Получение моноклональных антител к термолабильному энтеротоксину эшерихий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, кандидат биологических наук Серебряков, Сергей Николаевич

• Серебряков, Сергей Николаевич
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Серебряков, Сергей Николаевич

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Причины возникновения кишечных инфекций.

1.2. Факторы патогенности Е.соП.

1.2.1.Адгезины энтеротоксигенных эшерихий.

1.2.2.Энтеротоксины эшерихий.

1.2.2.1.Термолабильный энтеротоксин.

1.2.2.2.Строение и свойства 1Т.

1.2.2.3. Иммунологические свойства 1Т.

1.2.2.4.Генетический контроль синтеза 1Т.

1.2.3.Характеристика энтеротоксинов эшерихий других типов.

1.2.4.Методы определения 1Т.

1.2.4.1. Биологические методы определения 1.Т.

1.2.4.2.Иммунохимические методы определения !Т.

1.2.4.3.Другие методы детекции 1.Т.

1.3.Гибридомная техника.

1.3.1.Применение моноклональных антител.

1.3.2. Перспективы исследований.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1.Иммунизация животных.

2.2.Получение гибридом.

2.2.1.Ведение клеточных культур.

2.2.2.Слияние клеток.

2.2.3.Клонирование гибридом.

2.2.4.3амораживание клеток.

2.2.5.Размораживание клеток.

2.3.Получение препаративных количеств мкАт.

2.4.0чистка мкАт.

2.5. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

2.6.Изоэлектрическое фокусирование в полиакриламидном геле.

2.7.Иммуноферментный анализ с использованием пероксидазы хрена.

2.7.1.Приготовление субстрата пероксидазы хрена-о-фенилендиамина(ОФД).

2.7.2.Непрямой метод иммуноферментного анализа.

2.7.3. Приготовление конъюгата мкАт с пероксидазой хрена.

2.7.4.Двухцентровой метод иммуноферментного анализа.

2.7.5.Определение оптимального буфера для нанесения мкАт. 55 2.8.0пределение константы связывания.

2.9. Определение изотипа мкАт с помощью двойной иммунодиффузии по Ухтерлони.

2.10. Связывание мкАт с антигеном в растворе.

2.10.1.Анализ связывания мкАт с меченым антигеном.

2.11.Конъюгирование белков с ВгС1Ч-активированной сефарозой.

2.11.1. Конъюгирование антигенов с ВгСЫ-активированной сефарозой.

2.11.2. Конъюгирование антител с ВгСЫ-активированной сефарозой.

2.12.Приготовление высокоспецифичных антител кролика к иммуноглобулинам мыши и НИ.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.

3.1. Получение гибридом, продуцирующих мкАт против термолабильного энтеротоксина Е.соП.

3.1.1. Определение оптимальных условий слияния клеток.

3.1.2. Результаты слияния клеток для получения гибридом, продуцирующих мкАт против термолабильного энтеротоксина Е.соП.

3.2. Получение препаративных количеств, оценка и характеристика мкАт против НИ.

3.2.1. Получение препаративных количеств и очистка мкАт.

3.2.2. Определение изотипов и изоэлектрической точки мкАт.

3.3. Исследование полученных мкАт методом ИФА.

3.3.1.Конъюгирование иммуноглобулинов с ПХ.

3.3.2.Получение конъюгата кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши с ПХ.

3.3.3. Определение константы связывания мкАт.

З.ЗАХарактеристика поликлональных антисывороток против 1-Т11.

3.3.5. Определение оптимальных условий посадки мкАт на пластик.

З.З.б.Определение антигенных регионов, против которых направлены полученные мкАт.

3.3.7.Выбор оптимальной формы хранения стандарта

1.171.

3.3.8. Определение оптимального блокирующего белка.

3.3.9. Определение оптимальных концентраций ОФД и Н202 субстратного раствора ИФА.

3.4.Возможности практического использования мкАт.

3.4.1 .Тест-система для определения ИЬ.

3.4.2.Конъюгирование антител с ВгСМ-активированной сефарозой.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение моноклональных антител к термолабильному энтеротоксину эшерихий»

Актуальность темы. К настоящему времени значительно возрос уровень знаний о природе патогенности микроорганизмов-возбудителей заболеваний человека и животных. Одним из факторов патогенности бактерий является их способность продуцировать токсины. Этой способностью обладают многие грамотрицательные бактерии. В настоящее время объектом исследований ученых являются роды Vibrio, Shigella, Salmonella, Proteus, Clostridium, Campylobacter, Yersinia, Pseudomonas, Aeromonas, Klebsiella.

Одним из основных возбудителей диарейных заболеваний, широко распространенных среди людей, сельскохозяйственных животных и, в частности, пушных зверей являются энтеропатогенные эшерихии. На долю эшерихий и других энтеробактерий приходится до 70% обсемененных патогенной микрофлорой кормов и патматериала от пушных зверей. До 50% выявленных эшерихий несут детерминанты, обусловливающие их токсигенность. Серьезную тревогу у медиков и ветеринаров вызывает ситуация с распространением энтерогеморрагических эшерихий и приобретение ими новых сочетаний инфекционных свойств (32,64).

Нередко характер заболевания зависит не столько от вида микроорганизма, участвующего в инфекционном процессе, сколько от типа токсина, который он продуцирует (7,8,9,125). В данном случае речь идет о термолабильном (LT), термостабильном (ST) и шига-подобном энтеротоксинах, из которых доля термолабильного энтеротоксина в острых кишечных заболеваниях значительна (6,114).

Поскольку токсикоинфекции, обусловленные различными представителями семейства энтеробактерий наносят серьезный ущерб сельскому хозяйству и звероводству в том числе (29,37), весьма актуальной задачей является борьба с ними.

Серьезная роль в борьбе с токсикоинфекциями отводится ранней диагностике. Несмотря на то, что показана связь серогруппы с определенными типами продуцируемых энтеротоксинов, нет четкой корреляции между продукцией энтеротоксинов и наличием определенных соматических (О) и капсульных (К) антигенов у эшерихий (35). Исходя из этого, целесообразным представляется определение непосредственно токсинов. К сожалению, до настоящего времени простых и достаточно надежных методов детекции токсинов не разработано.

Большинство соответствующих биологических тестов трудоемко, характеризуется низкой чувствительностью, неудовлетворительной воспроизводимостью результатов. В случае энтеротоксинов эшерихий это биопроба на мышах-сосунках, тест отека лап у мышей, тест на изолированной петле кишечника (4,52,70,71), результат которых зависит от многих артефактов и не всегда объективен. Для определения 1Т распространены тесты на культурах клеток (166,201,242).

Вышеперечисленных недостатков лишены иммунохимические, основанные на применении специфических антитоксических сывороток, методы определения энтеротоксинов. Оптимальной, на наш взгляд, является разработка РИА и ИФА тест-систем для детекции токсинов. Иммуноферментный анализ (ИФА), так же как и радиоиммунологический (РИА), намного более специфичен и чувствителен, чем биологические методы или методы, основанные на преципитации, но не требует применения радиоактивных реагентов. Последнее обстоятельство делает его более доступным по сравнению с РИА. Идеальным инструментом для создания подобных методов индикации энтеротоксинов эшерихий являются моноклональные антитела (мкАт).

В настоящее время получены мкАт к 1Т и БТ энтеротоксинам эшерихий (243). Разработаны также твердофазный ИФА метод для определения БТа энтеротоксина на основе мкАт (243) и РИА системы для определения 1Т и СТ энтеротоксинов. Данных о ИФА тест-системах на основе мкАт для определения термолабильного энтеротоксина эшерихий до настоящего времени в доступной нам литературе не обнаружено.

Цель исследования. Целью настоящего исследования является получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к различным вариантам термолабильного энтеротоксина эшерихий и использование мкАт для разработки иммуноферментной тест-системы с целью детекции 1Т энтеротоксина в объектах ветнадзора.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие конкретные задачи:

1. Отработать оптимальные условия гибридизации.

2. Создать гибридомы, продуцирующие мкАт к термолабильному энтеротоксину эшерихий.

