Совершенствование гибридомной технологии и создание моноклональных антител для систем иммуноанализа тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, доктор биологических наук Самойлович, Марина Платоновна

• Самойлович, Марина Платоновна
• доктор биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации доктор биологических наук Самойлович, Марина Платоновна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1 Гибридомная технология и иммуноанализ на основе моноклональных антител (обзор литературы).

1.1. Культивируемые клетки плазмацитомы.

1.2. Получение иммунных лимфоцитов.

1.3. Подготовка к слиянию клеток.

1.4. Гибридизация (слияние) клеток.

1.5. Метаболическая селекция гибридов.

1.6. Скрининг - выявление I ибридов-продуцентов антител.

1.7. Клонирование гибридом-продуцентов антител.

1.8. Криоконсервация гибридом.

1.9. Массовое культивирование и пассирование гибридом на мышах.

1.10. Иммуноанализ на основе моноклональных антител.

Глава 2. I {ели, задачи и методы исследования.

2.1. Выбор цели и постановка задач исследования.

2.2. Материал и методы исследования.

Глава 3. Развитие ириемов гибридомной технологии.

3.1. Выведение штамма культивируемых клеток плазмацитомы мышей -опухолевого партнера для создания гибридом.

3.2. Исследование свойств и испытание штамма миеломы.

3.3. Выбор линии мышей-доноров иммунных лимфоцитов.

3.4. Приемы наработки моноклональных антител.

3.5. Обсуждение.

Глава 4. Получение и изучение свойств моноклональных антител против маркеров, используемых в иммуноанализе.

4.1. Ферменты и флуорохромы - маркеры, используемые в иммуноанализе.

4.2. Получение гибридомного штамма, синтезирующего антитела против пероксидазы.

4.3. Изучение свойств моноклональных антител против пероксидазы и некоторых возможностей их использования в иммуноанализе.

4.4. Получение гибридом-продуцентов моноклональных антител против флуоресцеина.

4.5. Изучение свойств моноклональных антител против флуоресцеина.

4.6. Обсуждение.

Глава 5. Получение и изучение свойств моноклональных антител против респираторно-синцитиального (РС) вируса.

5.1. Моноклональные антитела в исследовании РС вируса.

5.2. Получение гибридомных штаммов, продуцирующих антитела против антигенов РС вируса человека.

5.3. Изучение свойств и возможностей применения моноклональных антител против РС вируса.

5.4. Обсуждение.

Глава 6. Получение и изучение свойств моноклональных антител против иммуноглобулинов человека.

6.1. Антигенные свойства человека. Антитела - реагенты для иммуноанализа ^.

6.2. Получение гибридом, синтезирующих моноклональные антитела против изотипических и субизотипических маркеров ^ человека.

6.3. Иммунохимическая характеристика моноклональных антител против Ig человека.

6.4. Обсуждение.

Глава 7. Конструирование тест-систем, предназначенных для детекции и определения концентраций Ig человека в биоло1 ических жидкостях.

7.1. Изучение эпитопной специфичности моноклональных антител.

7.2. Конструирование двухцентровых иммуноферментных систем для определения Ig человека в биологических жидкостях.

7.3. Исследование Ig человека с помощью моноклональных антител.

7.4. Обсуждение.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Совершенствование гибридомной технологии и создание моноклональных антител для систем иммуноанализа»

Актуальность проблемы. Моноклональные антитела (МкАт) являются мощным инструментом исследования биологических макромолекул. С их помощью 1иучакн струкгуру и функции ранее открытых молекул, а также выявляют новые ашшенные компоненты клеток и тканей [72]. Анализ экспрессии и регуляции генов, идентифицированных в раличных геномных проектах, требует создания тысяч и тысяч новых МкАт [238]. МкАт позволяют обеспечить высокую специфичность, чувствительность и воспроизводимость приемов иммуноанализа и в то же время -увеличить их разнообразие и адаптировать для решения проблем фундаментального и практического характера [91]. Поэтому создание МкАт для систем иммуноаналиш было и остается актуальной задачей.

