Использование инструментальных микрометодов анализа для постадийного контроля процесса получения рекомбинантного инсулина человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Сергеев, Николай Валентинович

• Сергеев, Николай Валентинович
• кандидат химических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат химических наук Сергеев, Николай Валентинович

ВВЕДЕНИЕ.

1.СТРУКТУР А ИНСУЛИНА.

2. МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА.

2.1. Полный химический синтез.

2.2. Полусинтетический.

2.3. Биотехнологический.

2.3Л. Двухцепочечный метод.

2. J.2. Метод получения инсулина человека через природный предшественник ~ проинсулин.

2.3.3. Метод получения инсулина человека через секретируемый предшественник в дрожжах S.cerevesiae.

3.ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИНСУЛИНА.

4. КОНТРОЛЬ ПРОИЗВОДСТВА ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА.

5. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА СУБСТАНЦИИ ИНСУЛИНА.

5.1. Требования к чистоте и подлинности инсулина.

5.2. Гель-фильтрация.

5.3. Электрофорез в полиакриламидном геле.

5.4. Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография.

5.4.1.Влияние природы и рН буферного раствора.

6.2.2.Механизм удерживания и способ элюирования.

5.4.3. Природа органического модификатора.

5.4.4. Тип стационарной фазы.

5.4.5. Влияние температуры колонки.

5.5. Капиллярный электрофорез.

5.5.1. Природа и рН буферного раствора.

5.5.2. Приложенное напряжение.

5.5.3. Влияние типа и длины капилляра.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Использование инструментальных микрометодов анализа для постадийного контроля процесса получения рекомбинантного инсулина человека»

Сахарный диабет по распространенности и тяжести заболевания занимает третье место после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний, причем только в Российской Федерации количество больных достигает 2 млн.человек. Основным антидиабетическим средством до сих пор остается инсулин - гормон, состоящий из двух полипептидных цепей, соединенных дисульфидными связями, и включающий в свой состав 51 аминокислотный остаток. На протяжении многих десятилетий основным источником инсулина была поджелудочная железа крупного рогатого скота и свиньи, и только в последнее время положение пациентов в развитых странах заметно улучшилось из-за повышения качества препаратов и, в основном, благодаря переходу от инсулинов животных на генно-инженерный инсулин человека (ГИИЧ), который сводит к минимуму осложнения и побочные иммунные реакции [1].

Биотехнологический метод получения ГИИЧ в настоящее время является наиболее перспективным, главным образом, из-за отсутствия ограничений по источнику исходного сырья и относительно низкой стоимости конечного продукта, поэтому разработка отечественной технологии получения ГИИЧ имеет большое значение, так как позволит покрыть дефицит инсулина и снизить затраты валютных средств на закупку препарата за рубежом.

Кроме того, независимо от источника сырья для биотехнологического производства: экстракты или гидролизаты природных тканей и органов, ферментативная биомасса, совершенно необходимы: во-первых, структурная характеристика биологически активных компонентов, во-вторых, поиск и количественная оценка балластных и (или) вредных примесей, в -третьих, оценка качества и стабильности препаратов в условиях хранения.

В связи с этим является актуальной разработка аналитического обеспечения биотехнологических процессов, позволяющего достоверно оценить чистоту и природу пептида или белка на каждой производственной стадии и тем самым сократить время и затраты на разработку технологического процесса.

Целью диссертационной работы являлась разработка эффективного постадийного контроля производства генно-инженерного инсулина человека (ГИИЧ) с помощью комплекса инструментальных микрометодов разделения (микро-колоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии (микро-ОФВЭЖХ), капиллярного электрофореза (КЭФ)) и методов качественной идентификации (масс-спектрометрии (МС)).

1.СТРУКТУР А ИНСУЛИНА .