3. Изучить основные свойства полученных мкАт (специфичность, изоэлектрическая точка, аффинность, субкласс иммуноглобулинов, электрофоретическая подвижность).

4. Разработать на основе полученных мкАт иммуноферментную тест-систему для качественного определения термолабильного энтеротоксина эшерихий.

Для выполнения поставленных задач в работе были использованы следующие методы исследований: иммунобиотехнологические (гибридомная технология); физико-химические (ионообменная и аффинная хроматография, электрофорез в присутствии ДДС-Ма, изоэлектрическая фокусировка, иммунодиффузия, ИФА, РИА); методы математической обработки результатов.

Для иммунизации животных и скриннинга антител были использованы препараты энтеротоксинов, предоставленные НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи и полученные в НИИПЗиК им.В.А. Афанасьева (зав.лабораторией к.б.н. Ю.Е.Козловский).

Научная новизна исследования. Новизна настоящего исследования состоит в том, что получен льный набор мкАт против иь, подробно исследована специфичность полученных мкАт. Данные мкАт были использованы для разработки оригинальной иммуноферментной тест-системы для качественного определения термолабильного энтеротоксина эшерихий.

Показана возможность очистки 1Т из лизатов с помощью аффинной хроматографии на иммуносорбентах с использованием полученных мкАт.

Практическая ценность работы. Данная работа может служить методологической основой для создания и характеристики мкАт против различных вариантов термолабильного энтеротоксина и использования их в тест-системах для определения соответствующих энтеротоксинов в объектах ветнадзора.

Практическая ценность состоит в том, что на основе полученных мкАт разработана иммуноферментная тест-система для качественного определения термолабильного энтеротоксина эшерихий. По сравнению с широко используемыми биологическими пробами (44,157,186) настоящая тест-система работает с оптимальной чувствительностью, специфична, воспроизводима, что позволяет использовать ее для массового определения термолабильного энтеротоксина в объектах ветнадзора.

Полученные мкАт можно использовать для разработки новых прогрессивных технологий выделения и очистки препаратов энтеротоксинов, с целью практического их применения в сельском хозяйстве, в т.ч. звероводстве, а также для создания стандартов энтеротоксинов для исследовательских целей.

Положения, которые выносятся на защиту.

- создание гибридом, продуцирующих мкАт к различным типам термолабильного энтеротоксина эшерихий;

- изучение основных свойств полученных мкАт;

- разработка на основе полученных мкАт иммуноферментной тест-системы для индикации 1Т эшерихий в лизатах.

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Серебряков, Сергей Николаевич

выводы.

1. Получены стабильные высокопродуктивные гибридомы, продуцирующие мкАт к различным типам термолабильного энтеротоксина эшерихий.

2.Положительные клоны были получены через 72 часа после последнего введения антигена при использовании 45% ПЭГ 4000 в ЗФР рН 8.0-8.2.

3. В результате слияния клеток миеломной клеточной линии Х63-Ад8.653 со спленоцитами мышей Ва1Ь/сг иммунизированных цельной молекулой 1Т11 получены 25 первичных культур гибридных клеток, продуцирующих мкАт против 1Т эшерихий. 11 первичных культур отобраны для дальнейшей работы, клонированы и переведены в асцитную форму.

4. МкАт, продуцируемые девятью клонами, выделены из асцитической жидкости путем осаждения сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией

5. Для девяти мкАт определен изотип. Отобранные мкАт принадлежат к изотипу 1дб1.

6. Полученные мкАт охарактеризованы по ряду параметров (специфичность, изоэлектрическая точка, оптимальные условия посадки на пластик, константы связывания, взаимное расположение эпитопов, против которых направлены мкАт) и проконтролированы на специфичность на различных типах 1Т эшерихий.

7. Проведено сопоставление эпитопной специфичности мкАт против 1Л"1п и их перекрестной реактивности с 1Тр и холерогеном.

8. С помощью полученных мкАт было выявлено 3 антигенных региона на молекуле НИ.

9. Первый антигенный регион находится на В-субъединице 1ТИ и мкАт против него специфично реагируют с молекулой Ш1 и В-субъединицей НИ без перекрестных реакций с другими вариантами 1Т энтеротоксина эшерихий. Второй антигенный регион находится также на В-субъединице 1Т11, но обнаруживается также на молекуле холерогена. Антигенный регион №3 не обнаруживается на В-субъединице П?!, но выявляется на цельной молекуле различных типах термолабильного энтеротоксина эшерихий.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Серебряков, Сергей Николаевич, 1998 год

1. Бондаренко B.IVI-, Тимофеева И.Т., Колесников С.А., Степанова М.В., Вертиев Ю.В. Способность штаммов Citrobacter freundii, выделенных при острых кишечных инфекциях, к LT-энтеротоксинообразованию//Журн. микроб., эпидем., иммун.-1986,- № 12.-С.12-15.

2. Бондаренко В.М- Общий анализ представлений о патогенных и условно патогенных бактериях//Журн. микроб., эпидем., иммун.-1997,-№ 4.-С.20-26.

3. Бондаренко В.М., Мавзютов А.Р., Габидуллин З.Г. Термостабильные эытеротоксины условно патогенных представителей Enterobacteriaceae //Журн. микроб., эпидем., иммун.-1998- №3.-С.104-107.

4. Бондаренко В.М., Петровская В.Г. // Вестн. РАМН. -1997. №3,- С. 7-11.

5. Бондаренко В.М., Петровская В.Г., Нестерова Н.И. Проблема патогенности клебси^л. Ульяновск, 1996.

6. Вартанян Г.Г., Межлумян Н.И. О патогенности энтеробактерий, выделенных при диареи телят // Биол.ж.Армении.-1990.-43,- №5,1. С.401-404.

7. Вартанян Ю.П, Методы биологического тестирования энтеро-токсинов// Журн. микроб., зпидем., иммун.-1981,- № З.-С. 19-21.

8. Вертиев Ю.В. Бактериальные токсины // Проблемы инфектологии,- М.,1991,- С. 127-130.

9. Вертиев Ю.В. Бактериальные токсины и биотехнология //

10. Микробиологические аспекты иммунобиотехнологии: современное состояние, проблемы, перспективы,-М.,1992,-С.24-32.

11. Вертиев Ю.В. Бактериальные токсины: биологическая сущность и происхождение//Журн.микроб., эпидем., иммун.-1996.-№3.-С.43-46.

12. Вертиев Ю.В, Зоронов С.Е Иммунохимические особенности субъединиц холерного энтеротоксина и термолабильных энтеротоксинов кищечной палочки различного происхождения И Бюлл.экспер.биол. и мед.- 1987.-Т.104,- №10,- С.472-478.

13. Волынец Л.К., Балицкий Ю.Г Колибактериоз в свиноводческих хозяйствах // Ветенария.-1991 ,-М 1 .-С.41 -43.

14. Воронов C.fE., Вертиев Ю.В., Евепчук Ю.В. Сравнительное изучение холероподобных энтеротоксинов с помощью специфических антител // Бактериальные токсины: Сб. науч.тр./ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи М.,1987.-С.ЗЗ-42.

15. Давыдова Л. И., Магомедова АД., Козловский Ю.Е., Жирнова К.Г. Способ очистки термолабильного экзоэнтеротоксина Е. Coli // Вопросы ветеринарной биологии:Сб. науч. тр./ Моск. вет. акад. им. К.И.Скрябина, М. 1993, с.51-54.

16. Евглевский A.A., Наумов М.Н., Швец И.М. Экологически обоснованный способ профилактики колибактериоза телят // Современные экол. пробл. провинции: Междун. экол. Форум.Курск,4-8 июля 1995 г.-Курк, 1995.-С.89-90.

17. Езепчук Ю.В. биомолекулярные основы патогенности бактерий. М.,1985.

18. Ефременко В.И. Ганглиозиды клеточные рецепторы для бактериальных энтеротхжсинов // Журн.эпидем., микроб.,иммун,- 1981,-№4.-С.96-100.

19. Жукова Э.В., Шагинян И.А., Тайлонокая И.Н. Определение энтеротоксина холерных вибрионов методом пассивного иммунного гемолиза //журн.эпидем.,микроб., иммун.-1981.-№4.-С.55-59.