Опубликование в 1975 году статьи, в которой было описано слияние нормальных плазмацитов с их опухолевыми аналогами - клетками миеломы и последующий отбор клонов-продуцентов антител [200], открыло эру создания, исследования и исполыования МкАт. Совокупность приемов получения штаммов-продуцентов МкАт была патана гибридомной технологией. В ее основе лежит синтез ряда достижений клеточной биологии, фундаментальной иммунологии и экспериментальной онколо! ии.

Перспективность гибридомной технологии для развития методов иммуноанализа была высоко оценена исследователями, и лаборатории многих стран мира занялись ее освоением и адаптацией. Вскоре стало понятно, что на каждом этапе создания гибридом имеются многочисленные технические проблемы и что способ их решения определяв! результат в целом. Первая из таких проблем связана с высокой зависимостью миеломных клеток-партнеров от ростовых факторов эмбриональной сыворотки [124, 130]. Создание клеточных линий, менее зависимых от экзогенных ростовых факторов, способных расти и давать жизнеспособные гибриды в средах, не содержащих фетальной сыворотки, представляло актуальную задачу. Вторая проблема состояла в том, что при создании 1ибридом для иммунизации почти повсеместно использовали мышей BALB/c, от которых происходят миеломные штаммы-партнеры [185, 257]. Это приводило к сужению спек фа эпитопов, распознаваемых полученными МкАт. Представлялось целесообразным в качестве доноров иммунных лимфоцитов использовать животных иного генотипа с иным репертуаром вырабатываемых антител с тем, чтобы получаемые МкАт по эпитопной специфичности могли дополнять ранее созданные реагенты. Наконец, пассирование гибридом на животных с целью получения больших количеств МкАт остается до сих пор «узким местом» гибридомной технологии [118].

Таким образом, совершенствование ряда ключевых этапов гибридомной технологии представляет собой актуальную задачу.

Анализ литературы показывает, что иммунофлуоресцентные и иммунопероксидазные методы детекции антигенов и антител относятся к числу наиболее надежно работающих и чаще всего используемых вариантов иммуноанали ул как в фундаментальных исследованиях, так и в лабораторной диа1ностике. Наличие Мк/\л против молекул - маркеров позволяет с большей гибкостью подходить к разработке и применению систем иммуноанализа, создавать иммунные комплексы сложного состава и использовать их для визуализации или инструментальной регистрации продуктов реакции ангшен-антитело [94].

МкАт служат незаменимыми инструментами в вирусологических исследованиях. Иммунохимические способы диагностики вирусных заболеваний основаны на выявлении вирусных антигенов в клетках и в биологических жидкостях, а также на определении спектра циркулирующих в крови антивирусных антител. Респираторно-синцитиальный (РС) вирус человека вызывает тяжелое заболевание нижних отделов дыхательных путей, особенно опасное для новорожденных и детей 1-ю года жизни [151]. Энл вирус характеризуется чрезвычайно нестабильной антигенной структурой - она ле1ко нарушается при выделении, очистке и хранении препаратов вируса. Создание МкАт против антигенов РС вируса открывает пути совершенствования и стандаргишции методов иммунодиагностики этой вирусной инфекции.

При диагностике иммунодефицитов, инфекционных, аллергических, аутоиммунных, лимфопролиферативных заболеваний используют методы иммуноанализа, основанные на выявлении иммуноглобулинов человека. В антигенном отношении 1ц представляют собой молекулы с высокой степенью гомологии, в то же время они имеют антигенные детерминанты, отличающие отдельных типов, изотииов и субизогипов. Создание высокоспецифичных реагентов, способных дифференцировать и детектировать эти молекулы методами иммуноанализа, отвечает запросам фундаментальной и клинической иммунологии.

Цель работы состояла в совершенствовании ряда приемов гибридомной технологии и в создании МкАт против флуоресцеина, нероксидазы, РС вируса и человека как анти! енов, широко используемых в системах иммуноанализа.

Задачи исследования.

1. Создать штамм культивируемых клеток миеломы мышей, независимый от ростовых факторов эмбриональной сыворотки, позволяющий получать и поддерживать гибридомы на средах с сывороткой крупного рогатого скота (СКРС).

2. Испытать целесообразность использования при создании гибридом лимфоцитов животных с репертуаром иммунного ответа, отличным от присущею мышам линии ВАЬВ/с.