Аминокислотная последовательность инсулина человека и большинства млекопитающих хорошо известна [2]. Все инсулины состоят из двух полипептидных цепей (А-цепь-21 аминокислотный остаток, В-цепь-30), соединенных двумя дисульфидными связями (CysA7 - CysB7 и CysA20 - CysB19). Еще одна дисульфидная связь является внутрицепочечной, и соединяет 2 остатка Cys в А-цепи (CysA6 - CysA11). Первичная структура гормона достаточно консервативна (рис.1).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 И 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Свинья: --------------------------------------------------------------------------------------------------------

Бык ------------------Ala------Val-------------------------—----------

Кролик: -----------------------------------------------------------------------------------------------------------

Овца: -----------------Ala-Gly-Val------------------------

I I

Человек: NHj-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-COOH

Человек NH2-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-COOH

Овца ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AhCOOH

Кролик --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------SrCOOH

Бык -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AhCOOH

Свинья . ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AhCOOH

Рис.1. Структура инсулина человека и некоторых млекопитающих.

Наиболее близкими по своей структуре к инсулину человека являются взо инсулины свиньи и кролика, у которых в В-цепи вместо Thr содержатся аланин и серии, соответственно. Однако, до появления ГИИЧ для инъекций при сахарном диабете использовались, главным образом, инсулины свиньи и быка, получаемые экстракцией из соответствующих панкреатических желез.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Сергеев, Николай Валентинович

выводы

1. Совместное использование двух методов, основанных на разных механизмах разделения (микроколоночная высокоэффективная жидкостная хроматография и капиллярный электрофорез), позволяет контролировать чистоту и степень конверсии целевых полупродуктов на всех этапах получения генно-инженерного инсулина человека, что дает возможность оценить эффективность проведения каждой отдельной стадии и всего процесса в целом.

2. Изучена кинетика и оптимизированы условия реакций ренатурации и трипсинолиза гибридного белка, позволяющие добиться максимального выхода целевых продуктов.

3. Предложены методики анализа и идентификации примесей (ди-Arg831роо рэ 1 R40

Arg -инсулина, Arg -инсулина и их дез-амидо-форм, дез-Thr -инсулина, дез-амидо- Asn*21- инсулина, дез-амидо-Аэпвз- инсулина) в субстанции инсулина.

4. Методом ОФВЭЖХ выделены и масс-спектрометрически охарактеризованы эталонные образцы основных полупродуктов технологической схемы получения рекомбинантного инсулина человека

R^ 1 R49 R^ 1 1 R^O гибридный белок, ди-Arg -Arg -инсулин, Arg -инсулин, дез-Thr -инсулин), которые могут использоваться в качестве стандартов для идентификации примесей в субстанции инсулина.

5. Предложенная методика подтверждения первичной структуры инсулина позволяет локализовать возможные замены или химические модификации аминокислот в цепях инсулина и достоверно определить его видовую принадлежность.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Сергеев, Николай Валентинович, 2000 год

1. Chance R.E., Kroeff Е.Р., Hoffmann J.A., Frank. B.H. Chemical, physical, and biological properties of biosynthetic human insulin.// Diabetes Care. 1981.V.4(2).P. 147-154

2. Dolan-Heitlinger J. Recombinant DNA and Biosynthetic Human Insulin, A Source Book.Eli Lilly and Co., Indianopolis, IN, 1982

3. Шредер Э., Любке К.Пептиды. M.1969.T.2.C.468

4. Markussen J. Human insulin by tryptic transpeptidation of porcine Insulin and biosynthetic precursors. MTP. Lancaster. 1987.

5. Chance R.E., Kroeff E.P., Hoffmann J.A. Insulins, Growth Hormone and Recombinant DNA Technology. Raven Press. New York. 1981.P.71-85.

