян Д. М., Тишков В. И. Особенности структуры и механизма действия пероксидаз растений. Успехи биологической химии. 2006, 46: 303-322.

7. Гончарова Г.И. Бифидофлора человека и необходимость ее оптимизации. Сборник научных трудов «Бифидобактерии и их использование в клинике, медицинской промышленности и сельском хозяйстве». М.; 1986: 10-17.

8. Гусев М. В., Л. А Минеева А. Микробиология. М.; Издательство Московского университета, 1992.

9. Жизнь растений. Введение. Бактерии и актиномицеты. Под ред. Красильникова Н.А., Уранова А.А. М.; Просвещение, 1974.

10. Карзанова М.Е., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы. Доклады РАСХН, 2006, 5: 9-12.

11. П.Книрель Ю.А. Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. I. Общая характеристика липополисахаридов и структура липида А (обзор). Биохимия. 1993, 58(2): 166-181.

12. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. II. Структура кора (обзор). Биохимия. 1993, 58(2): 182-201.

13. Легионеллёз. Роспотребнадзор. http://marirpn.ru/index.php?option=comcontent&task=vicw&id=501&Itemid=267

14. Лисукова Т., Чекалина К. Легионеллез. Сестринское дело. 2000, 6. //http://medi.ru/doc/7100621.htm.

15. Методические рекомендации. Клиника, лечение и диагносика легионеллеза (ут. Минздравом РСФСР 02.01.1987)

16. Методические указания по выявлению бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды. МУК 4.2.2217—07.

17. Методические указания. Эпидемиологический надзор за легионеллезной инфекцией. МУ 3.1.2.2412-08.

18. Остерман. Л. А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлекгрофорезом и радиоизотопными методами М.; Наука, 1983.

19. Тартаковский И.С. Современные подходы к диагностике атипичных пневмоний. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2000,2(1): 60-68.

20. Тартаковский И.С., Синопальников АИ. Легионеллез: роль в инфекционной патологии человека. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001,3(1): 4-16.

21. Томов А Легионеллез. София; Медицина и физкультура, 1986

22. Шкопоров А.Н., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. Бифидобактерии: традиционный взгляд и современные генетические исследования. Вопросы практической педиатрии. 2007; 2 (5): 76-79.

23. Amemura-Maekawa J., Kura F., Chang В. and Watanabe H. Legionella pneumophila serogroup 1 isolates from cooling towers in Japan form a distinct genetic cluster. Microbiol. Immunol. 2005, 49(2): 1027-1033.

24. Benno Y., Sawada К., Mitsuoka Т. The intestinal microflora of infants: composition of fecal flora in breast-fed and bottle-fed infants. Microbiol. Immunol. 1984; 28: 975-986.

25. Benson R.F., Thacker W.L., Wilkinson H.W., Fallon R.J., Brenner D.J. Legionella pneumophila serogroup 14 isolated from patients with fatal pneumonia. Journal of clinical microbiology. 1988, 26(2): 382.

26. Biavati В., Castagnoli P., Crociani F., Trovatelli L.D. Species of the Bifidobacterium in the feces of infants. Microbiologica. 1984; 7(4): 341-5.

27. Biavati В., Mattarelli P. Bifidobacterium ruminantium sp. nov. and Bifidobacterium rnerycicum sp. nov. from the rumens of cattle. International journal of systematic bacteriology. 1991, 41(1): 163-168.

28. Biavati В., Vescovo M., Torriani S., Bottazzi V. Bifidobacteria: history, ecology, physiology and applications. Annals of Microbiology. 2000, 50: 117-131.

29. Breed R.S., Murray E.G.D., Smith N.R., eds. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7th edn., Williams & Wilkins, Baltimore. 1957.

30. Bibb W.F., Arnow P.M., Dellinger D.L., Perryman S.R. Isolation and characterization of a seventh serogroup of Legionella pneumophila. Journal of clinical microbiology. 1983, 17(2): 346-348.

31. Bissett M.L., Lee J.O., Lindquist D.S. New serogroup of Legionella pneumophila, serogroup 8. Journal of clinical microbiology. 1983, 17(5): 887-891.

32. Bonjoch X., Balleste' E., R. Blanch A. Multiplex PCR with 16S rRNA gene-targeted primers of Bifidobacterium spp. to identify sources of fecal pollution. Applied and environmenyal microbiology. 2004, 70(5): 3171-3175.

33. Brodie E.L., De Santis T.Z., Moberg Parker J.P. et al. PNAS 2007; 104(1): 299-304.

34. Charteris W.P., Kelly P.M., Morelli L., Collins J.K. Antibiotic susceptibility of potentially probiotic Bifidobacterium isolates from the human gastrointestinal tract. Lett. Appl. Microbiol. 1998, 26: 333-337.