20. Зароза В. Г. Антигены адгезии E.coli: морфологичесние и биофизические свойства // Сельскохозяйственная биология.-1988.-М 4.-С.9-11.

21. Лакин Г.Ф. Биометрия,- М.:Выошая школа, 1990,- 352 с.

22. Манолов А.Д. Твердофазные радиоиммунные и иммуноферментные методы для количественного экспресс- анализа в микробиологии // Журн.микроб.,эпидем.,иммун.- 1985.- № 4,- С.100-108.

23. Мерсон М.Х., Облапенко Т.П. Деятельность ВОЗ в области профилактики острых диарей у детей // Острые кишечные инфекции:Сб.8Т.-1990.-№ 13,- С.3-9.

24. Остерман Л.А.Методы исследования белков и нуклеиновых кислот.-М.:Наука,1981 .-288с., ил.

25. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами.-М.:На,ука,1983. 304 с.

26. Пайков В.А., Акимова Л. Иммуноглобулины и лизоцим копрофильтратов при острых кишечных инфекциях у детей раннего возраста // Рос.вестн.перинатол.и педиатрии. 1994,Т.39. № 1.С.34-35.

27. Петровская В.Г., Бондаренко В.М. Адгезины энтеротокоигенных кишечных палочек: роль в патогенезе диарей и генетический контроль // Журн. микроб., эпидем., иммун.-1990.-№ 5,-С.110-117.

28. Петровская В.Г., Бондаренко В.М. Энтеротоксины энтеротоксигенных Eschirihia coli: характеристика, механизм действия и генетический контроль // Журн.микроб., эпидем., иммун.-1990.-№ 7.-С. 92-98

29. Полякова O.A., Евглевская Н.И., Соколова H.A. и др. Адгезивный антиген К99 и термостабильный энтеротоксин упатогенных эшерихий, возбудителей колибактериоза телят. Ветеринария, 1986, 8: 37-40.

30. Сидоров М.А., Гущин В.Н. Профилактика колибактериоза животных // Ветеринария -1984. № 3. - С. 41.

31. Сидорчук И.И., Бондаренко В.М., Степанова М.И., Полищук Е.И. Энтероколиты неясной этиологии инфекционные процессы, вызванные условнопатогенной флорой // Смешанные инфекции:Сб.научн.тр./ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи - М.,1986.-С.59-63.

32. Скоупс Р. Методы очистки белков,- М.: "Мир", 1985.-358 с.

33. Смирнов Г. Б. Генетическая и молекулярная организация оперонов токсигенности E.Coli и V.cholerae и механизмы антитоксического иммунитета//Молек.ген., микроб., вир.-1984.-№ 12.-С.3-16.

34. Смирнова Л.А. Сравнительная характеристика токсинов E.coli//Журн.микроб.,эпидем.,иммун.-1984.-№ 1.- С.56-60.

35. Смирнова Л.А., Данилова О.Т., Белькова Е.И. Сравнительная иммунохимическая характеристика токсинов кишечных палочек // Острые кишечные инфекции,- Л.,1990.-№ 13.-С.62-64:.

36. Соколова H.A., Евглевская Н.И., Курашвили Т.К., Горбатов A.B. Адгезивные антигены и энтеротокоины Escherihia coli -возбудители колибактериоза молодняка с/х животных // Тр.ВНИИ экспериментальной вет.-1988,- № 66.-С.75-78.

37. Солодовников Ю.П., Ющук Н.Д., Мадеев В. В. Проблема кишечных инфекций // Эпидемиология и инфекцион. патология./ЦНИИ эпидемио-логии.-М.,1989.-С.46-64.

38. Степанова М.В., Вертиев Ю.В. Определение токсигенности штаммов кишечной палочки и холерного эмбриона радио-иммунологичеоким методом // Молек.ген.:микроб.,вир.-1985.-№ 3.-С.38-40.

39. Степанова М.В., Вертиев Ю.В. Использование имммуноферментного метода для определения токсигенности штаммов кишечной палочки // Бактериальные токсины: Сб.науч.тр./ НИИЭМ им.И.Ф.Гамалеи-М.,1987.-С. 151 -157.

40. Улиско И.Н., Степанова М.В., Вертиев Ю.В. Энтеротоксические эшерихии у больных острыми кишечными инфекциями //Журн.микроб.,эпидем.,иммун.-1988,- № 8.-С.48-53

41. Флуер Ф.С., Бондаренко В.М. Энтеротокоин Escherihia coli. Природа, биологические свойства и генетический контроль // Вопросы питания. -1978,- № 5.-С.9-16.

42. Хмелевская Б.В., Девтерова Л.В.,Яговкин Э.А., Шепелев А.П., Мартыненко Л.Д. Факторы патогенности некоторых условнопатогенных бактерий, вызывающих диареи //Журн. микроб.,эпидем.,иммун.-1990,-№ 4.-С.97-102.

43. Черепахина Л.А. Иммунохимичеокая идентификация кишечных палочек, продуцирующих термолабильный энтеротоксин: Автореф.дис.канд.вет.наук М., 1981,-16 с.

44. Шагинян И.А., Маракуша Б.Н. Модификация методапассивного иммунного гемолиза на плотной среде для выявления продукции термолабильных энтеротоксинов штаммами холерных вибрионов и кишечной палочки //Журн.микроб., эпидем., иммун.-1983,-№ 7.-С.92-97.

45. Acres S. Enterotoxigenic Echerichia coli infections in newborn calves : a review. J. Dairy Sci., 1985, 68, 1: p 229-256.

46. Against cholera// Eur.Blotechnol.Newslett.-1994.-N 171.P.2.

47. Alvarez J. В., Garsia E. A. G., Hermida I. В., Varela B. R. Modification del ensayo con ratones lactantes para la detección le la enterotoxina termoesteble (ST) de Echerichia coli. Enfermedades Infecciosas, 1983, 1, 107-114.

48. Batt P.M., Rutgers H.C., Sancak A.A. Enteric bacteria: Feind of toe? // J.Small. Anim.Pract.-1998. 37.-N6.-P.261-267.

49. Bazin H. Malache J. Ret (and mouse) monoclonal antibodies a simple automated technique of fntigen purification by immunoaffinity chromatography.-J. Immunol. Methods, 1986, v.88, p.19-24.

50. Beatti J.D., Beatti G.B., Vlakos W.G. Measurement of monoclonal antibodi affiniti by non competetive enzime immunoassay.- J. Immunol. Methods, 1987, v. 100, p. 173-179.

51. Belev M. et. al. A one step purification method for monoclonal antibodies baset on salt promoted adsorption chromatography and thiophilic adsorbent.- J. Immunol. Methods, 1987, v. 102, p. 173-182.

52. Belisle B.W., Twiddy E.M., Holmes R.K. Characterisation of monoclonal antibodies to heat-labile enterotoxin encoded by a plasmid from a chimical isolate of E.coli // lnfect.lmmun.-1984. 43.-N 3.-P.1027-1032.

53. Bettelhelm Karl A., Goldwater Paul N., Bourne Anthony I., Smith Deborah L. Toxigenie E.coli associated with sudden infant death syndrome // Scand.J.lnfect.Dis -1990,- 22.N 4.-P.467-476.

54. Boot J.H.A., Geerts M.E.J., Aarden L.A. Monoclonal anti-peroxidase isotipe switch variants.- J. Immunol. Methods, 1987, v. 103, p.69-77

55. Bottone Edward I. Bacterial gastroenteritis: microbiologic, clinical and epidemiologic correlates in diagnosis// Mount Sinai J.Med.-1995.-62.-N 3.-P. 178-182.

56. Broes Andre, Renaulf Zucien Nowelle classification des souches d'Escherichia coli responsables d' infection intestinale chez le porcelet// Bull. Acad.vet.Fr.-1990.-63.-N 2. P. 181-191.

57. Broome S., Gilbert W. Immunological screening method to detect specific translation products// Proc. Natl. Acad. Sci USA.- 1978.-V.75.-N 6.-P.2746-2749.

