Получение и характеристика моноклональных антител для экспресс-анализа бактериальных токсинов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат химических наук Шошина, Наталья Сергеевна

• Шошина, Наталья Сергеевна
• кандидат химических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат химических наук Шошина, Наталья Сергеевна

Е. coli

3.1.3.Выделение и очистка моноклональных антител

3.1.4.Характеристика МА к СТ

3.1.5.Характеристика МА к LT

3.1.6.Подбор пар МА для детекции СТ методом «сэндвич»-ИФА

3.1.7.Подбор пар МА для детекции LT методом «сэндвич»-ИФА

3.1.8.Детекция и количественное определение холерного токсина и термолабильного энтеротоксина Е. coli в образцах различной природы методом «сэндвич»-ИФА

3.1.9.Подготовка образцов смывов со слизистой оболочки носоглотки для детекции и количественной оценки в них холерного токсина и термолабильного энтеротоксина

Е. coli методом «сэндвич»-ИФА на планшетах

3.2.Разработка биплексной тест-системы на основе хМАР технологии для детекции

холерного токсина и термолабильного энтеротоксина Е. coli

3.2.1.Получение конъюгатов микросфер с МА к CT и LT

3.2.2.Определение оптимальных концентраций детектирующих антител

3.2.3.Определение минимальной детектируемой концентрации CT и LT в буфере методом биплексного иммунофлуоресцентного анализа с применением хМАР технологии

3.2.4.Биплексный анализ CT и LT в буфере

3.2.5. Изучение перекрестной активности моноклональных антител полученных к холерному токсину и термолабильному энтеротоксину Е. coli со специфическими антителами к стафилококковым токсинам АиВ

3.2.6.Детекция и количественное определение холерного токсина и термолабильного энтеротоксина Е. coli в продуктах питания в формате хМAP-анализа

3.2.7. Детекция и количественное определение холерного токсина и термолабильного энтеротоксина Е. coli в смывах со слизистой носоглотки человека в формате хМАР -анализа

3.2.8.Детекция и количественное определение холерного токсина и термолабильного

энтеротоксина Е. coli в воде из открытого водоема в формате хМАР - анализа

Заключение

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и характеристика моноклональных антител для экспресс-анализа бактериальных токсинов»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Научно-технический прогресс предоставляет ранее невиданные возможности не только для развития новых высокотехнологичных областей науки и техники, но и для развития средств широкомасштабного терроризма. Особую опасность несет в себе биотерроризм. Развитие молекулярной биологии и биотехнологий приводит к осознанию неизбежности этого вида терроризма в близком будущем и, следовательно, к необходимости создания как глобальной, так и национальной стратегии защиты. В современных условиях в любое время, в любой точке мира может начаться эпидемия, возбудителями которой оказываются новые или уже хорошо известные занесенные из эндемичных очагов микроорганизмы. Примером могут служить атипичная пневмония (ТОРС-синдром), болезнь легионеров, астраханская риккетсиозная пятнистая лихорадка и др. Микроорганизмы и их токсины могут стать причиной эпидемий не только вследствие намеренной диверсии, но и в силу непредсказуемости эпидемических и экологических последствий их неконтролируемого попадания во внешнюю среду.

Методы диагностики инфекционных заболеваний и мониторинга объектов окружающей среды и продуктов питания долгое время базировались, главным образом, на основе классических схем микробиологического анализа и сводились к выделению возбудителя в чистой культуре и последующей его идентификации. Стандартные микробиологические методы - культивирование бактерий и микроскопические исследования - трудоемки и долгосрочны, поэтому на сегодняшний день они вытесняются генно-инженерных методами, такими как ПЦР. Эти методы используются для выявления патогенов. Для детекции вырабатываемых этими патогенами токсинов широко используются методы иммунохимического анализа (ИХА). Они обладают высокой специфичностью и чувствительностью. Важным фактором, определяющим специфичность и чувствительность ИХА, являются антитела. Используются три вида антител - поликлональные, моноклональные и рекомбинантные. Для создания высокочувствительных специфических тест-систем количественного определения токсинов широко используются «сэндвич»-вариант иммуноферментного анализа (ИФА), в котором антитела используются в качестве как связывающих, так и детектирующих антител. Пары используемых антител могут состоять только из моноклональных антител или из моноклональных и поликлональных антител.

Развитие методов на основе ИХА идет в различных направлениях. Одно из направлений заключается в разработке сенсоров для детекции биологических агентов на поверхности различных субстратов, таких как оптоволокно, стеклянные капилляры, лунки для микротитрования, чипы с интегральными микросферами, магнитные микрочастицы.

Актуальным направлением развития методов ИХА является разработка мультиплексных форматов, позволяющих проводить определение нескольких аналитов в одном образце. К числу мультиплексных методов относят технологии биочипов, разработанные в различных форматах, позволяющие проводить последовательное определение нескольких дискретных аналитов на одной поверхности [1]. Это могут быть 2-х мерные биочипы, содержащие связывающие антитела к различным токсинам на поверхности носителя, или 3-х мерные биочипы, в которых связывающие антитела к различным токсинам иммобилизованы в массиве объемных гелевых элементов. Эти методы позволяют использовать как моноклональные, так и поликлональные антитела. Детекцию связанного биотоксина (токсинов) осуществляют с помощью смеси флуоресцентно-меченных детектирующих антител специфичным к другим эпитопам определяемых токсинов.

В настоящее время активно развивается метод мультиплексного иммунофлуоресцентного анализа (МИА), основанный на использовании суспензии окрашенных микрочастиц для определения несколько токсинов в одной опытной пробе, так называемый хМАР-анализ. Этот метод сочетает в себе проточную цитометрию и иммунохимический «сэндвич»-анализ на основе моноклональных антител и позволяет одновременно определять различные токсины в одной анализируемой пробе [2]. Разработка такого мультиплексного анализа для одновременного количественного определения нескольких токсинов в различных биологических жидкостях и объектах окружающей среды имеет большое значение для мониторинга окружающей среды, продуктов питания, предотвращения возможных терактов, а также для диагностики некоторых заболеваний.

До настоящего времени стратегия биологической защиты сфокусирована на существующей угрозе применения группы известных патогенов, к которым относится возбудитель холеры - Vibrio cholerae и энтеротоксигенные штаммы Escherichia coli, а также продуцируемые этими бактериями токсины. Важно, что аминокислотная последовательность, пространственная структура, иммунохимические свойства холерного токсина (СТ) и термолабильного энтеротоксина Е. coli (LT) характеризуются высокой степенью гомологии. Заболевания, вызываемые этими патогенами или одноименными токсинами, имеют сходные симптомы. В связи с этим затруднительно проводить идентификацию токсинов в клинических образцах и образцах окружающей среды с целью выявления особо опасного холерного токсина, поражения которым в отличие от LT в большом числе случаев приводит к летальному исходу. В настоящее время отсутствуют тест-системы, позволяющие одновременно в одном образце проводить количественное определение этих токсинов, поэтому разработка таких систем относится к числу приоритетных.

Цели и задачи. Целью данной работы явилось создание биплексной тест-системы на основе мультиплексного иммунофлуоресцентного анализа с применением микросфер (хМАР-технологиия) для одновременной количественной детекции холерного токсина и термолабильного энтеротоксина Е. coli, в одной анализируемой пробе.

В данной работе были поставлены следующие задачи: методом гибридомной техники получить и наработать в препаративных количествах моноклональные антитела к холерному токсину и термолабильному энтеротоксину Е. coli', не обладающие перекрестной активностью; определить их иммунохимические характеристики. Подобрать пары моноклональных антител методом «сэндвич»-ИФА в формате планшета для дифференциальной детекции CT и LT. Разработать биплексную тест-систему на основе хМАР технологии (Luminex) с использованием пар моноклональных антител к CT и LT, отобранных методом «сэндвич»- ИФА на планшетах. Использовать разработанные методы для идентификации холерного токсина и термолабильного энтеротоксина Е. coli в объектах окружающей среды, продуктах питания и биологических жидкостях человека.

