Хроматографический и масс-спектрометрический анализ модифицированных аналогов генно-инженерного инсулина человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.02, кандидат химических наук Корчажникова, Марина Николаевна

• Корчажникова, Марина Николаевна
• кандидат химических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат химических наук Корчажникова, Марина Николаевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ - - -

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР - - - - - - - - 10 1.1 Основные виды анатидиабетических средств - - -

1Л .1. Инсулин. Общая характеристика - - - -

1ЛЛЛ. Строение инсулина - - - - - -

1Л Л.2. Способы получения - - - - - -

1Л Л.3. Физикохимические свойства инсулина - - -

1Л Л.4. Лекарственные препараты - - - - -

1 Л.2. Модифицированные аналоги инсулина - - -

1Л.2Л. Инсулиноподобные аналоги - - - - -

1 Л.2.2. Химически модифицированные инсулины - -

1.1.2.2.1. Пэгилированные инсулины - - - -

1.1.2.2.2. Гликозилированные инсулины - - - -

1.1.2.2.3. Ацилированные инсулины - - - - - 28 1.2. Методы исследования и анализа инсулина и его модофицированных аналогов - - - - -

1.2.1. Методы разделения и определения места присоединения модифицирующего агента - - - - - -

1.2.2. Методы определения первичной структуры инсулина и его аналогов - - - - - - -39 1.2.2Л. Определение N-концевых аминокислот и последовательностей - - - - -

1.2.2.2. Опеделение С-концевых аминокислот - - -

1.2.2.3. Масс-спектрометрическое секвенирование - -

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Реактивы и материалы - - - - - - -

2.2. Приготовление рабочих растворов - - - - -

2.3. Приборы и оборудование - - - - - -

2.4. Общая методология работы - - - - - -

2.4.1. Анализ инсулина, дисахаридилинсулина и ПСА-инсулина методами ОФ ВЭЖХ и масс-спектрометрии - - -

2.4.2. Анализ инсулина, Lys-Pro-инсулина и Asp-инсулина методами ОФ ВЭЖХ и масс-спектрометрии - - -

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ - - - - -

3.1. Химически модифицированные инсулины - - -

3.1.1. Анализ дисахаридилинсулина - - - - -

3.1.2. Анализ полисиалированного инсулина - - -

3.2. Инсулиноподобные аналоги - - - - - - -79 ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Хроматографический и масс-спектрометрический анализ модифицированных аналогов генно-инженерного инсулина человека»

Актуальность работы. Сахарный диабет является социально значимым заболеванием и устойчиво занимает третье место в мире по смертности после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. Помимо тяжелого характера протекания, он опасен тем, что является причиной возникновения других тяжелых заболеваний, приводящих в лучшем случае к инвалидности, а часто и к летальному исходу. Инсулинозависимый диабет (диабет 1-го типа) в последние десятилетия устойчиво «молодеет», поражая даже детей. Поэтому борьба с диабетом, является приоритетом для органов здравоохранения всех стран.

В настоящее время для терапии диабета 1-ого типа чаще всего используют генно-инженерный инсулин человека (ГИИЧ). Крупномасштабное производство и поставки этого препарата в нашу страну осуществляет ряд крупных иностранных фирм. В России его производство началось в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (ИБХ РАН). К сожалению, ГИИЧ не всегда идеально регулирует уровень глюкозы в организме человека. Кроме того, его применение сопровождается рядом негативных явлений, включая протеолиз в потоке циркулирующей крови, преждевременное выведение, иммуногенность, небольшое время действия и т.п. По этой причине, наряду с производством рекомбинатного инсулина, идут разработки и внедрение в практику его модифицированных аналогов, которые отличались бы меньшей токсичностью и тем же самым, как минимум, или лучшим терапевтическим эффектом.

Модифицированные аналоги инсулина получают, используя два основных подхода. В одном случае проводят изменение первичной структуры полипептидной цепи ГИИЧ, удаляя определенный её фрагмент или изменяя часть аминокислотной последовательности. Достаточно удачными примерами осуществления этого подхода являются такие препараты как инсулин-аспарт, глулизин, инсулин-лизпро. В другом случае проводят химическую модификацию ГИИЧ, введением дополнительной боковой группы, используя для этого ряд соединений (сахара, полиэтиленгликоль, органические кислоты и т.п.). Целью таких модификаций является получение производных инсулина человека, обладающих большей устойчивостью к гидролизу в организме человека и меньшими побочными эффектами, присущими инсулинам предыдущих технологических поколений.

