Поли- и моноклональные антитела в анализе гуморального иммунного ответа, структуры и функциональных свойств иммуноглобулинов животных тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, доктор биологических наук Верховский, Олег Анатольевич

• Верховский, Олег Анатольевич
• доктор биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации доктор биологических наук Верховский, Олег Анатольевич

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Иммунная система: основные понятия.

2.2. Иммуноглобулины и гуморальный иммунный ответ: теоретические основы.

2.3. Развитие и совершенствование методов иммуноанализа на основе поли- и моноклональных антител.

2.4. Использование антител в клинической практике: стратегия антительной терапии.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1. Выделение, очистка, идентификация иммуноглобулинов и их фрагментов.

4.1.1. Выделение и очистка ^ хроматографическими методами.

4.1.2. Идентификация иммуноглобулинов свиньи и собак.

4.1.3. Выделение и идентификация тяжелых цепей иммуноглобулинов.

4.1.4. Выделение и идентификация Р(аЬ)2- и Рс- фрагментов иммуноглобулинов.

4.2. Получение поли- и моноспецифических антисывороток.

4.3. Получение моноклональных антител заданной специфичности.

4.3.1. Иммунизация мышей и слияние клеток с помощью полиэтиленгликоля.

4.3.2. Скрининг гибридом на продукцию МкА.

4.3.3. Клонирование гибридом.

4.3.4. Перевод гибридом в массовую культуру и получение асцитов.

4.4. Иммунохимическая характеристика моноклональных антител.

4.4.1. Определение изотипа моноклональных антител.

4.4.2. Определение активности и специфичности моноклональных антител.

4.4.3. Определение эпитопной специфичности моноклональных антител методом иммуноблоттинга.

4.4.4. Анализ перекрестной специфичности моноклональных антител.

4.4.5. Очистка моноклональных антител из мышиных асцитов и синтез иммунопероксидазных конъюгатов.

4.5. Использование моноклональных антител в качестве иммунодиагностических реагентов.

4.6. Эпитопное картирование у1-цепей свиньи с помощью моноклональных антител.

4.7. Оценка гуморального иммунного ответа и изотипического распределения антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ВТГС) в секретах молочных желез иммунных свиноматок.

4.7.1. Количественное определение уровня иммуноглобулинов и специфических антител в секретах свиноматок.

4.7.2. Анализ изотипического распределения антител к ВТГС в секретах молочных желез иммунных свиноматок.

4.7.2.1. Роль и его субизотипов в иммунном ответе к ВТГС.

4.7.2.2. Значение э^А и ^М в иммунном ответе к ВТГС.

4.7.2.3. Распределение (к) и (А,) в иммунном ответе к ВТГС.

4.8. Количественная характеристика иммуноглобулинов сыворотки крови собак при демодекозе и дерматитах.

4.9. Разработка и использование методов иммуноанализа для диагностики инфекционного гепатита плотоядных и анализ соотношения титр вируса/титр специфических антител в сыворотках крови спонтанно инфицированных собак.

4.9.1. Разработка непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к гексону САУ-1.

4.9.2. Получение и иммунохимическая характеристика МкА к структурным белкам САУ-1.

4.9.3. Разработка «сэндвич»-ИФА на основе полученных полии моноклональных антител для детекции гексона САУ-1.

4.9.4. Определение и анализ соотношения титр вируса/титр специфических антител в сыворотках крови спонтанно инфицированных САУ-1 собак.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Поли- и моноклональные антитела в анализе гуморального иммунного ответа, структуры и функциональных свойств иммуноглобулинов животных»

Бурное развитие научных и научно- прикладных направлений иммунологии и молекулярной биологии коренным образом изменило методологические подходы в разработке диагностикумов и вакцин нового поколения. К середине 1980-х годов новые идеи в иммунодиагностике и иммунопрофилактике были подготовлены прогрессом в изучении элементарных единиц иммунологической активности, что привело к материализации антигенной детерминанты, или эпитопа, как простейшей структуры, определяющей иммунологические свойства белка. Такой прогресс был обусловлен существенным расширением возможностей молекулярной иммунологии, базирующейся ныне целиком на использовании моноклональных антител и синтетических пептидов [9, 13, 38]. Развитие новых терапевтических подходов к предупреждению инфекционных заболеваний, изучение механизмов иммунологической защиты животных и взаимоотношений между различными клетками иммунной системы неразрывно связаны с разработкой и внедрением новых методов и технологий, в основе которых лежат современные представления об эффекторных механизмах иммунитета, среди которых главное место занимает отношение в системе антиген-антитело [1, 53].

