Разработка эффективной технологии получения фармацевтических препаратов генно-инженерного инсулина и его аналогов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Гусаров, Дмитрий Алексеевич

• Гусаров, Дмитрий Алексеевич
• кандидат химических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат химических наук Гусаров, Дмитрий Алексеевич

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1. Инсулин.

2. Способы производства инсулина человека.

2.1. Полусинтетический и генно-инженерный способы.

2.2. Ферментативное превращение предшественника в инсулин.

2.3. Методы очистки инсулина.

2.4. Валидация процессов и аналитического контроля в производстве биофармацевтических препаратов.

3. Фармацевтические аналоги генно-инженерного инсулина.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Постановка задачи.

2. Ферментативный гидролиз предшественника инсулина.

2.1. Внутрипроизводственный контроль ферментативного гидролиза.

2.2. Ферментативный гидролиз: влияние температуры.

2.3. Ферментативный гидролиз: оптимальные концентрации реагентов

2.4. Производственный ферментативный гидролиз.

2.5. Ферментативный гидролиз: обратимая модификация лизина (В29).

3. Разработка и валидация метода контроля производства ГИЧ.

3.1. Линейность.

3.2. Правильность и точность (сходимость и воспроизводимость).

3.3. Предел обнаружения и нижний предел количественной оценки.

3.4. Специфичность.

3.5. Устойчивость метода.

3.6. Выводы.

4. Хроматографическая очистка инсулина.

4.1. Подготовка опытного образца.

4.2. Изучение состава подвижной фазы.

4.3. Определение оптимальной нагрузки на сорбент.

4.4. Определение оптимальной геометрии колонны.

4.5. Подбор оптимальной неподвижной фазы.

4.6. Очистка от эндотоксинов клеточной стенки, проинсулинподобных полипептидов и высокомолекулярных примесей.

4.7. Производственная очистка инсулина.

4.8. Валидация процесса хроматографической очистки инсулина.

5. Технология получения и очистки инсулина-аспарта и инсулина-лизпро.

МАТЕРИАЛЫ, ПРИБОРЫ И МЕТОДЫ.

1. Материалы.

1.1. Реактивы.

1.2. Хроматографические сорбенты и колонны.

2. Приборы.

2.1. Хроматографические системы.

2.2. Оборудование.

3. Методы.

3.1. Контроль производства ГИЧ методом ОФ ВЭЖХ.

3.2. Контроль содержания дТИ методом ион-парной ОФ ВЭЖХ.

3.3. Контроль содержания ВМП методом SEC.

3.4. Получение рекомбинантных предшественников.

3.5. Проведение ферментативного гидролиза.

3.6. Проведение ВЭЖХ-очистки.

3.7. Проведение гель-фильтрации.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка эффективной технологии получения фармацевтических препаратов генно-инженерного инсулина и его аналогов»

Инсулин является одним из наиболее изученных гормонов. С момента открытия того факта, что инсулин, вырабатываемый поджелудочной железой, отвечает за снижение уровня сахара в крови [1], до настоящего времени прошло уже более 80 лет. Тем не менее, и по сей день этот гормон вызывает огромный интерес. Сахарный диабет занимает третье место по смертности после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний [2; 3]. В 2000 году во всем мире насчитывалось почти 150 миллионов больных сахарным диабетом [4], причем эта цифра растет год от года примерно на 2-6 % [5; 6]. Так, например, к 2010 году прогнозируется увеличение числа страдающих этим заболеванием примерно до 33 миллионов в странах Европы [7], а в нашей стране почти 400 тысяч человек нуждаются в регулярном приеме препаратов инсулина.

Несмотря на то, что все люди ведут различный образ жизни, концентрация глюкозы в крови у каждого из них поддерживается в пределах достаточно узкого диапазона и мало изменяется в течение суток. Нормальная концентрация глюкозы в плазме крови составляет от 3 до 8 мМ [5]. Через 15-30 минут после принятия человеком пищи уровень сахара в крови возрастает (Рис. 1) [8]. Примерно так же как суточная динамика глюкозы в крови выглядит и динамика содержания инсулина (Рис. 2) [8]. Возрастание концентрации инсулина в крови является откликом организма на повышение уровня глюкозы, гормон в свою очередь понижает содержание глюкозы до базального уровня примерно через 2 часа после принятия человеком пищи [9]. Сахарный диабет

Рис. 1. Суточная динамика концентрации глюкозы в крови здорового человека и больного сахарным диабетом. и J m I х те

§ X

25

4:00 8:00 12 ЮО 16:00 20:00 24:00 4:00 8:00

Время суток, час:мин

Рис. 2. Физиологический профиль инсулина у здорового человека.

При сахарном диабете происходит повышение уровня сахара в крови почти в 3-4 раза вследствие либо инсулиновой недостаточности (сахарный диабет первого типа), либо резистентности организма к действию инсулина (сахарный диабет второго типа). В случае сахарного диабета первого типа поддержание базального уровня глюкозы становится задачей заместительной терапии, и пациент нуждается в постоянных инъекциях различных препаратов инсулина в течение всей жизни.

Исторически первым способом получения инсулина для терапевтических целей является выделение аналогов этого гормона из природных источников (островков Лангерганса поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней). В 20-х годах прошлого века было установлено, что бычий и свиной инсулины (которые являются наиболее близкими к инсулину человека по своему строению и аминокислотной последовательности) проявляют в организме человека активность, сравнимую с инсулином человека [10]. После этого долгое время для лечения пациентов, страдающих сахарным диабетом первого типа, применяли инсулины крупного рогатого скота или свиньи. Однако со временем в ряде случаев в организме человека начинают накапливаться антитела к бычьему и свиному инсулинам, вызывая нежелательные аллергические реакции. Тем более что потребности в препарате инсулина не могут быть покрыты инсулином животного происхождения из-за ограниченности сырьевой базы [11].

Существенный вклад в развитие современной фармакологии вносит технология получения рекомбинантных ДНК с помощью методов генной инженерии. Созданные штаммы кишечной палочки, дрожжей, культивируемых клеток растений и животных используются для получения гормонов, большинства известных ферментов, противовирусных вакцин и т.д. С появлением технологии рекомбинантных ДНК впервые стало возможным производить инсулин в крупных масштабах. Так в 80-е годы XX века американской компанией Genentech разработана технология производства генно-инженерного инсулина человека (ГИЧ), которая впоследствии была коммерциализирована корпорацией Eli Lilly [12]. В настоящее время ежегодное производство активной фармацевтической субстанции (АФС) инсулина во всем мире превышает 15000 кг [13]. К лидирующим производителям ГИЧ относятся такие зарубежные фирмы, как Eli Lilly (США), Sanofi-Aventis (Германия-Франция),

Novo Nordisk (Дания). В нашей стране исследования в области генной инженерии и молекулярной биологии позволили Институту биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) при финансовой поддержке Правительства города Москвы, впервые выпустить на фармацевтический рынок наиболее востребованные лекарственные формы инсулина.

Разработка конкурентоспособной высокоэффективной технологии получения фармацевтических препаратов ГИЧ и других терапевтических белков является одним из основных направлений современной отечественной биотехнологии. Не менее важно производство аналогов ГИЧ, таких как инсулин-аспарт, инсулин-лизпро, инсулин-гларгин, которые существенно улучшают физиологическую динамику инсулина в крови.

Современные стандарты качества, принятые как в нашей стране, так и за рубежом предъявляют очень высокие требования к чистоте рекомбинантного инсулина человека, предназначенного для производства инъекционных лекарственных препаратов [14, 15, 16]. Однако разделение инсулина и близкородственных ему белков является сложной задачей из-за сходства их физико-химических характеристик. Основной целью данной работы была разработка эффективной отечественной технологической схемы выделения и очистки ГИЧ и его фармацевтических аналогов, ее оптимизация, разработка контроля производства ГИЧ.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи исследования:

1. Изучить и оптимизировать процесс ферментативного расщепления РП с образованием инсулина.

1.1. Определить оптимальную температуру для проведения ферментативного гидролиза;

1.2. Определить оптимальное соотношение ферментов;

1.3. Определить оптимальную концентрацию РП;

1.4. Изучить процесс ферментативного расщепления РП с предварительным блокированием аминогрупп.

2. Разработать и оптимизировать очистку инсулина методом ВЭЖХ на аналитическом уровне.

2.1. Определить оптимальную неподвижную фазу (размер частиц, пористость, длина алкильной прививки);

2.2. Изучить сорбенты различных производителей и выбрать оптимальные;

2.3. Определить оптимальный состав подвижной фазы (органический модификатор, буферные вещества, рН);

3. Масштабировать результаты ВЭЖХ очистки от аналитического до производственного уровня, рассчитать производительность процесса.

4. Разработать и валидировать метод контроля производства инсулина.

5. Провести валидацию процесса очистки инсулина от примесей.

6. Разработать процесс получения аналогов инсулина из соответствующих рекомбинантных предшественников (ферментативный гидролиз).