6. Chance R.E., Kroeff E.P., Hoffmann J.A., Johnson M.G., Schmirmer E.W. Bromer W.W., Ross M.J., Wetzel R. Peptides: Synthesis-Struture-Function. Rich D.H., Gross E. Eds. Pierce Chemical Co.Rockford, IL, 1981.P.721-728

7. Brange J. Galenics of insulin. Berlin- Heidelberg, Springer-Verlag, 1987. P.1-5

8. Nilsson J. Johansson P., Samuelson E., Stahl S., Uhlen M. Integrated production of human insulin and its C-peptide.// J.Biotechnol. 1996. V.48. P.241-250

9. Kroeff E.P.Owens.R.A. Campbell E.L. Johnson R.D., Marks H.I. Production Scale Purification of Biosynthetic Human Insulin by Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography //J.Chromatogr.l989.V.461.P.45-61

10. В.Г. Коробко, Е.Ф. Болдырева, Л.Н. Шингарова, А.И.Мирошников, В.Г. Гавриков, А.В. Степанов, Ю.Т. Калинин // Патент РФ № 99109523/13 Бюлл. №36, 27.12.99.

11. Frank BH, Chance RE. Two routes for producing human insulin utilizing recombinant DNA technology.//Munch Med Wochenschr. 1983.Suppl 1:P. S14-20.

12. Jonasson P., Nilsson J., Samuelsson E., Moks Т., Stahl S., Uhlen M. // Eur.J. Biochem.1988. V.236.P.656-661

13. Watson J.D.Tooze J., Kurtz D.T. Recombinant DNA-A short course. Scientific American Books.W.H.Freeman Co.New York. 1983.P.231-235

14. Markussen J.,Fill N., Ammerer G., Hansen M.N., Ihim L., Norris K. Insulin precursors, process for their preparation and process for preparing human Insulin from such Insulin precursors. European patent 0 163 529, Bulletin 65

15. Thim L., Norris K., Hansen M.T. //Insulin precursors, process for the preparation of human insulin. European patent 0 195 691, Bulletin 86/39, 24.09.86

16. Ladish M.R. Kohlmann K.L. Recombinant Human Insulin// Biotechnol. Prog.l992.V. 8.P. 469-478

17. Farias RN, Lopez Vinals AE, Posse E, Morero RD. Relationship between isoelectric point of native and chemically modified insulin and liposomal fusion.//Biochem J. 1989.V.264.P.285-287.

18. Pingel M, Volund A. Stability of insulin preparations.//Diabetes,1972 V.21. P. 805-813.

19. Cavallini D, Fderici G., Barboni F., et al. Formation of Persulfide Groups in Alcaline Treated Insulin. //FEBS Lett. 1970. V.10. P. 125 128

20. Markussen J.Proteolytic Degradation of proinsulin and of the intermediate forms: Application to Synthesis and Biosynthesis of insulin. Proceedings of the Symposium on Proinsulin, Insulin and C-peptide. Tokushima, 1978.P.50-62

21. Bentley G., Dodson E., Dodson G., Hodgkin D.,Mercola D. Structure of Insulin in 4-zinc insulin//Nature. 1976.V.261.P.166-168.

22. Klyushnichenko V.E., Yakimov S.A., Arutyunyan A.M., Ivanov A.E., Maltsev K.V., Nazimov I.V. Wulfson A.N. //J.Chromatogr. B. Biomed.Appl. 1994. V. 662 P. 363-369

23. United States Pharmacopeia, 23, Second Supplement. Insulin Human. P.2637-2645

24. British Pharmacopeia 1997, H.M. Stationary Office, London, 1997. P.312-313.

25. Chance R.E. Ellis R.M.Bromer W.W. Porcine proinsulin: characterization and amino acid sequence. //Science. 1968.V. 161.P. 165

26. ВФС-42-2128-92.Инсулин человека. 1992.C. 1899-2000.

27. НД 42-8098-97.Insulinum Humanis. «НОВО НОРДИСК».1997

28. Nielsen R.G.,Sittampalam G.S., Rickard,E.C. Capillary Zone Electrophoresis of Insulin and Growth Hormone.//Anal.Biochem.l989.V.177.P.20-26

29. Welinder B.S., Linde S. High Perfomance Ion Exchange Chromatography of Insulin and Insulin Derivatives. In CRC Handbook of HPLC for the Separation of Amino Acids, Peptides and Proteins. 1981. V.2. P. 357- 362

30. Gaus H.J., Beck-Sickinger A.G., Bayer E. Optimization of capillary electrophoresis of mixtures of basic peptides and comparison with HPLC.//Anal.Chem. 1993.V.65 .P. 1399-1405.

