Оптимизация процесса производства отечественного генно-инженерного инсулина человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Купцов, Василий Николаевич

• Купцов, Василий Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Купцов, Василий Николаевич

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава I. Сахарный диабет.

1.1 Классификация.

1.2 Клиника.

1.3 Лечение сахарного диабета.

1.4 Показания к применению инсулина человека.

Глава II. Открытие инсулина и его свойств.

2.1 История открытия инсулина.

2.2 Структура инсулина.

2.3 Биосинтез и секреция инсулина.

2.4 Аномальные инсулины человека.

2.5 Применение мутантных ГИИЧ в лечебных целях.

Глава III. Получение инсулина.

3.1 Химический синтез инсулина человека.

3.2 Получение полусинтетического инсулина.

3.3 Синтетико-ферментативный метод получения инсулина человека.

3.4 Получение генно-инженерного инсулина человека.

3.4.1 Использование эукариотов при производстве ГИИЧ.

3.4.2. Получение ГИИЧ при использовании рекомбинантных штаммов Е. coli

3.4.3. Ферменты, используемые при производстве ГИИЧ.

3.4.3.1. Трипсин.

3.4.3.2. Карбоксипептцдаза В.

3.4.4. Производство ГИИЧ в СССР и России.

3.4.5. Современное производство ГИИЧ в России.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава IV. Материалы и методы.

4.1 Материалы.

4.2 Исходный материал.

4.3 Оборудование.

4.4 Анализ экспериментальных материалов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава V. Разработка критериев оценки пригодности ферментов, используемых в производстве ГИИЧ при трансформации ГБ.

5.1 Ферменты, применяемые при производстве ГИИЧ.

5.2 Схема тестирования образцов трипсина.

5.3 Отбор препаратов трипсина, удовлетворяющих требованиям производства генно-инженерного инсулина человека.

5.4 Схема проверки новых партий карбоксипептидазы В.

Глава VI. Оптимизация процесса трансформации ГБ при получении инсулина.

6.1 Постадийный гидролиз ГБ с выделением промежуточных продуктов трипсинолиза

6.2 Постадийный гидролиз ГБ трипсином и карбоксипептидазой В без выделения промежуточных продуктов трипсинолиза.

6.3 Одностадийный гидролиз ГБ трипсином и карбоксипептидазой В.

6.3.1. Подбор оптимальной температуры для одностадийного гидролиза ГБ.

6.3.2 Подбор оптимального рН для одностадийного гидролиза ГБ.

6.3.3 Подбор оптимальных условий подготовки ферментов для одностадийного гидролиза ГБ.

6.3.4 Подбор оптимальных концентраций ферментов для одностадийного гидролиза ГБ.

Глава VII. Оптимизация условий хроматографической очистки диаргинининсулина.

7.1 Подбор оптимальной концентрации мочевины в буферных растворах.

7.2 Подбор оптимальной концентрации буферной соли в буферных растворах.

7.3 Масштабирование экспериментальных результатов на промышленный процесс.

Глава VIII. Использование результатов экспериментов в производстве ГИИЧ.

8.1 Проведение препаративного совместного гидролиза ГБ при получении ГИИЧ.

8.2 Проведение хроматографической очистки ГИИЧ на SP-Sepharose FF.

Глава IX. Получение ГИИЧ при использовании нового ГБ.

9.1 Проведение триптического гидролиза HINS11.

9.2 Разработка условий хроматографической очистки диаргинининсулина из трипсинолизата HINS11.

9.3 Разработка условий проведения совместного гидролиза HINS11.

9.4 Проведение экспериментальной хроматографии инсулина, полученного в результате совместного гидролиза HINS11.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Оптимизация процесса производства отечественного генно-инженерного инсулина человека»

Актуальность. Инсулин - гормон белковой природы, вырабатываемый Р-клетками поджелудочной железы для поддержания гомеостаза глюкозы в крови [1,2]. Недостаток инсулина в крови вследствие приобретенных или наследуемых факторов приводит к заболеванию сахарным диабетом (СД) [2, 3, 4]. Это системное заболевание, следствием которого является высокое содержание глюкозы в крови, вызывает поражение многих внутренних органов и систем организма, что неизбежно ведет к ухудшению качества жизни, а без лечения - к смерти. СД называют «болезнью цивилизации», т.к. первые его описания относятся к античным временам. Инсулин относится к жизненно важным лекарственным средствам, которые Всемирная организация Здравоохранения рекомендует самостоятельно производить тем странам, чье население превышает 50 млн. человек [5].