35. Coscolla M., Gonzalez-Candelas F. Population structure and recombination in environmental isolates of Legionella pneumophila. Environmental Microbiol. 2007, 9 (3): 643-656.

36. England A.C., McKinney R.M., Skaliy P., Gorman G.W. A fifth serogroup of Legionella pneumophila. Annals of internal medicine. 1980, 93(1, parti)): 58-59.

37. Edelstein P.H., Bibb W.F., Gorman G.W., Thacker W.L., Brenner D.J., Wilkinson H.W., Moss C.W., Buddington R.S., Dunn C.J., Roos P.J. Legionella pneumophila serogroup 9: a cause of human pneumonia. Ann Intern Med. 1984, 101(2): 196-198.

38. Everett K.D., Homung L.J., Andersen AA. Rapid detection of Ihe Chlaniydiaceae and other families in the order Chlamydiales: three PCR tests. Journal of clinical microbiology. 1999,37(3): 575-580.

39. Fenstersheib M.D., Miller M., Diggins C, Liska S., Detwiler L., Werner S.B., LindquistD., Thacker W.L., Benson RF. Outbreak of Pontiac fever due to Legionella anisa. Lancet 1990, 336(8706): 3537.

40. Fields B.S., Haupt Т., Davis J.P., Arduino M.J., Miller P.H., Butler J.C. Pontiac fever due to Legionella micdadei from a whirlpool spa: possible role of bacterial endotoxin. J Infect Dis. 2001, 184(10): 1289-1292.

41. Gabay J.E., Blake M., Niles W.D., Horwitz M.A. Purification of Legionella pneumophila major outer membrane protein and demonstration that it is a porin. Journal of bacteriology. 1985, 162(1): 85-91.

42. Gaia V., Fry N.K., Afshar B. et al. Consensus sequence-based scheme for epidemiological typing of clinical and environmental isolates of Legionella pneumophila. J. Clin. Microbiol. 2005, 43(5): 2047-2052.

43. Gibson G.R., Roberfroid M.B. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics. Journal of nutrition. 1995, 125: 1401-1412.

44. Gella F.J., Serraa J., Generx J. Latex agglutination procedure in immunodiagnosis. Pure&Appl. Chem. 1991, 63(8): 1131-1134.

45. George J.R., Pinel L., Reeves M.W., Harrell W.K. Amino acid requirements of Legionella pneumophila. Journal of clinical microbiology. 1980, 11(3): 286-291.

46. Gill S.R., Pop M., DeBoy R.T., Eckburg P.B., Turnbaugh P.J., Samuel B.S., Gordon J.I., Relman D.A., Fraser-Liggett C.M., Nelson K.E. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. 2006, 312(5778): 1355-1359.

47. Gore C., Munro K., Lay C. et al. Bifidobacterium pseudocatenulatum is associated with atopic eczema: a nested case-control study investigating the fecal microbiota of infants. J. Allergy. Clin. Immunol. 2008, 121(1): 135-40.

48. Helbig J.H., Ludvig В., Luck P.C., Groh A., Witzleb W., Hacker J. Monoclonal antibodies to Legionella mip proteins recognize genus- and species-specific epitopes. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 1995, 2(2): 160-165.

49. Helbig J.H., Luck P.C. Knirel Y.A., Witzleb W., Zahringer U. Molecular characterization of virulence-associated epitope on the lipopolisaccharide of Legionella pneumophila serogroup 1. Epidemiol. Infect. 1995, 115: 71-78.

50. Helbig J.H., Benson R.F., Pelaz C., Jacobs E., Luck P.C. Identification and serotiping of atypical Legionella pneumophila strains isolated from human and environmental sources. Juornal of applied microbiology. 2007, 102: 100-105.

51. Hindahl M.S., Iglewski B.H. Outer membrane proteins from Legionella pneumophila serogroups and other Legionella species. Infection and immunity. 1986, 51(1): 94-101.

52. Hunter P.R., Gaston M.A. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity. J. Clin. Microbiol. 1988, 26(11): 2465-2466.

53. HC info. Legionella pneumophila. Outbreaks, http://hcinfo.com/outbreaks-news.htm

54. Isolation and identification of Legionella species an overview. Microgen bioproducts newsletter, 2002, 9. www.microgenbioproducts.com

55. Joly J.R., McKinney R.M., Tobin J.O., Bibb W.F., Watkins J.D., Ramsay D. Development of a standardized subgrouping scheme for Legionella pneumophila serogroup 1 usng monoclonal antibodies. Journal of clinical microbiology. 1986, 83(4): 768-771.

