Молекулярно-генетический анализ распространения токсигенной микрофлоры тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, кандидат биологических наук Плугина, Ирина Владимировна

• Плугина, Ирина Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Плугина, Ирина Владимировна

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Систематика семейства Ег^егоЬа^епасеае.

1.2. Факторы патогенности и генетический контроль синтеза энтеротоксинов.

1.3. Классификация и молекулярная организация энтеротоксинов.

1.4. Механизм действия энтеротоксинов

1.5. Методы детекции токсигенной микрофлоры

1.5.1. Методы биологического тестирования энтеротоксинов

1.5.2. Иммунологические методы детекции энтеротоксинов

1.5.3. ДНК-ДНК гибридизация

1.5.3.1. Принцип метода гибридизации. Методы гибридизации

1.5.3.2. Гибридизационные ДНК-зонды

1.5.3.3. Введение метки в нуклеиновые кислоты

1.5.3.4. Способы введения метки в ДНК-зонды

1.5.4. Полимеразная цепная реакция

1.5.4.1. Принцип метода ПЦР

1.5.4.2. Этапы полимеразной цепной реакции

1.5.4.3. Компоненты реакционной смеси ПЦР

1.5.4.4. Условия проведения ПЦР

1.5.4.5. Детекция результатов ПЦР

1.5.4.6. Интерпретация результатов ПЦР

1.5.4.7. Способы повышения чувствительности ПЦР

1.5.4.8. Достоинства метода ПЦР

1.5.4.9. Практическое применение ПЦР при диагностике токсикоинфекций 48 Собственные исследования

2. Материалы и методы

2.1. Оборудование

2.2. Использованные реактивы

2.3. Буферные растворы

2.4. Штаммы и плазмиды

2.5. Питательные среды

2.6. Определение биохимических свойств культур

2.7. Получение биомассы

2.8. Выделение плазмидной ДНК

2.9. Очистка плазмидной ДНК

2.10. Электрофорез ДНК

2.11. Расщепление плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции

2.12. Извлечение ДНК из легкоплавкой агарозы

2.13. Выделение ДНК из агарозных гелей с использованием сорбента С^эМПк

2.14. Генетическая трансформация Е.соН

2.15. Введение биотиновой метки в препараты ДНК

2.16. ДНК-ДНК гибридизация с биотинилированными зондами

2.17. Детекция результатов гибридизации

2.18. Полимеразная цепная реакция

2.19. Подбор оптимальных условий проведения ПЦР

3. Результаты исследований

3.1. Выделение штаммов энтеробактерий, контаминирующих кормосмеси для норок

3.2. Изучение биохимических свойств штаммов и их идентификация

3.3. Определение патогенности изолированных штаммов

3.3.1. Биологические методы тестирования

3.3.1.1. Изучение патогенных свойств подкожным введением

3.3.1.2. Определение наличия токсинообразования

3.3.1.2.1. Определение наличия термостабильного токсина ЭТ

3.3.1.2.2. Определение наличия термолабилыюго энтеротоксина ЬТ

3.3.2. Молекулярно-генетические методы тестирования

3.3.2.1. Конструирование диагностических ДНК-зондов

3.3.2.1.1. Получение зондов на гены отдельных субъединиц термолабильного токсина

3.3.2.1.2. Биотинилирование зондов и определение включения метки

3.3.2.1.3. Получение зонда на полнйразмерный ЬТ-оперон

3.3.2.2. Анализ штаммов на наличие генов токсинообразования

3.3.2.2.1. Оптимизация условий гибридизации

3.3.2.2.2. Изучение распространения генов токсинообразования методом ДНК-ДНК гибридизации

3.3.2.2.3. Определение генов шига-подобных токсинов 8ЬТ1 и БЬТН методом гибридизации с радиоактивным зондом

3.3.2.3. Разработка метода полимеразной цепной реакции для детекции генов токсинообразования у энтеробактерий