7. Разработать эффективный способ очистки аналогов от примесей.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1. Инсулин

Инсулин является полипептидным гормоном, играющим ключевую роль в процессах обмена веществ. Основная функция инсулина состоит в том, что в мышцах, печени и жировой ткани он усиливает анаболитические и ингиби-рует катаболитические процессы. В частности, инсулин повышает скорость синтеза гликогена, жирных кислот, белков, а также стимулирует гликолиз. Существенное значение имеет стимуляция проникновения глюкозы, ряда других Сахаров, а также аминокислот в клетки мышц и жировой ткани. Способствуя транспорту глюкозы в указанные клетки, гормон снижает ее содержание в крови (так называемый гипогликемический эффект). Инсулин инги-бирует такие катаболические процессы, как распад гликогена [17]. Он тормозит также гликонеогенез путем снижения уровня ферментативной активности пируват-карбоксилазы и фруктозо-1,6-бисфосфатазы. Показано, что инсулин увеличивает также активность пируват-дегидрогеназы, ацетил-СоА-карбоксилазы и глицеролфосфат-ацетилтрансферазы [18]. Действие инсулина во многом противоположно действию адреналина и глюкагона [17]. Наиболее мощным нейромедиатором, стимулирующим секрецию инсулина Р-клетками, служит ацетилхолин. Секрецию инициирует связывание на поверхности клеток ацетилхолина или карбамоилхолина с мускариновыми хо-линергическими рецепторами, которые сопрягаются посредством G-белков с фосфолипазой С, генерирующей из фосфатидилинозит-4,5-бис-фосфата ино

У Азит-1,4,5-трифосфат, мобилизующий Са из внутриклеточных пулов, и диа-цилглицерин; последний служит активатором протеинкиназы С. Т.Биден [19] обнаружил также, что пищевые раздражители после метаболического превращения опосредованно передают на Р-клетки сигнал, резко повышающий чувствительность к Са2+ секреторного аппарата и, по-видимому, связанный с активацией протеинкиназ.

Интересна методология биосинтеза инсулина в клетке [20]. Инсулин является продуктом протеолиза другой белковой молекулы - проинсулина (Рис. 3) [21; 22].

Рис. 3. Схематическое изображение проинсулина человека (серым цветом показана аминокислотная последовательность, соответствующая С-пептиду; белым - инсулину).

Проинсулин синтезируется в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме (3-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы в виде предшественника - препроинсулина (молекулярная масса примерно 11500 Да) [23; 24; 25; 26]. Лидерная последовательность, состоящая из 23 аминокислотных остатков, направляет молекулу предшественник в аппарат Гольджи и там отщепляется [27; 28]. В результате образуется молекула проинсулина (молекулярная масса примерно 9000 Да), принимающая конформацию, необходимую для правильного образования дисульфидных мостиков. Затем проинсулин расщепляется трипсиноподобным ферментом на инсулин, С-пептид и два дипептида и депонируется в секреторных гранулах [18; 29; 30]. Далее содержимое этих гранул секретируется в воротную вену [18; 31]. Помимо инсулина образуется также эквимолярное количество С-пептида и 2-3 % проинсулина и его производных (продуктов неполного протеолиза проинсулина) [17,

19]. До попадания в периферическую кровеносную систему, инсулин и С-пептид направляются в печень, где деградирует 50 % инсулина, в то время как С-пептид не подвергается никаким воздействиям. Впервые структура молекулы инсулина установлена Сенджером в 1951 г [32].

Рис. 4. Схема расположения дпсульфидных связей в молекуле инсулина.

Молекула инсулина - полипептид, состоящий из двух цепей (Рис. 4): А и В. Молекулярная масса инсулина равна 5807,6 Да. Аминокислотная последовательность инсулина человека приведена ниже (Рис. 5). Цепи инсулина кова-лентно связаны между собой двумя дисульфидными связями А7-В7 и А20-В19. Также в молекуле инсулина имеется еще одна дисульфидная связь в А-цепи: А6-А11 [33]. А- и В-цепи у представителей большинства видов животных имеют по 21 и 30 аминокислотных остатков соответственно.

Среди животных инсулинов различного происхождения в обеих цепях во многих положениях встречаются аминокислотные замены, не оказывающие влияния на биологическую активность гормона, однако наиболее распространенными являются замены по 8, 9 и 10 положению А-цепи (Таблица 1). Из этого следует, что данный участок, скорее всего, не имеет критического значения для биологической активности инсулина.

Таблица 1. Замены в аминокислотной последовательности различных инсулинов.

Млекопитающее А-цепь В-цепь

8 9 10 30

Человек Thr Ser lie Thr

Свинья, собака, кашалот Thr Ser lie Ala

Кролик Thr Ser lie Ser

Бык, коза Ala Ser Val Ala

Овца Ala Gly Val Ala

Лошадь Thr Gly lie Ala

Сейвал Ala Ser Thr Ala

С другой стороны, некоторые участки и области молекулы обладают высокой консервативностью. К ним относятся:

1. положения трех дисульфидных мостиков;

2. гидрофобные остатки в С-концевом участке В-цепи;

3. С- и N-концевые участки А-цепи.

Использование химических модификаций и замен отдельных аминокислотных остатков в этих участках помогли идентифицировать структуру активного центра инсулина. Расположенный на С-конце В-цепи гидрофобный участок участвует также в димеризации инсулина.

Цинк, концентрация которого в [3-клетках островков Лангерганса достигает высоких значений, формирует комплексы с инсулином и проинсулином. Ин-сулины всех позвоночных образуют димеры с помощью водородных связей между пептидными группами остатков В24 и В26 двух мономеров, которые при высоких концентрациях, в свою очередь, реорганизуются в гексамеры, содержащие по два атома цинка в каждом. Наличие такой высокоупорядо-ченной структуры существенно облегчило изучение кристаллической структуры инсулина.

При восстановлении дисульфидных связей и последующем их окислении, третичная структура практически не восстанавливается (очень низкий выход) [33]. Это объясняется наличием прогормона - проинсулина, полипептидная цепь которого включает последовательность из 30-35 аминокислот, отсутствующая в инсулине. Это связывающий пептид (С-пептид от английского connecting - связывающий); который расположен между карбоксильным концом В-цепи и N-концом А-цепи будущего инсулина. Проинсулин обладает способностью к формированию правильно расположенных дисульфидных связей после обработки восстанавливающими агентами и последующей рена-турации. После замыкания дисульфидных мостиков, стабилизирующих молекулу проинсулина в целом, трипсиноподобная протеиназа "вырезает" С-пептид [10]. Точки воздействия этой протеиназы предопределены двумя факторами - пространственной структурой проинсулина и присутствием в его полипептидной цепи двух пар катионных аминокислот, расположенных в последовательности следующим образом: В-цепь - Arg Arg - С-пептид - Lys Arg - А-цепь (Рис. 6).

651 66 Arg-Gly

12

Lys 1

H-Phe

71 S ■ S

76 S S

Проинсулин

85 86 Asn- OH

19

30 -Tre

Gin ■ 63

H-Gly

-l-JL

H-Phe

6 S i S

HO Gin

20

11 S ■ s

19

-Glu-Arg-Arg 33f 321 31

Инсулин 21

Asn- OH

30

-Thr-OH

-Glu-H

С-пептид

Рис. 6. Схема отщепления С-пептида от проинсулина под действием трипсиноподобной протеиназы.

Трипсиноподобная протеиназа узнает пары аминокислот с катионными боковыми группами типа Arg-Arg и Lys-Arg и расщепляет пептидную связь на С-конце таких пар. В результате образуется С-пептид (Рис. 7) вместе с последовательностью Lys-Arg на С-конце и, связанные дисульфидными мостиками, цепи А и В. Причем на С-конце цепи В оказываются два остатка аргинина, отщепление которых является завершающей стадией получения активной формы гормона. Данный процесс осуществляет специализированная метал-лозависимая карбоксипептидаза [10].

Н — Arg -Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly- Pro

OH — Arg-Lys-Gln-Leu-Ser-Gly -Glu-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Leu-Ser- Gly-Ala-Gly Рис. 7. Аминокислотная последовательность С-пептида проинсулина человека.

В растворах инсулиновые молекулы существуют в состоянии равновесия между мономерной, димерной, тетрамерной и гексамерной формами [34]. При низких концентрациях, сравнимых с концентрациями в крови, преобладает мономерная форма, которая является биологически активной, так как именно она способна взаимодействовать с инсулиновым рецептором [35]. При более высоких концентрациях в кислой или щелочной среде (рН 8,0 и выше) в отсутствии ионов цинка гормон способен к самоассоциации в диме-ры, а в присутствии катионов цинка в нейтральной или слабоосновной среде - в гексамеры (Рис. 8). В результате биосинтеза инсулин накапливается в организме в форме кристаллического цинк-связанного инсулина в везикулах островковых клеток, высвобождаясь по мере увеличения концентрации глюкозы в крови [36]. И хотя хорошо известно, что гексамер существует в трех конформациях (R6, T3R3 и Т6), зависящих от конформации мономерной единицы, тем не менее, до сих пор не ясно, какая из конформаций реализуется при накоплении в клетках островков Лангерганса [37; 38; 39; 40]. Инсулиновые молекулы можно кристаллизовать в различных конформаци-онных состояниях [41]. Впервые кристаллическая структура инсулина была определена еще в 1969 году и представляла собой гексамер, в котором объединялись три димера вокруг двух ионов цинка [42; 43]. В последствии были описаны гексамерные структуры, содержащие и по четыре иона цинка [44] .В гексамере, содержащем два иона цинка, области в мономерных единицах BIBS и В20-В30 отталкиваются а-спиральным участком В9-В19 [45]. Поэтому это конформационное состояние носит название напряженного (tense, Т-состояние).

А-цепь М

S-цепь В в

Рис. 8. Схематическое изображение возможных структур инсулина человека: А-мономер; Б-днмер; В-гскеамер R-6, стабилизированный катионам» цинка и резорцином (по две молекулы в каждой днмер-ной субъедииице, одна молекула - в центре гексамера); Г-гексамер Т-б, стабилизированный двумя катионами цинка.