58. Burgess M.N., Bywater R.I., Cowley C.M. Biological evaluation of a methanolsoluble, heat-stable Escherichia coli enterotoxin in infect mice, pigs, rabbits and calves // lnfect.lmmun.-1978.-V.21.-N 2.-P.526-531.

59. Burrows W., Musteikis C.M. Cholera infection and toxin in the rabbit ileal loop//J.Infect.Dis.-1986.-V. 116.-N 2.-P.183.

60. Busoni-Gatel D., De Ryeke I., Bosseray N. A footpad lesion test to demonstrate the pathogenicity of E.coli strains// Ann. Microbiol (Inst.Pasteur).-1984.-V. 135 B.-N 3.-P.311-321.

61. Callahan L.T., Richardson S.H. Biochemistry of Vibrio cholerae virulence. Ill Nutritional requirements for toxin production and the effect of pH on toxin elaboration in chemically defined media// lnfect.lmmun.-1973.-7.-N 4.-P.587-572.

62. Cassels F.I., Wolf M.K. Colonization factors of diarrheagenic E. coli and their intestinal receptors// J. Ind.Microbiol.-1995. -15.-N 3,-P.214-226.

63. Celemin Cesar, Rubio Pedro, Echeverria Peter, Sharez Susana Gene toxin patterns of E.coli isolated from diseased and healthy piglets// Vet. Microbiol.-1995.-45.-N2-3.-P. 121-127.

64. Chapman P.A., Swift D.L. A simplified method for detecting the heat-labile enterotoxin of E.coli / /. J. Med.Microbiol.-1984.-18.-N 2.-P.399-403.

65. Chavasse D.C., Blumenthal U., Kolsky P. Fly control in prevention of diarrhoeal disease // Lancet.-1994.-N8931 .-P. 1231.

66. Clarke D.R., Harpor I.A., Thompson R.Q. The detection of E.coli heat-labile enterotoxin by ELISA/ / J.lnfection.-1984.-V.9.-N 1.-P.224-251.

67. Clements I.D. Properties of homogeneous heat-labile enterotoxin from Escherichia coli // Infect. lmmun.-1980.-29.-N 1.-P.91-97.

68. Clements I.D. Adjuvant activity of E.coli heat-latile enterotoxin and effect on the induction of oral tolerance in mice to unrelated protein antigens II Vaccine.-1988.-N 6.-P.269-277.

69. Clements I.D. Construction of a nontoxic fusion peptide for immunisation against E.coli strains that produce heat-labile and heat-stabie enterotoxins II Infect.Immun.-1990.-V 58,- N 5.-P.1159-1188.

70. Clements I.D., Finkelstein R.A. Isolation and characterisation of horiogeneous heat-labile enterotoxins with high specific activity from E.colicultures // Infect Jmmun.-1979.-24.-N 3.-P.760-763.

71. Clements I.D., Yancey R.I., Finkelstein R.A. Properties of homogeneous heat-labile ennerotoxin from E.coli // Infect. Immun.-1980-29.-N 1.-P.91-97.

72. Cole S.P.C., Vreken E.H., Roder J.G. Antibodie production by human x human hydridomas in serum free medium.- J. Immunol. Methods, 1985, v.78, p.271-278.

73. Craige I. P. A permiability factor (toxin) found in cholera stool and culture filtrates and its neutralisation by convalescent cholera sera // Nature (London).-1985.-V.20-P.814-818.

74. Cryan B. Comparison of three assay systems for detection of enterotoxigenic E.coli heat-stable enterotoxin // J. Clin.Microbiol.- 1990. -28.-N 14.-P.792-794.

75. Cuatrecasas P. Gangliosides and membrane receptors for cholera toxin // Biochemistry.-1973.-12.-N 16.-P.3558-3568.

76. Dallas W.S., Falkow S. Amino acid sequence homology between cholera toxin and E.coli heat-labile toxin // Nature.-1980.-V.288.-N 5790,-P.499.

77. De Rie M.A. et. al. Evaluation of a method of production and purification of Mab for clinical applications.- J. Immunol. Methods, 1987, v.102, p. 187-193.

78. De S.N., Chatlerjee D.N. An experimental study of the mechanism of action of V. cholerae in the intestinaL mucosa membrane // J.Pathol.Bacteriol.-1953. -V.48.-N 2.-P.559.

79. De Wolf M., Ven Dessel 0., Lagras A. Structural features ofthe binding site of cholera toxin inferred from fluorescence measurements //

80. Biochim.,Biophus.Acta.-1985.-832.- N 2.-P. 183-174.

81. Diano M., Bivic A., Hirn M. A. A method for the production of highli specific polyclonal antibodies.-Anal. Biochem., 1987, v.116, p.224-229.

82. Donnenberg M., Donohue-Rolfe A., Keusch Q. A comparison of HEp-2 cell invasion by enteropathogenic and enteroinvasive E.coli // FEMS Microbiol.Lett.-1890.-89.-N 1-2.-P.83-88.

83. Donta S.T., Moon H.W., Whipp S.C. Detection of heat-labile E.coli enterotoxin with the use of adrenal cells in tissue culture // Science.-1974.-V.183-N 4122,- P.334.

84. Dusuchet-Suchaux M. Le souriceau, modele d'etude de la diarrhee colibacillaire. Ann. Microbiol., (Inst. Pasteur), 1980, 131B, p. 239-250.

85. Edwards P.A.W. Some properties and applications of Mab.- Biochem. J., 1981, v .200, p. 1-10.

86. Eideis L., Prola R.L., Hart D.H. Membrane receptors for bacterial toxins. // Microbiol Rev.-1983.- 47.-N 4.-P.596-620.

87. Eisenstein B. New molecular techniques for microbial epidemiology and the diagnosis of infection diseases // J.Infec.Diseases.-1990.-181.-N 4,-P.595-802.

88. Evans D.G., Evans D.I.Jr., Gorbach S.L. Identification of enterotoxigenic Echerichia coli and serum antitoxin activity by the vascular permeabiIiti factor assay. Infect. Immun., 1973, v.8, p.731-735.

89. Evans D.l.lr., Evans D.G. Ingibition of immune hemolysis: a serological assay for the heat-labile enterotoxin of E.coli // J.Clin.Microbiol.-1977.-V.5.- N 1.- P. 100-105

90. Evans D.l.lr., Evans D.G. Direct serological assay for the heat-labile enterotoxin of Escherichia coli using passive immune hemolysis // Infec. Immun.-1977. V.16.-N 3,- P.604-603.

91. Evans D.I.Jr., Evans D.G., Gorbaoh S.L. Polymyxin B -induced release of low molecular-weight heat-labile enterotoxin from E.coli // Infec.Immun.-1974.-V. 10.-N 5,- P. 1010-1017.

92. Faris A., Lindhal M., Wadstrom 111 FEMS microbiol. Lett., 1980.,v7„ p.265-269.

93. Fazekas de St. Groth S., Schneidegger D. Production of monoclonal antibodies: strategy and taktics.-J. Immunol.Methods, 1980, v.35, p. 1-21.

94. Finkelstein R.A. Quo vadis: thirty years after the discoveries of cholera enterotoxin in India II Curr.ScI (India) 1990.- 59.-N 13-14.-P.658~ 664.

95. Finkelstein R.A. Burks M.F. Application of monoclonal antibodies and genetically engineered hybrid B-subunit proteins to the analysis of the cholera I coli enterotoxin family // Develop. Biol. Standart.-1985.-59.-P. 51-62.

96. Finkelstein R.A., Larue M. K., Jonhston D.S., Jones I.R., Vasil M.L. Isolation and properties of heat-labile enterotoxin from enterotoxigenic E.coli // J.Infect. Dis. Suppl / En/-1978,-133,- №3,- p102-137.

97. Fogel N., Klemm P., Elling F. Passive immunizaition of newborn piglets with anti-K88 murine monoclonal antibodies. Proceedings of 9 World Pig Vet. Ass. Congress, Barselona, 1986: 149.

98. Friguet B. et al. Measurement of the true affiniti constant in solution of antigen-antitelo complexes by ELISA.- J. Immunol. Methods, 1985, v.77., p.305-319.