Научная новизна. Получены моноклональные антитела к двум близкородственным токсинам: CT и LT, не обладающие перекрестной активностью к LT или CT соответсвенно, с помощью которых, впервые, была разработана тест-система на основе «сэндвич»-варианта ИФА для дифференцированной детекции CT и LT с использованием моноклональных антител в роли связывающих и детектирующих антител.

Впервые создана тест-система для одновременного количественного определения холерного токсина и термолабильного энтеротоксина Е. coli в одном образце методом мультиплексного иммунофлуоресцентного анализа с применением технологии хМАР.

Практическая значимость. Полученные результаты дают основания использовать в дальнейшем разработанные тест-системы для мониторинга холерного токсина и термолабильного энтеротоксина Е. coli в объектах окружающей среды, в образцах пищевых продуктов. Определение токсинов необходимо в лечебно-профилактических учреждениях для идентификации токсина, вызывающего заболевание, и выбора соответствующего лечения.

Апробация работы. Результаты были представлены на российских и международных конференциях: XXI зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2009); Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва, 2009); Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова» (Москва-Пущино, 2011)

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Шошина, Наталья Сергеевна

выводы

1. Получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к холерному токсину и к термолабильному энтеротоксину Е coli. Антитела к каждому из токсинов не взаимодействуют с другим токсином. МА к обоим токсинам относятся к иммуноглобулинам класса G. Величины констант аффинности МА к СТ варьируют от 0,11x109М"' до 2,9х109М"1; МА к LT от 0,16х109М1 до 2,0 хЮ9М"'.

2. Из панелей антител подобраны пары связывающих и детектирующих МА для количественного определения холерного токсина и термолабильного энтеротоксина Е. coli в «сэндвич»-ИФА в формате планшета. МДК, определенная в модельном буфере составила 0,2 нг/мл для СТ, 0,4 нг/мл для LT. Впервые создана тест-система на основе МА для специфической детекции СТ и LT.

3. Подобраны комбинации пар МА для количественного определения холерного токсина и термолабильного энтеротоксина Е. coli в модельном буфере методом хМАР-анализа. Величины МДК СТ (0,01 нг/мл) и LT (0,08 нг/мл) существенно выше соответствующих величин МДК, определенных в формате «сэндвич»-ИФА.

4. Величины МДК СТ в разработанных тест-системах, определенные в образцах молока, мясного бульона, воды из открытого водоема и носоглоточных смывов, сравнимы с величиной МДК СТ, определенной в модельном буфере. Величины МДК LT, определенные в образцах молока, мясного бульона и носоглоточных смывов превышают соответствующие значения для МДК LT в модельном буфере и воде из открытого водоема.

5. Впервые создана высокочувствительная иммунофлуоресцентная тест-система на основе хМАР технологии с использованием системы Luminex для одновременной детекции холерного токсина и термолабильного энтеротоксина Е. coli в буфере, биологических пробах и продуктах питания.

101

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Моноклональные антитела являются мощным инструментом для детекции веществ различной природы, в том числе, бактериальных токсинов. В диссертационной работе методом гибридомной технологии получены представительные панелей гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к холерному токсину и термолабильному энтеротоксину Е. coli. Методом непрямого ИФА из панели гибридом отобраны клоны, продуцирующие антитела, не обладающие кросс - реактивностью с родственным токсином. Моноклональные антитела наработаны в препаративных количествах. Все полученные препараты моноклональных антител к СТ и LT охарактеризованы с использованием метода непрямого твердофазного ИФА: Определены изотипы тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, константы аффинности определены методом Битти. Каждое из антител было биотинилировано с помощью jV-гидроксисукцинимидного эфира биотина. Из полученного набора нативных и биотинилированных антител к СТ и LT были подобраны пары антител для определения токсинов методом «сэндвич»-иммуноанализа в формате планшета. Значения минимальной детектируемой концентрации СТ и LT, определенные в «сэндвич»-ИФА, составили 0,2 и 0,4 нг/мл соответственно. Показана возможность применения подобранных в «сэндвич»-ИФА пар антител для детекции токсинов в пробах молока, бульона, смыва со слизистой носоглотки и воды из открытого водоема. Значения МДК холерного токсина, внесенного в биологические пробы, не отличались от значений МДК токсина в модельном буфере и составляли 0,2 нг/мл. МДК термолабильного энтеротоксина Е. coli в пробах молока и бульона составляла 9,6 и 6,4 нг/мл соответственно, в пробах смывов со слизистой носоглотки человека 8 нг/мл, а в пробах воды из открытого водоема 2 нг/мл. Пары моноклональных антител, детектирующие СТ и LT в «сэндвич»-ИФА, использовали для создания тест-системы в другом формате иммуноанализа - биплексном иммунофлуоресцентном анализе по технологии хМАР. Были получены конъюгаты связывающих МА, специфичных к LT или СТ, с микросферами, имеющими различные спектральные адреса. Подобрана оптимальная концентрация детектирующих биотинилированных антител и определены значения МДК для LT и СТ, В модельном буфере эти величины составили 0,01 нг/мл и 0,08 нг/мл соответственно. Значения МДК обоих токсинов, определенные в хМАР анализе в среднем на порядок выше значений МДК, определенных в планшетном «сэндвич»-варианте ИФА.

Был проведен мультиплексный анализ для 4 различных энтеротоксинов: LT, СТ, SEA и SEB. Были синтезированы конъюгаты микросфер с МА к стафилококковым энтеротоксинам А и В, а также созданы биотинилированные производные антител для детекции этих токсинов. Присутствие стафилококковых токсинов, конъюгатов микросфер с МА к этим токсинам, и соответствующих детектирующих антител не влияло на детекцию, и не снижало чувствительности определения СТ и LT.

Разработанная биплексная тест-система позволяет определять СТ и LT в различных биологических жидкостях, в объектах окружающей среды и в продуктах питания. Было показано, что МДК СТ в молоке, мясном бульоне, в смывах с носоглотки составляет 0,02 нг/мл. Идентифицировать и количественно определять LT в образцах молока, мясного бульона, носоглоточных смывов возможно, учитывая, что в этих средах величина МДК для LT существенно выше (1 нг/мл) чем МДК в модельном буфере (0,08нг/мл). Величина МДК LT в воде близка величине МДК LT, определенной в модельном буфере.

Для холерного токсина и термолабильного токсина Е. coli создана биплексная иммунофлуоресцентная тест-система на основе хМАР технологии, позволяющая детектировать эти токсины в присутствии SEA и SEB в различных объектах окружающей среды, продуктах питания и биологических жидкостях человека. Полученные данные дают основания для успешной разработки в будущем тест-системы мультиплексного определения СТ и LT в присутствии целого ряда других энтеротоксинов в образцах окружающей среды и клинических образцах мультиплексной иммунофлуоресцентной тест-системы в формате хМАР анализа.

Впервые в России создана биплексная иммунофлуоресцентная тест-система на основе хМАР технологии для одновременной детекции СТ и LT для определения в модельном буфере, объектах окружающей среды, продуктах питания и биологических образцах.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Шошина, Наталья Сергеевна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

1. McBride МТ, Gammon S, Pitesky M, O'Brien TW, Smith T, Aldrich J, Langlois RG, Colston B, Venkateswaran KS. Multiplexed liquid arrays for simultaneous detection of simulants of biological warfare agents. Anal Chem. (2003) Apr 15;75(8):1924-30.