Ионы металла координируют остатки гистидинов в положениях В10 всех трех димеров. В каждом мономере димера А и В-цепи образуют компактную молекулу, включающую две а-спирали А-цепи и одну а-спираль В-цепи (состояние Т6).

В конформации, содержащей четыре иона цинка, при высоких концентрациях хлорид-ионов три N-конца В-цепи (остатки аминокислот в положениях В1-В8) ассоциируются в а-спираль. Подобная конформация называется R6, или ослабленной (relaxed) [46]. Переход из Т6 в R6 состояние возможен при связывании молекулы с такими лигандами, как фенол, крезол, метилпарабен, резорцин и т.д. [35]. Подобное связывание происходит по участкам молекулы инсулина, названным гидрофобными карманами. В состоянии T3R3 (несимметричная структура, в которой 4 иона цинка координируются В10-гистидинами) имеется три таких кармана, а в состоянии R6 — шесть. Известно, что фенол и его производные можно использовать в лекарственных препаратах инсулина и как антибактериальные консерванты [47], и как добавки, препятствующие протеканию реакций дезамидирования [48]. Показано, что соединения фенольного ряда способствуют также стабилизации T3R3 и R6 гексамеров, увеличивая тем самым устойчивость молекулы к термической денатурации и полимеризации [35].

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Гусаров, Дмитрий Алексеевич

выводы

1. Был изучен и оптимизирован процесс ферментативного расщепления РП с образованием инсулина.

1.1. Разработан метод производственного контроля содержания дТИ, побочного продукта ферментативного гидролиза, в растворах ГИЧ. Метод основан на ион-парной ОФ ВЭЖХ. Продемонстрировано, что метод позволяет получать разделение между пиками инсулина и дТИ не менее 1,8. Время анализа составило 20 мин.

1.2. Определена оптимальная температура для проведения ферментативного гидролиза, составившая +6 ± (-1)°С.

1.3. Определено оптимальное соотношение ферментов, составившее:

- соотношение РП/трипсин: от 1/11000 до 1/7500;

- соотношение РП/карбоксипептидазаВ: от 1/7000 до 1/5500;

- соотношение трипсин/карбоксипептидаза В: 1,5/1,0.

1.4. Определена оптимальная концентрация РП, составивашая 9,75 ± 0,25 мг/мл;

1.5. Разработан процесс ферментативного расщепления РП с предварительным блокированием аминогрупп с тем, чтобы минимизировать образование дТИ. Обратимая модификация аминогруппы лизина (В29) в составе РП позволила избежать узнавания его трипсином и минимизировать образование побочного продукта гидролиза, дТИ. Определено, что наименьшее содержание дТИ и максимальный выход ГИЧ наблюдаются при использовании цит-раконового ангидрида в концентрации 0,25-0,5 г/г. После деблокирования аминогрупп получаемого в результате гидролиза инсулина содержание примесного дТИ не превышало 0,5 %.

2. Была разработана эффективная схема очистки инсулина методом ВЭЖХ на аналитическом уровне.

2.1. Для этого первоначально был изучен процесс волокнообразования ГИЧ в растворах с низким значением рН. Образование волокон инсулина в хромато-графических подвижных фазах является следствием агрегации его молекул и приводит к физическому блокированию внутренних пор сорбентов, снижая их срок эксплуатации, производительность процесса очистки, качество разделения. Продемонстрировано, что волокнообразование практически исключается в подвижных фазах, содержащих органические кислоты, такие как уксусная и молочная.

2.2. Определен оптимальный состав подвижной фазы (этиловый спирт в качестве органического модификатора, уксусная кислота (рН 3,0-3,5), этил-ацетат в качестве вытесняющего агента).

2.3. Определена оптимальная неподвижная фаза для производственного процесса (размер частиц 15 мкм, пористость 20 нм, длина алкильной прививки С8).

2.4. Изучены сорбенты различных производителей и выбран оптимальный для производственных целей (YMC Basic С8-15 мкм-20 нм).

3. Масштабированы результаты ВЭЖХ очистки от аналитического до производственного уровня, производительность процесса составила не менее 2 г инсулина / л сорбента * ч. Оптимальная нагрузка составила 10-15 мг инсулина / мл сорбента. Рассчитаны оптимальные размеры производственной ВЭЖХ колонны, а именно внутренний диаметр и высота слоя сорбента. Экспериментально подтверждено, что высота слоя сорбента должна быть 1015 см, диаметр должен быть не ниже 100 см.

4. Разработан метод контроля производства инсулина более оперативный (длительность анализа 23,5 мин), чем метод, рекомендуемый фармакопейной статьей. Достоверность результатов анализа была доказана валидационной процедурой, в ходе которой оценивались линейность, правильность, точность, предел обнаружения, нижний предел количественной оценки, специфичность, устойчивость к изменению температуры, составу подвижных фаз, смене хроматографических колонок.

5. Проведена валидация процесса очистки инсулина от примесей. Подтверждено, что разработанный процесс воспроизводим, предсказуем и позволяет получать АФС ГИЧ качества, соответствующего фармакопейным требованиям.

6. Разработан процесс получения аналогов инсулина из соответствующих рекомбинантных предшественников (ферментативный гидролиз).

7. Разработан эффективный способ очистки аналогов от примесей. Полученные фармацевтические аналоги инсулина обладали активностью не менее 27,5 МЕ/мг и чистотой, удовлетворяющей стандартам качества. АФС аналогов были переданы на клинические испытания.

Разработанная технология выделения и очистки позволила получать соответствующую фармакопейным требованиям АФС с суммарным выходом до 220240 мг инсулина / мЗ культуральной жидкости.

Разработанная технология в настоящее время успешно реализуется на Опытном биотехнологическом производстве Учреждения российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю .А.Овчинникова.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

Опубликованные статьи:

1. Гусаров Д.А., Востриков В.В., Ручко Е.А., Ласман В. А., Михалев А.В., Баи-рамашвили Д.И. / Использование ОФ ВЭЖХ для очистки генноинженерного инсулина человека // Биотехнология. 2006. №2. С. 44-49.

2. Gusarov D., Lasman V., Bayramashvili D. / Methods for protecting silica sor-bents used in high-performance liquid chromatography from strongly adsorbed impurities during purification of human recombinant insulin // J. Chromatogr. B. 2007. V.853. P.354-359.

3. Gusarova V., Vorobjeva Т., Gusarov D., Lasman VBayramashvili D. / Size-exclusion chromatography based on silica-diol for the analysis of the pro insulin fusion protein // J. Chromatogr. A. 2007. V.l 176. P. 157-162.

4. Гусаров Д.А., Гусарова В Д., Баирамашвили Д.И., Миронов А. Ф. / Генно-инженерный инсулин и его фармацевтические аналоги // Биомедицинская Химия. 2008. Т.54. №6. С.624-642.

5. Гусаров Д. А., Гусарова В Д., Михалев А.В., Ласман В.А., Баирамашвили Д.К, Миронов А. Ф, Сенаторова Н.К., Сенаторов А.В. / Валидация метода контроля производства генно-инженерного инсулина человека // Биоорганическая Химия. 2009. Т.35. №1. С.55-61.

6. Gusarov D., Nekipelova К, Gusarova V., Lasman V., Bayramashvili D. / Displacement effect during HPLC preparative purification of human insulin // J. Chromatogr. B. 2009. V.877. P. 1216-1220.

7. Гусаров Д. А., Гусарова В.Д., Миронов А. Ф., Баирамашвили Д.И. /Инсулины пролонгированного действия: структура и фармакологический эЭффект // Биофармацевтический Журнал. 2009. Т.1. №1. С.3-11.

8. Гусарова В.Д., Гусаров ДА., Шепелъ Е.Н., Михалев А.В., Ласман В.А. / Аналитическое определение содержания ВЗО-дезтреонин-инсулина в растворах генно-инженерного инсулина человека // Биофармацевтический Журнал. 2009. Т.1. №1. С.28-33.

9. Гусарова В.Д., Гусаров Д. А., Миронов А.Ф., Баирамашвили Д.И., Мирошни-ков А.И. / Оптимизация промышленного получения рекомбинантного предшественника инсулина человека // Биоорганическая Химия. 2009. Т.35. №4. С.510-518.

10. Некипелова В.О., Гусаров ДА., Ласман В.А., Баирамашвили Д.И., Миронов А.Ф.,, Швец В.И. / Образование фибрилл генно-инженерного инсулина человека в условиях хроматографической очистки // Биотехнология. 2009. №3. С.49-53.

Опубликованные патенты:

Баирамашвили Д.И., Гусаров ДА., Давыдов В.И., Зинченко А.А., Косарев С.А., Ласман В.А., Мирошников А.И., Михалев А.В., Шибанова Е.Д. / Способ получения генно-инженерного инсулина человека // Патент Российской Федерации №2322504 С1, заявка 26.06.2006, опубликован 20.04.2008 Бюл №11.

Опубликованные тезисы докладов и конференций:

1. Гусаров Д. А., Востриков В.В. / Подбор и сравнительная оценка условий разделения инсулина и А21-дезамидоинсулина на ОФ ВЭЖХ // XVII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления биологии и биотехнологии», тезисы докладов и стендовых сообщений под ред. к.х.н. Т.В.Овчинниковой и Т.И.Соркиной, Москва, 2005.

2. Гусаров Д. А., Ручко Е.А., Востриков В.В., Михалев А.В., Баирамашвили Д.И. / Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии в производстве генноинженерного инсулина человека // Третий Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», материалы конференции, Москва, 2005.