3.3.2.3.1. Анализ первичных последовательностей и подбор праймеров

3.3.2.3.2. Оптимизация условий проведения полимеразной цепной реакции

3.3.2.3.3. Изучение распространения генов токсинообразования методом ПЦР

4. Обсуждение результатов

5. Выводы 6. Сведения о практическом использовании результатов

7. Синеок литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетический анализ распространения токсигенной микрофлоры»

Актуальность работы. Диарейные заболевания относятся к числу наиболее распространённых среди людей и животных и создают одну из серьёзнейших проблем современной медицины и ветеринарии. Возбудителями диареи могут быть различные микроорганизмы, но чаще всего заболевание вызывается токсигенными энтеробактериями. Заражение происходит перорально. Факторами передачи бактерий являются инфицированные продукты и вода [Бондаренко, 1987; Guth, Pickett, 1986]. Наиболее восприимчивыми к токсикоинфекциям являются дети младшего возраста и молодняк сельскохозяйственных животных. Диарейные заболевания распространены и в клеточном звероводстве, являясь основной причиной повышенного отхода молодняка пушных зверей и ослабления иммунной системы организма.

Проблема острых кишечных инфекций до настоящего времени остаётся одной из важнейших в инфекционной патологии пушных зверей. Отмечается возрастающий удельный вес заболеваний, вызываемых бактериями сем. Enterobacteriaceae, относящихся к группе условно-патогенных микроорганизмов [Бондаренко, 2002; Зенин-Бермес, 1985; Канарейкина и др.,1981]. Детекция энтеробактерий, продуцирующих термолабильный и термостабильные энтеротоксины, ответственных за диарейный компонент при острых кишечных инфекциях, является одной из важнейших задач, направленных на повышение эффективности диагностики диарейных заболеваний.

Термолабильный (LT) и термостабильные (ST) энтеротоксины, синтез которых кодируется плазмидами [Dallas et al., 1980; So et al., 1980; Moseley et al., 1983], поражают органы пищеварения, выделения и активизируют других возбудителей диарей. Способность продуцировать энтеротоксины передаётся представителям других родов энтеробактерий. Поэтому важным этапом борьбы с энтеротоксигенными бактериями является разработка эффективных методов обнаружения как токсигенных микроорганизмов, так и продуцируемых ими токсинов.

Для обнаружения токсигенной микрофлоры используют два принципиальных подхода: либо поиск самого токсина, либо поиск генетических детерминант, ответственных за его продукцию бактериальной клеткой. Стандартный биологический метод, используемый для детекции энтеротоксигенных штаммов, позволяет определить биологически активный токсин. В последнее время широкое распространение получили молекулярно-генетические методы, позволяющие обнаружить генетические детерминанты, отвечающие за продукцию токсинообразования [Moseley et al.,1982; Кафтырева и др., 2004]. Такими методами являются ДНК-ДНК гибридизация и полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Всё это делает актуальным как изучение распространения энтеротоксигенных штаммов в патологическом материале, кормосмесях для пушных зверей, объектах окружающей среды, так и разработку методов их обнаружения.

Цель исследования. Целью данного исследования является изучение распространения генов токсинообразовании в популяциях энтеробактерий, изолированных из кормов и патологического материала, полученного от пушных зверей зверохозяйств, изучение частоты встречаемости различных типов энтеротоксинов и проведение сравнительного анализа эффективности методов индикации токсигенной микрофлоры.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Выделить из кормов пушных зверей и патологического материала бактерии, принадлежащие к сем. Еп1егоЬас1епасеае, и провести их идентифицикацию.

2. Провести тестирование энтеробактерий на способность к токсинообразованию с использованием биологического метода.

3. Сконструировать биотинилированные зонды на основе фрагментов генов токсинообразования ЬТ, БТа и БТЪ для детекции потенциальных возбудителей токсикоинфекций, подобрать оптимальные условия гибридизации и провести скрининг штаммов лабораторной коллекции на наличие генов токсинообразования методом дот-блот гибридизации.