В ходе разработки указанных новых препаратов возникает ряд проблем, связанных с их синтезом, контролем качества, биодеградацией, определением их структуры. Решение данных проблем позволило бы найти эффективные пути совершенствования их качества и производства. В настоящее время не существует типовой (универсальной) схемы анализа инсулинов данного типа, позволяющей их объективно сопоставить с ГИИЧ. Актуальность темы данной диссертации заключается в разработке, с одной стороны, общей аналитической методологии, а с другой, конкретных методик определения строения новых производных инсулина человека, перспективных в качестве новых отечественных антидиабетических лекарств. Разработка таких отечественных препаратов позволила бы, во-первых, создать инсулины нового поколения с улучшенными терапевтическими свойствами, во-вторых, обеспечить пациентов необходимыми им лекарствами, в-третьих, уменьшить зависимость от импортных поставок, т.е. провести импортозамещение, что в условиях экономического кризиса является крайне актуальным, и, в-четвертых, обеспечить медицинскую и технологическую безопасность России.

В данной работе исследован ряд модифицированных аналогов инсулина, имеющих как неизмененные, так и измененные инсулиновые цепи. Эти соединения обладают пролонгированным действием, менее иммуногены, чем сам ГИИЧ. На их основе возможно создание ингаляционных лекарственных форм.

Цель работы заключается в разработке общих принципов и методологии изучения и анализа химически модифицированного ГИИЧ (дисахаридилинсулина, ПСА-инсулина) и инсулиноподобных аналогов с измененными инсулиновыми цепями (инсулина-аспарта и инсулин-лизпро), аналитическом обеспечения разработки с применением комплекса отечественного оборудования.

Задачи исследования:

Разработка типовой схемы анализа упомянутых препаратов; Отработка аналитических методик и режимов анализа, позволяющих проводить эффективный и рациональный аналитический контроль с использованием комплекса отечественного оборудования;

- Проверка эффективности разработанных методик на смесях пептидов - являющихся фрагментами образцов сравнения и инновационных разрабатываемых препаратов;

Исследование структуры модифицированных инсулинов (аминокислотной последовательности, определение места присоединения и числа молекул модифицирующих агентов в структуре инсулинов).

Научная новизна.

1. Разработана типовая схема анализа химически модифицированных ГИИЧ с применением пептидного картирования, ВЭЖХ, ESI- и MALDI-МС.

2. Разработан способ установления аминокислотной последовательности цистеин-содержащих инсулиноподобных аналогов, основанный на использовании комплекса химических (восстановление дисульфидных связей, модификация SH-групп с последующим ферментативным гидролизом выделенных пептидных цепей) и инструментальных методов (ВЭЖХ, МС-секвенирование).

3. Установлена структура гликозилированных инсулинов (ПСА-инсулина, дисахаридилинсулина), определены точки модификации полипептидных цепей ГИИЧ этими сахаридами.

Практическая значимость заключается в создании аналитического обеспечения процесса разработки модифицированных инсулинов с применением комплекса отечественного оборудования. Необходимость такого вида исследований обусловлена практической потребностью разработки и их внедрения в практику. Гликозилированные полипептиды представляют интерес как новые терапевтические средства. Методики разделения и определения структуры цистеин-содержащих пептидов являются универсальными и могут быть применены как для изучения инвертированных аналогов инсулина и образующихся в ходе получения ГИИЧ родственных инсулиноподобных примесей нормируемых фармакопейной статьей, так и для анализа любых двухцепочечных цистеин-содержащих пептидов.

На защиту выносятся: типовая схема анализа химически модифицированных (гликозилированных) инсулинов с неизмененными инсулиновыми цепями; результаты исследования пробоподготовки и анализа гликозилированных инсулинов, определения точки модификации полипептидных цепей ГИИЧ; способ установления аминокислотной последовательности инсулинов с измененной пептидной цепью, включающий комплекс химических (денатурация, восстановление дисульфидных связей, модификация SH-групп, ферментативный гидролиз и выделение модифицированных цепей) и инструментальных (ВЭЖХ и МС-секвенирование) методов анализа;

- результаты применения разработанного способа установления аминокислотной последовательности к образцам сравнения, для которых она надежно установлена.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов, (Россия, Санкт-Петербург, 2005); 16 Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2007», (Россия, Москва, 2007); Всероссийском симпозиуме «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях», (Россия, Москва, 2007); 34-ом международном симпозиуме «HPLC 2009 - High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques» (Германия, Дрезден, 2009), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Россия, Казань, 2009), Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии» (Россия, Самара, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ в виде статей и тезисов докладов.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы.