3. Гусаров Д. А., Ласман В. А., Баирамашвили Д.И. / Сравнение технологий очистки генноинженерного инсулина человека (ГИЧ) с помощью гидрофобной хроматографии и ОФ ВЭЖХ // Московская Международная Конференция «Биотехнология и Медицина», материалы конференции, Москва, 2006.

4. Гусарова В.Д., Ласман В. А., Гусаров Д. А., Баирамашвили Д.И. / Оптимизация процесса ферментативного расщепления рекомбинантного белка в производстве субстанции инсулина человека // Московская Международная Конференция «Биотехнология и Медицина», материалы конференции, Москва, 2006.

5. Михалев А.В., Шепелъ Е.Н., Ласман В.А., Гусаров Д.А., Баирамашвили Д.И. / Аналитическое определение содержания ВЗО-дезтреониноинсулина (дТИ) в растворах генноинженерного инсулина человека (ГИЧ) // Московская Международная Конференция «Биотехнология и Медицина», материалы конференции, Москва, 2006.

6. Gusarov D., Lasman V., Bobruskin A., Bayramashvili D. / Pilot Plant Scale Purification of the Human Insulin and Human Growth Hormone by Reversed Phase HPLC and Hydrophobic Interaction Chromatography: Methods comparison and Qualification //Advancements, Applications and Theory in Downstream Processing, 5th ШС/RPC Bioseparation Conference, abstracts, Switzerland, Interlaken, 2007.

7. Гусаров Д. А., Ласман В. А., Баирамашвили Д.И. / ВЭЖХ в производстве терапевтических рекомбинантных белков // Пятый Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», материалы конференции, Москва, 2009.

8. Гусарова В Д., Гусаров Д. А., Воробьева Т.В., Ласман В. А., Баирамашвили Д.И. / Оптимизация фолдинга и рефолдинга рекомбинантного препроинсули-на // Пятый Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», материалы конференции, Москва, 2009.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю искреннюю признательность моему научному консультанту, доктору Д.И.Баирамашвили, за ценные советы и критику во время написания диссертации и полезные дискуссии, а также всем коллегам по работе, инженерам Опытного биотехнологического производства ИБХ РАН, ученым лаборатории спектральных исследований ИБХ РАН, которые помогли при выполнении отдельных экспериментов.

Особо благодарю В.А.Ласмана, В.Д.Гусарову, А.В.Михалева, А.А.Зинченко, а также моего научного руководителя профессора А.Ф.Миронова за неоценимые комментарии и предложения.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Гусаров, Дмитрий Алексеевич, 2009 год

1.G., Best C.H. / The 1.ternal Secretion of the Pancreas // J.1.b. Clin. Med. 1922. V.7. P.251-266.

2. Barfoed H.C. / Insulin Production Technology// Chem. Eng. Prog.1987. V.83. P.49-54.

3. Ladish M.R., Kohlmann K.L. / Recombinant Human Insulin // Biotechnol. Prog. 1992. V.461. P.469-478.

4. KJe/dsen Т., Ludvigsen S., Diers /., Balschmidt P., Sorensen A.R.,

5. Kaarshotm N.C. / Engineering Enhanced Protein Secretory Expression in Yeast With Application to Insulin // J. Biolog. Chem. 2002. У.211. P. 18245-18248.

6. Klyushnichenko V., Brush R., Bulychev A. / Feasibility of International

7. Technology Transfer for the Production of Recombinant Human Insulin. Parti: Preparing for Product-Specific Manufacturing on a Global Scale //Bioprocess International. 2004. V.2. P.45-59.

8. Баирамашвили Д.И. / Генно-инженерный Инсулин Человека: Успехи и Перспективы // Рос. Хим. Ж. 2005. T.XLIX. №1. С.34-45.

9. Zimmet P., AtbertiК. / Shaw Global and Societal Implication of the

10. Diabetes Epidemic// Nature. 2001. V.414. P.782-787.

11. Ten S., McLaren N.K. / Management of Type-1 and Type-2 Diabetes in

12. Paediatric Endocrinology // Endocrinology Web Textbook, ln:New, M.(Ed.), 2004. P.1-289.

13. Bhatnagar S., Srivastava D., Jayadev M.S.K., DubeyA.K. / Molecular

14. Variants and Derivatives of Insulin for Improved Glycemic Control in Diabetes // Progress in Biophysics and Molecular Biology. 2006. V.91. P.199-228.

15. Степанов B.M. / Молекулярная биология. Структура и функции белков//Москва, Высшая школа, 1996. С.1-182.

16. Древаль А.В. / Массовая Инсулинофобия // Москва, Профессионал-центр, 2003. С.1-160.

17. PetridesD., Sapidou E., Calandranis J. / Computer-Aided Process Analysis and Economic Evaluation for Biosynthetic Human Insulin Production A Case Study // Biotechnol. Bioeng. 1995. V.48. P.529-541.

18. United States Pharmacopeia. Philadelphia, PA. USA. 2000. (USP24). Suppl. 3.

19. British Pharmacopoeia 1988. London: H.M. Stationary Office. 1988. P.1-312.

20. Фармакопейная Статья Предприятия ФСП 42-0452361302 // 2002. С.1-44.

21. СтрайерЛ. / Биохимия // Москва, Мир, 1985. С.1-514.

22. Марри Р., Гренер Д. Мейерс П. I Биохимия человека // Москва, Мир, 1993. С. 1-486.

23. Biden T.J. / Signal Transduction Events in the Regulation of Insulin // Australian Physiology and Pharmacology Society. 1997. V.28. №1. P.84.

24. Евстигнеева P.П. / Тонкий Органический Синтез // Москва, Химия, 1991. С.1-115.

25. Howell S.L., Young D.A., Lacy Р.Е. / Isolation and Properties of Secretory Granules From Rat Islets of Langerhans. 3. Studies of the Stability of the Isolated Beta Granules//J. Cells Biol. 1969. V.41.1. P.167-176.

26. Kemmler W., Steiner D.F., Borg J. / Studies on the Conversion of Proinsulin to Insulin. 3. Studies in vitro With a Crude Secretion Granule Fraction Isolated From Rat Islets of Langerhans// J. Biol. Chem. 1973. V.248. P.4544-4551.

27. Воюшин K.E. / Инсулин // Москва, Мир, 2002. T.1. С.1-142.

28. Kemmter W., Peterson J.D., Steiner D.F. / Studies on the Conversion of Proinsulin to Insulin: III. Conversion in vitro With Trypsin and Car-boxypeptidase В //J. Biol. Chem. 1971. V.246. P.6786-6791.

29. Given B.D., Cohen R.M., Shoe/son R.M., Frank B.H., Rubenstrein A.H., TagerH.S. / Biochemical and Clinical Implications of Proinsulin Conversion Intermediates//J. Clin. Invest. 1985. V.76. P.1398-1405.

30. Steiner D.F., Oyer P.F. / The Biosynthesis of Insulin and a Probable Precursor of Insulin by a Human Islet Cell Adenoma. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1967. V.57. P.473-480.

31. Docherty K., Carrot R.J., Steiner D.F. / Conversion of Proinsulin to Insulin: Involvement of 31,000 Molecular Weight Thiol Protease// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. V.79. P.4613-4617.

32. Mackin R.B. / Proinsulin: Recent Observations and Controversies // Cell. Mol. Life Sci. 1998. V.54. P.696-702.

33. Cowley D.J., Mackin R.B. / Expression, Purification and Characterization of Recombinant Human Proinsulin // FEBS Lett. 1997. V.402. P.124-130.

34. Munte C.EVilela L., KalbitzerH.R., GarrattR.C. / Solution Structure of Human Proinsulin C-Peptide // FEBS J. 2005. V.272. P.4284-4293.

35. Sanger F., Tuppy H. / Studying Influence of Introduction of Insulin in Cells of a Liver// Biochem. J. 1951. V.46. P.463-481.

36. Альберте Б., БрейдЛ., Льюис Дж. I Молекулярная Биология Клетки // Москва, Мир, 1994. С.1-426.

37. Brange J. / Galenics of Insulin // Berlin: Springer-Verlag, 1987. P.1-179.

38. HuusK., HavelundS., Olsen H.B., WeetM.van de, FrokjaerS. / Thermal Dissociation and Unfolding of Insulin // Biochemistry. 2006. V.45. P.4014-4024.

39. Blundell T.L., Dodson, G., Hodgkin, D., Merco/a, D. I Insulin: the Structure of the Crystal and Its Reflection in Chemistry and Biology // Adv. Protein Chem. 1972. V.26. P.279-402.

40. Grant P. Т., Frank В.H. / Differences in the Nature of the Interaction of Insulin and Proinsulin With Zinc// Biochem. J. 1972. V.126. P.433-440.

41. Goldman J., Carpenter F.H. / Zinc Binding, Circular Dichroism, and Equilibrium Sedimentation Studies on Insulin (Bovine) and Several of Its Derivatives // Biochemistry. 1974. V.13. P.4566-4574.

42. Summerell J.M., OsmandA., Smith G.H. / An Equilibrium-Dialysis Study of Binding of Zinc to Insulin // Biochem. J. 1965. V.95. P.31.

43. Emdin S.O., Dodson G.G., Gutfie/d J.M., Gutfie/dS.M. / Role of Zinc in Insulin Biosynthesis. Some Possible Zinc Insulin Interactions in the Pancreatic B-Cell // Diabetologia. 1980. V.19. P.174-182.

44. Whittingham J.L., Scott D. J., Chance K., Wilson A., Finch J., Brange J., Dodson G.G. / Insulin at pH 2: Structural Analysis of the Conditions Promoting Insulin Fibre Formation //J. Mol. Biol. 2002. V.318. P.479-490.