Впервые инсулин был выделен в чистом виде и применен для лечения в 1921 г., а уже в 1923 г. начато его массовое производство. В то время единственным доступным для промышленного использования источником инсулина являлись поджелудочные железы крупного рогатого скота и свиней, поступавшие с боен [1,6]. Этому способствовало отсутствие видовой специфичности в проявлении функций у инсулинов различного происхождения. Однако, по мере накопления данных о последствиях инсулинотерапии выяснилось, что у большого количества пациентов по мере применения животного инсулина развивается ряд серьезных осложнений: падает чувствительность к вводимому инсулину, что приводит к постоянной корректировке вводимой дозы; проявляются различные аллергические реакции, накапливаются антитела к инсулину и т.д. Данные проблемы связывали с развитием иммунной реакции, которая вызвана структурными отличиями инсулина человека от животных инсулинов [6]. Только в конце 50-х, начале 60-х годов XX века развитие молекулярной биологии позволило определить структуру инсулинов различного происхождения. Результаты данных исследований легли в основу разработок промышленного получения инсулина, идентачного человеческому, основными способами получения которого, в настоящее время, являются полусинтетический и биотехнологический. При использовании полусинтетического метода свиной инсулин подвергается химической модификации [1,6]. Биотехнологическим путем инсулин производят используя высокопродуктивные генетически измененные микроорганизмы. Полусинтетический метод полностью зависит от сырья, поступающего с боен. Биотехнологический метод лишен этого недостатка, так как потребляет только энергоресур-сы[7]. Также важным достоинством биотехнологического метода является простота масштабирования процесса. Поэтому, получение инсулина при помощи высокопродуктивных штаммов рекомбинантных микроорганизмов, обеспечивающих стабильный уровень экспрессии встроенного гена инсулина человека, становится актуальным. Однако в микроорганизмах инсулин синтезируется в виде неактивного биотехнологического предшественника, гибридного белка (ГБ), поэтому получение генно-инженерного инсулина человека (ГИИЧ) является сложным многостадийным процессом, основанным на нескольких этапах трансформации и препаративной очистке промежуточных продуктов и инсулина. Это отражается на выходе и стоимости генно-инженерного инсулина. В связи с этим значительно возрастает значение разработки оптимальной технологической схемы, обеспечивающей высокий выход, и чистоту конечного продукта. Основными направлениями по оптимизации технологии производства являются поиск легко вписываемых в существующую технологию, дающих заметный выигрыш по времени, уменьшающих себестоимость и легко масштабируемых решений на основе существующего оборудования.

Настоящая работа основана на исследованиях, проведенных по оптимизации стадии получения первичного инсулина (инсулина, имеющего чистоту 90-96% и являющегося сырьем для стадий финишной очистки инсулина методами высокоэффективной жидкостной, гидрофобной, гель-эксклюзивной хроматографий и др.) из ГБ. Работа проводилась в Федеральном государственном унитарном предприятии «22 Центральный научно-исследовательский испытательный институт Минобороны России». Результаты диссертации проверяли на базе существующего производства генно-инженерного инсулина человека в ОАО «Национальные биотехнологии». Проектирование данного производства было начато в 1996г. на основе совместных разработок коллективов ГНЦ ПМ (п. Оболенск) и ИБХ РАН им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова. В 2003г. в п. Оболенск была запущена производственная линия, основанная на получении ГИИЧ из гибридного белка, продуцентом которого являлся штамм E.coli JM109/pPINS07.

Целью исследования стало усовершенствование технологии получения генно-инженерного инсулина человека с целью снижения себестоимости и увеличения выхода конечного продукта.

Перед началом работы основными проблемами производства были:

• использование дорогих ферментов иностранного производства из-за отсутствия методик поиска более дешевых отечественных аналогов;

• применение буферных растворов с высоким содержанием мочевины при хромато-графической очистке диаргинининсулина (ДАИ) на промежуточной стадии получения ГИИЧ;

• применение технологической схемы трансформации ГБ в инсулин с большим количеством промежуточных стадий (т.н. схема «раздельного гидролиза»);

• низкое содержание инсулина в гибридном белке, продуцируемом штаммом E.coli JM109/pPINS07.