Для проведения разноплановых исследований необходим выбор одной из двух форм антительных реагентов: поликлональные антисыворотки или моноклональные антитела (МкА). Препараты и тех и других получают различными путями с различной целью; выбор между ними осуществляется не произвольно, а в большей степени зависит от соответствия специфичности антител требованиям теста [35, 39,48, 51].

Природа антисывороток ограничивает их использование в иммунологических тестах. Поликлональные антитела образуются в результате функционирования многочисленных клеточных клонов и, следовательно, гетерогенны на самых разных уровнях: по изотипу антител, их специфичности, активности и аффинности. Из одной и той же антисыворотки можно приготовить препарат, содержащий антитела к множеству отдельных антигенов (полиспецифичность), антитела к небольшому числу антигенов (олигоспецифичность) или антитела к одному единственному антигену (моноспецифичность). Но даже в последнем случае антитела не являются гомогенными, поскольку иммуноген представляет собой полидетерминантную структуру, стимулирующую образование поликлональных, направленных к различным детерминантам антител, причем нередко относящихся к разным изотипам [94]. Кроме того, в процессе формирования гуморального иммунного ответа, на индивидуальный эпитоп антитела продуцируются многочисленными клонами клеток, и таким образом за один и тот же эпитоп могут конкурировать антитела с разной аффинностью. Поэтому, в каждом отдельном случае необходимо оценивать пригодность антисыворотки для того или иного иммунологического теста. Низкое содержание специфических антител в неочищенной антисыворотке (20- 30% от общего количества Ig) снижает ее эффективность в одних тестах и может приводить к повышению фоновых значений в других. В связи с поликлональной полиспецифической природой обычных антисывороток их очистка до той степени специфичности, которая необходима для выявления отдельных структур и антигенных различий между молекулами на уровне индивидуального эпитопа, представляется практически невозможной задачей [2].

Разработанный Келлером и Милыптейном (1975) метод получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела заданной специфичности, открыл новую эру в биологической науке. С тех пор моноклональные антитела завоевали прочные позиции в качестве мощного инструмента исследований в молекулярной биологии, генетике, медицине и ветеринарии. Гибридомная биотехнология является примером не только очень быстрого внедрения науки в практику, но и продолжающегося одновременного развития фундаментальных научных исследований, причем на качественно новом уровне.

Секретируемые гибридомными клетками антитела гомогенны по специфичности, аффинности и изотипу. Образуемые in vitro МкА преобладают (или оказываются единственным белком) в культуральной среде. Являясь реагентами направленного действия, моноклональные антитела позволяют идентифицировать отдельные эпитопы в сложных композициях антигенных структур [188, 189, 192, 193].

Область применения МкА быстро расширяется, поскольку все больше ученых, работающих в разных лабораториях, убеждается в их преимуществах и овладевает методами их получения. Ряд фирм уже предлагают коммерческие препараты МкА для приобретения, что очень важно прежде всего для специалистов, работающих в области иммунологии, вирусологии и микробиологии, где преимущества МкА воплощены в разработанных тест-системах широкого спектра [30,121,191,199].

Особая ценность МкА предопределяет их использование для проведения исследований различных антигенов, где их чувствительность и специфичность способствуют решению множества проблем, которые не могут быть решены с помощью поликлональных реагентов. Моноклональные антитела способны значительно упростить многие тесты и значительно расширить число тестируемых молекул.

Вместе с тем, потребность в полиспецифических преципитирующих антисыворотках, равно как и значение самих методов, связанных с иммунопреципитацией, в связи с разработкой технологии получения и расширением областей применения моноклональных антител, не снижается.

В настоящее время современные методы иммунохимического анализа, основанные на применении как поли- так и моноклональных антител, широко используются в диагностике инфекционных и паразитарных болезней, онкологической, сердечно-сосудистой и другой патологии. Как в медицине, так и в ветеринарии, особая роль при этом отводится углубленной характеристике иммунного статуса здоровых и больных людей и животных. В связи с этим, возникает необходимость разработки разноплановых диагностических тест-систем на основе МкА для оценки распределения изотипов/субизотипов иммуноглобулинов в иммунном ответе и ¿для эпитопного картирования субъединиц ^'э, что представляет значительный интерес не только в прикладных аспектах, но и для фундаментальной науки в целом [3, И, 12, 34,77, 84,107,131,141,167,170,173].