45. Adams M.J., Blundell T.L., Dodson E.J., Dodson G.G., Vijayan M„ Baker E.N., Harding M.M., Hodgkin D.C., Rimmer В., SheatS.I Structure of Rhombohedral 2-Zinc Insulin Crystals // Nature. 1969. V.22. P.491-495.

46. Peking Insulin Structure Group, Peking Rev. 1971. V.40. P.10-16.

47. Shlichtkrull J., Brange J., Christiansen A.H., Hallund O., Heding L.G., Jorgensen K.H., Munkgaard S., Rasmussen M., Sorensen E„ Vol-undA.A. / Monocomponent Insulin and Its Clinical Implications // Horm. Metab. Res. 1974. V.5. P.134-143.

48. Ciszak E., Smith G.D. / Crystallographic Evidence for Dual Coordination Around Zinc in the T3R3 Human Insulin Hexamer// Biochemistry. 1994. V.33. P.1512-1517.

49. CiszakE., Beals J.M., Frank B.H., Baker J.C., Carter N.D., Smith G.D. / Role of C-terminus B-chain Residues in Insulin Assembly: the Structure of Hexameric LysB28ProB29-Human Insulin // Structure. 1995. V.3. P.615-622.

50. Derewenda U., Derewenda Z., Dodson E.J., Dodson G.G., Reynolds C.D., Smith G.D., Sparks C., Swenson D. / Phenol Stabilizes More Helix in a New Symmetrical Zinc Insulin Hexamer// Nature. 1989. V.338. P.594-596.

51. Brange J., LangkjaerL. / Chemical Stability of Insulin. 3. Influence of Excipients, Formulation, and pH //Acta Pharm. Nord. 1992. V.4.1. P.149-158.

52. Овчинников ЮЛ. / Биоорганическая химия // М: Просвещение, 1987. С.1-815.

53. Миргородская О.А., Казанина ГЛ., Миргородская Е.П. / Протео-лиз Проинсулина Человека, Катализируемый Нативным, Модифицированным и Иммобилизованным Трипсином // Биоорганическая химия. 1997. Т.23. №2. С.91-97.

54. Morihara К., Ока Т., TsuzukiН. / Semi-Synthesis of Human Insulin // United States Patent №4.400.465, 1983.

55. Morihara К., Oka Т., TsuzukiH. / Semi-Synthesis of Human Insulin // United States Patent №4.511.505, 1985.

56. Van Dedem G. W.K., Van Houdenhofen F.E.A. i Modified Porcine Insulin and Its Use for Preparing Human Insulin // United States Patent №4.840.897, 1989.

57. ObermeierR. / Process for the Manufacture of Human Insulin // United States Patent №4.029.642, 1977.

58. Chance R.E., Hoffmann J.A. / Process for Producing an Insulin // United States Patent №4.421.685, 1983.

59. Belagae R.M., DiMarchiR.D., Heath W.F.,jr„ Long H.B. / A-C-B Pro-insulin, Method of Manufacturing and Using Same, and Intermediates in Insulin Production // United States Patent №5.304.473, 1994.

60. KroeffE.P., Owens R.A., Campbell E.L., Johnson R.D., Marks H.I. / Production Scale Purification of Biosynthetic Human Insulin by Re-versed-Phase High Performance Liquid Chromatography// J. Chromatogr. 1989. V.2. P.45-61.

61. Chance R.E., Hoffman J.A., KroeffE.P. / Peptides: Synthesis-Structure-Function // Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Pierce Chemical Company, Rockford, 1981. P.721-728.

62. Burnett J.P. / Experimental Manipulation of Gene Expression // Academic Press, New York, 1983. P.259-277.

63. Frank B.H., Chance R.E. / Therapeutic Agents Produced by Genetic Engeneering // Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Pierce Chemical Company, Rockford, 1981. P.138-146.

64. FrankB.H., Prouty W.E., Heiney R.E., Walden M.R. / Process for Transforming a Human,Insulin Precursor to Human Insulin // United States Patent, №5.457.066, 1995.

65. Obermeier R., GeigerR., Grau U. / Process for Converting Preproin-sulin Analogs into Insulins // United States Patent №4.639.333, 1987.

66. Hansen F.B., Balschmidt P. / Human Insulin Analogs and Preparations Containing them // United States Patent №5.149.777, 1992.

67. Shin H.-Ch., Chang S.-Gu, Kim D.-E., Kim Ch.-S. / Proinsulin Derivative and Process for Producing Human Insulin // United States Patent №5.962.267, 1999.

68. Yomota C., Yoshii Y., Takahata Т., Okada S. / Separation of B-3 Monodesamidoinsulin From Human Insulin by High-Performance Liquid Chromatography Under Alkaline Conditions // J. Chromatogr. A. 1996. V.721. P.89-96.

69. SergeevN. V., Gloukhova N.S., Nazimov /. V., Miroshnikov A.I. / Monitoring of Recombinant Human Insulin Production by Narrow-Bore Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography, High

70. Performance Capillary Electrophoresis and Matrix-Assisted LASER Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry // J. Chro-matogr. A. 2001. V.907. P.131-144.

71. Oliva A., Farina J., Llabres M. / Development of Two High-Performance Liquid Chromatographic Methods for the Analysis and Characterization of Insulin and its Degradation Products in Pharmaceutical Preparations//J. Chromatogr. A. 2001. V.749. P.25-34.

72. Kje/dsen T. / Yeast Secretory Expression of Insulin Precursors // Application of Microbiological Technology. 2000. V.54. P.277-286.

73. Kjeldsen T.B., Ludvigsen S., Kaarsholm R.C. / Method for Making Insulin Precursors and Insulin Precursor Analogs // United States Patent Application №20010023069, 2001.

74. Anniba/iN. / Expression of Human Insulin Precursor in P.Pastoris // United States Patent Application №20030104607, 2003.

75. Moloney M.M., Boothe J., Keon R., Nykiforuk C., Van Rooijen G. / Methods for the Production of Insulin in Plants // United States Patent Application №20050039235, 2005.

76. Arakawa E. / The Production of Gamma-lnterferon in Plants // United States Patents № 4.956.282, 1997.

77. Arakawa E. / The Production of Gamma-lnterferon in Plants // United States Patents № 5.550.038, 1999.

78. Shin H.-Ch., Chang S.-Gu, Kim D.-E., Kim Ch.-S. I The Production Human Serum Albumin in Plants // United States Patents № 5.650.307, 1999.

79. Shin H.-Ch., Chang S.-Gu, Kim D.-E., Kim Ch.-S. i The Production Human Serum Albumin in Plants // United States Patents № 5.716.802, 2001.

80. Nilsson J., Jonasson P., Samue/sson E., Stah/S., Uhlen M. / Integrated Production of Human Insulin and Its C-Peptide // J. Biotech-nol. 1996. V.48. №3. P.241-250.

81. Jonasson P., Nygren P.A., Jonasson B.L. / Gene Fragment Polymerization Gives Increased Yyields of Recombinant Human Proinsulin C-Peptide // Gene. 1998. V.210. №2. P.203-210.

82. Sun H., Tana J., Ни M. / Preparization of Tyr-C-Peptide From Genetically Altered Human Insulin Precursor//Appliement of Biochemical Biotechnology. 1995. V.55. №3. P.167-174.

83. Chang S.-G., Kim D.-Y., ChoiK.-D., Shin J.-M., Shin H.-C. i Human Insulin Production From a Novel Mini-Proinsulin Which Has High Receptor-Binding Activity// Biochem. J. 1998. V.329. P.613-635.

84. Liu M., Ramos-Castaneda J., Arvan P. i Role of the Connecting Peptide in Insulin Biosynthesis // J. Biolog. Chem. 2003. V.278. №1.1. P.14798-14805.

85. SchaffnerJ., Winter J., Rudolph R. and Schwarz E. / Cosecretion of Chaperones and Low-Molecular-Size Medium Additives Increases the Yield of Recombinant Disulfide-Bridged Proteins // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V.67. P.3994-4000.

86. Winter J., Neubauer P., Glockshuber R., Rudolph R. / Increased Production of Human Proinsulin in the Periplasmic Space of Escherichia Coli by Fusion to DsbA // J. Biotechnol. 2000. V.84. P. 175-185.

87. Kang Y., Yoon J. W. / Effect of modification of connecting peptide of proinsulin on its export//J. Biotechnol. 1994. V.36. P.45-54.

88. Rosenbusch J.P. / Structural and Functional Properties of Porin Channels in E. Coli Outer Membranes // Experientia. 1990. V.46. P.167-173.

89. Winter J., Lilie H., Rudolph R. / Recombinant Expression and in vitro Folding of Proinsulin are Stimulated by the Synthetic Dithiol Vec-trase-P// FEMS Microbiology. 2003. V.213. P.225-230.

90. Woycechowsky K.J., Wittrup K.D., Raines R.T.I A Small-Molecule Catalyst of Protein Folding in vitro and in vivo // Chem. Biol. 1999. V.6. P.871-879.

91. Diers I., Kieldsen T. / Method for Making Insulin Precursors and Insulin Analog Precursors // United States Patent Application №20030040601,2003.

92. PfefferS.R., Rothman J.E. / Biosynthetic Protein Transport and Sorting by the Endoplasmic Reticulum and Golgi // Ann. Rev. Biochem. 1987. V.56. P.829-852

93. Thim L., Hansen M. Т., Norris K. / Secretion and Processing of Insulin Precursors in Yeast. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V.83.1. P.6766-6770.

94. Kjeldsen T.B., Ludvigsen S. / Method for Making Insulin Precursors and Insulin Precursor Analogues Having Improved Fermentation Yield in YeastII United States Patent Application №20020137144, 2002.