31. Л.А.Остерман. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. Москва, Наука. 1985 г.

32. Jorpes J.E.//Arch.lnter.Med. 1949.V.83 .Р.363-371

33. Rolando R.L., Torroba D. Heterogeneity of the Fourth International Standard for insulin by gel-chromatography on sephadex. //Experimentia. 1972. Y.28.P. 1169

34. Schlichtkrull J. Letter: Antigenicity of monocomponent insulins //Lancet 1974.V.II.P. 1260-1261

35. Fisher B.V., Porter P.В Stability of bovine insulin. .//J.Pharm.Pharmacol. 1981.V.33.P.203-206

36. Welinder B.S. Gel Permeation Chromatography of Insulin //J.Liq. Chtomatogr. 1980.V.3.P.1399

37. Welinder B.S. Homogeneity of Crystalline Insulin Estimated by GPC and Reversed Phase HPLC. In CRC Handbook of HPLC for the Separation of Amino Acids, Peptides and Proteins. V.II. P. 413-419

38. Остерман Л.А. Методы Исследования Белков и нуклеиновых кислот. Элекрофорез и ультра-центрифугирование.Москва.Наука.1980.

39. Chance R.E., Ellis R.M., Galloway J.A. Porcine Proinsulin: Characterization and Amino Acid Sequence//Science.l968.V.161.P.165-167

40. Fling S.P., Gregerson D.S. Peptide and Protein Molecular Weight determination by Electrophoresis Using a High-Molarity Tris Buffer System Without Urea.//Anal.Biochem. 1986. V. 155.P.83-88.

41. Хеншен А., Хупе К.П, Лотшпайх Ф., Вёльтер В. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. Москва. .Мир. 1988.

42. Шатц В.Д., Сахартова О.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Рига. Зинатне. 1988.1

43. Dinner A, Lorenz L. High-Performance Liquid Chromatographic Determination of Bovine Insulin//Anal.Chem. 1979.V. 51.1872-1873.

44. Lloyd L.F,.Corran P. H. Analysis of Insulin Preparations by Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography // J. Chtomatogr.l982.V. 240.P. 445454

45. Rivier J., McClintock R. Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography of Insulin From Different Species// J. Chromatogr. 1983 .V.268.P. 112-119

46. Yomota C., Yoshii Y, Takahata N.,Okada S. Separation of B-3 Desamidoinsulin from Human Insulin by High-Performance Liquid Chromatography Under Alkaline Conditions //J.Chromatogr. A. 1996. V.721 P.89 96

47. Damgaard U, Markuseen T.J. Analysis of Insulins and Related Compounds by HPLC// Horm. Metab. Res. 1979.V.II.P. 580-581

48. Parman, A. U. Rideout, J. M. Purification of Porcine Insulin by High-Performance Liquid Chromatography // J. Chromatogr. 1983 .V. 256.P. 283-291

49. McLeod A.N., Mauer.A., Wood.S.P. High-Performance Liquid Chromatography of Insulin//J.Chromatogr.l990.V.502.P.325-336.

50. Guevara O.L., Estrada G., Antonio S., Alvarado X., Guereca L., Zamudio F., Bolivar F. Identification and Isolation of Human Insulin A and В Chains by High-Performance Liquid Chromatography//J.Chromatogr. 1985.V.349.P.91-98.

51. Seino S., Funakoshi A., Fu ZZ., Vinik A. Idrntification of Insulin Variants in Patients with Hyperinsulinemia by Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography//Diabetes.l985.V.34.P.l-7.

52. Peter A., Szepesi G., Balaspiri L., Burger K. Coordinative Interactions in the Separation of Insulin and its Derivatives by High-Performance Liquid Chromatography//J.Chromatogr.l987.V.408.P.43-52.