99. GaastraWim, Van der Leigst , Bernard A.M. Fimbriae of human enterotoxigenic E.coli and their possible use as vaccine components// Rev.Med.Miorobiol.-1996-7.-N 3.-P. 186-177.

100. Geary S., Marchlewicw B., Finkelstein R. Effect of parenteral vaccination of dams on intestinal Echerichia coli in piglets with diarrhea. Infect. Immun., 1982, 36: 900-906.

101. Geary S.I., Marohlewiez B.A., Finkelstein R.A. Comparison of heat-labile enterotoxin from human and porcine strains of E.coli // lnfec.lmmun.-1982.- 38.-N1- P.216-220.

102. Germani Y. Sondes nucleiques chonees et oligonucleotides synthetiques pour I'identification des "patlutypes" de E.coli agents d'enterites // Bull.Inst.Pasteur 1990.-88.-N 4,- P.383-397.

103. Germani Y., Brethes B., Le Gonides G., Moreau I.P. Bilan epidemlologyque des etudea realises sur les E.coli enterotoxinogenes en Nouvelle Caledonie entre 1983 et 1988 // Bull.Soc.pathol exot -1988. -81.-N 5-P.795-805.

104. Gill D. Mode of action of the cholera-coli family of enterotoxins. Progr. Fd. Nutr. Sei., 1983, v.7„ p.143-146.

105. Gill D.M., Clements I.D., Robertson D.C.,Finkelstein.A. Subunit number and arrangement in E.coli heat-labile enterotoxin // Infec.lmmun.-1981. 33.-N 3,- P.877-682.

106. Gill D.M., Richardson S.H. Adenosin diphosphate-ribosylation of adenylate cyclase catalased by heat-labile enterotoxin of E.coli: comparison with cholera toxin // J.lnfec.Dis.-1980.-41 ,-N 1.-P.71-76.

107. Gioquelaus K.G., Baldini M.M., Martiner J., Maggi L. Practical and economical method for using biotinylated DNA probes with baoterial colony blots to identify diarrhea causing E.coli // J.Clin Microbiol -1990. -28.-N II.- P.2485-2490.

108. Goling. J. W, Antibodi production by hybridomas.- J. Immunol. Methods, 1980, v. 39, p. 295-308.

109. Goling. J. W, Mab, principles and practice.- London: Academic Press, 1983.

110. Goyal I., Ganguly N.K., GargU.C., Walla B.N.S. Differences between the mechanisms of action of heat-sfable and heat-labile enterotoxins of Escherichia coli // F£MS Microbiol.Lett.- 1990,--86.-N 1-S.P.I 69-174.

111. Grasser F., Scheftel I.M., Montell H. Purification of E.coli heat-labile enterotoxin and comparison with enterotoxic factor elaborated by teropathogenic E.coli // Bacteriol protein toxins London, 1984.- P.263-254.

112. Griswold W. R. Theoretical analysis of sensitivity of the solid phase antibodi assay (ELISA).- Molecular Immunol., 1987, v.24, N 12, p. 12911294.

113. Guzman-Verduzco L.-M., Kupersztoch Y.M. Export and processing analysis of a fusion between the extracellular heat-stabie enterotoxin and the periplasmic B- subunit of the heat-labile enterotoxin in E.coli // Mol.Microbiol. 1990,- 4.-N 2,- P.233-234.

114. Gyles C.L. Heat-labile, and heat-stable forms of enterotoxin from Escherichia coli strains enteropathogenic for pigs // Ann.N.Y.Acad. Sci- 1971. -78.-N 2.- P.314-322.

115. Gyles C.L., Falkow S. The enterotoxin plasmids of E.coli // J. Infec.Dis. -1974. 130.-N 1,- P.40-49.

116. Hale G. et al. Isolation of low-frequency-class switch variante from rat hybrid myelomas.-J. Immunol. Methods, 1987, v. 103 p.59-67.

117. Harris H.,Watkins J. F. Hybrid cells derived from mouse and man: Artificial heterocaryons of mammalian cells from different species.// Nature, 1965, 205, p 640.

118. Heuzenroeder M. W., Elliot T.R., Thomas C.I., Halter R., Manning P. A. A new fimbrial type (PCF 09) on enterotoxigenic E.coli 09:H" LT+ isolated from a case of infant diarrthea in Central Australia // FEMS Microbiol. Lett. -1980, -66.-N -3,- P.55-60.

119. Hill W.E. DNA hybridisation method for detecting enterotoxigenic E.coli in human isolates and its possible application to food samples // J.Food Safety -1981.-V.3.-P.233-247.

120. HiratT.R., Hardy S.I., Randall L.L. Assembly in vivo of enterotoxin from E.coli: formation of B-subunit oligomer // J. BacterioL1983. 153.-N 1.- P.21-26.

121. Hirst T.R., Randall L.L., Hardy S.I.S. Cellular localisation of enterotoxin in E.coli // Biochem.Sec.Transaction -1984.- V.12.-N 2.-P.189-191.

122. Hofstra H., Withelf B. Kineties of syntesis processing a periplasmatic protein in Escherichia coli // J.Biol.Chem.- 1984. V.259.- N 24,-P.15182-15137.

123. Holland R.F. Some infections causes of diarrhea in young form animals // Clin.Microbiol.Rev.-1990. -N3.-N 4.-P.345-375.

124. Holmgreen J., Fredman P., Lindblarid M. Rabbit intestinal glycoprotein receptor for E. coli heat labile enterotoxin affinity for cholera toxine. Infect, immun., 1982, v 38, p. 424 - 433.

125. Holmgren I. Comparison of tissue receptors for V. cholerae and E.coli enterotoxins by means of gangliosides and natural cholera toxoid // Infec.Immun -1973. 8,- N 4.-P.851-858.

126. Holmgren I. From cholera toxin to subunit vaccines // Curr.Scl. (India) -1990. 59,- N 13-14.-P.865-699.

127. Honda T., Sato M., Miwatani T. Differential detection of cholera entero- toxin and E.coli heat-labile enterotoxin by ensyme-linked immunosorbent assay with antibodies specific to the two toxins // J.Clin.Microbiol -1984.-20.-N 4.-P.664-667.

128. Horenstein A. L ., Glait H.M., Voss A. An improved selectionprocedure for the rescue of hybridomas. A comparative study of methotrexate versus aminopterin.- J. Immunol. Methods, 1987, v.98, p. 145149.

129. Hunson L., Hau F. C. Practical Immunology.- Oxford: Blfckwell,1980.

130. James K., Bell G. T. Human Mab production, Current status and future prospects.-J. Immunol. Methods, 1987, v.100, p.5-40.

131. Jayappa H., Goodnow R., Geary S. Role of Echerichia coli type I pilus in colonization of porcine ileum and its protective nature as a vaccine antigen in controlling colibacillosis. Infect. Immun., 1985, 48: 350-354.

132. Jonge de H. The mechanism of action of Echerichia coli heat-stable toxin. Biochem. Soc. Transact., 1984, 12: 180-184.

133. Kaper I.B., Moseley S.L., Falkow S. Molecular characterisation of enviromental and nontoxigenic strains of V.cholerae II Infec.lmmun.- 1981.-V.32.- N 2.-P.661-667.

134. Karsten U. Calibration of hybridoma antibodi assays by policlonal supernatants produced in vitro. Biomed. Biochim. Acta , 1984, v.43,N 6, p.828-833.

135. Kazemi Moham mad,Finkelstein Richard A. Study of epitopes of cholera enterctoxin related enterotoxins by checkerboard immunoblotting // Infec.and Immun.- IS90. -58.-N 7.-P.2352-2360.

136. Kenichi 0., Shuichi K., Shoichi Y. Naturally occuring plasmid coding for heat-labile enterotoxin production and drug resistence from Echerichia coli strain of porcine origin. Jap. J. Vet. Sci., 1985, 47: 125-128.

137. Kennan R.M., Monekton P.P. Adhesive fimbriae associated with porcine enterotoxigenic Escherichia coli of the 0141 serotipe // J.Clin

138. Microbiol.-1990.-28.-N 9.-P.2006-2011.

139. Kennedy D., Greenberg R., Dunn J. Effects of Echerichia coli heat-stable enterotoxin STb on intestines of mice, rats, rabbins and piglets. Infect. Immunol., 1984, 46: 639-643.