Анализ гуморальных факторов иммунного ответа играет важную роль в диагностике и анализе иммунологической недостаточности и напрямую связан с определением количественных соотношений иммуноглобулинов и распределением изотип/субизотип-специфических антител в биологических жидкостях организма. Несмотря на то, что за последние годы сделаны значительные успехи в изучении иммуноглобулинов, остаются недостаточно рассмотренными вопросы, связанные с изучением эпитопной структуры ^ и их субъединиц, иммунохимической природы специфических антител и их функциональных свойств у многих видов животных.

Получению поли- и моноклональных антител к различным изотипам/субизотипам и их структурным субъединицам, разработке иммунохимических методов на их основе и применению этих методов для оценки иммунологического состояния организма на различных этапах онто- и иммуногенеза, характеристики гуморального иммунного ответа и изучения роли иммунных реакций в патогенезе инфекционных и инвазионных заболеваний животных и при контроле традиционных и разрабатываемых вакцин и посвящена данная работа.

Цель работы.

Анализ гуморального иммунного ответа на основе оценки изотип-/субизотип-специфического распределения антител и/или количественного определения уровня иммуноглобулинов в биологических жидкостях свиней и собак на примере ряда болезней инфекционной и неинфекционной этиологии, а также при определении антигенных и иммуногенных свойств вакцинных препаратов. Изучение и характеристика эпитопов иммуноглобулинов свиньи и некоторых других видов животных и человека.

Основные задачи исследований.

1. Унифицировать методы выделения, очистки и идентификации различных изотипов иммуноглобулинов животных и их структурных субъединиц.

2. Получить панель поли- и моноклональных антител к различным изотипам и легким цепям иммуноглобулинов свиньи и собак. Дать иммунохимическую характеристику полученным и имеющимся в нашем распоряжении антителам и испытать их в качестве иммунодиагностических реагентов.

3. Разработать и внедрить в ветеринарную практику тест- системы на основе различных вариантов ИФА и РИД с использованием поли- и моноклональных антител для выявления и количественной оценки иммуноглобулинов различных изотипов в биологических жидкостях организма животных.

4. Изучить общие (межвидовые) эпитопы иммуноглобулинов животных и человека, провести исследования по эпитопному картированию у1- цепи 1^01 свиньи и детально охарактеризовать специфичность формирующих ее эпитопов.

5. Провести анализ распределения в гуморальном иммунном ответе изотип-специфических антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ВТГС) в секретах молочных желез супоросных свиноматок после иммунизации ассоциированной вакциной против трансмиссивного гастроэнтерита, ротавирусной инфекции и колибактериоза, а также изучить их роль в формировании лактогенного иммунитета у новорожденных.

6. Провести количественную оценку уровня ^М и ^А в сыворотке крови собак при демодекозе, дерматитах неинфекционной и непаразитарной этиологии в сравнении с показателями уровня иммуноглобулинов у здоровых животных.

7. Используя поли- и моноклональные антитела к основным структурным белкам аденовируса собак 1 серотипа (САУ-1), сконструировать диагностические иммуноферментные тест- системы, предназначенные для одновременной детекции гексона САУ-1 и антител к нему и с их помощью изучить взаимосвязь в цепи вирус- гуморальный иммунный ответ.

Научная новизна работы.

Получены и охарактеризованы моноклональные антитела к ^О, ^01, ^М, в^А, к- и Х- легким цепям ^ свиньи, а также охарактеризованы МкА, направленные к различным изотипам ^ крупного рогатого скота и человека. На гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к ^М и Ь- цепям ^ свиньи получены Патенты РФ: № 2093572 «Штамм гибридных культивируемых клеток Мш.тшоЛш Ь., используемый для получения моноклональных антител к Ь-цепям иммуноглобулинов свиньи», № 2093573 «Штамм гибридных культивируемых клеток Мт.тизсиЫз Ь., используемый для получения моноклональных антител к ^М свиньи» и № 2093574 «Штамм гибридных культивируемых клеток Миз.ппшсЫш Ь., используемый для получения моноклональных антител к 1^0 свиньи» от 20 октября 1997 г.

С использованием полученных и охарактеризованных поли- и моноклональных антител к различным изотипам/субизотипам и легким цепям иммуноглобулинов свиньи и собак разработано девять диагностических тест- систем на основе различных вариантов ИФА и РИД.

Впервые проведено эпитопное картирование у1- цепи ^01 свиньи и детально охарактеризована специфичность семи ее эпитопов.

Показана принципиальная возможность использования моноклональных антител к межвидовым эпитопам иммуноглобулинов или их структурных субъединиц для разработки разноплановых иммунохимических методов (различные варианты ИФА и РИД) по выявлению специфических антител и/или количественному определению уровня ^ в биологических жидкостях организма нескольких видов животных и человека.