Таким образом, для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи исследования:

1. разработать методы оценки пригодности ферментативных препаратов протеаз для нужд биотехнологического производства;

2. найти более экономически выгодные и доступные отечественные препараты трипсина, для применения в процессе производства инсулина;

3. разработать оптимальную технологию хроматографической очистки инсулина и его предшественников на SP-Sepharose FF с использованием буферных растворов с меньшим содержанием мочевины, при сохранении объемов расходуемых буферных систем;

4. разработать новую более совершенную технологическую схему трансформации гибридного белка в инсулин;

5. разработать технологию получения инсулина человека, основанную на использовании нового, более экономически выгодного штамма-продуцента.

Практическая значимость.

Предложен метод ферментолиза и хроматографической очистки, позволяющий повысить выход конечного продукта инсулина с единицы гибридного белка и значительно снизить себестоимость продукта за счет применения 2-х М мочевины и замены импортных ферментов на отечественные.

Разработанная технология получения инсулина применяется при производстве ГИИЧ на ОАО «Национальные биотехнологии» (изменения к регламенту на производство субстанции генно-инженерного инсулина человеческого № ПР-50159728-01 -02). Получена приоритетная заявку на патент РФ № 2006137635 от 25.10.2006 на способ получения ГИИЧ. Использование результатов работы в производстве привело к увеличению производство ГИИЧ более чем в 3 раза, понизить себестоимость продукта на 65%, при этом экономический эффект составил около 30 млн. руб. в год.

Новый способ гидролиза и очистки позволил получать конечный продукт с чистотой 98%, что соответствует требованиям международной фармакопеи и ФСП на субстанцию инсулина. Разработанный алгоритм позволил статистически достоверно определять пригодность различных ферментных препаратов для нужд биотехнологического производства с наименьшими временными и денежными затратами. Использование нового метода очистки инсулина и его предшественников на SP-Sepharose FF с использованием буферных растворов на основе 2 молярной мочевины привел к снижению потребления мочевины в три раза не снижая чистоты получаемого полупродукта. Технология получения первичного инсулина, основанная на результатах исследований процесса совместного гидролиза гибридного белка и новом методе очистки инсулина, позволила значительно увеличить выход готовой продукции и снизить издержки производства, используя существующее оборудование. Разработанные технологические приёмы легли в основу новой технологии получения генно-инженерного инсулина на основе нового штамма-продуцента Е. coli JM109/pHINSl 1. Научная новизна.

1. Изучено влияние температуры, рН и количества ферментов на результаты триптиче-ского и совместного гидролизов PINS07.

2. Определено, что динамика накопления продуктов гидролиза при триптическом гидролизе ренатурированного гибридного белка, постоянна при условии, что гибридный белок состоит из лидерной последовательности, пептидного линкера GlySerHis^GlySerArg и про-инсулина человека.

3. Показано, что при очистке инсулина и его производных на сорбентах с сильными ка-тионообменными свойствами (например SP-Sepharose FF) можно использовать буферные системы на основе ацетата аммония с низким содержанием мочевины (до 2 М и менее) без увеличения временных затрат при получении полупродукта той же чистоты, как и при использовании буферных систем с высоким содержанием (6 М и более) мочевины. Данных результатов можно добиться путем увеличения ионной силы гидролизата и увеличения концентрации аммоний ацетата в используемых буферных растворах.

4. Предложен универсальный метод получения первичного инсулина при использовании штаммов-продуцентов ГБ, имеющих различные лидерные последовательности.

5. Разработан новый метод одновременного (совместного) гидролиза ГБ карбоксипептидазой В и трипсином в соотношении (1,25-40): 1, в котором для уменьшения количества трудноотделимых примесей используется трипсин, инкубированный 24 часа при 4 °С в 0,01 ННС1.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработан алгоритм позволяющий определить пригодность ферментативных препаратов для нужд биотехнологического производства генно-инженерных препаратов.

2. Показана возможность использования буферной системы на основе 2М мочевины при хроматографической очистке инсулина и его производных на SP-sepharose при том же расходе буферных растворов и с той же эффективностью, что и при использовании буферной системы на основе 6М. Для этого необходимо увеличить ионную силу наносимого материала и увеличить содержание буферной соли в буферных растворах.