140. Kennet R. H., McKearn T. J., Bechtol K. Eds. Monoclonal Antibodies and T cell Hybridomas, Elsevier/North-Holland, Amsterdam, 1981.

141. Keslow H.R., Johnson G.X., Brothers V.M., Bourne H.R. A regulatory component of adenylate cyclase from human erythrocyte membrans // J.Biol.Chem.-1980. 255.-N 8,- P.3736-3741.

142. Keusch G.T., Donta S.T. Classification of enterotoxins on the basis of activity in cell culture //J.lnfect.Dis.- 1975,-V.131.- N 1,- P.58-62.

143. Klipstein F.A., Engert R.F., Clements I.D., Hougten R.A. Vaccine for enterotoxigenic E.coli basedon synthetic heat-stable toxin crosslinked to the B subunit of heat-labile toxin //J.lnfec.Dis.- 1983. -147.-N 2,- P.318-326.

144. Klipstein F.A., Gaerrant R.L., Wells I.G. Comparison of assay of coliform enterotoxins by conventional techniques versus in vivo intestinal perfusion// lnfec.lmmun.-1978. V.25.-N 1.- P. 146-152.

145. Knutton Stuart, Me Connell Moyba M., Rowe Bernard., Me Nelsh Alexander S. Adhesion and ultrastructural properties of human enterotoxigenic E.coli producing colonisation factor antigens III and IV // Infec.lmmun.-1989,- 57. N 11 .-P.3364- 3371.

146. Koziol J. A., Ferrari C., Chisari F. V. Evaluation of monoclonaliti of cell linies from sequential dilution assays.- J. Immunol. Methods, 1987, v.105, p. 139-143.

147. Krovaoek K., Faris A., Wandstrom T. Hight levels of heat-labile E.coli enterotoxin in bacterial cell sonicates of agar grown cultures // Zbl.Bact.Hyg.-1983. -V.A255.-N 2-3,- S.265-270.

148. Kruth H. S. Flow cytometry Rapid biochemical analysis of single cells.-Analytical Biochem ., 1982, v.125, p.225-242.

149. Kunkel S.L., Robertson D.C. Purification and chemical characterisation of the heat-labile enterotoxin produced by enterotoxigenic E.coli // Infec.,Immun -1979.-V.25.-N 2.-P.586-596.

150. Kwan C.N., Wishow R.M. Escherichia coli enterotoxin induced steroidogenesis in cultured tumor cells // Infec.Immun.- 1974.-V. 10.-N 1,-P.146.

151. Levine M., Edelman R. II Epidem. Rev.-1984.-v. 6.- p. 31-51.

152. Lopez-Vidal Yalanda, Calva Juan I., Trujillo Ana Enterotoxins and adgesins of enterotoxigenic Escherichia coli: are they risk factor for acute diarrhea in the community? // J.lnfec.Dis.- 1990. -162.- N 2,- P.442-447.

153. Lortie Louis-Andre, Dubreuil I.Daniel, Harel losee Characterisation of E.coli strains producing heat-stable enterotoxin b (ST b) isolated from humans with diarrhea // J. Clin.Microblol.-1991.-29,- N 3,- P.656-659.

154. Marusich MF Efficient hibridoma production using previously frozem splenocytes. // Immun.Meth .-1988-124-P. 155-159

155. Melchers F., Potter M., Warner N. et al. Current Topics in Microbiology and Immunoiogy,Vol.81, Lymphocyte Hybridomas, SpringerVerlag, Berlin 1978.

156. Mendoza-Vega 0., Buri E., Speck D. Enhancement of recombinant cholera oxil B suunit production in E.coli by applyinga fed-batch control strategy II Bloteohnol. Lett.-1995. 17.-N 10,- P. 1037-1042.

157. Middlebrook 1.1., Dorland R.B. Bacterial toxin cellular mechanism of action // MIorobiol.Rev.-1984,- 48.-N 3.-P.199-221.

158. Mills K., Tietze K. Monoclonal antibody enzyme-linked immunosorbent assay for identification of K99 positive Echerichia coli isolates from calves. J.Clin. Microbiol., 1984, 19, 4: 498-501.

159. Milon A., Esslinger I., CamgTjilhein R. Adhesion of E.coli strains solated fron diarrheic weaned rabbits to intestinaL villi and HeLa cells // Infec., Immun.-1990. 58,- N 8,- P.2890-2895.

160. Milstein C., Cuello A. C. Hibrid hybridomas and their use in immunohistochemistry.- Nature, 1984, v.305, p.537-540.

161. Mishel R. I., Shiigi S. M. Selected methods in cellular immunology.-San Franzisko, W. H. Freeman and Co., 1979.

162. Minami I., Okabe A., NagotaA. Quantitative analysis of the production of heat-labile enterotoxin by enteroto-xigenio E.coli // Acta Med.Okayana.-1984.-V.38.-N 5,- P.481-489.

163. Mirza I. H.,Wilkin T. J., Cantarini M., Moore K. Acomparison of spleen and lymph node cells as fusion partners for the raising of monoclonfl antibodies after different routes of immunisation J. Immunol. Methods, 1987,v. 105, p.235-243.

164. Morris I., Sojka W., Ready R. Research serological comprarison of the Echerichia coli prototype strain for the F(Y) and Att 25 adhesins implicated in neonatal diarrhea in calves. Research in Veter. Sei., 1985, 38: 246-247.

165. Morris I., Thome C., Wellis G. The production of F41 fimbrae bypiglet strains of enterotoxigenic E. coli that lack K88, K99 and 987P fimbrae. J. Gen. Microbiol., 1983, 129: 2753.

166. Morris I., Thorus C Boarer C Evalution of monoclonal antibody to the K99 fimbrial adhesin prodused by E.coli enterotoxigenic for calves, lambs and piglets. Res. Vet, Sci., 1985, 39: 75-79.

167. Morris I, Welles G, Scott A. e.a. Colonization of the intestine of lambs by an anterotoxigenic Echerichia coli producting F41 fimbrae. Vet. Rec., 1983, 113: 71-72.

168. Moss I., Richardson S.H Activation of adenylate cyclase by heat-labile E.coli enterotoxin. Evidence for ADF-ribosyltransferase activity similar to that of oholeragen // J.Clin.lnvesb.-1978.-81 ,-N 2.-P.281-288.

169. Myers Lyie L., Shoop Douglas S., Collins lames E. Rabbit model to valuate enterovirulence of Bacteroides bragilis // J.Clin.Microbiol.-1990. 28.-N 7,- P. 1658-1680.

170. Nagy Bela, Hoglund Stefan, Morein Bror Isoom (immunostimulating cmplex) vaccines containing mono- or polivalent pill of enterotoxigenic E.coli immune response of rabbit and swine // J.Vet.Mod.3.-1990. -37.-N 10,- P.728-738.

171. Newmark P. The mani merits of monoclonals.- Nature, 1985, v316, p.387

172. Nimmioh W. Adhesins of E.coli // Acta biotechnul-1990.-10.-N 2,-P.447.

173. Nogareda M., Arias M., Sanches-Vizcaino J. Factor de adhesion K88 de cepas eterotoxigenicas porcinas de Echerichia coli y su adaption a la tecnica elisa sandwiche in directo. An. INIA Ser. Ganadera, 1984, 20: 105-119.

174. Nunos M., Alvarez M., Lonza 1., Carmenes P. Roel of enteric pathopens in the acticlogy of neonatal diarrhoea in lambs and goat kids in Spain // Epidemiol and Infec.-1996. -117.-N 1.- P.203-211.

175. Ohnishi K. et al. Improvement in the basic tehnology of electrofusionfor generation of antibodi-producing hybridomas.- J. Immunol. Methods, 1987, v. 100, p. 181-189.

176. Okad Y., Murayama F. Multinucleated giant cell formation by fusion between cells of two differens. // Exp. Cell. Res., 1965, 40, 154.