2. Kellar K.L., Iannone M.A. Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays. Experimental Hematology, (2002) 30:1227-1237

3. Center for disease control and prevention. Laboratory metohods for diagnosis of Vibrio cholerae. http://www.cdc.gov/cholera/pdf/Laboratory-Methods-for-the-Diagnosis-of-Yibrio-cholerae-chapter-7.pdf

4. Gill D.M. Bacterial toxins: a table of letal amounts. (1982) Microbiol Rev 46(l):86-94

5. Lubran M. Bacterial toxins. (1988) Ann Clin Lab Sei. 18(1): 58-71.

6. Finlay В., Falkow S. Common Themes in Microbial Pathogenicity Revisited (1997) Microbiology and Molecular Biology Reviews. 61(2): 136-169.

7. Schmitt C.K., Meysick K.C., O'Brien A. Bacterial Toxins: Friends or Foes? (1999) Emerging Infectious Diseases. 5(2): 224 - 234.

8. Супотницкий M.B. Микроорганизмы, токсины и эпидемии. (2000) М.: Вузовская книга: 376.

9. Weitmann, S., Schultz, G., Kleuss, С. Adenylyl cyclase type II domains involved in Gbetagamma stimulation. (2001) Biochem. 40: 10853-10858.

10. Ulrich R.G., Wilhelmsen C.L., Krakauer Т. Staphylococcal enterotoxin В and related toxins. (2007) Medical aspects of biological warfare. Department of defense, office jf the surgeon general, US Army, Borden Institute: 311-322

11.Bhakdi S., Tranum-Jensen J. Alpha-Toxin of Staphylococcus aureus (1991) Microbiological Reviews, 55(4): 733-751

12. Rolf J.M., Eidels L. Structure-Function Analyses of Diphtheria Toxin by Use of Monoclonal Antibodies (1993) Infectoin and Immunity, 61(3): 994-1003

13. Gyles C.L. Shiga toxin-producing Escherichia coli: An overview (2007) JAnim Sei .85:4562.

14. Sack D.A., Sack R.B., G Balakrish Nair, Siddique AK Cholera (2004) The Lancet. 363(9404): 223-233

15. Топорков В.П., Кедрова О.В., Караваева Т.Б. Топорков A.B. Обзор эпидемической обстановки по холере, как чрезвычайной ситуации в области общественного здравоохранения, имеющего международное значение, в 2011 году. (2001) ФГУЗ

«Российский научно-иследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов. http://www.microbe.ru/files/cholera2011 .pdf

16. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология, под ред. Воробьева.(2008) М.: Медицинское информационное агентство, С.:374-377

17. Halpern М, Senderovich Y, Izhaki I Waterfowl—The Missing Link in Epidemic and Pandemic Cholera Dissemination (2008) PLoS Pathogens, 4 (10), 1000173

18. Davy Vanden Broeck, Caroline Horvath, Marc J.S. De Wolf Vibrio cholerae: Cholera toxin

(2007) The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 39(10): 1771-1775

19. Middlebrook J., Dorland R. Bacterial Toxins: Cellular Mechanisms of Action (1984) Microbiological Reviews. 48(3): 199-221

20. Mekalanos J., Collier J., Romig W. Enzymic Activity of Cholera Toxin (1979) The journal of biological chemistry. 254(13): 5655-5861

21. Simon van Heyningen Cholera Toxin: Interaction of Subunits with Ganglioside GmiO 974) Science 183(4125): 656-657

22. Fujinaga Yuk. Transport of bacterial toxins into target cells: pathways followed by cholerat and botulinum progenitor toxin. (2006) J. Biochem. 140: 155-160

23. Torgersen M.L., Skretting G., Deurs В., Sandvig K., Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms (2001) Journal of Cell Science 114 (20): 3737-3747

24. Fujinaga Y., Wolf A.A., Rodighiero Ch., Wheeler H., Tsai В., Allen L., Jobling M.G., Rapoport Т., Holms R.K., Lencer W.I. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmatic reticulum (2003) Molecular biology of the cell 14: 4783-4793

25. Chinnapen D.J.-F., Chinnapen H., Saslowsky D., Lencer W.I. Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER. (2007) FEMS Microbiol Lett 266: 129-137

26. Jorgensen R., Purdy A., Fieldhouse R., Kimber M., Bartlett D., Merrill R. Cholix toxin, a novel ADP-ribosylating factor from Vibrio cholerae. (2008) The journal of biological chemistry 283(16): 10671-10678

27. Gill M. Bacterial Toxins: a Table of Lethal Amounts (1982) Microbiological reviews, 46(1): 86-94

28. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология, под ред. Воробьева.(2008) М.: Медицинское информационное агентство, С.:354-358

29. Arbuthnott J. P., Rutter J. M., Glynn A. A. Host damage from bacterial toxins (1983) Phil. Trans. R. Soc. Lond. В 303: 149-165

30. Т. Connell Choler toxin, LT-I, LT-IIa, and LTIIb: the critical role of ganglioside-binding in immunomodulation by Type I and Type II heat-labile enterotoxins. (2007) Expert Rev Vaccines, 6(5): 821-843

31. R.K.Holmes, M.G.Jobling, T.D. Conell Cholera toxin and related enterotoxins of gramnegative bacteria. Cholera toxin and related enterotoxins of gram-negative bacteria (1995), In J. Moss, B. Iglewski, M. Vaughan, and A. T. Tu (ed.) Bacterial toxins and virulence factors in disease. Marcel Dekker, Inc., New York, NY. 8:225-255

32. Dallas W.D., Falkow S.Amino acid sequence homology between cholera toxin and Escherichia coli heat-labile toxin (1980) Nature 288: 499 - 501

33. Hofstra H., Witholt B. Heat-labile Enterotoxin in Escherichia coli: kinetics of assotiation of subunits into periplasmic holotoxin. (1985) The journal of biological chemistry 260(29): 16037-16044

34. Nawar H.F., King-Lyons N.D., Hu J.C., Pasek R.C., Conell T.D. LT-IIc, a new member of the type II heat-labile enterotoxin family encoded by Escherichia coli Strain obtain from a nonmammalian host.(2010) Infection and immunity, 78 (11): 4705-4713

35. Conell T.D. Cholera toxin, LT-I,LT-IIa, and LT-IIb: the critical role of ganglioside-binding in immunomodulation by Type I and Type II heat-labile enterotoxins. (2007) Expert Rev Vaccines, 6(5):821-834

36. Focco van den Akker, Steve Sarfaty, Edda M Twiddy, Terry D Connell, Randall К Holmes, Wim GJ Hoi Crystal structure of a new heat-labile enterotoxin, LT-IIb (1996) Structure, 4,(6): 665-678

37. Mudrak В., Rodriguez D., Kuehn M. Residues of heat-labile enterotoxin involved in bacterial cell surface binding. (2009) Journal of bacteriology. 191(9): 2917-2925

38. Дизентерия и другие острые кишечные диарейные инфекции. (2002) Указания по диагностике, лечению и профилактике в Вооруженных Силах и Российской Федерации. Министерство Обороны РФ. Главное Военно-Медицинское Управление

39. Le Roux W.J., Masoabi D., de Wet c.M., Venter S.N. Evalution of a rapid polymerase chain reaction based identification technique for Vibrio cholerae isolates. 2004 Water Sci. Technol. 50: 229-232

40. Inglis T.J.J., Aravena-Romabn M., Ching S., Croft K., Wuthiekanum V., Мее B. J. Cellular fatty acid profile distinguishes Burkholderia pseudomallei from avirulent Burkholderia thailandensis. 2003 J. Clin. Microbiol 41: 4812-4814

41. Song Y., Yang R., Guo Z., Zhang M., Wang X., Zhou F. Distinctness of spore and vegetative cellular fatty acid profiles of some aerobic endospore-forming bacilli. 2000 J. Microbiol. Methods 39: 225-241

42. Серологические методы в диагностике холеры. Дополнение к МУК 4.2.2218-07 Лабораторная диагностика холеры. Методические указания. МУК 4.2.2315-08

43. Honda Т., Taga S., Takeda Y., Miwatani Т. Modified Elek test for detection of heat-labile enterotoxin of enterotoxigenic Escherichia coli. (1981) J! Clin. Microbiol. 13:1-5.