3. Рафаботать способы эффеюгивной наработки МкАт пассированием штаммов гибридом на животных.

4. Получить гибридомы-продуценты МкАт против флуоресцеина и пероксиданл -маркеров антигенов и антител в системах иммуноанализа. Исследовать свойсша МкАт и возможности их применения в иммуноанализе.

5. Создать панель МкАт против антигенов РС вируса человека и отобрать реагенты, необходимые для иммунодиагностики РС вирусной инфекции. 6 Создать гибридомы, продуцирующие МкАт против антигенных маркеров иютипов (IgA, IgM, IgG, IgE) и субизотипов IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4) человека.

7. Изучить иммунохимические характеристики МкАт против Ig человека и свойства распознаваемых ими антигенных детерминант.

8. Разработать лабораторные варианты систем иммуноанализа для определения концентраций Ig отдельных изотипов и субизотипов.

Работа выполнялась в рамках государственной целевой программы 0.1Д.043 и КП НГП стран-членов СЭВ "Биотехнология в медицине" (задание - «Разработка и организация производства диагностических реагентов на основе моноклональпыч антител»), в соответствии с планом научно-исследовательских работ Центральною научно-исследовательского рентгено-радиологического института (номера государственной регистрации 01.83.0 021559, 01.85.0 025322 и 01.99. 0 04371). Исследования, выполняемые соискателем, были поддержаны грантами РФФИ (00-0449516 и 02-04-49120). Научная новизна.

Создан новый штамм культивируемых клеток миеломы мышей, независимый oí ростовых факторов эмбриональной сыворотки.

Впервые для пассирования гибридом и наработки МкАт in vivo в сингенной системе использовано сублетальное облучение реципиентов.

Впервые получены МкАт против пероксидазы, взаимодействующие со всеми изоформами фермента и не ингибирующие его каталитическую активность.

Среди МкАт против РС вируса человека впервые описаны реагенты, способные дифференцировать полноценный вирус от вирусных частиц, имеющих структурные дефекты.

Впервые при получении МкАт против изотип-сиецифичных эпитопов IgG человека исследован профиль их антиген-распознающей активности и отобраны реагешы, равномерно связывающие все четыре подкласса.

Получены МкАт против изотипических и субизотипических маркеров Ig человека, не имеющие аналоюв по эпитопной специфичности.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Использование мышей линии SJL/J позволяет расширить репертуар эпитопов, распознаваемых МкАт.

2. Сублетальное облучение мышей при пассировании гибридом увеличивает эффективность наработки МкАт.

3. Полноценное использование МкАт в иммуноанализе требует одновременного изучения иммунохимических характеристик самих антител и свойств распознаваемых ими эпитопов.

4. МкАт против флуоресцеина и против пероксидазы позволяют расширить возможности иммуноанализа за счет сочетанного применения антшенов и антител, меченных ферментом, флуорохромом и/или гаптеном.

5. На основе полученных МкАт против классов и подклассов IgG разрабоганы системы ИФА, позволяющие выявлять и определять концентрации IgA, IgE, IgM, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 и суммарною IgG, как в сыворотке крови, так и в других биологических жидкостях человека.

Практическая значимость результатов работы.

Созданные в работе МкАт против PC вируса могут быть использованы как для диагностики инфекции, так и для оценки качества вирусных препаратов.

МкАт против IgA, IgE, IgM, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 и суммарного IgG в виде нативных препаратов и в виде конъюгатов с пероксидазой прошли государственные испытания и рекомендованы для практического применения Комитетом по иммунобиологическим препаратам при ГИСК им. JI.A. Тарасевича.

Государственным фармакопейным Комитетом утверждены фармакопейные статьи:

1. «Антитела моноклональные диагностические против легких и тяжелых полипептидных цепей иммуноглобулинов человека» - №42-0190-059300.

2. «Антитела моноклональные диагностические против легких и тяжелых полипептидных цепей иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой хрена» - № 42-0596-636605.

Внедрение результатов исследования.