177. Orlandi P.A., Critchley D.R., Fischman P.H. The heat-labile enterotoxin of E.coli binds to polylaotosaminoglycan-containing receptors in CaCo-2 human intestinal epithelial cells // Biochemistry 1994. - V. 33.- N 43,-P. 12886-12895.

178. Orlandi P.A., Fischman P.H. The heat-labile enterotoxin of E. coli binds to terminal galactosyl (P 1,4+) N-acetylglucosaminylcontaining receptors in CaCo-2 intestinal epithelial cells // J.Cell.Bloohem.- 1994-Suppl.18d.-P.279.

179. Orskov F., Orskov I. Serotyping of E.coli // Methods in microbiology -London, 1984.-P.43-112.

180. Ouchterlony 0. Methods for immunological identification of enterotoxigenic pathogens, in "43 Noble symposium cholera and related diarrheas, Stockholm" (O. Ouchterlony & J. Holmgren) pp. 142-154). S. Karger, Basel, 1978.

181. Pahhotra B.R., Agarwal K.S., Vinayak V.K. Co-agglutination and latex agglytination test for the detection of E.coli enterotoxin // Indian J.Mod.Res.-1981.- V. 14.-N 10,-P.662-667.

182. Parreira Valeria Regina, Arns Clarloe Wels, Yano Tomamasa An agar-overlay method for defection of toxin produced by E.coli // FEMS Micro- biol.Lett.-1984.-120.-N 3,- P.300-301.

183. Pfeiffer N. E., Wylie D. E., Schuster S. H. Immunoaffinity hromatography utilizing Mab .- J. Immunol. Methods, 1987, v.97, p. 1-9.

184. Pontevorco C. Production of indefinitely multiplying mammalian somatic cell hybrids by polyethylene glycol ( PEG ) treatment. // Somatic. Cell Genet., 1976,1, 397

185. Poole A. R., Howell J. I., Lucy J. A. Lysolecithin in cell fusion. // Nature, 1970, 227,810.

186. Reading C L Theory and methods for immunization in culture and Mab production.-J. Immunol. Methods, 1982, v.53, p.261-291.

187. Red Fiebig, Veb Gustav Fischer Verlag. Immunologische Arbeitsmethoden. Jena, 1984.

188. Reik C. M. et al. A simple, non-chromatographic purificación procedure for Mab.- J. Immunol. Methods, 1987, v. 100, p. 123-130.

189. Riley Leba K., Caffrey Connie I. Identification of enterotoxigenic E.coi. by colony hybridization with nonradioactive digoxigenin-labeled DNA probes //J. Clin.Microbiol.- 1990.-28.-N 6.-P. 1465-1468.

190. Rutter J.// Virulence Mechanisms of Bacterial Pathogen.// Ed. A. Roth.- Washington, 1988,- p. 213-227.

191. Sack B.// J. Infect. Dis. -1980. v. 142,- p. 279-286.

192. Sack R. B. Human diarrheal disease caused by enterotoxigenic Echerichia coli. Ann. Rev. Microbiol., 1975, 29, 333-353.

193. Sadowski P. Production of monoclonal antibodies against bacterial adhesins. Patent 4443549 USA; N428622, 17.04.84.

194. Saeed A., Sriranganathan N., Cosand W., Burger D. Purification and characterisation of heat-stable enterotoxin from bovine enterotoxigenic E. coli. Infect. Immun., 1983, 40: 701-707.

195. Samoilovich S. R., Dugan C. B., Macario A. J. L. Hybridoma technology: new developments of practical interest.- J. Immunol. Methods, 1987, v. 101, p. 153-170.

196. Sandefur P.O., Peterson I.W. Neutralisation of Salmonella toxin-induced elongation of Chinese hamster ovary cells by cholera antitoxin II1.fec.lmmun.-1977. V.15.-N 3,- P.988-992.

197. Schroder J. Mab: A new tool for research and immunodiagnostics.-Medical Biology, 1980, v.58, p. 140-148.

198. Serebrjakov,S., Plishkina.K., Verbitsky,M., Fiedler ,R., Matevosian,K. ElA-kit for determining bovine somatotropine.lmmunology of reproduction. Abstracts from international symposium October, 19-23,1993, Kiev, Ukraine.C.73

199. Shan D.B., Kauffman P.E., Beutin B.K., Johnson C.H. Detection of heat-labile enterotoxin-producing colonies of E.coli and V.choleraeby solid-phase sandwich radioimmunoassay // J.CIin.Miorobiol.-1982.- V.16.- N 3.-P.504-508.

200. Shapiro S. Z., Kimmel B. E. A simple method for the production of specific antiserum to protein in cloned genes.- Immunization with precipitin lines.- J. Immunol. Methods, 1987, v.97, p.275-279.

201. Shi L, Xu H, Wang D., Dong Z. An improving methods to increase fusion rate by using in vivo myeloma cells from solid tumors in BALB/c mise. // Chin J. Microbiol Immunol 1987, 7, p.324-327.

202. Shida Kan., Takamizawa Kataro, Takeda Tae, Osawa Toshiaki Characterization by western blotting of mouse intestinal glycoproteins bound by E.coli heat-labile enterotoxin type I //, Microbiol, and Immunol.-1998.-40.-N 1.-P.71-75.

203. Sihengrund CaraLynne, Ringler Nancy I. Binding of V. cholera toxin and the heat-labile enterotoxin of E.coli to Gm(, derivatives of Gmi, and nonlipid oligosaccharide polyvalent ligands // J.Biol.Chem. 1989. -264,-N22,-P. 13233-13237.

204. Siifonen Anja What makes Escherichia coli pathogelio // Ann.Mod.-1994. 26.-N 4,- P.229-231.

205. Silva M.L., Scaletsky I.C.A., Reis M.H.L. Plasmid coding for drug resistence and production of heat-labile and heat-stablei toxins harbored by an E.coli strgin of human origin // Infec.lmmun.- 1983,- 39.-N 2,- P.970-973.

206. Smith H. Genetics of enterotoxin production in Echerichia coli. Biochem. Soc. Transact., 1984, 12: 187-189.

207. Sohenkein I., Green R.F., Santos D.S., Moos W.K. Partial purification and characterisation of a heat-labile enterotoxin of E.coli // Infec.lmmun.-1976.-13.-N6-P.1710-1720.

208. Sohlfferll D.M., Beachey E.H., Taylor R.K. The 987 P finbrial gene cluster of enterotoxigenic E.coli is plasmid enooded // Infec.Immun.-1990 .-58.-N2.-P. 149-156.

209. Spioer E.K., Noble I.A. E.coli heat-labile enterotoxin. Nucleotide sequence of the A subunit gene // J.Biol. Chem.-1982.- 257,- N 25,- P.5716-5721.

210. Stevens F. J. Modification of an ELISA-based procedure for affinity determination Correction necessari for use with bivalent antibodi.-Molec.Immunol., 1987, v.24, N10, p. 1055-1060.

211. Steward M. W., Lew A.M. The importance of antibody affinity in the performance of immunoassay for antibody.- J. Immunol. Methods, 1985, v.78, p. 173-190.

212. Strijbosch L.W.G. et al. Limiting dilution assays, experimental design and statistical analysis.-J.Immunol.Methods, 1985,v.97,p. 133-140.

213. Sugannann B. Zink and the heat-labile enterotoxin of E.coli // J.Med.Microbiol.- 1984.-V.18,- N 3,- P.393-398.

214. Sugii Shunji, Tsuji Takao Studies on the binding substances on hu- man erythrocytes for the heat-labile enterotoxin isolated from chicken enterotoxigenic E.coli // Biochim.et biophys acta Biomembranes -1989,-983.-N 1,- P.30-34.

215. Sugii Shunji, Tsuji Takao. Binding specificaties of heat-labile en-terotoxins isolated from porcine and human enterotoxigenic E.coli for different gangliosides // Can.J.Miorobiol.-1989. -35,- N 6,- P.670-673.

216. Svennerholm A. M. Gangliosides isolation in "Methods in carbolydrate chemistry"(R. L. Whistler & R. L. Miller), v. 6. Academic Press,1. New York, London, 1978.