3. Доказано, что проведение одновременного гидролиза гибридного белка ГИИЧ, состоящего из лидерной последовательности, пептидного линкера GlySerHis^GlySerArg и проинсулина человека, трипсином и карбоксипептидазой В необходимо проводить при t=5±l °С, рН=7,2±0,1, и при соотношении гибридный белок:трипсин:карбоксипешвдаза В = 1000:1,25:1. Перед использованием необходимо раствор трипсина в 0,01 Н НС1 с концентрацией 10 мг/мл инкубировать в течении 24 часов при 4 °С.

4. Разработана новая универсальная и масштабируемая технология получения ГИИЧ на основе штамма-продуцента Е. coli JM109/pHINSl 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В литературном обзоре обобщены данные о сахарном диабете, открытии инсулина, его структуре, свойствах и способах получения.

Гпава I. Сахарный диабет

Сахарный диабет - эндокринное заболевание, обусловленное абсолютной и/или относительной инсулиновой недостаточностью. Под абсолютной инсулиновой недостаточностью подразумевается сниженная секреция инсулина, а относительная - характеризуется потерей, в той или иной степени, чувствительности инсулинзависимых тканей к биологическому действию инсулина.

СД является самым распространенным заболеванием в промышленно развитых странах мира. По данным ВОЗ во всем мире насчитывается от 120 до 140 миллионов больных СД, причем к 2025 году прогнозируется увеличение числа больных в два раза [2, 5, 8,9].

По определению Всемирной организации здравоохранения сахарный диабет охарактеризован как неинфекционная эпидемия и по распространенности занимает третье место после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний [2,8,10].

1.1 Классификация

Существует два вида СД: тип I, инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД), и тип П, инсулиннезависимый сахарный диабет (ИНСД). Тип I характеризуется тем, что поджелудочная железа утрачивает свою способность вырабатывать жизненно необходимый инсулин. Этой формой чаще всего заболевают дети и подростки, однако наблюдается рост заболевания среди людей более зрелого возраста. Тип II обуславливается невосприимчивостью инсу-линовых рецепторов клеток [3,4,5].

1.2 Клиника

Симптомы неосложненного сахарного диабета обусловлены, главным образом, ин-сулиновой недостаточностью, что проявляется гипергликемическим синдромом. Поскольку инсулин обладает анаболическим действием, то при его дефиците больные худеют, несмотря на компенсаторно повышающийся аппетит, достигающий иногда степени булемии («волчий голод») [3,4,11].

Следует заметить, что не всегда удается однозначно определить по клиническим проявлениям и даже лабораторным признакам тип сахарного диабета, особенно, когда он развивается после 30 лет. Тогда тип диабета определяется клиницистом относительно произвольно, с учетом преобладания у больного признаков, характерных для одного из его типов^, 12].

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Купцов, Василий Николаевич

выводы

1. Усовершенствована технология производства инсулина человека, позволившая увеличить выход готового продукта в 2 раза при снижении его себестоимости более чем на 60%.

2. Разработана новая схема очистки продуктов гидролиза ГБ на сорбенте SP-sepharose FF с применением буферной системы на основе 2 М мочевины. Добавление в гидролизат ГБ КС1 до концентрации 140 мМ и использование буферной системы на основе 2М мочевины и ЮОмМ NH4AC позволило, не уменьшая выход продукта и степень очистки, оставить расход буферных растворов при хроматографической очистке на том же уровне, что и при использовании буферной системы на основе 6М мочевины.

3. Создана оригинальная методика проведения совместного гидролиза ГБ трипсином и карбоксипептидазой В, в разработке которой использованы данные полученные при поиске оптимальных условий процесса трипсинолиза ГБ. В результате быж определены и статистически достоверно доказаны промышленные условия совместного гидролиза ГБ: t=5±l °С, рН=7,1±0,1, соотношение белок: карбоксипептидаза В: трипсин = 1000:1,25:1. Перед использованием необходимо инкубировать раствор трипсина с концентрацией 10 мг/мл в течении 24 часов в 0,01Н НС1 при 4 °С.

4. Впервые была разработана технологическая схема получения ГИИЧ, основанная на использовании нового штамма Е. coli JM109/pHINSll, продуцента рекомбинантного белка HINS11.

5. Технология получения инсулина, основанная на проведении совместного гидролиза ГБ и последующей хроматографической очистке инсулина человека на SP-Sepharose FF с применением буферных растворов на основе 2М мочевины, является универсальной для использования в биотехнологическом производстве ГИИЧ и масштабируемой в производственных условиях.