44. F. Nato, A. Boutonnier, M. Rajerison, P. Grosjean, S. Dartevelle, A. Gue'nole', N. A. Bhuiyan, D. A. Sack, G. B. Nair, J. M. Fournier, and S. Chanteau One-Step Immunochromatographic Dipstick Tests for Rapid Detection of Vibrio cholerae 01 and 0139 in Stool Samples (2003) Clinical and diagnostic laboratory immunology 10(3): 476-478

45. Поздеев O.K. Медицинская микробиология. (2007) M.: ГЭОТАР-Медиа.:768

46. Miyagi К. Sano О., Morita С., Imura S. Morimatsu S., Goto Т., Nakanot Y., Omuras K, Matsumotos Y., Maedas K, Hashimotos S. Honda T. An improved method for detecting faecal Vibrio cholerae by PCR of the toxin A gene.(1999) J. Med. Microbiol. 48: 883-889

47. Technologies and Techniques for Early Warning Systems to Monitor and Evaluate Drinking Water Quality: State-of-the-Art Review Office of Research and Development National Homeland Security Research Center Resarch Report. (2005) United States Environmental Protection Agency.

48. Detection of cholera toxin. (1994) Laboratory methods for the diagnosis for the Vibrio cholerae: 62-88

49. Burrows W. Cholera Toxins.(1968) Annual Review of Microbiology 22: 245-268

50. Определение «остаточной» токсигенности штамма холерного вибриона лигированных петлях тонкого кишечника взрослых кроликов. Приложение 7. Основные требования к вакцинным штаммам холерного вибриона. Методические указания. МУ 3.3.1.2075-06

51. Donta S.T., Moon H.W., Whipp S.C. Detection of heat-labile Escherichia coli enterotoxin with the use of adrenal cells in tissue culture. (1974) Science; 183: 334-336

52. Padmapriya P. Bañada, Arun. K. Antibodies and Immunoassays for Detection of Bacterial Pathogens (2008) Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems Springer Science+Business Media, LLC: 567-601

53. Andreotti PE, Ludwig GV, Peruski AH, Tuite JJ, Morse SS, Peruski LF Jr Immunoassay of infectious agents (2003) Biotechniques.35(4): 850-9

54. Рубина А.Ю., Паньков С.В., Иванов С.М., Деменьтева Е.И., Мирзабеков А.Д. Белковые микрочипы(2001) Докл. Акад. Наук. 381: 701-704

55. Vignali DAJ Review Multiplexed particle-based flow cytometric assays. (2000) Immunol Methods. 243(1-2): 243-55.

56. The Immunoassay Handbook. Wild D. (2005) New York: Elsevier Science.: 930

57. Köhler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity . (1975) Nature-, 256; 5517: 495-497.

58. Engler K., Efstratiou A Rapid Enzyme Immunoassay for detection of toxigenicity among clinical isolates of corynebacteria. (2000) Journal of clinical microbiology, 38(4): 1385-1389

59. Burton D.R., Barbos III C.F., Persson M.A., Koenig S., Chanock R.M., Lerner R.A. A large array of human monoclonal antibodies ti tipe 1 human immunodeficience virus from combinatorial libraries of asymptomatic seroposiyive individuals. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 10134-10137

60. McCafferty J, Griffiths AD, Winter G, Chiswell DJ: Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. (1990) Nature, 348(6301): 552-554

61. Watkins N.A., Ouwehand W.H. Introduction to antibody engineering and phage display (2000) Vox Sang 78: 72-79

62. Nakayama G.R., Valkirs G., McGrath D., Huse W.D. Improving the copy numbers of antibody fragments expressed on the major coat protein of bacteriophage M13. (1996) Immunotechnology 2: 197-207

63. Krebs В., Rauchenberger R., Reiffert S., Rothe С., Tesar M., Thomassen E., Cao M., Dreier Т., et al. High-throughput generation and engineering of recombinant human antibodies. (2001) J. Immunol. Methods 254:67-84

64. Петровская JI.E., Шингарова JI.H., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Альтернативные каркасные белки. (2011) Биоорганическая химия, 37 (5): 581-591

65. James W. Aptamers (2000) Encyclopedia of Analytical Chemistry R.A. Meyers (Ed.): 4848^4871

66. Andersson M., Rdnmark J., Arestrüm I., Nygren P.E., Ahlborg N. (2003) J Immunol. Methods, 283: 225-234

67. Jun Sheng Lin, McNatty K.P. Aptamer-Based Regionally Protected PCR for Protein Detection (2009) Clinical Chemistry 55(9): 1686-1693

68. Pendergrast PS, Marsh HN, Grate D, Healy JM, Stanton M. Nucleic acid aptamers for target validation and therapeutic applications. (2005) Journal of Biomolecular Techniques 16(3): 224-233

69.0'Sullivan CK. Aptasensors - the future of biosensing? (2002) Analytical and Bioanalytical Chemistry: 372(1): 44-48.

70. Jenne A. The aptamer approach to drug discovery. (2005) Innovations in Pharmaceutical Technology: 16

71.Kricka L.J. Chemiluminescent and bioluminescent techniques. (1991) Clin. Chem. 37: 1472-1481

72. Engvall E., Perlmann P. Enzime-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. (1971) Immunochemistry 8: 871-874

73. Higgins J. A., Ibrahim M.S., Knauert F. K.,. Ludwig G. V,. Kijek T. M, Ezzell J. W., Courtney B. C., Henchal E. A. Sensitive and Rapid Identification of Biological hreat Agents (1999) Ann N YAcadSci.-,894: 130-48.

74. Kiening M., Niessner R., Weller M.G. Microplate-based screening methods for the efficient development of sandwich immunoassays (2005) Analyst,, 130: 1580-1588

75. Porstmamann B., Porstmamann T., Nugel E. Comparison of chromogens for the determination of horseradish peroxidase as marker in enzyme immunoassay (1981,) J. Clin. Chem. Clin. Biochem, 19: 435-439

76. Charles Grimshaw, Carol Gleason, Eric Chojnicki, John Young. Development of an equilibrium immunoassay using electrochemiluminescent detection for a novel recombinant protein product and its application to pre-clinical product development (1997) J Pharm Biomed Anal 16(4): 605-612

77. Dickson E.F., Pollak A., Diamandis E.P. Ultrasensitive bioanalytical assays using time-resolved fluorescence detection.(1995) Pharmacol Ther. 66(2): 207-235

78. https://perkinelmerreagents.onconfluence.com/download/attachments/328582/DELFIA 2 5.pdf

79. Technologies and Techniques for Early Warning Systems to Monitor and Evaluate Drinking Water Quality: (2005) State-of-the-Art Review Office of Research and Development National Homeland Security Research Center Resarch Report. United States Environmental Protection Agency.

80. Peruski A.H., Peruski L.F. Immunological Methods for detection and identification of Infectious Disease and Biological Warfare Agents. (2003) Clin. Diag. Lab. Immunol. 10; 4: 506-513.

81. Lubavina I. A., Zinchenko A. A., Lebedin Yu. S., Chukanov S. V. Development of a Rapid Method for the Detection of Prostate-Specific Antigen by Immunochromatography. (2007) Russian Journal of Bioorganic Chemistry 33(5): 511-515.

82. Wang, Y., Xu, H., Wei, M., Gu, H., Xu, Q. & Zhu, W. Study of superparamagnetic nanoparticles as labels in the quantitative lateral flow immunoassay. (2009) Materials Science and Engineering: 293: 714-718.