217. Svennerholm A.M. & Holmgren J. Indefication of Echerichia coli heat-labile enterotoxin by means of a ganglioside immunosorbent assay (GMi-ELISA) procedure. Curr. Microbiol., 1978, 1: 19-23.

218. Svennerholm A.-M., Willund G. Rapid GM1-enzyme-linked immunosorbsnt assay with visual reading for identificution of E.coli heat-labile enterotoxin // J.Clin Microbiol.- 1983.-V.17.-N 4.-P.596-600.

219. TakedaY., Honda T., Sima H. Analysis of antigenic determinants in cho-lera enterotoxin and heat-labile enterotoxins from human and porcine enterotoxigenic E.coli // lnfec.lmmun.-1983.- 41.-N 1.-P.50-53.

220. Takeda Y., Taga S., Miwatani F. Purification ot heat-labile enterotoxin of E.coli // FEMS Microbiol.Lett.- 1979.-V.5.- N 3,- P. 181-186.

221. Tamanai-Shaccori Z., lolivet-Gougeon A., Pommepuy M, Cormier M., Colwell R.R. Detection of enterotoxigenic E.coli in water by polymerase chain reaction amplification and hibridization // Can. J.Microbiol 1994,- V.40.- N 4,- P.243-249.

222. Tamura K., Sakozaki R., Murase M., Kosoko V. Serotyping and categorisation of E.coli strains isolated between 1958-1992 from diarrhoeal diseases in Asia // J.Med.Microbiol,-1996. 45.-N 5,- P.353-358.

223. Thompson M., Brandwain H., La Bine-Racke M. e.a. Simple and reliable anzyme-linked immunosorbent assay with monoclonal antibodies for detection of E.coli heat-stable enterotoxins. J. Clin. Microbiol., 1984, 20, 1: 59-64.

224. Tijssen P., Kurstack E. Highly efficient and simple method for the preparation of POD and active peroxidase-antibodies conjugates for EIA. -Anal. Biochem.,1984, v. 136, p451~457.

225. Tijssen P. Practice and theory of enzyme immunoassays. Amsterdam, Elsevier, 1985.

226. Tsuji T., Honda T., Miwatani T. Analysis of receptor-binding site in E.coli enterotoxin // J.Biol.Chem.- 1985.-v260.- N 14,- P.8552-8558.

227. Tsuji Takao, Honda Takeshi, Miwatani Tashio, Miyama Akio. Comparison of coligenoid formation by B subunits of porcine and human E.coli heat-labile enterotoxins // FEMS Microbiciol. Lett.-1990.-69.-N 3,- P.299-304.

228. Tsuji Takao, Honda Takeshi, Miwatani Toshio, Miyama Akio. Detection and purification of the free A subunit of heat-labile enterotoxin produced by enterotoxigenic E.ooli // FEMS Microbiol.Lett.-1991 .-77.-N 2-3.-P.277- 282.

229. Tsuji T., Taga S., Honda T. Molecular heterogenity of heat-labile enterotoxins from human and porcine enterotoxigenic E.coli // Infec.lmmun.-1982.-32,- N 2,- P.444-448.

230. Vos Q., Klassen E.A.,Haaijmann J.J. The effect of divalent and univalent binding on antibodi titration curves in solid phase ELISA. -J. Immunol. Methods, 1987,v. 103, p.47-54.

231. Wachamuth K. Laboratory detection of enterotoxins II Infect, diarrheal diseases: current concept and laboratory procedure -1984. -P.93-115.

232. Wandstrom T., Faris A., Lindahl M., et. al. // Lectins. 1983., v.111., p.503-510.

233. Westerwoudt R. J. Improved fusion methods. IV. Technical aspects . J. Immunol. Methods, 1985,v.77, p. 181-196.

234. Wlgmore I.A. Detection of heat-labile enterotoxin of E.coli usingthe Biken-test // Med. Lab. Sci -1984. -V.41.-N 2,- P. 146-149.

235. Wipp Shannon C. Assey for enterotoxigenic E.ooli heat-stable toxin b in rats and mice // Infec. Immun. -1990. 58.-N 4.- P.930-934.

236. Yamamoto T., Tamura T., Yokota T. Primary structure of heat-labile enterotoxin produced by E.coli pathogenic for human II J.BIol. Chem -1984.-259.-№ 8.-P.5037-5044.

237. Yamamoto T., Yakota T. Sequence of heat-labile enterotoxin of E.coli pathogenic for human // J.Bacterid -1983. 155.-N 2,- P.728-733.

238. Yolken R.H., Greenberg H.B., Merson M.H. Ensyme-linked immunosorbent assay for detection of E.coli heat-labile enterotoxin // J.Clin.Microbiol.-1977,-V.6.- N 5.-P.439-444.

239. Yolken R.M., Greenberg M. B., Merson M. H., Sack R.B., Kapikian A. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Echerichia coli heat-labile enterotoxin. J. Clin. Microbiol., 1977, 6: 439-444.

240. Zenser T.V. & Metzger J.F. Comparison of the action of Echerichia coli enterotoxin and thymocyte adenylate cyclase-cyclic adenosine monophosphate system to thet of of choleria toxin and prostaglandin F1. Infect. Immun., 1974, 10: 503-509.

241. Zimmerman U., Vienken J. Elektric field-induced cell to cell fusion.-J. Membrfne Biol., 1982, y.67, p. 165-182.

242. Zhang Rong-Guang, Scott David L., Westbrook Mary L., Nance Sharon, Spangler Brenda, Shipley G.Graham. The three-dimensional crystal structure of cholera toxin // J.Mol.Biol -1995.-251.-N4.-P.563-573.

243. РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

244. НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПУШНОГО ЗВЕРОВОДСТВА И КРОЛИКОВОДСТВА ИМ. В.А.АФАНАСЬЕВА

245. УТВЕРЖДАЮ: Директор ННИПЗК им. В.А.Афанасьева доктор с-х. наук, профессор1. H.A. Балакирев1998 г.1. ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ РЕГЛАМЕНТ

246. НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕРМОЛАБИЛЬНОГО ЭНТЕРОТОКСИНА ЭШЕРИХИЙ ( ЛТ-ИФА ) В ОБЪЕКТАХ ВЕТНАДЗОРА.

247. Ответственный исполнитель: Серебряков С.Н.научный сотрудник1. Зам. Директора по НИРкандидат с-х. наук Тинаева Е.А.п. Родники, Московской обл. 1998 г.

248. Технологический регламент производства ИФА набора разработаны коллективом авторов лаборатории генно-инженерных препаратов в составе :

249. Заведующего лабораторией кандидата биологических наук Козловского Ю.Е.

250. Гл .научн. сотр . ,д.в.н.Емельяненко П.А. , научн. сотр. Серебряков С.Н.

251. Рецензент: ведущий научный сотрудник, доктор ветеринарных наук, профессор Майоров А.И.

252. Рекомендации рассмотрены и утверждены на секции пушного звероводства и кролиководства Россельхозакадемии ( протокол № от «»1998 г. )

253. ХАРАКТЕРИСТИКА КОНЕЧНОЙ ПРОДУКЦИИ1. ПРОИЗВОДСТВА

254. Наименование продукта набор изделий для иммуноферментного определения термолабильного энтеротоксина эшерихий для лабораторного применения.

255. Основное назначение продукта качественное одноступенчатое определение термолабильного энтеротоксина эшерихий в объектах ветнадзора. Область применения - вет-бак лаборатории и НИИ.

256. Краткое описание продукта : в состав набора входят :

257. Планшет с сорбированными на поверхности лунок монокпо-' ; 1 нальными антителами к термолабильному энтеротоксину эшерихий2. Коньюгат 1

258. Нулевой стандарт ( отрицательный контрольный образец ) 14. Хромоген 15. Субстратный буфер Н202 1

259. Фосфатный буферный раствор 17. Стоп-раствор- 2М Н2304 1

260. Буфер для разведения образцов 19. Растворитель 1

261. ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ СХЕМА ПРОИЗВОДСТВА

262. Технологическая схема производства набора «ЛТ-ИФА» представлена в таблице 2.1.