95. Cereghino G.P.L., Cregg G.M. / Application of Yeast in Biotechnology: Protein Production and Genetic Analysis. //Curr. Opin. Biotech-nol. 1999. V.10. P.422-427.

96. Панин Jl.E., Тузиков Ф.В., Потеряева О.Н. / Синтез Фрагментов Инсулина и Изучение их Физико-Химических и Иммунологических Свойств // Биоорганическая Химия. 1997. Т.23. №12. С.953-960.

97. Ludvigsen S., Roy М., Thogersen Н. I Insulin Human // New-York, Biochemistry. 1994. P.7998-8006.

98. NadlerJ.L., Baion T. W., Yamaguchi Y. / Method of Enhancing Insulin Action // United States Patents №6316458, 2001.

99. Tchelingerian, J.-L. / Insulin Conjugates and Methods of Use Thereof // United States Patent Application № 20030153490, 2003.

100. Кпюшниченко B.E., Якимов СЛ., Мальцев К.В., Арутюнян A.M., Иванов А.Е., Вульфсон А.Н. / Генно-Инженерный Инсулин Человека: 1. ВЭЖХ в Анализе Продуктов Основных Стадий Производства // Биоорганическая химия. 1992. Т. 18. №2. С. 1478-1486.

101. Зинченко А.А., Нокель Е.А., Толстое Д.Н., Гордеева Е.А., Баирамашвили Д.И., Мирошников А.И. / Способ Выделения Карбокси-пептидазы В // Патент РФ №2177997, 2002.

102. MansurM. / Expression, Purification and Characterization of Porcine Pancreatic Carboxypeptidase В from Pichia Pastoris for the Conversion of Recombinant Human Insulin // Enzyme and Microbial Technology. 2007. V.40. P.421-429.

103. Диксон М., УэббЭ. / Ферменты // Москва, Мир, 1966. С.2-146.

104. Poreth J., Fiodin P. / Gel Filtration: A Method for Desalting and Group Separation // Nature. 1983. V.2. P.1657-1659.

105. Смирнов А. В., Гукасова E.A., Баирамашвили Д.И., Мирошников А.И. / Способ Получения Гидрофильного Геля // Патент РФ, № 2187363, 2002.

106. Podesta A., Tiana G., MiianiР., Маппо М. / Early Events in Insulin Fibrillization Studied by Time-Lapse Atomic Force Microscopy.// Bio-phys J. 2006. V.90 (2). P.589-597.

107. Grudzielanek S., Jansen R., Winter R. / Solvational Tuning of the Unfolding, Aggregation and Amyloidogenesis of Insulin // J. Mol. Biol. 2005. V.351. P.879 -894.

108. Ahmad A., Uversky V. N. Hong D., Fink A. L. / Early Events in the Fibrillation of Monomeric Insulin // J. Biol. Chem. 2005. V.280. P.42669-42675.

109. Yu C.M., Chin C. Y., Franses E. /., Wang N.-H. L. / In situ Probing of Insulin Aggregation in Chromatography Effluents with Spectrotur-bidimetry// J. Colloid and Interface Science. 2006. V.299. P.733-739.

110. Nett/eton E. J., Tito P., Sunde M., Bouchard M., Dobson С. M„ Robinson C. V.I Characterization of the Oligomeric States of Insulin in Self-Assembly and Amyloid Fibril Formation by Mass Spectroscopy // Biophys. J. 2000. V.79. №2. P.1053-1065.

111. Ahmad A., Millett /. S., Doniach S., Uversky V. N., Fink A. L. / Partially Folded Intermediates in Insulin Fibrillation // Biochemistry.2003. V.42. P.11404-11416.

112. LouX., Zhu Q., LeiZ., Van Dongen J.L., Meijer E. W. / Simulation of Size Exclusion Chromatography for Characterization of Su-pramolecular Complex: a Theoretical Study//J. Chromatogr. A.2004. V.1029. P.67-75.

113. Yu C.M., Mun S., Wang N.-H.L. / Theoretical Analysis of the Effects of Reversible Dimerization in Size Exclusion Chromatography//J. Chromatogr. A. 2006. V.1132. P.99-108.

114. Yu C.M., Mun S., Wang N.-H.L. / Phenomena of Insulin Peak Fronting in Size Exclusion Chromatography and Strategies to Reduce Fronting // J. Chromatogr. A. 2008. V.1192. P.121-129.

115. Шматченко В. В., Шматченко Н.А., Байдусь А.Н., Купцов В.Н., Ноздрин В.Н., Степанов А.В. II Заявка на изобретение №2006137635А, 2008.

116. Obermeier R., Ludwig J., Sabel W. / Process for Isolating Insulin by High-Pressure Liquid Chromatography// United States Patent №5977297, 1999.

117. Купцов B.H., Байдусь A.H., Шматченко H.A., Борисов Н.В., Гор-кун Т.А., Борисова Т.Ю., Степанов А.В. / Оптимизация Условий Ферментативного Гидролиза При Производстве Генно-Инженерного Инсулина Человека. // Биотехнология. 2006. № 4. С.27-32.

118. BairamashviliD.I., Rabinovich M.L. I Russia Through the Prism of the World Biopharmaceutical Market // Biotechnol. J. 2007. V.2.1. P.801-817.

119. DickhardtR., Unger В., Grafe С. / Chromatographic Process for Purification of Insulin // United States Patent №5621073, 1997.

120. Sfevers W„ Bicker R., Desch D., Von Eysmondt J., KellerR., Richard F. / Procedure for the Chromatographic Purification of Insulins // United States Patent №6710167, 2004.

121. Thim L., Hansen M. Т., Sorensen A.R. / Secretion of Human Insulin by a Transformed Yeast Cell // FEBS Letters. 1987. V.212. №2.1. P.307-312.

122. LakhiariH., Legendre E., Muller D., Josefonvicz J. / High-Performance Affinity Chromatography of Insulin on Coated Silica Grafted with Sialic Acid // J. Chromatogr. B. 1995. V.664. P.163-173.

123. LackhiariH., Muller D. / Purification of IgG and Insulin on Supports Grafted by Sialic Acid Developing "Thiophilic-Like" Interactions // J. Chromatogr. B. 2005. V.818. P.53-59.

124. KunkelA., GunterS., Dette Ch., Watzig H. / Quantitation of Insulin by Capillary Electrophoresis and High-Performance Liquid Chromatography. Method Comparison and Validation // J. Chromatogr. A. 1997. V.781. P.445-455.

125. HoyerG.L., Nolan P.E., jr., LeDouxJ.H., Moore L.A. / Selective Stability-Indication High-Performance Liquid Chromatography Assay for Recombinant Human Regular Insulin // J. Chromatogr. A. 1995. V.699. P.383-388.

126. Sergeev N. V., Nazimov /. V., MiroshnikovA.I. / An Effective Analytical Procedure for Gradual Control of Recombinant Human Insulin Production //American Biotechnology Laboratory. 2001. V.9. P.52.

127. Mandrup G. / In-Process Control of Insulin Production by High-Performance Liquid Chromatography//Trends in Anal. Chem. 1992. V.11. №10. P.389-395.

128. Староверов C.M. / Хроматография в Отечественной Фармацевтической Промышленности // Рос. Хим. Фарм. Ж. 2003. T.XLVII. №1. С.111-118.

129. Калинин Ю.Т., Степанов А.В., Байдусь А.Н. / Способ Промышленного Получения Рекомбинантного Инсулина Человека // Описание Изобретения к Патенту Российской Федерации № 2003104596/13, 2003.

130. Lloyd L.L., Millichip М.1., Watkins J.M. / Reversed-Phase Poly (Sty-rene-Divinylbenzene) Materials Optimized for Large Scale Preparative and Process Purification of Synthetic Peptides and Recombinant Proteins//J. Chromatogr. A. 2002. V.944. P.169-177.

131. Protein Purification, Handbook// Protein Separations' Handbook Collection, Amersham Biosciences, Sweden, 2003.

132. European Pharmacopeia 4th Edition, Strasbourg, France, 2002, 4.02 version.

133. Hua Q.-X., Weiss M.A. / Mechanism of Insulin Fibrillation. The Structure of Insulin Under Amyloidogenic Conditions Resembles a Protein-Folding Intermediate // J. Biol. Chem. 2004. V.279. №20. P.21449-21460.

134. Grudzielanek S., Smirnovas V., Winter R.I Solvation-Assisted Pressure Tuning of Insulin Fibrillation: From Novel Aggregation Pathways to Biotechnological Applications // J. Mol. Biol. 2006. V.356. P.497-509.

135. Jansen R., Grudzielanek S., Dzwolak W., Winter R. / High Pressure Promotes Circularly Shaped Insulin Amyloid // J. Mol. Biol. 2005. V.338. P.203-206.

136. Mauro M., Craparo E.F., Podesta A., Bulone D., Carrotta R., Martorana V., Tiana G., Biagio P.L.S. / Kinetics of Different Processes in Human Insulin Amyloid Formation // J. Mol. Biol. 2007. V.366. P.258-274.

137. Majors R.E. / The Role of the Column in the Preparative HPLC // LCGC North America. 2004. V.22. №5. P.416-428.

138. Dickhardt R., UngerB., HafnerL. / Process for the Purification of Insulins by Chromatography // United States Patent № 5245008, 1993.

139. Стыскин Е.Л., ИциксонЛ.Б., Брауде Е.В. / Практическая Высокоэффективная Жидкостная Хроматография // М: Наука, 1986. С.1-282.