Заключение диссертации по теме «Аналитическая химия», Корчажникова, Марина Николаевна

выводы

1. Разработаны методология, типовая схема и методика анализа химически модифицированных аналогов ГИИЧ с применением комплекса методов пробоподготовки (ферментативный гидролиз), разделения (микроколоночная ВЭЖХ) и анализа (ОФ ВЭЖХ, МС-анализ).

2. Определено место присоединения модифицирующего агента в гликолизированных производных инсулина (дисахаридилинсулине и ПСА-инсулине). Показано, что присоединение гликозида происходит только по N-концевому остатку Phe В-цепи инсулина человека.

3. Установлено, что при масс-спектрометрическом анализе полисиалированного инсулина методом MALDI происходит разрыв дисульфидных связей в молекуле инсулина и расщепление гликозидных связей в молекуле полисиаловой кислоты. В масс-спектрах фрагментов полисиалированного инсулина присутствует только фрагмент инсулина, содержащий дисахаридный фрагмент полисиаловой кислоты.

4. Разработана типовая схема пробоподготовки (восстановление SH -групп, их химическая модификация, ферментативный гидролиз модифицированных цепей), разделения пептидных смесей (ВЭЖХ) и анализа (отечественный комплекс микро-ВЭЖХ-МС) аминокислотной последовательности инсулиноподобных пептидов, содержащих перестановку (инсулин-лизпро) и замену (инсулин-аспарт) аминокислоты в В-цепи инсулина человека.

5. Показана принципиальная возможность использования отечественного аппаратно-программного комплекса Proteos для определения измененной аминокислотной последовательности пептидов на примере В-цепей генно-инженерных инсулинов человека.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Корчажникова, Марина Николаевна, 2010 год

1. Barfoed Н.С. Insulin production technology. // Chem. Eng. Prog. -1987. -V.83.-P 49-54.

2. Ladish M.R. Kohlmann K.L. Recombinant human insulin. // Biotechnol. Prog. -1992. -V. 461. -P. 469-478.

3. Баирамошвили Д.И. Генно-инженерный инсулин человека: успехи и перспективы. // Рос. Хим. Ж. 2005. -Т. XLIX. -№ 1. -С. 34-45.

4. Zimmet P., Alberti К. Shaw global and societal implication of the diabetes epidermic. // Nature. -2001. -V. 414. -P. 782-787.

5. Watson J.D., Tooze J., Kurtz D.T. Recombinant DNA a short course scientific american books. N.Y.: W.H. Freeman Co. -1983. -P. 231-235.

6. Brange J. Galenics of insulin. // Berlin: Springer-Verlag. -1987. -P.l-179.

7. Owens D. R. New horizons-alternative routes for insulin therapy. // Nat. Rev. DrugDiscov. -2002. -V. 1. -P. 529-540.

8. Brange J., VolundA. Insulin analogs with improved pharmacokinetic profiles.// Adv. DrugDeliv. Rev. -1999. -V. 35. -P. 307 335.

9. Brange J. Protein delivery: Physical systems, NY: Plenum Press. -1997. -P. 343 -412.

10. Старостина Е.Г. Инсулин и инсулинотерапия: "темный лес" или стройная система? // В мире лекарств. -1998. -№2.

11. Morihara К., Ока Т., Tsuzuki Н. Semi-synthesis of human insulin. // United States Patent № 4.400.465, 1983.

12. Obermeier R. Process for the manufacture of human insulin // United States Patent № 4.029.642, 1977.

13. Van Dedem G.W.K., Van Houdenhofen F.E.A. Modified procine insulin and its use for preparing humani insulin. // United States Patent № 4.804.897, 1989.

14. Баирамашвили Д.И., Гусаров Д.А., Давыдов В.И., Зинченко А.А., Косарев С.А., Ласман В.А., Мирошников А.И., Михалев А.В., Шибанова Е.Д. Способ получения генно-инженерного инсулина человека. // Патент

15. Российской Федерации № 2322504 С1, заявка 26.06.2006, опубликован 20.04.2008 Бюл № 11.