53. Szepesi G, Gazgad M. Imroved High-Performance Liquid Chromatographic Method for the Analysis of Insulins and Related Compounds // J. Chromatogr. 1981. V.218.P.597-602

54. Szepesi G, Gazgad M. Separation of Large Polypeptides by High-Performance Liquid Chromatography//J. Chromatogr.l981.V.218.P.603-612

55. Pikal M.J., Rigsbee D.R. The Stability of Insulin in Cristalline and Amorphous Solids: Observation of Greater Stability for the Amorphous Form.//Pharm.Res.V. 14.1997.P. 1379-1387

56. Geng X., Regnier F.E. Retention Model for Proteins in Reversed-Phase Liquid Chromatography//.!. Chromatogr. 1984. V.296.P. 15-30.

57. The Handbook of Analysis and Purification of Peptides and Proteins by Reversed-Phase HPLC.Vydac (The Separation Group).Second Edition.1995.

58. Rubinstein M. Preparative high-performance liquid partition chromatography of proteins. //Anal.Biochem. 1979.V.98.P. 1-7

59. Rubinstein M Chen-Kiang S., Stein S., Udenfriend S. Characterization of proteins and peptides by high-performance liquid chromatography and fluorescence monitoring of their tryptic digests. //Anal.Biochem. 1979.V. 95. P.117-121

60. Rivier J., McClintock. Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography of Insulins from Different Species.// J.Chromatogr. 1983. V.268.P.112-119.

61. Linde S., Welinder B.S. Non-ideal Behavior of Silica-Based Stationary Phases in Trifluoroacetic Acid-Acetonitrile-Based Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatographic Separation of Insulins and Proinsulins//J. Chromatogr.l 991. V.536.P.43-55

62. Welinder B.S., Sorensen H.H., Hansen B. Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography of Insulin. Resolution and Recovery in Relation to Column Geometry and Buffer Components.//J.Chromatogr.l986.V.361. P.357-367

63. Cohen K.A., Schellenberg К., Benedek К., Karger B.L., Grego.B., Hearn T.W. Mobile-Phase and Temperature Effects in the Reversed Phase Chromatographic Separation of Proteins//Anal.Biochem.l984.V.140.P.223-235

64. Purcell A.W., Aquilar M.I., Hearn M.T.W. Conformational Effects in High-Performance Liquid Chromatography of Polypeptides. I. Resolution of Insulin Variants.//J.Chromatogr.A.V.71 l.P.61-70

65. Mikkers F, Ringoir S, De Smet R. Analytical isotachophoresis of uremic blood samples. //J.Chromatogr. 1979.V.169.P.11-20

66. Karger B.L. Cohn A.S., Guttman A. High-Performance Capillary Electrophoresis in the Biological Science.//J. Chromatogr.l989.V.492.P.585-614

67. Grossman P.D.,Wilson K.J., Petrie G., Lauer H.H. Effect of Buffer pH and Peptide Composition on the Selectivity of Peptide Separation by Capillary Zone Electrophoresis.Anal.Biochem.l988.V.173.P.265-270

68. Nielsen,R.G.,Sittampalam G.S.,Rickard,E.C. Capillary Zone Electrophoresis of Insulin and Growth Hormone.// Anal.Biochem.l989.V.177.P.20-26

69. Yomota C., Matsumoto Y., Okada S., Hayashi Y., Matsuda R. Discrimination Limit for Purity Test of Human Insulin by Capillary Electrophoresis.// J. Chromatogr.B. 1997. V. 703 .P .139-145

70. Arcelloni C., Fermo I., Banfi G., Pontiroli A.E., Paroni R.//Capillary Electrophoresis for Protein Analysis:Separation of Human Growth Gormone and Human Insulin Molecular Forms.//Anal.Biochem.l993.V.212.P.160-167

71. Smith R.D., Olivares J.A., Nguyen N.T., Udseth H.R. Capillary Zone Electrophoresis Mass Spectrometry Using an Electrospray Ionization Interface //Anal.Chem. 1989.V.60.P. 434-441.