4. Подобрать нуклеотидные праймеры для детекции генов токсинообразования ЬТ, ЭТа и ЭТЬ методом полимеразной цепной реакции, подобрать оптимальные условия проведения ПЦР и проанализировать коллекцию штаммов, изолированных из кормов и патологического материала, на наличие генов токсинообразования методом ПЦР,

5. Провести сравнительный анализ эффективности методов индикации токсигенной микрофлоры.

Научная новизна исследования состоит в том, что:

- впервые изучен с качественной и количественной сторон видовой состав энтеробактерий, изолированных из кормов пушных зверей, и определена частота встречаемости представителей сем. Еп1егоЬас1епасеае;

- впервые исследована репрезентативная коллекция штаммов, выделенных из кормов и патологического материала, на наличие энтеротоксинов;

- впервые установлены типы токсинов, встречаемые в кормах и патологическом материале, с привлечением самых современных молекулярно-генетических методов.

Практическая ценность работы.

Практическая ценность состоит в том, что определён видовой состав микрофлоры, обсеменяющей кормосмеси пушных зверей, разработаны методы ДНК-гибридизации на основе сконструированных нами генно-инженерным путём нерадиоактивных зондов для определения генов токсинообразования. При разработке ПЦР-метода для детекции энтеротоксигенных штаммов, нами подобраны праймеры, позволяющие амплифицировать фрагменты ДНК, соответствующие ЬТ, БТа, БТЬ токсинам энтеробактерий.

Основные положения, выносимые на защиту

- изучение видового состава энтеробактерий, обсеменяющих кормосмеси пушных зверей,

- разработка молекулярно-генетических методов детекции энтеротоксигенных штаммов на основе ДНК-гибридизации и полимеразной цепной реакции,

- скрининг коллекции энтеробактерий молекулярно-генетическими методами и проведение сравнительного анализа эффективности методов детекции токсигенной микрофлоры.

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Плугина, Ирина Владимировна

5. Выводы

1. Качественный и количественный анализ бактериальной обсеменённости свежеприготовленного корма для пушных зверей показал обсеменённость в пределах 7,8 млн. микробных тел на 1 г корма.

На долю энтеробактерий приходится 31,3%, которые представлены следующими родами: Enterobacter - 31,6%, Citrobacter - 20,6%, Proteus - 15,5%, Hafnia - 13,5%, Escherichia - 8,1%, Salmonella - 5,8%, Serratia - 2%, Kluyvera- 2%, Klebsiella - 1%.

Наиболее часто встречаемыми в кормах являются бактерии рода Enterobacter (31,1%), причём из них отмечаются 2 вида - Enterobacter cloacae (16,2%) и Enterobacter agglomerans (14,4%), а также Citrobacter freundii -19,2%, Hafnia alvei - 10,8%, Proteus vulgaris - 9%, Escherichia coli - 7,2%.

2. Установлено, что в абиотических условиях признак токсинообразования у микроорганизмов встречается редко. Из 310 штаммов, выделенных из кормов, достоверная токсигенность определена для одного штамма (STa), что составляет 0,3 %, в то время как у штаммов, выделенных из патологического материала, обнаружено 25 токсигенных культур, что составляет 14,2%, причём на долю LT-продуцентов приходится только 4% штаммов, STa -продуцентов - 3,4 %, STb - 2,3%, имеют оба гена термостабильного токсина STa+ STb - 2,3% штаммов, 1,1% - сочетание генов LT+STb, а 1,1% - сочетание трёх генов токсинообразования LT+ STa+ STb в одном штамме.

3. Методами ДНК-ДНК гибридизации и ПЦР показано отсутствие генов, кодирующих шигаподобпые токсины I и II типов, как в кормосмесях, так и в патологическом материале, изолированном от пушных зверей.