6. Получен алгоритм определения пригодности различных препаратов протеолитиче-ских ферментов для нужд биотехнологического производства, основанный на выявленном наборе критериев.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Купцов, Василий Николаевич, 2007 год

1. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. М.: Просвещение, 1987, с.247-249.

2. Zimmet P., Alberti K.G., Shaw J. Nature, 2001, v.414, p. 782-787.

3. Аметов A.C. Российский медицинский журнал, 1998, т.6, № 12, с. 1321-1324.

4. Чазова Т.Е. Российский медицинский журнал, 2003, т.11, № 27, с. 1507-1514.

5. Дедов И.И. Сахарный диабет в Российской Федерации: проблемы и пути решения. Сахарный диабет. 1998, №1, с. 212-285.

6. Старостина Е.Г. Инсулин и инсулинотерапия: «темный лес» или стройная система? В мире лекарств, 1998, №2, с. 32-39.

7. КоледоваЕ.А. Современные проблемы инсулинотерапии. Сахарный диабет. 2001, № 12, с. 66-69.

8. Klyushnichenko V., Bruch R., Bulychev A. e. a. Bioprocess International, 2004, v. 2, №8, p. 48-59.

9. Хигинс И., Бест Д., Джонс Дж. Биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 1988, с. 325—338.

10. Amos A., McCarty D., Zimmet P. Diabetes Med. 1997. - №14. - P. 57-85.

11. Балаболкин М.И., Клебанова E.M., Креминская B.M. Патогенез ангиопатий при сахарном диабете. Сахарный диабет. 1999, №1, с. 212-285.

12. Кудрякова С.В., Сунцов Ю.И. Смертность среди больных сахарным диабетом по данным территориального регистра. Сахарный диабет. 2001, №12, с. 12-20.

13. Kjeldsen Т., Appl. Microbiol. Biotechnol, 2000, v. 54, p.277-286.

14. Sanger F., Tuppy H. The amino acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin. Biochem. J., 1951, v.49, p.463-490.

15. Sanger F., Thompson E.O. The amino acid sequence in the glycyl chain of insulin. Biochem. J., 1963, v.53, p.353-374.

16. Ladish M.R., Kohlmarm K.L. Recombinant Human Insulin. Biotechnol. Prog., 1992., v. 8., p. 469-478.

17. Farias R.N., Lopez Vinals A.E., Posse E., Morero R.D. Relationship between isoelectric point of native and chemically modified insulin and liposomal fusion. Biochem J., 1989., v.264., p.285-287.

18. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рефф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. Москва, Мир, 1994.

19. Brown Н., Sanger F., Kitai R. The structure of sheep and pig insulin. Biochem. J., 1955, v.60, p. 556-565.

20. Nicol S., Smith L.F. Amino-acid sequence of human insulin. Nature, 1960, v. 187, p.433.

21. Dolan-Heitlinger J. Recombinant DNA and Biosynthetic Human Insulin, A Source Book. Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN, 1982.

22. Derewenda U., Derewenda Z„ Dodson E.J. e. a. Nature, 1989, v. 338, p. 594 596.

23. Bentley G., Dodson E., Dodson G., Hodgkin D., Mercola D. Structure of Insulin in 4-zinc insulin. Nature. 1976, v.261,p. 166-168.

24. Mirmira R.J., Tager H.S. J. Biol. Chem., 1989, v. 264, p. 6349-6354.

25. Olsen H.B., Ludvigsen S„ Kaarsholm N.C. Biochemistry, 1996, v. 35, p. 8836-8845.

26. Марри P., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. М.: Мир, 1993, т. 2, с. 247-263.

27. Hales C.N. Actions of hormones in the regulation of glucose metabolism. Essays in Biochemistry, 1967, v. 3,p. 73-104.

28. Степанов В. М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. Москва, Высшая школа, 1996.

29. Steiner D.F., Oyer P.F. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1967, v. 57, p. 473-480.

30. Steiner D.F., Hallund 0., Rubenstein A. e. a. Diabetes, 1968,v. 17, p. 725-736.

31. Biden T. J. Signal transduction events in the regulation of insulin. Proc. Austral. Physiol, and Pharmacol. Soc., 1997,28, № 1, p. 84.