83. Danks, C. & Barker, I. On-site detection of plant pathogens using lateral-flow devices. (2000) EPPO Bulletin 303(4): 421-426.

84. Yan Z., Zhou L., Zhao Y., Wang J. Sens. Actuators B Rapid quantitative detection of Yersinia pestis by lateral-flow immunoassay and up-converting phosphor technology-based biosensor (2006) Chemical 119(2): 656-663.

85. R.F. Zuk, V.K. Ginsberg, T. Houts, J. Rabbie Enzyme immunochromatography - a quantitative immunoassay requiring no instrumentation (1998) Clin. Chem 31:1144-1150.

86. Niemeyer C.M., Adler M., Wacker R. Immuno-PCR: high sensitivity detection of proteins by nucleic acid amplification (2005) TRENDS in Biotechnology 23 (4)

87. Sano, T. et al Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates. (1992). Science 258: 120-122

88. Sims, P.W. et al Immunopolymerase chain reaction using realtime polymerase chain reaction for detection.. (2000) Anal. Biochem. 281: 230-232

89. Wu, H.C. et al. Detection of Clostridium botulinum neurotoxin type A using immuno-PCR. (2001) Lett. Appl. Microbiol. 32: 321-325

90. Henterich, N. et al. Assay of gliadin by real-time immunopolymerase chain reaction. (2003) Nahrung 47: 345-348

91. Chye, S.M. et al. Immuno-PCR for detection of antigen to Angiostrongylus cantonensis circulating fifth-stage worms. (2004) Clin. Chem. 50: 51-57

92. Lind K., Kubista M. Development and evaluation of three real-time immuno-PCR assemblages for quantification of PSA (2005) Journal of Immunological Methods 304: 107— 116

93. Barletta, J.M. et al. Lowering the detection limits of HIV-1 viral load using real-time immuno-PCR for HIV-1 p24 antigen. (2004) Am. J. Clin Pathol. 122: 20-27

94. Lyon WJ: TaqMan PCR for detection of Vibrio cholerae Ol, 0139, non-Ol, and non-0139 in pure cultures, raw oysters, and synthetic seawater. (2001) Appl Environ Microbiol 67: 46854693.

95. Wataru Yamazaki*, Kazuko Seto, Masumi Taguchi, Masanori Ishibashi and Kiyoshi Inoue. Sensitive and rapid detection of cholera toxin-producing Vibrio cholerae using a loop-mediated isothermal amplification. (2008) BMC Microbiology, 8: 94

96. VET-RPLA toxin detection kit (2006) OXOID manual. 9-th edition compiled by E.Y. Bridson, 1039-1042

97. Almeida RJ, Hickman-Brenner FW, Sowers EG, Puhr ND, Farmer JJ III, Wachsmuth IK. Comparison of a latex agglutination assay and an enzyme-linked immunosorbent assay for detecting cholera toxin (1990) J Clin Microbiol,28: 128-30.

98. Uesaka Y, Otsuka Y, Kashida M, Oku Y,Horigome K,Nair GB,Pal SC, Yamasaki S, Takeda Y. Detection of cholera toxin by a highly sensitive bead-enzyme linked immunosorbent assay. (1992) Microbiol Immunol. 36(1): 43-53

99. Ramamurthy T., Bhattacharya S. K., Uesaka Y., K Horigome, M Paul, D Sen,S C Pal, T Takeda, Y Takeda and G B Nair. Evaluation of the bead enzyme-linked immunosorbent assay for detection of cholera toxin directly from stool specimens. (1992) J! Clin. Microbiol. 30(7): 1783-1786

100. W. Bruce Turnbull, Bernie L. Precious, and Steve W. Homans Dissecting the Cholera Toxin-Ganglioside GM1 Interaction by Isothermal Titration Calorimetry (2004) J. AM. CHEM. SOC 126: 1047-1054

101. Ahn-Yoon S, DeCory TR, Baeumner AJ, Durst RA. Ganglioside-liposome immunoassay for the ultrasensitive detection of cholera toxin. (2003) Anal Chem. 75(10): 2256-2261.

102. Ahn S, Durst RA. Detection of cholera toxin in seafood using a ganglioside-liposome immunoassay. (2008) Source Anal Bioanal Chem. 391(2): 473-478

103. Honda T. Sato M., Miwatani T. Differential detection of cholerae enterotoxin and Escherichia coli heat-labile enterotoxin by enzyme-linked immunosorbent assays with antibodies specific to the two toxins. (1984) J. Clin. Microbiol. 20: 664-667

104. Koike N., Okada K., Yabushits Y., Zhang Yamamoto K., Miwatani T., Honda T. Rapid and differential detection of two analogous enterotoxins of Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli by a modified enzyme-linked immunosorbent assay (1997) FEMS Immunology and microbiology, 17: 21-25

105. Lian W., Wu D., Lim D.V., Jin Sh. Sensitive detection of multiplex toxins using antibody microarray. (2010) Analytical Biochemistry, 401: 271-279

106. McHugh T.M., Miner R.C., Logan L.H., Stites D.P. Simultaneous detection of antibodies to cytomegalovirus and herpes simplex virus by using flow cytometry and a microsphere-based fluorescence immunoassay (1988) J. Clin. Microbiol, 26: 1957-1961

107. McHugh T.M., Wang Y.J., Chong H.O.h up. Development of a microsphere-based fluorescent immunoassay and its comparison to an enzyme immunoassay for the detection of antibodies to three antigen preparation from Candida albicans (1989)/. //J. Immunol. Methods, 116:213-219

108. T.M. McHugh, M.K. Viele, E.S. Chase, D.J. Recktenwald The sensitive detection and quantitation of antibody to HCV by using a microsphere-based immunoassay and flow cytometry (1997) Cytometry, 29: 106-112

109. McHugh T.M. Flow microsphere immunoassay for the quantitative and simultaneous detection of multiple soluble analytes (1994) Methods Cell Biol., 42: 575-595

110. http://www.luminexcorp.com

111. E. Morgan, R. Varro, H. Sepulveda, et al. Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with application in various areas of biology (2004) Clin. Immunol., 110: 252-266

112. Collins D.P., Luebering B.J., Shaut D.M. T-lymphocyte functionality assessed by analysis of cytokine receptor expression, and femtomolar detection of cytokine secretion by quantitative flow cytometry (1998) Cytometry, 33: 249-255.

113. Chen R., Lowe L., Wilson J.D., et al Simultaneous quantification of six human cytokines in a single sample using microparticle-based flow cytometric technology (1999) Clin. ChemA5: 1693-1694.

114. Oliver K.G., Kettman. J.R., Fulton R.J. Multiplexed analysis of human cytokines by use of the FlowMetrix system (1998) Clin. Chem. 44: 2057-2060.

115. Carson, R.T., Vignali D.A.. Simultaneous quantitation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay (1999) J. Immunol. Methods, 227: 41-52.

116. Bellisario R., Colinas R.J., Pass K.A. Simultaneous measurement of thyroxine and thyrotropin from newborn dried blood-spot specimens using a multiplexed fluorescent microsphere immunoassay (2000) Clin. Chem., 46: 1422-1424.

117. Bellisario R., Colinas R.J., Pass K.A. Simultaneous measurement of thyroxine and thyrotropin from newborn dried blood-spot specimens using a multiplexed fluorescent microsphere immunoassay (2001) Early Hum., 64: 21-25.

118. Bray, R.A. Flow cytometry in human leukocyte antigen testing (2001) Semin. Hematol. 38: 194.

119. J.W. Pickering, T.B. Martins, R.W. Greer, et al A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides (2002) Am J. Clin. Pathol., 117: 589-596.

120. I.V. Jani, G. Janossy, D.W.G. Brown, F. Mandy Multiplexed immunoassay by flow cytometry for diagnosis and surveillance of infectious diseases in resourses-poor settings (2002) Lancet Infect. Dis.\ 2: 243-250.