16. Гусарова В.Д., Гусаров Д.А., Миронов А.Ф., Баирамашвили Д.И., Мирошников А.И. Оптимизация промышленного получения рекомбинантного инсулина человека. // Биоорганическая химия. -2009. -Т. 35. -№4. -С. 510-518.

17. Сергеев Н.В., Назимов И.В. Постадийный контроль производства рекомбинантного инсулина человека с помощью комплекса аналитических микрометодов. // Тезисы конференции Проблемы медицинской и экологической биотехнологии. Оболенск. 1999. С. 260.

18. Kjeldsen T. Yeast Secretory Expression of Insulin Precursors. // Application of Microbiological Technology. 2000. -V. 54. -P. 277-286Г68.

19. Nadler J.L., Balon T.W., Yamaguchi Y. Method of enhancing insulin action // United States Patent № 6316458, 2001.

20. Tchelingerian J.-L. Insulin conjugates and methods of use thereof // United States Patent Application № 20030153490, 2003.

21. Huus К, Havelund S., Olsen H. В., Weet M.van de, Frokjaer S. Thermal dissociation and unfolding of insulin // Biochemistry. -2006. -V. 45. -P. 4014 -4024.

22. Bhatnagar S., Srivastava D., Jayadev M. S. K., Dubey A. K. Molecular variants and derivatives of insulin for improved glycemic control in diabetes // Progr. in Biophysics and Molecular Biology. -2006. -V. 91. -P. 199 228.

23. Brange J. Studies of insulin stability // Netherlands, Academic Publishers. -1994. -P. 17-37.

24. Dodson G. G., Steiner D. The role of assembly in insulin's biosynthesis. // Curr. Opin. Struct. Biol. -1998. -V. 8. -P. 189 194.

25. Brange J., Langkjaer L. Chemical stability of insulin. 3. Influense of excipients, formulation and pH. // Acta Pharm. Nord. -1992. -P. 149 158.

26. Blundell T. L. Three-dimensional atomic structure of insulin and its relation to activity. //Diabetes. -1972. -V. 21. -P. 492 505.

27. Heinemann L., Starke AA.R., Hohmann A, Berger M. Timing between the subcutaneous administration of insulin and consumption of a carbohydrate rich meal. // Horm. Metab. Res. -1992. -V. 26(S). -P. 137 139.

28. Hvaas A., Skelbaek-Pedersen B. Determination of protamine peptides in insulin drug products using reversed phase high performance liquid chromatography // J. Pharm. and Biomed. Analysis. -2005. -V. 37. -P. 551 557.

29. Hallas-Moller K., Petersen K., Schlichtkrull J. Crystalline and Amorphous Insulin-Zinc Compounds with Prolonged Action // Science. -1952. -V. 116 (3015). -P.394 398.

30. Hoffman J. A, Chance R. E., Johnson M. G. Purification and analysis of the major components of chum salmon protamine contained in insulin formulations using high performance liquid chromatography. // Prot. Exp. Purif. -1990. -V. 1. -P. 127- 133.

31. Samuel S.E., Kolk AH, Rumke P. Studies on the immunogenicity of protamines in humans and experimental animals by means of a micro complement fixation test. //Clin. Exp. Immunol. -1978. -V. 33. -P. 252-260.

32. Ando Т., Yamasaki M., Suzuki К. Protamines, isolation, characterization structure and function//Berlin: Springer-Verlag, -1973. -P. 1 117.

33. Markussen J., Jonassen lb., Havelund S., Brandt J., Kurtzhals P., Hansen P.-H., Kaarsholm N. Ch. Insulin derivatives //United States Patent № 6620780, 2003.

34. Derewenda U., Derewenda Z., Dodson E. J., Dodson G. G.,Reynolds C. D., Smith G. D., Sparks C.,Swenson D. Phenol stabilizes more helix in a new symmetrical zinc insulin hexamer// Nature. -1989. -V. 338. -P. 594 596.

35. Yomota C, Yoshii Y, Takahata Т., Okada S. Separation of B-3 monodesamidoinsulin from human insulin by high-performance liquid chromatographi under alkaline conditions // J. Chromatogr. A. -1996. -V. 721. -P. 89 96.

36. Reichard O., Nilsson B.-Y.,Rosenquist U. The effect of long-term intensified insulin treatment on the development of microvascular complications of diabetes mellitus. //N. Engl. J. Med. -1993. -V. 329. -P. 304 309.