4. Сравнительный анализ эффективности различных методов обнаружения токсигенных бактерий и продуцируемых ими энтеротоксинов показал, что наиболее объективным и точным является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который можно рекомендовать при исследовании кормов и патологического материала.

6. Сведения о практическом использовании результатов исследования.

На основании проведенных исследований разработан «Регламент применения ПЦР-диагностикума для определения токсигенных эшерихий, продуцирующих цитотонические токсины», который был обсужден и одобрен на заседании секции пушного звероводства и кролиководства Россельхозакадемии (протокол № 4 от 18 июля 2000 г.).

ПЦР-диагностикум может быть использован для обнаружения термолабильного и термостабильных токсинов энтеробактерий при исследовании патологического материала, кормов, объектов окружающей среды и при прижизненной экспресс-диагностики токсикоинфекций.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Плугина, Ирина Владимировна, 2004 год

1. Алмагамбетов К.Горская Е.М., Бондаренко В.М. Транслокация кишечной микрофлоры и ее механизмы // Журн. микроб., эпидем., иммун. 1991. - № 10. -С. 74-78.

2. Бондаренко В.М. Токсические биомолекулы патогенных энтеробактерий // Аграрная Россия. 2002. - № 2 - С. 29-32.

3. Бондаренко В.М. "Острова" и "островки" патогенности бактерий // Аграрная Россия. 2002. - № 2. - С. 33 -35.

4. Бондаренко В.М. Мавзютов А.Р., Габидуллин З.Г. Термостабильные энтеротоксины условно патогенных представителей Enterobacteriaceae // Журн. микроб., эпидем., иммун. 1998. - № 3. - С. 104-107.

5. Бондаренко В.М., Мавзютов А.Р. Ингибиторы полимеразной цепной реакции // Генодиагностика инфекционных заболеваний, 4 Всеросс. Науч.-практич. конфер. 2002. — С.399-402.

6. Бондаренко В.М., Мавзютов А.Р. Секретируемые факторы патогенности энтеробактерий // Микробиология. 2002. - № 1. - С. 84-90.

7. Бондаренко В.М., Тимофеева И.Т., Степанова М.В., Вертиев Ю.В. О значимости высеваемости клебсиелл, энтеробактер, цитробактер и кишечных иерсиний при бактериологических исследованиях // Журн. микроб., эпидем., иммун. 1987. - № 6. - С. 74-78.

8. Бондаренко В.М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса// Микробиология. 1999. - № 5. - С. 34-39.

9. Боровой В.Н., Терехов В.И., Шпонько Ю.Б. Генодиагностика патогенных эшерихий в Краснодарском крае // Генодиагностика инфекционных заболеваний, 4 Всеросс. Науч.-практич. конфер. 2002. - С.323-324.

10. Бухарин О.В, Туйгунов М.М., Зурочка A.B., и др. Феномен апоптоза в выживании энтеробактерий в системе паразит хозяин // Журн. микроб., эпидем., иммун. - 2002. - № 1. - С. 79-81.

11. Вартанян Ю.П. Методы биологического тестирования энтеротоксинов // Журн. микроб., эпидем., иммун. -1981. № 3. - С. 19-24

12. Вартанян Ю.П., Северцова М.К., Введенская О.И., Станиславский Е.С. Отёк лап белых мышей тест для оценки активности энтеротоксинов E.coli // Бюл. экспер. биол. - 1978. - № 2. - С. 150-152.

13. Вартапетян А. Б. Полимеразная цепная реакция // Молекулярная биология. -1991. т.25.- № 4. - С. 926-936.

14. Вертиев Ю.В. Бактериальные токсины: биологическая сущность и происхождение // Журн. микроб., эпидем., иммун. 1996. - №3. - С. 43-46.

15. Вертиев Ю.В., Шагинян И.А., Степанова М.В. Определение токсигенности штаммов кишечной палочки и холерного вибриона радиоиммунологическим методом // Молек. ген. микробиол. и вирусол. 1985. - № 3. - С.38-40.16