140. LiuX., SzabelskiP., KaczmarskiК., Zhou D., Guiochon G. / Influence of Pressure on the Chromatographic Behavior of Insulin Variants Under Non-Linear Conditions // J. Chromatogr. A. 2003. V.988. P.205-218.

141. Degerman M., Jakobsson N., NHsson B. / Modeling and Optimization of Preparative Reversed-Phase Liquid Chromatography for Insulin Purification //J. Chromatogr. A. 2007. V.1162 (1). P.41-49.

142. Swadesh J.K. / HPLC. Practical and Industrial Applications, Second Edition // CRC Press, USA, NY, 2001. P.1-480.

143. CazesJ., ScottR.P.W. / Chromatography Theory, Marcel Dekker, Inc., USA, NY, 2002. P.1-486.

144. PurcellA.W., Aguilar M.i., Hearn M. T. W. / Conformational Effects in Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography of Polypeptides. I. Resolution of Insulin Variants // J. Chromatogr. A. 1995. V.711. P.61-70.

145. Lough W.J., Wainer i.W. / High Performance Liquid Chromatography. Fundamental Principles and Practice // Blackie Academic & Professional, London, Glasgow, Weinheim, New York, Tokyo, Melbourne, Madras, 2000. P.1-282.

146. A WHO Guide To Good Manufacturing Practice (GMP) Requirements, Part 2: Validation // Geneva: World Health Organization, 1997. P.1-100.

147. Давлетбаева Л.Р., Исрафилов А.Г., Нигматуллин P.P., Хафизо-ва Р.Н. / Валидация Аналитических Методов Исследования // Уфа: Микроген, 2000. С.34-47.

148. Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation // Rockville, MD, USA: US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, 2001. P.1-22.

149. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceutaicals for Human Use, Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology (Q2(R1)) // ICH, Geneva, 2005. P.1-13.

150. Sandal I J.M., Millership J.S., Collier P. S., McElnayJ.C. / Development and Validation of an HPLC method for the Determination of Spironolactone and Its Metabolites in Paediatric Plasma Samples // J. Chromatogr. B. 2006. V.839. P.36-44.

151. Guiochon G., FeiingerA., ShiraziD.G., KattiA.M. / Fundamentals of Preparative 12 and Nonlinear Chromatography // Elsevier, San Diego, CA, 2006. P.1-262.

152. The MathWorks Inc., Optimization Toolbox For Use with MATLAB // MathWorks, 26 Natick, MA, 2005.

153. PoncinA. / Eurogentec Biologies Experience In the Field of Validation of the Biopharmaceutical Processes //Advancements, Applications and Theory in Downstream Processing, 5th HIC/RPC Biosepa-ration Conference, abstracts, Switzerland, lnterlaken, 2007.

154. Rodrigues R.C.R., Araujo J.M.M., Mota J.P.B. / Optimal Design and Experimental Validation of Synchronous, Asynchronous and Flow-Modulated, Simulated Moving-Bed Processes Using a Single-Column Setup // J. Chromatogr. A. 2007. 1162. P.14-23.

155. Reichard O., Niisson B.-Y., Rosenqvist U. / The Effect of Long-Term Intensified Insulin Treatment in the Development of Microvascular Complications of Diabetes Mellitus // N. Engl. J. Med. 1993. V.329. P.304-309.

156. WangP.H., Lau J., Chalmers T.C. / Meta-Analysis of Effects of Intensive Blood-Glucose Control on Late Complications of Type 1 Diabetes//Lancet. 1993. V.341. P.1306-1309.

157. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group, / Hypoglycaemia in the Diabetes Control and Complications Trial // Diabetes, 1997. V.46. P.271-286.

158. Starke A.A., Heinemann L., Hohmann A., Berger M. / The Action Profiles of Human NPH Insulin Preparations // Diabet. Med. 1989. V.6. P.239-244.

159. Jehle P.M., Micheler C., Jeh/e D.R., Breitig D., Boehm B.O. / Inadequate Suspension of Neutral Protamine Hagedorn (NPH) Insulin in Pens//Lancet. 1999. V.354. P.1604-1607.

160. Kelendorf K., Bojsen J., Deckert T. / Clinical Factors Influencing the Absorption of 1251-NPH Insulin in Diabetic Patients // Horn. Metab. Res. 1983. V.15. P.274-278.

161. Brange J.J. V., Norn's K., Hansen M. T. / Insulin Analogues and Method of Preparing the Same // European Patent Application №0214826, 1989.

162. Mrke E.A. / Artificially Prepared Analogs of Human Insulin // Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1979. V.360. P.1619-1632.

163. Shoe/son S., Fickova M., Haneda M., Nahum A., Musso G., Kaiser E. Т., Rubenstern A.H., Tager H. I Insulin Receptor Essential Sites for Binding Insulin // Proc. Nat. Acad. Sci. 1983. V.80. P.7390-7394.

164. Kobayashi M., Haneda M., Maegawa H., Watanabe N., Takada Y., Shigeta Y., Inouye К i Receptor Binding and Biological Activity of SerB24.-lnsulin, an Abnormal Mutant Insulin// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984. V.29. P.49-57.

165. Schwartz S, Modi P. i Pharmacodynamics of Oral Insulin in Healthy Volunteers // Diabetologia. 2000. V.43 (Suppl 1). P.A202.

166. Dreier К / The Bioactivity of Insulin Analogues From in vitro Receptor Binding to in vivo Glucose Uptake // Diabetes Metab. Rev. 1992. V.8. P.259-285.

167. Howey D.C., Bowsher R.R., Brunelle R.L., Woodworth J.R. / Lys (B28), Pro (B29).-human Insulin. A Rapidly Absorbed Analog of Human Insulin // Diabetes. 1994. V.43. P.396-402.

168. LindholmA. I New Insulins in the Treatment of Diabetes Mellitus // Best Practice & Research Clinical Gastroenterology. 2002. V.3.1. P.475-492.

169. TsuiE., BarnieA., Ross S., ParkesR., Zinman B. / Intensive Insulin Therapy With Insulin Lispro // Diabetes Care. 2001. V.24. P.1722-1727.

170. LuntH., KendallD., Moore M.P., Scott R.S., Cole D., Frampton C.M., Си/lens M. / Prospective Audit of Conversion from Regular to Lispro Insulin During Routine Clinical Care // Intern. Med. J. 2004. V.34. P.320-323.

171. Schernthaner G., Wein W., Shnawa N., Bates P.C., Birkett M.A. / Preprandial vs Postprandial Insulin Lispro A Comparative Crossover Trial in Patients With Type 1 Diabetes // Diabet. Med. 2004. V.21. P.279-284.

172. Woodworth J., HoweyD., BowsherR. I Lys (B28) Pro (B29). Human Insulin: Dose Ranging versus Humulin // Diabetes. 1993. V.42. P.54A.

173. Ter Braak E.W., Woodworth J.R., Bianchi R., Cerimele В., Erkelens D. W., Thijssen J.H., Kurtz D. I Injection Site Effects on the Pharmacokinetics and Glucodynamics of Insulin Lispro and Regular Insulin // Diabetes Care. 1996. V.19. P.1437-1440.

174. DeFeiiipis M.R., Bakaysa D.L., Bell M.A., Heady M.A., LiS., Pye S., Youngman KM., RadziukJ., Frank B.H. i Preparation and Characterization of a Co-Crystalline Suspension of LysB28,ProB29.-Human Insulin Analogue // J. Pharm. Sci. 1998. V.87. P.170-176.

175. Balschmidt P., Brange J.J. V. / Human Insulin Analogs // United States Patent Application №0020013269, 2002.

176. Brange J., Ribel U., Hansen J.F., Dodson G., Hansen M. Т., Have-lund S., Malberg S.G., Norris F., Norris K., SnelL. / Monomeric Insulins Obtained by Protein Engineering and Their Medical Implications // Nature. 1988. V.333. P.679-682.

177. Brange J. / The New Era of Biotech Insulin Analogues // Diabetolo-gia. 1997. V.40. P.S48-S55.

178. Owens D.R., Zinman В., BoHi G.B. / Insulins Today and Beyond // Lancet. 2001. V.358. P.739-746.

179. Heinemann L., Kapitza C., Starke A.A., Heise T. / Time-Action Profile of the Insulin Analogue B28Asp // Diabet. Med. 1996. V.13.1. P.683-684.

180. Lindhoim A., McEwen J., RiisA.P. / Improved Postprandial Glyceric Control With Insulin Aspart. A Randomised Double-Blind CrossOver Trial in Type 1 Diabetes // Diabetes Care. 1999. V.22. P.801-805.

181. Home P.D., Lindhoim A., Hyiieberg В., Round P. / Improved Glyceric Control With Insulin Aspart: a Multicenter Randomized Double-Blind Crossover Trial in Type 1 Diabetic Patients. UK Insulin Aspart Study Group // Diabetes Care. 1998. V.21. P.1904-1909.

182. Bott U., Ebrahim S., Hirschberger S., Skoviund S.E. I Effect of the Rapid-Acting Insulin Analogue Insulin Aspart on Quality of Life and Treatment Satisfaction in Patients With Type 1 Diabetes // Diabet. Med. 2003. V.20. P.626-634.

183. Robinson R.T.C.E., Harris N.D., Ireland R.H., Lindhoim A., Heller S.R. / Comparative Effect on Human Soluble Insulin and Insulin Aspart Upon Hypoglycaemia-lnduced Alterations in Cardiac Repolarization // Br. J. Clin. Pharmacol. 2003. V.55. P.246-251.