37. Wong P.H., Lau J., Chalmers T.S. Meta-analysis of effects of intensive blood-glucose control on late complications of type 1 diabetes. // Lancet. -1993. -V. 341. -P. 1306-1309.

38. Starke A.A., Heinemann L., Hohmann A., Berger M. The action profiles of human NPH insulin preparations. //Diabet. Med. -1989. -V. 15. -P. 239-244.

39. Jehle P.M., Micheler C., Jehle D.R., Breitig D., Boehm B.O. Inadequate suspension of neutral protamine Hagendorn (NPH) insulin in pens. // Lancet. -1999. -V. 354. -P. 1057- 1065.

40. Homko C., Deluzio A., Jimenez C., Kolaczynski J.W., Boden G. Comparison of insulin aspart and lispro: pharmacokinetic and metabolic effects // Diabetes Care. -2003. -V. 26. -P. 2027 2031.

41. Osterberger O., Erichsen L., Ingwersen S.H., Plum A., Poulsen H.E., Vicini P. Pharmacodynamics and pharmacokinetics of insulin and insulin analogs // J. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. -2003. -V. 30. -№ 3. -P 221-235(15).

42. Owens D. R., Zinman В., Bolli G. B. Insulins today and beyond. // Lancet. -2001.-V. 358.-P. 739-746.

43. Brange J. The new era of biotech insulin analogues. // Diabetologia. -1977. -V. 40. -P. S48 S55.

44. Balschmidt P., Brange J.J.V. Human insulin analogs. // United States Patent Application № 0020013269, 2002.

45. Plank J., Wutte A., Brunner G., Siebenhofer A., Semlitsch В., Sommer R., Hirschberger S., Pieber T.R. A direct comparison of insulin aspart and insulin lispro in patiets with type 1 diabetes. // Diabetes Care. 2002 V. 25. -№ 11. -P. 2053-2057

46. Becker R., Frick A., Wessels D., Scholtz H. Pharmacodynamic and pharmacokinetics of a new, rapidly acting insulin analog, insulin glulisin. // Diabetes. -2003. -V. 52. -P. A110.

47. Dailey G., Rosenstock J., Moses R.G., Ways K. Insulin glulisine provides improved glycemic control in patients with type 2 diabetes. // Diabetes Care. -2004. -V. 27. -P. 2363 2368.

48. Plakogiannis R., Nathan J. P., Rosenberg J. M. How are insulin glargine and insulin aspart different from the older insulins? // Drug Topics. -2000. -V. -144. -№22.-P. 41.-47.

49. Bolli G. В., Owens D. R. Insulin glargine. // Lancet. 2000. -V. 356. -P. 443 -445.

50. Bolli G. В., Di Marchi R. D., Park G. D., Pramming S., Koivisto V. A. Insulin analogues and their potential in the management of diabetes mellitus. // Diabetologia. -1999. -V. 42. -P. 1151 1167.

51. Tan С Y., Wilson D. M., Buckingham B. Initiation of insulin glargine in children and adolescents with type 1 diabetes. // Pediatric Diabetes. -2004. -V. 5. -P. 80 86.

52. Home P. Insulin glargine: the first clinically useful extended-acting insulin in half a century. //Expert Opin. Invest. Drugs. -1999. -V. 8 (3). -P. 307 314.

53. Berger M. Safety of insulin glargine. // Lancet. -2000. -V. 356. -P. 2013 -2014.

54. Calceti P., Salmaso S., Walker G., Bernkop-Schnurch A. A development and in vivo evaluation of an oral insulin-PEG delivery system. // Eur. J. Pharm. Sci. -2004. -V. 22(4). -P. 315-323.

55. Molineux G. Pegylation: engineering improved pharmaceuticals for enhanced therapy. // Cancer Treat. Rev. -2002. -V. 28 (A). -P. 13 16.

56. Pasut G., Veronese M. PEGylation of proteins as tailored chemistry for optimized bioconjugates //Adv. in Polymer Science. -2006. V. 192. -P. 95-134.

57. Gregoriadis G., Jain S., Papaioannou I., Laing P. Improving the therapeutic efficacy of peptides and proteins: A role for polysialic acids. // Int. J. of Pharmaceutics. -2005. -V. 300. -P. 125 130.

58. Caliceti P., Veronese F.M. Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates. // Adv. Drug Delivery Rev. -2003. -V. 55. -P. 1261-1277.