121. Pickering J.W., Martins T.B., Schroder M.C., Hill H.R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for quantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae type b (2002) Clin. Diagn. Lab. Immunol., 4: 872-876.

122. Biagini R.E., Sammons D.L., Smith J.P., et al. Comparison of a multiplexed fluorescent covalent microsphere immunoassay and an enzyme-linked immunosorbent assay for

measurement of human immunoglobulin G antibodies to anthrax toxin (2004) Clin. Diagn. Lab. Immunol, 11: 50-55.

123. P.G.M. van Gageldonk, F.G. van Schaijk, F.R. van der Klis, G.A.M. Berbers Development and validation of a multiplex immunoassay for the simultaneous determination of serum antibodies to Bordetella pertussis, diphtheria and tetanus (2008) J. Immunol. Methods 335: 79-89.

124. G.M. Wasserman, J.D. Grabenstein, P.R. Pittman, et al. Analysis of adverse events after anthrax immunization in US Army medical personnel (2003) J. Occup. Environ. Med., 45: 222232.

125. Cirino N.M., Musser K.A., Egan C. Multiplex diagnostic platforms for detection of biothreat agents (2004) Expert Rev. Mol. Diagn.-, 4: 841-857.

126. Lim D.V., Simpson J.M., Kearns E.A., Kramer M.F. Current and developing technologies for monitoring agents of bioterrorism and biowarfare (2005) Clin. Microbiol. Rev.-, 18: 583-607.

127. Anderson G.P., Taitt C.R. Amplification of microsphere-based microarrays using catalyzed reporter deposition (2008) Biosensor and Bioelectronics, 24: 324-328.

128. Kim J.S., Anderson G.P., Erickson J.S., Golden J.P., Nasir M, Ligler F.S. Multiplexed detection of bacteria and toxins using a microflow cytometer. (2009) Anal. Chem., 81: 54265432.

129. C. Hennig, L. Rink, U. Fagin, et al The influence of naturally occurring heterophilic anti-immunoglobulin antibodies on direct measurement of serum proteins using sandwich ELISAs ( 2000); J. Immunol. Methods; 235: 71-80.

130. K.L. Kellar, R.R. Kalwar, K.A. Dubois, et al Multiplexed fluorescent bead-based immunoassays for quantitation of human cytokines in serum and culture supernatants (2001) Cytometry, 45: 27-36.

131. W. de Jager, B.J. Prakken, J.W. Bijlsma, et al Improved multiplex immunoassay performance in human plasma and synovial fluid following removal of interfering heterophilic antibodies (2005) J. Immunol. Methods, 300: 124-135.

132. M. Robb, J. Nichols, S. Whoriskey, J. Murphy (1982) Isolation of hybridoma cell lines and characterization of monoclonal antibodies against cholera enterotoxin and its subunits. Infect Immun 38(1): 267-272.

133. F. Apter, W. Lencer, R. Finkelstein, J. Mekalanos, M. Neutra (1993) Monoclonal immunoglobulin A antibodies directed against cholera toxin prevent the toxin-induced chloride secretory response and block toxin binding to intestinal epithelial cells in vitro. Infect Immun 61(12): 5271-5278.

134. E. Remmers, R. Colwell, R. Goldsby (1982) Production and characterization of monoclonal antibodies to cholera toxin. Infect Immun 37(1): 70-76.

135. S. Chou (2004) Production and purification of monoclonal and polyclonal antibodies against cholera toxia Hybrid Hybridomics 23(4): 258-261.

136. L. Lindholm, J. Holmgren, M. Wikström, U. Karlsson, K. Andersson, N. Lycke (1983) Monoclonal antibodies to cholera toxin with special reference to cross-reactions with Escherichia coli heat-labile enterotoxia Infect Immun 40(2): 570-576.

137. Han S, J. Cho, I. Cho, E. Paek, H. Oh, B. Kim, C. Ryu, K. Lee, Y. Kim, S. Paek (2007) Plastic enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA)-on-a-chip biosensor for botulinum neurotoxin A Anal Chim Acta 587(1): 1-8.

138. K. Tsuzuki, N. Yokosawa, B. Syuto, I. Ohishi, N. Fujii, K. Kimura, K. Oguma (1988) Establishment of a monoclonal antibody recognizing an antigenic site common to Clostridium botulinum type B, CI, D, and E toxins and tetanus toxia Infect Immun 56(4): 898-902.

139. Ferreira, M. Hamdy, S. McCay, F. Zapatka (1990) Monoclonal antibody to type F Clostridium botulinum toxia Appl Environ Microbiol 56(3): 808-811.

140. A. Hamad, A. Herman, P. Marrack, J. Kappler (1994) Monoclonal antibodies defining functional sites on the toxin superantigen staphylococcal enterotoxin B. J Exp Med 180(2): 615-621.

141. C. Edwin, S. Tatini, R. Strobel, S. Maheswaran Production of monoclonal antibodies to staphylococcal enterotoxin A. (1984) Appl Environ Microbiol 48(6): 1171-1175.

142. R. Meyer, L. Miller, R. Bennett, J. MacMillan Development of a monoclonal antibody capable of interacting with five serotypes of Staphylococcus aureus enterotoxia (1984) Appl Environ Microbiol 47(2): 283-287.

143. Rolf, L. Eidels Structure-function analyses of diphtheria toxin by use of monoclonal antibodies. (1993) Infect Immun 61(3): 994-1003.

144. D. Tortorella, D. Sesardic, C. Dawes, E. London Immunochemical Analysis of the Structure of Diphtheria Toxin Shows All Three Domains Undergo Structural Changes at Low pH. (1995) J Biol Chem 270(46): 27439-27445.

145. S. Hayakawa, T. Uchida, E. Mekada, M. Moynihan, Y. Okada (1983) Monoclonal antibody against diphtheria toxin. Effect on toxin binding and entry into cells. J Biol Chem. 258(7): 4311 -4317.

146. V. Raso, M. Brown, J. McGrath, S. Liu, W. Stafford Antibodies Capable of Releasing Diphtheria Toxin in Response to the Low pH Found in Endosomes. (1997) J Bio. Chem. 272(44): 27618-27622.

147. F. Gigliotti, R. Insel (1982) Protective human hybridoma antibody to tetanus toxin. J Clin Invest 70(6): 1306-1309.

148. J. Chin, Y. Sohn, S. Lee, Y. Park, M. Choi Production of neutralizing human monoclonal antibody directed to tetanus toxin in CHO cell. (2003) Biologicals 31(1): 45-53.

149. H. Ziegler-Heitbrock, C. Reiter, J. Trenkmann, A. Futterer, G. Riethmuller Protection of mice against tetanus toxin by combination of two human monoclonal antibodies recognizing distinct epitopes on the toxin molecule. (1986) Hybridoma 5(1): 21-31.

150. W. Volk, B. Bizzini, R. Snyder, E. Bernhard, R. Wagner Neutralization of tetanus toxin by distinct monoclonal antibodies binding to multiple epitopes on the toxin molecule. (1984) Infect Immun 45(3): 604-609.

151. J. Kenimer, W. Habig, M. Hardegree Monoclonal antibodies as probes of tetanus toxin structure and function. (1983) Infect Immun 42(3): 942-948.

152. H. Brandwein, A. Deutsch, M. Thompson, R. Giannella Production of neutralizing monoclonal antibodies to Escherichia coli heat-stable enterotoxia (1985) Infect Immun 47(1): 242-246.

153. A. Svennerholm, M. Wikstrom, M. Lindblad, J. Holmgren Monoclonal antibodies against Escherichia coli heat-stable toxin (STa) and their use in a diagnostic ST ganglioside GM1-enzyme-linked immunosorbent assay. (1986) J Clin Microbiol 24(4): 585-590.