32. Zierath J.R., Handberg A., Tally M., Wallberg-Henriksson H. C-peptide stimulates glucose transport in isolated human skeletal muscle independent of insulin receptor and tyrosine kinase activation, Diabetologia, v.39, p.306-313.

33. Cheatham В., Kahn C.R. Insulin action and insulin signaling network. Endocrine Rev., 1995, №16, p.l 17-142.

34. Scrutton M.C., Utter M.F. The regulation of glycolysis and gluconeogenesis in animal tissues, Ann. Rev. Biochem., 1968, v. 37, p. 249-302.

35. Given B.D., Mako M.E., Tager H.S., Baldwin D., Markese J., Rubenstein A.N., Olef-sky J., et al. Diabetes due to secretion of an abnormal insulin. N. Engl. J. Med., 1980, v.302, p. 129-135.

36. Tager H.S., Given В., Baldwin D., Mako M., Markese J. et al. A structurally abnormal insulin causing human diabetes. Nature, 1979, v.281. p. 122-125.

37. Kwok S.C.M., Chan S.J., Rubenstein A.N., Poucher., Steiner D.F. Loss of restriction endonuclease cleavage site in the gene of a structurally abnormal insulin. Biochem. Bio-phys. Res. Commun., 1981, v. 98, p.844-849.

38. Shoelson S., Haneda M., Blix P., Nanjo K., Sanke Т., Inouye K., Steiner D. et al. Three mutant insulins in man. Nature, 1983, v.302, p.540-543.

39. Kwok S.C.M., Steiner D.F., Rubenstein A.N., Tager H.S.Identification of the mutation giving rise to insulin Chicago. Diabetes, 1983, v.32, p.872-875.

40. Quiocho F.A., Lipscomb W.N., Adv. Protein Chem., 25,1,1971.

41. Балаболкин М.И. 35-я ежегодная конференция Европейской Ассоциации по изучению диабета. Сахарный диабет. 2001, № 12, с. 35-40.

42. Hirsch I. Insulin analogues. N. Engl. J. Med., 2005, v.352, p. 174-183.

43. Gerich J. Insulin glargine: long-acting basal insulin analog for improved metabolic control. Curr. Med. Res. Opin., 2004, v. 20, p. 31-37.

44. Klein R, Klein ВЕК, Moss SE. Relation of glycemic control of diabetic microvascular complications of diabetes mellitus. Ann Int Med, 1996, v. 124, p. 90-96.

45. Owens D.R., et al. Pharmacokinetics of 1251-labeled insulin glargine in healthy men: comparison with NPH insulin and the influence of different subcutaneous injection sites. Diabetes Care, 2000, v. 23, p. 813-819.

46. Yki-Jarvinen H. Combination therapy with insulin and oral agents. Optimizing glycemic control in patient with type 2 diabetes mellitus. Diabetes Met Res Rev. 2002, v. 18(suppl.3), p. 77-87.

47. Yki-Jarvinen H. Insulin therapy in type 2 diabetes: role of the long acting insulin glargin analogue. Eur J Clin nvest 2004, v. 34, p. 410-416.

48. Fritsche V.M., et al. Glimepiride combined with morning insulin glargin, bedtime NPH insulin, or bedtime insulin glargine in patients with type 2 diabetes mellitus. A randomized control trial. Ann Intern Med. 2003, v. 138, p. 952-959.

49. US Patent №6444641,03.09.2002.

50. US Patent №5939387,17.08.1999.

51. Australian patent № 199965392,02.03.2000.

52. Dixon G. H., Wardlow A.C. Regeneration of insulin activity from the separated and inactive A and В chains. Nature, 1960, v. 186, p. 721.

53. Шредер Э., Любке К. Пептиды. М., 1969, Т. 2, с. 468.

54. Hirschmann R., Nutt R.F., Veber D.F., Vitali R.A., Varga S.L. at all. Studies on the total synthesis of an enzyme. The preparation of enzymatically active material. J. Am. Chem. Soc., 1969, v. 91, p.507-508.

55. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы, т.1. Генетическая и белковая инженерия. М.: Наука, 2004, с. 171-173.

56. Cereghino G.P.L., Cregg G.M. Curr. Opin. Biotechnol, 1999, v. 10, p. 422-427.

57. Watson J.D., Tooze J., Kurtz D.T. Recombinant DNA-A short course. Scientific American Books. W.H. Freeman Co., New York, 1983, p. 231-235.