59. Gregoriadis G., McCormack В., Wang Z., Lifely R. Polysialic acids: potential in drug delivery. // FEBS Lett. -1993. -V. 315. -P. 271-276.

60. Gregoriadis G., Fernandes A., McCormack B. Polysialylated proteins. An approach to improving enzyme stability and half-life in the blood circulation. // S.T.P. PHARMA SCIENCES. -1995. -V. 9 (1). -P. 61-66.

61. Valuev L., Valuev L.I., Plate N.A. New possibilities for biospecific chromatography. // Appl. Biochem. and Microbiol. -2003 -V. 39. №. 4. -P. 422 -442.

62. Корчажникова M.H., Назимов И.В., Глубоков Ю.М., Безуглов В.В. Исследование полисиалированного генно-инженерного инсулина человека. / Вестник МИТХТ. -2009. -Т. 4. -№2. -С. 77-79.

63. Корчажникова М.Н., Назимов И.В., Глубоков Ю.М., Безуглов В.В. Хроматографический и масс-спектрометрический анализ анализ гликозилированного генно-инженерного инсулина человека. / Вестник МИТХТ. -2009. -Т. 4. -№ 5. -С. 37 39.

64. DennisM. S.,ZhangM.,Meng Y. G.,KadhodayanM., Kirchhofer D., Combs D., Damico L. A. Albumin binding as a general strategy for improving the pharmacokinetics of proteins. // J. Biol. Chem. -2002. -V. -277. -P. 35035 35043.

65. Kurtzhals P., Havelund S., Jonassen I., Kiehr В., Larsen U. D., Ribel U., Markussen J. Effect of fatty acids and selected drugs on the albumin binding of a long-acting, acylated insulin analogue. //Biochem. J. -1995. -V. 312. -P. 725 731.

66. KjeldsenT.B., Ludvigsen S., Kaarsholm R.C. Method for making insulin precursors and insulin precursor analogs // United States Patent Application №20010023069, 2001.

67. Balschmidt P., Brange J.J.V. Human insulin analogs. // United States Patent Application № 20020013269. 2002.

68. Gomez-Perez F. J., Rull J. A. Insulin therapy: current alternatives. // Arch, of Med. Res. -2005. -V. 36. -P. 258 272

69. Whittingham J. L., Havelund S., Jonassen I. Crystal structure of a prolonged-acting insulin with albumin-binding properties. // Biochemistry. -1997. -V.36. -№ 10. -P. 2826-2831.

70. Huus K., Havelund S, Olsen H.B., Marco van de Weert, Frokjaer S. Thermal Stability of insulin: effects of zinc and ligand binding to the insulin zinc-hexamer. // Pharm. Research. -2006 V. 23. -№ 11. -P. 2611 2611.

71. Сочилина К.О., Некипелова В.О., Гусаров Д.А. Гидрофобные полимерные гели российского производства для обессоливания и очистки белков. // Биофарм. Ж. -2009. -Т. 1. -№ 1. -С. 23 26.

72. Manzi Е., Higa Н., Diaz S., Varki A. Intramolecular self-cleavage of polysialic acid. //J. of Biological Chem. -1994. -V. 269. -№ 38. -P. 23617 23624.

73. Sadako Inoue, Shu-Ling Lin, Yuan Chuan Lee, Yasuo Inoue / An ultrasensitive chemical method for polysialic acid analysis.// J. of Biological Chem. -2005. -V. 280. -No. 46. -P. 38305-38316.

74. Sadako Inoue, Shu-Ling Lin, and Yasuo Inoue Chemical analysis of the developmental pattern of polysialylation in chicken brain. // J. of Biological Chem. -2000. -Y. 275. -№. 39. -P. 29968 29979.

75. Lloyd L.F,.Corran P. Н. Analysis of insulin preparations by reversed-phase high-performance liquid chromatography. // J. Chtomatogr. -1982. -V. 240. -P. 445 -454.

76. Rivier J., McClintock R. Reversed-phase high-performance liquid chromatography of insulin from different species. // J. Chromatogr. 1983. V. 268. P. 112-119

77. Yomota С., Yoshii Y, Takahata N.,Okada S. Separation of B-3 desamidoinsulin from human insulin by high-performance liquid chromatography under alkaline conditions. // J.Chromatogr. A. -1996. -V. 721. -P. 89 96.