72. Introduction to Capillary Electrophoresis. Beckman.Inst.Inc. 1989.

73. Jorgenson J.W. Capillary Zone Electrophoresis: New Directions in Electrorhoretic Methods.Washington. Americ.Chem.Soc. 1987. P.182-192

74. Rose D.J., Jorgenson J.W. Characterisation and Automatisation of Sample Introduction Methods for Capillary Zone Electrophoresis.// Anal.Chem. 1988.V.60.P. 642-648

75. Schneed,J., Ueland,P.M. Application of Capillary Electrophoresis with Laser-Indused Fluorescence Detection for Routinic Determination of Methylamonic Acid in Human Serum. //Anal.Cnem.l995.V.67. P. 812-819

76. Faller T, Engelhardt H. How to achieve higher repeatability and reproducibility in capillary electrophoresis// J. Chromatogr. A. 1999.V.853.P. 83-94

77. Энгельгардт X. Руководство по капиллярному электрфорезу. М.Наука.1996.

78. Grossman,P.D.,Wilson,K.J.,Petrie G.,Lauer,H.H. Effect of Buffer рН and Peptide Composition on the Selectivity of Peptide Separation by Capillary Zone Electrophoresis//Anal.Biochem.l988.V. 173 .P.265-270

79. Grossman PD, Colburn JC, Lauer HH. A semiempirical model for the electrophoretic mobilities of peptides in free-solution capillary electrophoresis.//Anal Biochem. 1989 May 15;179(l):28-33.

80. Kasicka V.Capillary electrophoresis of peptides.//Electrophoresis.l999 V.20. P.3084-105.

81. Cifuentes A, Poppe H. Behavior of Peptides in Capillary Electrophoresis: Effect of Peptide Charge, Mass and Structure.// Electrophoresis 1997 V.18.P.2362-2376

82. Tran A.D., Blanc Т., Park S., Lisi P.G. Effect of Phosphate Ion in the Analysis of Glicoproteins at Low pH by Capillary Electrophoresis Using a P/ACE System 2000.Beckman Inst.Inc.1989.

83. Corradini D., Rhomberg A., Corradini C. Electrophoresis of Proteins in Uncoated Capillaries with Amines and Amino Sugars as Electrolyte Additives//J.Chromatogr.A. 1994. V.661 .P.305-313.

84. Glajch JL. Analytical challenges in biotechnology.Anal Chem. 1986.V.58.P:385-394.

85. McCormick R.M. Capillary Zone Electrophoretic separation of Peptides and Proteins Using Low pH Buffers in Modified Silika Cappilaries.// Anal.Chem. 1989. V.61 .P. 1055-1 Об 1.

86. Rush RS, Cohen AS, Karger BL. Influence of column temperature on the electrophoretic behavior of myoglobin and alpha-lactalbumin in high-performance capillary electrophoresis.//Anal Chem. 1991.V. 63.P. 1346-50.

87. Atria K.D. Troubleshooting in Capillary Electrophoresis. HPCE' 2000. 13th International Symposium on High Performance Capillary Electrophoresis and Related Microscale Techniques. Saarbrucken. Germany. 20th-24th February 2000.P.11

88. Separation of Proteins and Peptides by Capillary Electrophoresis: Application to Analytical Biotechnology. Beckman Instr.Inc.1994.

89. Kemmler W., Peterson J.D., Steiner D.F.Studies on the conversion of proinsulin to insulin//J.Biol.Chem.1971.V.246.P.6786-6791.

90. Ludvigsen S, Roy M, Thogersen H, Kaarsholm NC. High-resolution structure of an engineered biologically potent insulin monomer, В16 Tyr->His, as determined by nuclear magnetic resonance spectroscopy// Biochemistry. 1994V.33.P. 79988006.

91. Grau.U. Fingerprint Analysis of Insulin and Proinsulins//Diabetes.l985.V.34. P.1174-1180