56. Kibbe W.A. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic Acids Res. 2007, 35. http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html

57. Leahy S.C., Higgins D.G., Fitzgerald G.F., van Sinderen D. Getting better with bifidobacteria Journal of Applied Microbiology. 2005, 98: 1303-1315.

58. Legionella and the prevention of legionellosis. Editors: Bartram J., Chartier Y., Lee J. V., Pond K, Surman-Lee S. World Health Organization, 2007.

59. Legionella: Molecular Microbiology. Editors: Heuner K, Swanson M. ISBN: Caister Academic Press, 2008.

60. Lindquist D.S., Nygaard G., Thaker W.L., Benson R.F., Brenner D.J., Wilkinson H.W. Thirteenth serogroup of Legionella pneumophila isolated from patients with pneumonia. Journal of clinical microbiology. 1988, 26(3): 586-587.

61. Luck P.C., Schneider Т., Wagner J., et al. Community-acquired Legionnaires' disease caused by Legionella pneumophila serogroup 10 linked to the private home. J. Med. Microbiol. 2008, 57(Pt 2): 240-243.

62. McKinney R.M., Thacker L., Harris P.P., Lewallen K.R., Herebert G.A., Edelstein P.H., Thomason B.M. Four serogroups of Legionnaires' disease bacteria defined by direct immunofluorescence. Annals of internal medicine. 1979, 90(4): 621-624.

63. Mclnerney J.O., Mullarkey M, Wernecke M.E., Powell R. Bacteria and Archaea: Molecular techniques reveal astonishing diversity. Biodiversity, 2002,3(2): 3-10.

64. Method for detection of Legionella bacteria employing purified antigen-specific antibodies. European Patent EP1107773

65. Meghrous J., P.Euloge, A.M. Junelles, J. Ballongue H. Petitdemange screening of Bifidobacterium strains for bacteriocin production. Biotechnology letters. 1990, 12(8): 575-580.

66. Mevissen-Verhage E.A.E., Marcelis J.H., De Vos M.N. et al. Bifidobacterium, Bacteroides and Clostridium spp. in fecal samples from breast fed and bottle-fed infants with and without iron supplement. J. Clin. Microbiol. 1987, 25: 285-289.

67. Mitsuoka T. Vergleichende Untersuchungen uber die Bifidobakterien aus dem Verdauungstrakt von Menschen und Tieren. Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkd. Infek-tionskr. Hyg. Abt. 1 Orig. Reihe A. 1969, 210: 52-64.

68. Mitsuoka Т., Hayakawa K., Kimura N. The fecal flora of man. II. Communication: the composition of bifidobacterium flora of different age groups. Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. 1 Abt. Orig. A. 1974, 226:469-478.

69. Moubareck C., Gavini F., Vaugien L., Butel M.J., Doucet-Populaire F. Antimicrobial susceptibility of bifidobacteria. 2005, 55: 38-44.

70. Murga R, Forster T.S., Brown E., Pruckler J.M., Fields B.S., Donlan RM. Role of biofilms in the survival of Legionella pneumophila in a model potable-water system. Microbiology. 2001, 147: 3121-3126.

71. Nielsen D.S., Moller P.L., Rosenfeldt V. et al. Case study of the distribution of mucosa-associated Bifidobacterium species, Lactobacillus species, and other lactic acid bacteria in the human colon. Appl. Environ. Microbiol. 2003,69(12): 7545-7548.

72. Ratcliff R.M., Lanser J.A., Manning P.A., Heuzenroeder M.W. Sequence-Based classification scheme for the genus Legionella targeting the mip gene. J. Clin. Microbiol. 1998, 36 (6): 1560-1567.

73. Reuter G. Vergleichende Untersuchungen uber die Bifidus-Flora im Sfuglings- und Erwachsenensthul. Zentralbl. 1-14. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. 1 Abt. Orig. 1963; 191: 486-507.

74. Reuter G. The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession. Current Issues in Intestinal Microbiology. 2001, 2(2): 4353.

75. Sakata Sh., Kitahara M., Sakamoto M., Hayashi H., Fukuyama M., Benno Y. Unification of Bifidobacterium infantis and Bifidobacterium suis as Bifidobacterium longum. International journal of systematic and evolutionary microbiology. 2002, 52: 1945-1951.

76. Sakata Sh., Ryu Ch.S., Kitahara M., Sakamoto M., Hayashi H., Fukuyama M., Benno Y. Characterization of the genus Bifidobacterium by automated ribotyping and 16S rRNA gene seguences. Micrbiol. Immunol. 2006, 50(1): 1-10.

77. Satocari R.M., Vaughan E.E., Akkermans D.L., Saarela M., de Vos W.M. Bifidobacterial diversity in human feces detected by genus-specific PCR and denaturing gradient gel electrophoresis. Applied and environmental microbiology. 2001, 67(2): 504-513.