Прошедшие государственную экспертизу и включенные в фармакопейные статьи антитела применяются в иммунодиагносгических тест-системах, выпускаемых НПО «Вектор» (Новосибирск), ООО «ЦКФФ» (Ставрополь). Полученные в работе МкАг используются в научных и диагностических лабораториях ряда учреждений страны, в том числе в: BMA (Санкт-Петербург), ВЦЭРМ МЧС (Санкт-Петербург), НИИ гриппа РАМН (Санкт-Петербург), СПб МАПО, Институте детских инфекций (Санкт-Петерб>р1), СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова, ВНЦ МДЛ (Москва), ГУ НИИ вакцин и сывороток (Москва).

Теоретические положения и практические результаты, полученные в настоящей работе, используются при проведении практическою курса «Иммунологические методы исследования» на кафедре цитологии и гистологии биолого-почвенного факультета СПбГУ.

Личный вклад автора в проведение исследования. Данные, представленные в работе, получены лично автором. Автором выполнены все этапы создания 1ибридом, получения МкАт, изучения их свойств, конструирования систем иммуноанали ja, подютовки материалов для публикаций и для проведения государственных испытаний МкАт. При получении МкАт против PC вируса, диссертантом выполнены этапы иммунизации, разработки системы скрининга, создания гибридомных штаммов, исследования свойств МкАт и распознаваемых ими эпитопов. Получение препаратов РС-вируса, ею очистку, электронно-микроскопические исследования, а также работу с материалом от пациентов проводили сотрудники лаборатории иммунодиагностических препаратов НИИ гриппа РАМН, руководимой профессором Сомининой A.A.

Апробация работы Материалы работы были представлены на Всесоюзных и международных конференциях и симпозиумах, в том числе: на всесоюзном конгрессе "Актуальные вопросы в биохимической и иммунологической диагностике злокачественных новообразований" (Москва, 1989), на конференциях «Современные достижения медицинской радиологии» и «Новые технологии в радиационной медицине» (С-Г1етербург, 1993 и 1995), на 1-ой Национальной конференции Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических иммунологов (РААКИ), (Москва, 1997), на 5-м Конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммуггологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002), на Объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004), на Всероссийском совещании "Клеточная биология на пороге XXI века" (С-Петербург, 2000), на восьми Всероссийских научных конференциях с международным участием "Дни иммуггологии в Сатгкт-Г1етербурге"( 1996-2005), на XI и XII-м международных совещаниях по эволюционной физиологии, посвященных памяти академика. Л.А.Орбели (С-Петербург 2001 и 2006), на международных конференциях по медицинской биотехнологии «Иммунизация и СПИД» и «Биотехнология С-Петербург-94» (С-Петербург, 1991 и 1994). Результаты исследования были доложены и обсуждены на международных симпозиумах: «Регуляция и клиническое значение IgE» (Москва, 1990), «Множественная миелома. Достижения в биологии и лечении» (Вена, 1996), «Достижения в клинической вирусологии -IV» (Гамбург, 1998), «Эволюция системы иммунитет» (Йена, 1999), на IV международном симпозиуме по клинической иммунологии (Амстердам, 1997), на XI-м международном конгрессе но иммунологии (Стокгольм, 2001).

Диссертационная работа прошла апробацию на расширенном совместном заседании проблемных комиссий «Медицинская биотехнология» и «Медицинская радиобиология» ФГУ ЦНИРРИ, а также на научной конференции отдела иммунологии ГУ НИИЭМ РАМН.

Публикации. Результаты работы отражены в 4-х авторских свидетельствах на изобретения, в 23-х статьях и 40 тезисах докладов на Международных, Всесоюзных и Всероссийских конференциях, съездах и симпозиумах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 237 страницах машинописного текста и состоит из обзора литературы, пяти глав, содержащих изложение и обсуждение результатов исследования, заключения и выводов. Диссертация иллюстрирована 85 рисунками и 48 таблицами. Список цитированной литературы содержит 350 источников.

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Самойлович, Марина Платоновна

Заключение.

Тенденции развития гибридомной технологии и создания моноклональных антител для имммуноанализа

В 2000 году иммунологическое сообщество отметило 25-летие со дня опубликования статьи, содержавшей описание метода получения гибридом-продуцентов антител заданной специфичности [200, 238]. Настоящее исследование было начато в 1983 году, спустя 8 лет после рождения гибридомной технологии. В приведенном в 1-й главе очерке гибридомной технологии изложены те сведения, которые послужили основой при планировании работы. Современное состояние исследований в обласш получения МкАт для иммуноанализа, некоторые тенденции развития и проблемы этого направления иммунологии заслуживают внимания.