58. Markussen J., Fill N., Ammerer G., Hansen M.N., Thim L., Norris K. Insulin precursors, process for their preparation and process for preparing human insulin from such Insulin precursors. European patent 0 163 529, Bulletin 65.

59. Thim L., Norris K., Hansen M.T. Insulin precursors, process for the preparation of human insulin. European patent 0 195 691, Bulletin 86/39,24.09.86.

60. Kjeldsen Т., Brandt J., Andersen A.S. e.a. Gene, 1996, v. 170, p. 107-112.

61. Thim L., Hansen M.T., Norris K. e.a. PNAS USA, 1986, v. 83, p. 6766-6770.

62. Kjeldsen Т., Petterson A.F., Hach M. J. Biotechnology, 1999, v.75, p. 195-208.66 US Patent №4,946,828.

63. Brange J. Galenics of Insulin. Berlin-Heidelberg, Springer-Verlag, 1987, p. 1-99.

64. Goeddel D.V., Kleid D.G., Bolivar F. e.a. PNAS USA, 1979, v.76, p.106-110.

65. CreaR., Kraszewski A., Hirose T. e.a. Ibid., 1978, v. 75, p. 5764-5769.

66. Miller W.L., Baxter J.D. Diabetologia, 1980, v. 18, p. 431-436.

67. Williams D.C., Frank R.M., Muth W.L., e.a. Science, 1982, v. 215, №5, p. 687-689.

68. Хиггинс И., Бест Д., Джонс Дж. Биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 1988, с. 325-338.

69. Burnett J.P. Experimental Manipulation of Gene Expression. N.Y.: Acad. Press, 1983, p. 261-271.

70. Nilsson J., Johansson P., Samuelson E., Stahl S., Uhlen M. Integrated production of human insulin and its C-peptide. J. Biotechnology 1996, V. 48, p. 241-250.

71. Kroeff E.P., Owens R.A., Campbell E.L., Johnson R.D., Marks H.I. Production Scale Purification of Biosynthetic Human Insulin by Reversed-Phase High-Perfomance Liquid Chromatography. J. Chromatography, 1989, v. 461, p. 45-61.

72. Frank B.H., Chance R.E. Two routes for producing human insulin utilizing recombinant DNA technology. Munch Med Wochenschr. 1983, Suppl. 1:P, S14-20.

73. Johansson P., Nilsson J., Samuelson E., Moks Т., Stahl S., Uhlen M. Eur. J. Biochemistry, 1988, v. 236, p. 656-661.

74. Ленинжер А.Л. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функции клетки. Пер. с английского Москва, Мир, 1974.

75. Бернхард С. Структура и функция ферментов. Пер. с английского Москва, Мир, 1971.

76. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. Пер. с английского Москва, Мир, 1966.

77. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов . Пер. с английского Москва, Мир, 1980.

78. Blow D.M. Structure and mechanism of chymotrypsin. Acc. Chem. Res., v.9, p.142-152.

79. Matthews B.W., Singler P.B., Henderson R„ Blow D.M. Nature, Lond., 1967, v.214, p. 652.

80. Stroud R.M., Kay L.M., Dickerson R.E., J. molec. biol., 1974, v.83, p. 185.

81. Shotton D.M., Watson H.C., Nature., Lond. 225,811,1970.

82. Уэбб Л., Ингибиторы ферментов и метаболизма. Пер. с английского Москва, Мир, 1966.

83. Bier M., Nord F.F. On the mechanism of enzyme action. XLVI. The effect of certain ions on crystalline trypsin and reinvestigation of its isoelectric point. Arch. Biochem. Biophys., 33,320, 1951.

84. Buck F. F., Vithayathil A. J., Bier M., Nord F. F. On the mechanism of enzyme action. LXXIII. Studies on trypsins from beef, sheep and pig pancreas.— Arch. Biochem. Biophys., 97,417,1962.

85. Folk J. E. A new pancreatic carboxypeptidase. J. Amer. Chem. Soc., 78,3541,1956.

86. Weil L., Seibles T.S., Telka M. Studies on the specificity of protarminase. Arch. Biochem. Biophys., 79,44,1959.

87. Folk J. E., Gladner J. A. Carboxypeptidase В. I. Purification of the zymogen and the specificity of the enzyme.- J. Biol. Ghem., 231,379,1958.