78. Scaturro M, Losardo M., De Ponte G., Ricci M.L. Comparison of three molecular methods used for subtiping of Legionella pneumophila strains isolated during an epidemic of legionellosi in Rome. Journal of clinical microbiology. 2005,43(10): 5348-5950.

79. Smehilova M., Vilkova E., Nevoral J. Comparison of intestinal microflora in healthy infants and infants with allergic colitis. Folia Microbiol (Praha). 2008; 53(3): 255-258.

80. Stackebrandt E., Rainey F.A., Ward-Rainey N.L. Proposal for a new hierarchic classification system, Actinobacteria classis nov. International journal of systematic bacteriology, 1997, 47: 479-491.

81. Standard European Working Group on Legionella Infections Amplified Fragment Length Polymorphism Protocol (Version 1.2)

82. Stone B.J., Kwaik Y.A. Expression of multiple pili by Legionella pneumophila: identification and characterization of type IV pilin gene and its role- in adherence to mammalian and protozoan cells. J. Clin. Microbiol. 1998, 66 (4): 1768-1775.

83. Thacker W.L., Benson R.F., Wilkinson H.W., Ampel N.M., Wing E.J., Steigerwalt A.G., Brenner D.J. 11th serogroup of Legionella pneumophila isolated from a patient with fatal pneumonia. Journal of clinical microbiology. 1986, 23(6): 1146-1147.

84. Thacker W.L., Wilkinson H.W., Benson R.F., Brenner D.J. Legionella pneumophila serogroup 12 isolated from human and environmental sources. Journal of clinical microbiology. 1987, 25(3): 569-570.

85. Thtirmer A, Helbig J.H., Jacobs E., Luck P.C. PCR-based 'serotyping' of Legionella pneumophila. J Med Microbiol. 2009,58(Pt5): 588-595.

86. Politi B.D., Fraser D.W., Mallison G.F., Mohatt J.V., Morris G.K., Patton C.M., Feeley J.C., Telle R.D., Bennett J.V. A major focus of Legionnaires' disease in Bloomington, Indiana. Ann Intern Med. 1979,90(4): 587-591.

87. Water recreation and disease. Plausibility of associated infections: acute effects, sequelae and mortality. Edited by: Kathy Pond World Health Organization, 2005.

88. Van Belkum A, Struelens M., Quint W. Typing of Legionella pneumophila strains by polymerase chain reaction-mediated DNA fingerprinting. Journal of clinical microbiology, 1993, 31(8): 2198-2000.

89. Ventura M., Elli M., Reniero R, Zink R. Molecular microbial analysis of Bifidobacterium isolates from (liferent environments by the species-specificc amplifed ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA). FEMS Microbiology Ecology. 2001,36:113-121.

90. Ventura M., Zink R. Rapid identification, differentiation, and proposed new taxonomic classification of Bifidobacterium lactis. Appl. Environ. Microbiol. 2002, 68(12): 6429-6434.1 r\ л

91. Vilkova E., Nevoral J., Jencikova В., Kopecny J., Godefrooij J., Trojanova I., Rada V. Detection of infant faecal bifidobacteria by enzymatic methods. J Microbiol Methods. 2005, 60(3): 365-73.

92. Wilson D.A., Reischl U., Hall G.S., Procop G.W. Use of partial 16S rRNA Gene sequencing for identification of Legionella pneumophila and non-pneumophila Legionella spp. Journal of clinical microbiology. 2007, 45 (91): 257-258.

93. Woese C, Fox G. Phylogenetic structure of the prokaiyotic domain: the primary kingdoms. Proc Natl Acad Sci USA 1977,74 (11): 5088-5090.

94. Woese C.R A new biology for a new century. Microbiology and molecular biology reviews. 2004,68(2): 173-186.

95. Yildirim Z, Johnson M.G. Characterization and antimicrobial spectrum of bifidocin В, a bacteriocin produced by Bifidobacterium bifidum NCFB 1454. JFoodProt. 1998,61(1): 47-51.

96. Список публикаций по теме диссертации

97. Статьи в рецензируемых журналах:

98. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №2008128540 от 15.07.2008 «ШтаммBifidobacterium bifidum OV-19.».

99. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №2008128541 от 15.07.2008 «ШтаммBifidobacterium bifidum OV-7.».

100. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №2008128542 от 15.07.2008 «ШтаммBifidobacterium longum OV-20.».

101. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №2008128543 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium pseudocatenulatum OV-17.».

102. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №2008128544 от 15.07.2008 «Штамм Bifidobacterium angulatum OV-15.».

103. Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С., Лунин В.Г., Амерханова A.M., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. №2008128545 от 15.07.2008 «Штамм. Bifidobacterium pseudocatenulatum OV-2.».1. Благодарности