184. PettittD.J., Ospina P., KolaczynskiJ.W., Jovanovic L. / Comparison of an Insulin Analog, Insulin Aspart, and Regular Human Insulin With1.sulin in Gestational Diabetes Mellitus // Diabetes Care. 2003. V.26. P.183-186.

185. Airaghi L., LoriniM., TedeschiA. / The Insulin Analog Aspart: a Safe Alternative in Insulin Allergy// Diabetes Care. 2001. V.24. P.2000.

186. Yasuda H., Nagata M., Moriyama H., Fujihira K., Kotani R., Yamada K., Ueda H., Yokono K. / Human Insulin Analog Insulin Aspart Does Not Cause Insulin Allergy // Diabetes Care. 2001. V.24. P.2008-2009.

187. Ушакова О.В., Шапиро И.А. / Фармакоэкономическое Обоснование Перевода Больных Сахарным Диабетом 1-го Типа на Ин-сулиновый Аналог Короткого Действия «Аспарт» (Новорапид) // Проблемы Эндокринологии. 2006. Т.52. С.9-12.

188. Plank J., Wutte A., BrunnerG., Siebenhofer A., Semlitsch В., SommerR., Hirschberger S., Pieber T.R. / A Direct Comparison of Insulin Aspart and Insulin Lispro in Patients With Type 1 Diabetes // Diabetes Care. 2002. V.25. P.2053-2057.

189. Homko C„ DeluzioA., Jimenez C., Kolaczynski J. W., Boden G. / Comparison of Insulin Aspart and Lispro: Pharmacokinetic and Metabolic Effects // Diabetes Care. 2003. V.26. P.2027-2031.

190. Von Mach M.A., Brinkmann C., Hansen Т., Weilemann L.S., Beyer J. / Differences of Pharmacokinetic and Pharmacodynamic of Insulin Lispro and Aspart in Healthy Volunteers // Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 2002. V.110. P.416-419.

191. Rakatzi /., Ramrath S., Ledwig D., Dransfeld O., Barte/s Т., Seipke G., eckel J. / A Novel Insulin Analog With Unique Properties // Diabetes, 2003. V.52. P.2227-2238.

192. Rakatzi I., Seipke G., Eckel J. i LysB3, GluB29. Insulin: a Novel Insulin Analog With Enhanced Beta-Cell Protective Action // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. V.310. P.852-859.

193. BeckerR., FrickA., Wesseis D., Schoitz H. / Pharmacodynamic and Pharmacokinetics of a New, Rapidly Acting Insulin Analog, Insulin Glulisine // Diabetes. 2003. V.52. P.A110.

194. DaiieyG., Rosenstock J., Moses R.G., Ways K. / Insulin Glulisine Provides Improved Glycemic Control in Patients With Type 2 Diabetes // Diabetes Care. 2004. V.27. P.2363-2368.

195. Anderson J.H.,jr., De Fellipis M.R., Frank B.H., Havel H.A. / Insulin Analog Formulations// United States Patent №5547929, 1996.

196. Gonda I., Rubsamen R.M. / Method of Delivering Insulin Lispro // United States Patent №5970973, 1999.

197. Piakogiannis R., Nathan J.P., Rosenberg J.M. / Clinical Q&A: How Are Insulin Glargin and Insulin Aspart Different From the "Older Insulins"? // Drug Topics. 2000. V.144. P.41.

198. BolliG.B., Owens D.R. / Insulin Glargine // Lancet. 2000. V.356. P.443-445.

199. BolliG.B., DiMarchiR.D., Park G.D., Pramming S., Koivisto V.A. / Insulin Analogues and Their Potential in the Management of Diabetes Mellitus // Diabetologia. 1999. V.42. P.1151-1167.

200. Tan C. Y., Wilson D.M., Buckingham B. i Initiation of Insulin Glargine in Children and Adolescents With Type 1 Diabetes // Pediatric Diabetes. 2004. V.5. P.80-86.

201. Yki-Jarvinen H. i Insulin Therapy in Type 2 Diabetes: Role of the Long-Acting Insulin Glargine Analogue // European Journal of Clinical Investigations. 2004. V.34. P.410-416.

202. Aiemzadeh R., Ellis J.N., Holzum M.K., Parton E.A., Wyatt D. T. / Beneficial Effects of Continuous Subcutaneous Insulin Infusion and

203. Flexible Multiple Daily Insulin Regimen Using Insulin Glargine in Type 1 Diabetes // Pediatrics. 2004. V.114. P.e91-e95.

204. SchoberE., Schoenle E., Van Dyk J., Wernicke-Panten К / Comparative Trial Between Insulin Glargine and NPH Insulin in Children and Adolescents With Type 1 Diabetes // Diabetes Care. 2001. V.24. P.2005-2006.

205. Gomez-Perez F.J., Rull J.A. / Insulin Therapy: Current Alternatives //Archives of Medical research. 2005. V.36. P.258-272.

206. Wang F., Carabino J.M., Vergara C.M. / Insulin Glargin: A Systematic Review of a Long-Acting Insulin Analogue // Clinical Therapeutics. 2003. V.25. №3. P.1541-1577.

207. McKeage K, Goa K.L. / Insulin Glargine: A Review of Its Therapeutic Use as a Long-Acting Agentfor the Management of Type 1 and 2 Diabetes Mellitus // Drugs. 2001. V.61. P.1599-1624.

208. BergerM. / Safety of Insulin Glargine // Lancet. 2000. V.356. P.2013-2014.

209. Kiess W., Raile K., GallerA., Kapellen T. i Insulin Detemir Offers Improved Glycemic Control Compared With NPH Insulin in People With Type 1 Diabetes // Diabetes Care. 2004. V.27. P.2567-2568.

210. Ambler R.P. i Enzymatic Hydrolysis with Carbozipeptidases // Methods in Enzymology, V.25, part В Ed. by C.H.W.Hirs and S.N.Timasheff, Academic Press NY and London, 1972. P.143-154.

211. Gray W.R. / End-group Analysis Using Dansyl Chloride // Methods in Enzymology, V.25, part В Ed. by C.H.W.Hirs and S.N.Timasheff, Academic Press NY and London, 1972. P.121-138.

212. Владимирова Б.Г., Потапенко Н.А., Левина Н.Б., Модянов Н.Н. И Биологические Мембраны. 1990. Т.7. С.1256-1270.

213. Dixon Н.В., Perham R.N. / Reversible Blocking of Amino Groups with Citraconic Anhydride / Biochem. J. 1968. V.109. P.312-314.

214. Shetty J.K., Kinsella J.E. / Ready Separation of Proteins from Nucleoprotein Complexes by Reversible Modification of Lysine Residues // Biochem. J. 1980. V.191. P.269-272.

215. MossavaraliS., HosseinkhaniS., Ranjbar В., MiroliaeiM. / Stepwise Modofocation of Lysine Residues of Glucose Oxidase with citraconic anhydride // International Journal of Biological Macromolecules. 2006. V.39. P.192-196.

216. Sangeetha K., Abraham Т.Е. / Chemical Modification of Papain for Use in Alkaline Medium // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2006. V.38. P.171-177.

217. RozetECeccato A., Hubert C., Ziemons E., Oprean R., Rudaz S., Boulanger В., Hubert Ph.l Analysis of Recent Pharmaceutical Regulatory Documents on Analytical Method Validation // J.Chromatogr.A. 2007. V.1158. P.111-125.

218. Dejaegher В., Vander Y. Heydenl Ruggedness and Robustness Testing//J.Chromatogr.A. 2007. V.1158. P.138-157.

219. Novitsky T.J. // Пирогены немикробного происхождения, Бюллетень ЛАЯ-те ст. 2002. Т.2. С.5.

220. Ситников А.Г., Травина ПЛ., Багирова B.J1. // Современные подходы к определению пирогенности, М: Мир, 2007.

221. Wettings D.A. // A Practical Handbook of Preparative HPLC, Elsevier, Amsterdam, 2006. P.1-180.

222. Colin H, CoxG.B. II Large Scale Liquid Chromatography, Encyclopedia of Separation Science, Elsevier, Acad.Press, 2000. P.685-690.

223. CoxG.B., SnyderL.R. II Displacement Effects in Preparative Gradient High-Performance Liquid Chromatographic Separations / J.Chromatogr.A., 590, 1992, P.1-17.

224. Horvath C., NahumA., FrentzJ.H. II High-Performance Displacement Chromatography / J.Chromatogr. 218, 1981, P.365.

225. Vigh Gy., Varga-Puchony Z., Szepesi G., Gazdag M. Я Semi-Preparative High-Performance Reversed-Phase Displacement Chromatography of Insulins / J.Chromatogr. 386, 1987, P.353.

226. Kromidas S., Practical Problem Solving in HPLC, Weinheim, Germany, Willey-VCH, 2002. P.1-178.

227. Giddings J.C., Dynamics of Chromatography, NY, USA, Marcel Dekker, 1965. P. 1-56.

228. Anderson L., UngerF. //ACS Symposium Series, No.231, American Chemical Society, Washington, DC, 1983. P.1-101.

229. Drugs and Pharmaceutical sciences, vol.167. Endotoxins: Pyrogens, LAL Testing and Depyrogenation, Third Edition, edited by Williams K.L., Marcel Dekker, Inc., IN, USA, 2007. P.1-440.

230. Li Y., Lander R., Manger W., Lee A. / Determination of Lipid Profile in Meningococcal Polysaccharide Using Reversed-Phase Liquid Chromatography// J. Chromatogr. B. 2004. V.804. P.353-358.

231. Патрушев Jl.И., Баирамашвили Д.И., Мирошников А.И. // Патент Российской Федерации №2267534, 2006.