154. R. Urban, E. Pipper, L. Dreyfus Monoclonal antibodies specific for the Escherichia coli heat-stable enterotoxin STb. (1991) J Clin Microbiol 29(9): 1963-1968.

155. T. Takeda, G. Nair, K. Suzuki, H. Zhe, Y. Yokoo, P.D. Mol, W. Hemelhof, J. Butzler, Y. Takeda, Y. Shimonishi Epitope mapping and characterization of antigenic determinants of heat-stable enterotoxin (STh) of enterotoxigenic Escherichia coli by using monoclonal antibodies. (1993) Infect Immun 61(1): 289-294.

156. K. Gupta, R. Agha, E. Santos, B. Brodeur (1992) Isolation of human monoclonal antibodies binding to В fragment of diphtheria toxin. Hum Antibodies Hybridomas 3(1): 25-31.

157. Егорова С., Мойсенович M., Новиков К., Гибридомная технология, Практикум по иммунологии, под ред. Кондратьева И.А. Ярилин А. (2004) Академия: Москва,: 131-135

158. Laemmly U.K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 (1970) Nature. 227: 680-685.

159. Gill D.M., Dinius L.L.Observations on the structure of Diphtheria toxin. (1971) J. Biol. Chem., 246: 1485-1491.

160. Beatty J.D., Beatty B.G., Vlahos W.G. Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay (1987). J. Immunol. Methods. 100: 173-179.

161. Honda Т., Ni Y., Yoh M., Miwatani T. Production of monoclonal antibodies against termostable direct hemolysin of Vibrio parahaemolyticus and application of the antibodies for enzyme-linked immunosorbent assay. (1989) Med. Microbiol. Immunol. 178: 245-253

162. Clements J.D., Dickinson B.L. Use of Escherichia coli heat-labile enterotoxin as an oral adjuvant (1996) Mucosal Vaccines, Kyono H., Ogra P.L., McGhee J.R., eds. Academic, London and New York,: 73-87

163. Bowman C.C., Clements J.D. Differential Biological and Adjuvant Activities of Cholera Toxin and Escherichia coli Heat-Labile Enterotoxin Hybrids (2001) Infect Immun. 69(3): 1528-1535.

164. Фрезе К. Иммуноглобулины: выделение и анализ. (2001) Практикум по иммунологии, под ред. Кондратьевой, В.Д.Самуилова. - М.: Изд-во МГУ,: 83-111

165. Kaper J.B., Srivastava B.S. Genetics of cholera toxin. (1992) Indian J. Med. Res. V. 95. P. 163-167.

166. Clements J.D., Finkelstein R.A. Immunological cross-reactivity between a heat-labile enterotoxin(s) of Escherichia coli and subunits of Vibrio cholerae enterotoxin (1978). Infect. Immun. V. 22(3) 709-713.

167. Свиридов B.B., Зайцев E.M., Дельвиг A.A., Мазурова И.К., Семенов Б.Ф. (1986) Молекулярная генетика, микробиология и вируслогия, 1: 30-35

168. Cruz JR, Gil L, Cano F, Caceres P, Pareja G Breast milk anti-Escherichia coli heat-labile toxin IgA antibodies protect against toxin-induced infantile diarrhea. (1988) Acta Paediatr Scand. 77(5): 658-62.

169. Laegreid A, Otnaess AB, Fuglesang J Human and bovine milk: comparison of ganglioside composition and enterotoxin-inhibitory activity. (1986) Pediatr Res. 20(5):416-21.

170. Филиппова M.A. Одновременный количественный анализ бактериальных и растительных биотоксинов на гидрогелевых микрочипах. (2011) Автореф. дисс. на соискание уч. степени канд. хим. наук. (03.01.03) Москва

171. Joao P. S. Cabral Water Microbiology. Bacterial Pathogens and Water (2010) Int. J. Environ. Res. Public Health, 7: 3657-3703

172. Zhu J., Mekalanos J.J. Quorum Sensing-Dependent Biofilms Enhance Colonization in Vibrio cholerae (2003) Developmental Cell, 5: 647-656

СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

Рисунок 1. Пространственная структура холерного токсина.............................................10

Рисунок 2. Механизм действия холерного токсина в клетке кишечного эпителия.................11

Рисунок 3. Пространственная структура термолабильного энтеротоксина Е. coli.................13

Рисунок 4. Схема получения моноклональных антител с помощью гибридомной технологии..!9 Рисунок 5. Электрофореграмма моноклональных антител в 12,5% ПААГ-SDS в

восстанавливающих условиях..................................................................................58

Рисунок 6. Определение константы аффинности МА B1F8.............................................60

Рисунок.7. Вестерн-блот-анализ связывания моноклональных антител с субъединицами

холерного токсина.................................................................................................................................61

Рисунок 8. Определение константы аффинности МА B11G11..........................................62

Рисунок 9. Вестерн-блот-анализ связывания моноклональных антител с субъединицами

термолабильного энтеротоксина Е. coli.......................................................................63

Рисунок 10. Зависимость оптического поглощения при 490 нм анализируемых проб от концентрации токсина при тестировании холерного токсина методом «сэндвич»-ИФА с

использованием пары антител F5H3-BlF8biot...............................................................66

Рисунок 11. Зависимость оптического поглощения при 490 нм анализируемых проб от концентрации токсина при тестировании термолабильного энтеротоксина Е. coli методом

«сэндвич»-ИФА с использованием пары антител El lF4-F5G2biot.....................................69

Рисунок 12. Зависимость оптического поглощения при 490 нм пары антител F5H3-BlF8biot от концентрации СТ, в «сэндвич»-ИФА холерного токсина в стандартном буфере и в образцах

молока, бульоны и воды из открытого водоема............................................................70

Рисунок 13. Зависимость оптического поглощения при 490 нм пары El lF4-F5G2biot от концентрации LT в «сэндвич»-ИФА термолабильного энтеротоксина Е. coli в стандартном

буфере, в образцах молока, бульона и воды из открытого водоема........................................71

Рисунок 14. Зависимость интенсивности медианного флуоресцентного сигнала комплекса иммобилизованных на микросферах антител F5H3 с поликлональными антимышиными

антителами, меченными фикоэритрином, от концентрации антимышиных антител................74

Рисунок 15. Зависимость интенсивности флуоресцентного сигнала комплекса иммобилизованных на микросферах антител F4F4 с поликлональными антимышиными

антителами, меченными фикоэритрином, от концентрации антимышиных антител................76

Рисунок 16. Зависимость интенсивности флуоресцентного сигнала комплекса иммобилизованных на микросферах антител El 1F4 с поликлональными антимышиными антителами, меченными фикоэритрином, от концентрации антимышиных антител...............77

Рисунок 17. Зависимость интенсивности сигнала флуоресценции в пробах, содержащих микросферы Р5НЗхМАР129 и детектирующие антитела В1Р8 Ыог в концентрациях 0,5, 1,0, 2,0

и 4,0 мг/мл, от концентрации СТ...............................................................................78

Рисунок 18. Зависимость интенсивности сигнала флуоресценции, в пробах, содержащих микросферы Р4Р4хМАР129, конъюгированные с антителами Р4Р4 в количестве 5 и 1 мкг, детектирующие антитела Е6Е10 Ь1о1 в концентрациях 0,5,1,0, 2,0 и 4,0 мг/мл,

от концентрации СТ...............................................................................................79

Рисунок 19. Зависимость интенсивности сигнала флуоресценции, в пробах, содержащих микросферы Р4Р4хМАР129, конъюгированные с антителами Р4Р4 в количестве 5 и 1 мкг, детектирующие антитела В1Р8ЬЫ в концентрациях 0,5, 1,0, 2,0 и 4,0 мг/мл,

от концентрации СТ...............................................................................................79