Базовый протокол создания МкАт, разработанный на основе опыта mhoihx лабораторий в 80-е годы, в настоящее время остается наиболее широко применимым. Мышиные 1ибридомы получают на основе линий миелом NSO, NSI, X63Ag8.653 и SP-2/0-Agl4, зависимых от ростовых факторов эмбриональной сыворотки. Получение клеток-наргнеров для слияния, менее зависимых от экзогенных ростовых факторов, на протяжении всех лет оставалось задачей, решение которой искали с помощью разных методических подходов. Один из таких подходов основан на наблюдении тою, что культуральные среды, кондиционированные клетками, секретирующими IL-6, способны увеличивать выход гибридом-продуцентов МкАт. Для создания нового штамма миеломы -Sp2/mIL-6 в клетки линии SP-2/O с помощью ретровируса были введены юны, обеспечившие постоянную экспрессию мышиного IL-6 [158]. Слияние клеток Sp2/mlL-6 с иммунными В-лимфоцитами позволило увеличить как выход Ig-секрегирующих гибридов, так и количество гибридом, продуцирующих МкАг искомой специфичности. По ростовым характеристикам, стабильности и продуктивности гибридомы, полученные на основе клеток Sp2/mIL-6, не уступали гибридомам, полученным на основе исходно! о штамма. Другой экспериментальный подход состоял во введении в миеломные, а также в гибридомные клетки экзогенных генов Вс1-2, регулирующих апоптоз. Это способствовало снижению клеточной гибели в условиях разреженной культуры, дефицита питательных веществ или увеличения кислотности среды [107, 292]. Эти данные моиш бы указывать путь создания линий миелом, менее зависимых от экзоюнных ростовых факторов, однако, они не нашли подтверждения в ряде независимых исследований [87]. Работы по модификации миеломных мышиных клеток продолжаются по сей день.

Для получения иммунных лимфоцитов в большинстве работ так же, как и в 80-е годы, используют мышей линии BALB/c [258]. Инбредные мыши других генотипов служат донорами лимфоцитов в редких случаях, при решении специфических задач. Так, например, для изучения репертуара антител при аутоиммунных заболеваниях получали гибридомы из лимфоцитов мышей MRL/1, NZB и BXSB [346]. Авторов другою исследования трудности получения каталитических МкАт, обладающих эстера зной активностью, заставили обратить внимаггие на мышей линии MRL/MpJ-lpr/lpr, имеющих дефект Fas-rcna. При иммунизации этих мышей было получено в 8 раз больше гибридом, продуцирующих искомые МкАт, чем при иммунизации мышей BALB/c [307]. Высказано предположение, что мыши линии MRL/MpJ-lpr/lpr могут оказаться полезными для создания других МкАт, особенно против слабоиммунн о генных антигенов [258]. Создается впечатление, что повсеместная практика использования мышей BALB/c тормозит реализацию возможностей гибридомной технологии, особенно при создании реагентов для эпитопного картирования биологических молекул.

Наиболее существенные изменения за последние годы произошли в подходах к иммунизации доноров иммунных лимфоцитов [285]. Исследования, направленные на получение МкАт против высокогомологичных молекул или против минорных компонентов антигенных смесей, сформировали стратегию, которая получила название вычитателыгой иммунизации (subtractive immunization), суть которой состоит в создании неоотвечаемости к нежелательным антигенным детерминантам [96, 227, 293, 343]. Вариант вычитателыгой иммунизации, основанный на связывании рецепторов В-лимфоцитов IgG-антителами против иммунодоминантных эпитопов, общих для гомологичных молекул, был использован в настоящей работе при получении МкАг против маркеров IgG4 и IgG2. Другой вариант вычитательной иммунизации сосюит во введении антигена животным, у которых в отношении иммунодоминантных молекул индуцирована высокодозная толерантность [211]. Эффективным способом индукции иммуносупрессии является элиминация антиген-специфичных В- и Т- лимфоцитов с помощью циклофосфамида [294, 326]. Действие циклофосфамида на антшелообразование было описано почти потвека назад [288], однако, его широкое использование при получении МкАт является достижением последнего времени.