78. Damgaard U, Markuseen T.J. Analysis of insulins and related compounds by HPLC. // Horm. Metab. Res. -1979.-V. II. -P. 580 581.

79. Parman, A. U. Rideout, J. M. Purification of porcine insulin by high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. -1983. -V. 256. -P. 283 -291.

80. McLeod A.N., Mauer.A., Wood.S.P. / High-performance liquid chromatography of insulin. //J.Chromatogr. -1990. -V. 502. -P. 325 336.

81. Guevara O.L., Estrada G., Antonio S., Alvarado X., Guereca L., Zamudio F., Bolivar F. Identification and isolation of human insulin A and В chains by high-performance liquid chromatography. // J.Chromatogr. -1985. -V. 349. -P.91 -98.

82. Seino S., Funakoshi A., Fu ZZ., Vinik A. Identification of insulin variants in patients with hyperinsulinemia by reversed-phase high-performance liquid chromatography. // Diabetes. -1985. -V. 34. -P. 1 7.

83. Peter A., Szepesi G., Balaspiri L., Burger K. Coordinative interactions in the separation of insulin and its derivatives by high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. -1987. V. 408. -P. 43 52.

84. Szepesi G, Gazgad M. Imroved high-performance liquid chromatographic method for the analysis of insulins and related compounds. // J. Chromatogr. -1981.-V. 218.-P. 597-602.

85. Szepesi G, Gazgad M. Separation of large polypeptides by high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. -1981. -V. 218. -P. 603 -612.

86. Pikal M.J., Rigsbee D.R. The Stability of insulin in cristalline and amorphous solids: observation of greater stability for the amorphous form. // Pharm.Res. -1997. -V. 14. -P. 1379 1387.

87. Rubinstein M Chen-Kiang S., Stein S., Udenfriend S. Characterization of proteins and peptides by high-performance liquid chromatography and fluorescence monitoring of their tryptic digests. // Anal.Biochem. -1979. -V. 95. -P. 117- 121.

88. Rivier J., McClintock. Reversed-phase high-performance liquid chromatography of insulins from different species. // J. Chromatogr. -1983. -V. 268.-P. 112- 119.

89. Kroeff E.P., Owens.R.A., Campbell E.L., Johnson R.D., Marks H.I. Production scale purification of biosynthetic human insulin by reversed-phase high-performancel liquid chromatography. //J. Chromatogr. -1989. -V. 461. -P. 45 -61.

90. Rubinstein M. Preparative high-performance liquid partition chromatography of proteins. // Anal. Biochem. -1979. -V. 98. -P. 1-7.

91. Welinder B.S., Sorensen H.H., Hansen B. Reversed-phase high-performance liquid chromatography of insulin. Resolution and recoveiy in relation to column geometry and buffer components. // J. Chromatogr. -1986. -V. 361. -P. 357 367.

92. Tuesca D., Reiff C., Joseph I., Lowman M. Synthesis, characterization and in Vivo efficacy of PEGylated insulin for oral delivery with complexation hydrogels. // Pharm. Res. -2009. -Vol. 26. -№ 3. -P. 727 739.

93. Nielsen,R.G.,Sittampalam G.S.,Rickard,E.C. Capillary zone electrophoresis of insulin and growth hormone // Anal. Biochem. -1989. -V. 177. -P. 20 26.

94. Yomota С., Matsumoto Y., Okada S., Hayashi Y., Matsuda R. Discrimination limit for purity test of human insulin by capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. B. -1997. -V. 703. -P. 139 145.

95. Arcelloni C., Fermo I., Banfi G., Pontiroli A.E., Paroni R. Capillary electrophoresis for protein analysis: separation of human growth gormone and human insulin molecular forms //Anal. Biochem. -1993. -V. 212. -P. 160 167.

96. Степанов B.M. Молекулярная биология. Структура и функции белков. -М.: Наука, 2005,-336 с.

97. Практическая химия белка / Под ред. А. Дарбре, пер.с англ. Н.А. Алданова, И.В. Назимов, П.Д. Решетова, М.: Мир, 1989, 611 с.

98. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. М: Просвещение, 1987, -815 с.

99. Лебедев А.Т. Масс-спектрометрия в органической химии. М.: Бином, 2003, - 493 с.

100. Артеменко К.А., Самгин Т.Ю., Лебедев А.Т. Масс-спектрометрическое de novo секвенирование пептидов // Масс-спектрометрия. -2006 -Т. -3. -№4. -С. 225-253.