Рисунок 20. Зависимость интенсивности сигнала флуоресценции, в пробах, содержащих микросферы Е11Р4хМАР136, конъюгированные с антителами Е11Р4 в количестве 5 и 1 мкг, детектирующие антитела Р502Ыо1 в концентрациях 0,5, 1,0, 2,0 и 4,0 мг/мл,

от концентрации ЬТ...............................................................................................80

Рисунок 21. Зависимость интенсивности сигнала флуоресценции, в пробах, содержащих микросферы Р502хМАР136, конъюгированные с антителами Р5в2 в количестве 5 и 1 мкг, детектирующие антитела 1ВЮ6Р2Ьюг в концентрациях 0,5, 1,0, 2,0 и 4,0 мг/мл,

от концентрации ЬТ...............................................................................................81

Рисунок 21. Зависимость интенсивности флуоресцентного сигнала в пробах

от концентрации СТ...............................................................................................83

Рисунок 22. Зависимость интенсивности флуоресцентного сигнала в пробах

от концентрации ЬТ...............................................................................................83

Рисунок 23. Зависимость интенсивности сигнала флуоресценции от концентрации СТ в хМАР анализе, проведенном с участием двух пулов микросфер, конъюгированных с антителами Б4Р4

и с Е11Р4, и с детектирующими СТ антителами В1Р8 ЬЫ...............................................84

Рисунок 24. Зависимость интенсивности флуоресценции сигнала от концентрации ЬТ в хМАР анализе, проведенном с участием двух пулов микросфер, конъюгированных с антителами Р4Р4

и с Е11Р4, и с детектирующими ЬТ антителами Р502 Ыо1...............................................85

Рисунок 25. Зависимость интенсивности медианного флуоресцентного сигнала от концентрации СТ и ЬТ в хМАР анализе, проведенном с участием двух пулов микросфер, конъюгированных с антителами Р4Р4 и с Е11Р4, в присутствии детектирующих СТ антител

В1Р8 Ькй.............................................................................................................86

Рисунок 26. Зависимость интенсивности медианного флуоресцентного сигнала от концентрации СТ и ЬТ в хМАР анализе, проведенном с участием двух пулов микрсофер,

конъюгированных с антиелами F4F4 и с E11F4, в присутсвии детектирующих LT антител

F5G2 biot.............................................................................................................86

Рисунок 27. Зависимость интенсивности медианного флуоресцентного сигнала от концентрации СТ и LT в хМАР анализе, проведенном с участием двух пулов микросфер, конъюгированных с F4F4 и с E11F4, в присутствии детектирующих антител B1F8 biot и

F5G2 biot.............................................................................................................87

Рисунок 28. Зависимость интенсивности медианного флуоресцентного сигнала от концентрации СТ (1), LT (4), SEA (2) и SEB (3) в хМАР анализе, проведенном с участием микросфер, конъюгированных со связывающими антителами к этим токсинам: F4F4, El 1F4,

SEA11 и SEB2, в присутствии детектирующих антител B1F8 biot, F5G2 biot, SEA6 biot и

SEB6 biot.............................................................................................................90

Рисунок 29. Зависимость интенсивности флуоресценции сигнала от концентрации СТ в

образцах молока в хМАР анализе СТ и LT...................................................................92

Рисунок 30. Зависимость интенсивности флуоресценции сигнала от концентрации LT в

образцах молока в хМАР анализе СТ и LT...................................................................92

Рисунок 31. Зависимость интенсивности флуоресценции сигнала от концентрации СТ в хМАР

анализе СТ и LT в образцах мясного бульона...............................................................93

Рисунок 32. Зависимость интенсивности флуоресценции сигнала от концентрации LT в хМАР

анализе СТ и LT в образцах мясного бульона...............................................................93

Рисунок 33. Зависимость интенсивности флуоресценции сигнала от концентрации СТ в

биплексном анализе СТ и LT в образцах смывов со слизистой носоглотки человека..............95

Рисунок 34. Зависимость интенсивности флуоресценции сигнала от концентрации LT в

биплексном анализе СТ и LT в образцах смывов со слизистой носоглотки человека...............95

Рисунок 35. Зависимость интенсивности медианного флуоресцентного сигнала от

концентрации СТ в хМАР анализе СТ и LT в образцах воды...........................................96

Рисунок 36. Зависимость интенсивности медианного флуоресцентного сигнала от

концентрации LT в хМАР анализе СТ и LT в образцах воды............................................96

Таблица 1. Иммунизация конвенциональных мышей холерным токсином..........................56

Таблица 2. Иммунизация мышей категории SPF холерным токсином.................................56

Таблица 3. Иммунизация мышей термолабильным энтеротоксином E.coli...........................57

Таблица 4. Характеристика МА к холерному токсину...................................................59

Таблица 5. Характеристики моноклональных антител к термолабильному энтеротоксину

E.coli..................................................................................................................62

Таблица 6. Перечень интактных и биотинилированных антител к СТ, использованных для подбора пары МА для «сэндвич»-варианта ИФА...........................................................64

Таблица 7. Пары моноклональных антител, выявляющие в «сэндвич»-анализе холерный токсин

в концентрации ниже 1 нг/мл...................................................................................66

Таблица 8. Перечень интактных и биотнилированных антител к LT, использованных для

подбора пары МА для «сэндвич»-варианта ИФА..........................................................67

Таблица 9. Пары моноклональных антител, выявляющие в «сэндвич»-ИФА термолабильный

энтеротоксин Е. coli...............................................................................................68

Таблица 10. Минимальные детектируемые концентрации холерного токсина и термолабильного энтеротоксина Е. coli в продуктах питания и в воде из открытого водоема в

нг/мл, определенные методом «сэндвич» - ИФА в формате планшета................................71

Таблица 11. Минимальные детектируемые концентрации токсинов, определенные «сэндвич»-

ИФА в образцах смывов слизистой оболочки носоглотки человека...................................72

Таблица 12. Пары МА, отобранные для хМАР - анализа токсинов СТ и LT.........................82

Таблица 13. Минимальные детектируемые концентрации СТ и LT, определенные в хМАР анализе с участием различным пар связывающих антител, иммобилизованных на микросферах,

и детектирующих антител.......................................................................................82

Таблица 14. Минимальные концентрации холерного токсина и термолабильного энтеротоксина Е. coli, детектируемые в биплексном иммунофлуоресцентном анализе с применением

технологии Luminex и в «сэндвич»-ИФА в формате планшета..........................................88

Таблица 15. Компоненты мультиплексной тест системы для определения стафилококковых

энтеротоксинов А и В, холерного токсина и термолабильного энтеротоксина Е. coli..............89

Таблица 16. МДК холерного токсина, термолабильного энтеротоксина E.coli, стафилококковых энтеротоксинов А и В, определенные с помощью мультиплексного иммунофлуоресцентного

анализа с применением технологии хМАР...................................................................90

Таблица 17. МДК (нг/мл) холерного и термолабильного энтеротоксина Е. coli в молоке, определенные в хМАР «сэндвич» - анализе и в «сэндвич» - ИФА для одноименных антител...93 Таблица 18. МДК СТ и LT в бульоне и модельном буфере, детектируемые в биплексном иммунофлуоресцентном анализе с применением хМАР технологии и ««сэндвич»»-ИФА в

формате планшета..................................................................................................94

Таблица 19. МДК определенные для холерного токсина и термолабильного энтеротоксина Е coli, в образцах смывов со слизистой носоглотки человека и в модельном буфере двумя вариантами анализа - биплексном имунофлуоресцентном анализе с применением хМАР

технологии и «сэндвич» - ИФА в формате планшета......................................................95

Таблица 20. МДК холерного токсина и термолабильного энтеротоксина Е coli, определенные в образцах воды и в модельном буфере двумя вариантами анализа - мультиплексном

имунофлуоресцентном анализе с применением хМАР технологии и «сэндвич» - ИФА в формате планшета.............................................................................................................97