Дшгьнейшее развитие гибридомной технологии связано с применением методов генной инженерии. Исследования, проводимые на трансгенных мышах, открывают возможности манипуляции регуляторньтми генами у иммунизируемых животных. 1ак, гранстенные мыши BALB/c, имеющие увеличенную дозу гена Вс1-2, при создании МкАт против галактоз ид азы, оказались более эффективными донорами специфических силеноцитов, чем мыши BALB/c дикого типа [196]. Эти результаты указывали на то, что манипулирование 1енами, отвечающими за апоптоз, может увеличивагь эффективность созданияiибридом.

Для получения МкАт против молекул с известной первичной структурой в качестве иммуногена вместо природных молекул все шире стали использовать сишетические пептиды [254, 285]. Применение такого приема позволило с большей эффективностью получать МкАт против определенных антшенных участков интересующих молекул. В то же время реа1енты, полученные в результате иммунизации синтешческими пептидами, далеко не всегда способны распознавать нативные молекулы, чго, вероятно, связано с различиями в конформации синтетического пептида и той же последовательности аминокислот в составе нативной молекулы.

Другим источником иммунотена стали рекомбинантные пептиды, эксирессированные в бактериях, дрожжах или клетках насекомых. Создание рекомбинантных антигенов стало возможным благодаря использованию методов генной инженерии и требует знания нуклеотидной последовательности антигена или ею фрагментов [90, 319]. Применение рекомбинантных молекул при создании гибридом наиболее целесообразно при работе с клеточными антигенами, когда скрининг можно проводить с помощью цитофлуоримегрии, клеточного ИФА или других аналогичных приемов, исключающих выявление антител против компонентов тех клеток, в которых проходила экспрессия антигенных фрагментов.

Принципиальным изменением в процедуре подготовки доноров иммунных лимфоцитов стало использование ДНК-иммунизации [106, 184, 213, 311] Вместо введения эмульгированных в адъювантах белковых молекул, животным инъецируют ДНК, кодирующую интересующий фрагмент антигена. ДНК обесггечивает экспрессию искомого аггтигена, на который организм формирует иммунный огвет. Проведены исследования количества специфических гибридом, а также эпитопной специфичности и свойств МкАт, получаемых при иммунизации белковыми молекулами или соответствующей ДНК-иммунизации [184]. Гак введение мышам вместо простато-специфическою антигена (PSA) плазмиды, экспрессирующей полномерную кДНК этою белка, привело к появлению в крови животных антител, титр которых был достоверно ниже, чем при иммунизации белком [213]. Очевидно, в процессе иммунизации участвуют аутологичные белки трансформированных клеток, что может активировать супрессорные механизмы [277]. Соответственно, выход гибридом был также ниже. Существенно, чго МкАт, полученные при гибридизации спленоцитов мышей, инъецированных кДНК, не отличались ни по эпитопной специфичности, ни по изотопам, ни по аффинитету от МкАт, синтезируемых гибридомами, созданными в результате белковой иммунизации. ДНК-иммунизация стала методом выбора при получении МкАт против клеточно-ассоциированных антигенов, которые трудно выделять в чистом виде [106]. Таким образом, ДНК-иммунизация может быть эффективно использована для получения МкАг в тех ситуациях, когда белок оказывается малодоступным.

В отличие от этапа иммунизации, этап подютовки клеток к слиянию и сама процедура слияния за истекшие 30 лет не претерпели значительных изменений. Сгоит отметить более широкое использование клеточных сортеров для предварительной селекции B-лимфоцитов, несущих АГ-специфные рецепторы. Сочетание генно-инженерных приемов с использованием клеточных сортеров рекомендуется в качесгве экономичной и эффективной технологии получения МкАт против белков - продуктов новых генов, для которых известна только нуклеотидная последовательность [90]. Слияние миеломных клеток с иммунными лимфоцитами проводят как правило в присутствии ПЭГ, правда все более широко применяется метод электрослияния [350].