88. Folk J. E., Gladner J. A. Carboxypeptidase В. II. Mode of action on protein substrates and its application to carboxyl terminal group analysis.—J. Biol. Ghem., 231,393,1958.

89. Jones D. D., .Miller W. G. Studies on the action of carhoxypeptidase В on polylysine.-Biochim. biophys. acta, 159,411,1968.

90. Wolff E. C., Schirmer E. W„ Folk J, E. The kinetics of carboxypeptidase В activity. I. Kinetic parameters.—J. Biol Chem., 237,3094,1962.

91. Shmid M.F., Herriot J.R., J. molec. Biol., 103,175 1976.

92. Folk J. E., Gladner J. A. Garboxypeptidase В. III. Specific esterase activity. • Bio-chim. biophys. acta, 33, 570, 1959.

93. Folk J. E., Piez K. A., Carroll W. R., Gladner J. A. Garboxypeptidase В. IV. Purification and characterization of the porcine enzyme. J. Biol. Chem., 235,2272, 1960.

94. Cox D. J., Wintersberger E.t Neurath H. Bovine pancreatic procarboxypeptidase B. П. Mechanism of activation,Biochemistry, 1,1078,1962.

95. Folk J. E., Gladner J. A. Influence of cobalt and cadmium on the peptidase and esterase activities of carboxypeptidase B. Biochim. biophys. acta, 48,139,1961.

96. Folk J. E., Wolff E. C., Schirmer E. W. The kinetics of carboxypeptidase В activity. II. Kinetic parameters of the cobalt and cadmium enzymes. J. Biol. Chem., 237, 3100, 1962.

97. Prahl J. W., Neurath H. Pancreatic enzymes of the spiny Pacific dogfish. II. Procarboxypeptidase В and carboxypeptidase B. Biochemistry, 5,4137,1966.

98. Wintersberger E., Cox D. J., Neurath H. 1962. Bovine pancreatic procarboxypeptidase B. I. Isolation, properties, and activation. Biochemistry, 1,1069,1962.

99. Инсулин человека ВФС 42-212892 от 19.06.1992, МЗ РФ.

100. The United States Pharmacopeia. Philsdelphia, USA. 2000. (USP24), Suppl. 3.

101. European Pharmacopeia 4th Edition. Strasbourg, France. 2002.4.02 Version.

102. Патент РФ RU 2208637 16.04.2002.

103. Баирамашвилн Д.И. Генноннженерный инсулин человека: успехи и перспективы. Российский химический журнал. М.: 2005, т. XLIX, №1.

104. Патент РФ RU2208637,16.04.2002.

105. US Patent №6,281,329,28.08.2001.

106. US Patent № 6,699,692,02.03.2004.

107. US Patent № 6,509,452,21.01.2003.

108. European Patent CY1830,01.12.1995.

109. US Patent US5457066,10.10.1995.

110. US Patent №6,068,993,30.05.2000.

111. Патент РФ RU 2144957,26.02.1999.

112. Патент РФ RU 2141531,26.05.1999.

113. Приоритетная заявка на патент РФ № 2006137635 от 25.10.2006.

114. ОСТ 42-510-98. Правила организации производства и контроля качества лекарственных средств (GMP).

115. Markussen J. Proteolytic Degradation of proinsulin and of the intermediate forms: Application to Synthesis and Biosynthesis of insulin. Proceedings of the Symposium on Proinsulin, Insulin and C-peptide. Tokushima, 1978, p. 50-62.

116. Chance R.E., Ellis R.M., Bromer W.W. Porcine proinsulin: characterization and amino acid sequence. Science. 1968, v. 161, p. 165.

117. Сергеев H.B. Использование инструментальных микрометодов анализа для постадийного контроля процесса получения рекомбинантного инсулина человека. Диссертация к.х.н. ИБХ РАН. Москва. 2000 г. с. 92.

118. Welinder B.S., Linde S. High Perfomance Ion Exchange Chromatography of Insulin and Insulin Derivatives. In CRC Handbook of HPLC for the Separation of Amino Acids, Peptides and Proteins., 1981, v.2., p. 357- 362.

119. Уильяме Б., Уилсон К. Методы практической биохимии. Пер. с английского Москва, Мир, 1978.

120. US Patent №1218888,24.04.1997.

121. US Patent №55089252,05.07.1980.

122. US Patent №4459226,07.09.1983.