Системы скрининга гибридом так же как и в прошлые десятилетия опираются преимущественно на варианты иммуноферментного анализа. В зависимости от природы анти1 ена и целей создания Мк А г используют твердофазный ИФА в планшетном варианте, или «дот»-анализ, антитела против клеточных антигенов выявляют в ИФА на иммобилизованных на планшетах клетках, или на проточных анализаторах, применяя флуоресцирующие метки. Новой по формату исполнения и чрезвычайно экономичной в отношении времени и реагентов стала техника с применением микрочипов. Основным ограничением в ее распространениии пока является отсутствие соответствующей дорог остоягцей аппаратуры.

Клонирование с помощью лимитирующих разведений остается основным методом отбора и размножения клеток-продуцентов МкАт. При этом фидерные клетки, которыми обычно служили первичные культуры мышиных перитонеальных макрофагов, все чаще заменяют на бесклеточные добавки, содержащие один или несколько цитокинов. Источником цитокинов могут служить как надосадки постоянных клеточных линий макрофагальной природы, так и очищенные рекомбинантные белки. Описаны некоторые модификации, основанные на создании специальной аппаратуры, позволяющей упростит г. процедуру клонирования [340].

Все годы существования гибридомной технологии процессу наработки МкАт уделялось немало внимания, однако, особую остроту проблема приобрела после 1999 года, когда решением Европейского комитета по этике были введены значительные ограничения на работу с лабораторными животными [118]. Переход на производство

МкАт in vitro потребовал кропотливых испытаний и исследований [252, 174, 320]. Было необходимо сопоставить параметры роста, продуктивность, стабильность гибридом и свойства МкАт, получаемых в биореакторах с реагентами, получаемыми при пассировании опухолей на мышах. Проведены эксперименты по оптимизации состава ростовых сред, возможности замены сыворотки. В итоге были созданы ферментеры разного объема, основанные на разных принципах, позволяющие нарабатывать от соген миллиграммов до сотен граммов МкАт. Поскольку каждый штамм гибридомы представляет собой индивидуальную линию опухолевых клеток, имеющую свой, отличный от остальных гибридом, генотип, для них харктерен чрезвычайно широкий спектр ростовых характеристик. Многие гибридомные штаммы с успехом были адаптированы к поддержанию в условиях массовых культур в ферментерах. Часть гибридомных штаммов не удается адаптировать к росту in vitro несмотря на оптимизацию всех условий культивирования Именно для таких штаммов сохраняется необходимость пассирования на животных. При этом эффективность прививок опухолевых клеток, количество асцита, получаемого от одного животного и концентрация Ig в нем являются важнейшими показателями, а сгратетия состоит в максимальном снижении числа животных, необходимых для наработки нужного количества МкАт [118].

Принципиально новым подходом к получению моноклональных реагнегов явилось создание методами генной инженерии фрагмнентов Ig, включающих антшен-распознающий участок. Разработка таких реагентов в первую очередь диктуется интересами фармацевтических компаний, поскольку на их основе создают препараты для иммунотерапии [142]. В то же время рекомбинантные фрагменты антител полезны для исследования функций клеточных рецепторов и других биологических молекул, а также могут применяться в иммуноанализе. Первыми шагами на пути создания технологии, позже получившей название "phage display technology" (технология экспонирования на фаговых частицах), было формирование библиотек генов, кодирующих вариабельные участки молекул антител, а гакже использование полимеразной цепной реакции (PCR) для и\ амплификации [167]. В 1990 году было показано, что фрагменты антител могут бьпь экспонированы на поверхности фатов, если ген, кодирующий участок антигела, присоединен к гену, кодирующему один из поверхностных белков фага. Экспрессия генов фага в клетках E.coli, последущий скрининг и селекция фаговых частиц, несущих "фаговые антитела", затем повторные циклы заражения бактериальных клеток и селекции позволили производить фрагменты антител искомой специфичности.

Таким образом, краткий обзор современного состояния гибридомной технологии, направленной на создание моноклональных реагентов для иммуноанали за, показывает, что выбранные в начале настоящей работы направления совершенствования се, оказались в русле ряда тенденций развития эгой области в течение двух последних десятилетий.