Впервые изучена роль антител, содержащих различные типы легких цепей, в формировании иммунитета слизистых при трансмиссивном гастроэнтерите свиней и проведен анализ распределения (к)- и (к)- антител в иммунном ответе к ВТГС.

Получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к основным структурным белкам САУ-1 и на основе МкА разработаны тест- системы с использованием различных вариантов ИФА для диагностики инфекционного гепатита плотоядных и изучения гуморальных факторов иммуногенеза при данном заболевании. На «Штамм гибридных клеток Мш.тшаиш Ь., продуцирующий моноклональные антитела к гексону аденовируса собаки первого серотипа (САУ-1) получен Патент РФ № 2095411 от 10 ноября 1997 г.

Получены новые данные по количественной характеристике ^О, ^М и 1§А в сыворотке крови собак при различных формах демодекоза и дерматитах неинфекционной и непаразитарной этиологии.

Практическая значимость исследований.

Материалы исследований по получению, характеристике и использованию поли- и моноклональных антител к различным изотипам ^ животных вошли в нормативно-техническую документацию (НТД) на:

Набор компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях свиней методом радиальной иммунодиффузии» ТУ № 93880038-00008064-96; Временное наставление по применению № 13-7-2/618. Утв. Департаментом ветеринарии МСХиП РФ от 27.05.96.;

Набор компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методом радиальной иммунодиффузии» ТУ № 9388-0039-00008064-96; Временное наставление по применению № 13-7-2/617. Утв. Департаментом ветеринарии МСХиП РФ от 27.05.96.

На примере ряда болезней инфекционной и неинфекционной этиологии, а также при определении антигенных и иммунногенных свойств вакцинных препаратов, показана возможность использования препаратов поли- и моноклональных антител для иммунодиагностики и оценки изотип-/субизотип- специфического распределения антител и/или количественного определения уровня иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных.

Результаты научных исследований использованы при оформлении НТД и выпуске коммерческих иммунотерапевтических и иммуномодулирукяцего препаратов:

Сыворотка против парвовирусного энтерита и чумы плотоядных гипериммунная» ТУ № 08064-19-66-95; Наставление по применению № 13-4-2/405. Утв. Департаментом ветеринарии МСХиП РФ от 28.09.95.;

Гамма- глобулин (иммуноглобулин) против парвовирусного энтерита и чумы плотоядных» ТУ № 9382-08-11472788-96; Временное наставление по применению № 13-42/739. Утв. Департаментом ветеринарии МСХиП РФ от 16.08.96.;

Препарат "Риботан" для регуляции иммунной системы организма животных (иммуномодулятор)» ТУ № 9365-082-95; Временное наставление по применению № 134-2/496. Утв. Департаментом ветеринарии МСХиП РФ от 28.12.95.

Положения, выносимые на защиту.

Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:

Получение, иммунохимическая характеристика поли- и моноклональных антител к иммуноглобулинам животных и их использование в качестве иммунодиагностических реагентов в разработанных тест- системах на основе различных вариантов ИФА и РИД;

Определение роли изотипов, субизотипов, к- и А,- цепей иммуноглобулинов в формировании гуморального иммунного ответа на иммуногены различной природы у свиней и собак;

Характеристика эпитопов иммуноглобулинов и их структурных субъединиц.

Апробация работы.

Основные результаты работы доложены на:

• Пленарном заседании секции «Биохимия сельскохозяйственных животных» Московского отделения Всесоюзного Биохимического общества АН СССР, 1991 г.;

• Международном симпозиуме по молекулярной генетике и биотехнологии (С.-Петербург, Пушкин, 1994 г.);

• 4 Международном симпозиуме по ветеринарной иммунологии (Дэвис, США, 1995 г.);

• 9 Международном конгрессе по иммунологии (Сан-Франциско, США, 1995 г.);

• Европейской школе по иммунологии (Прага, Чехия, 1995 г.);

• Заседании секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН, (Москва, 1995 г.);

• Итоговом годичном собрании Отделения ветеринарной медицины РАСХН, (Москва, 1996 г.);

• Углубленном курсе и симпозиуме по иммунологии (Пекин, Китай, 1996 г.);

• Межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ, 1998 г.

Результаты исследований по отдельным разделам работы были рассмотрены и опубликованы в материалах 3 Международного симпозиума по ветеринарной иммунологии (Будапешт, Венгрия, 1993 г.); 4 Международном симпозиуме по ветеринарной иммунологии (Дэвис, США, 1995 г.); 9 Международном конгрессе по иммунологии (Сан-Франциско, США, 1995 г.);8 Международного симпозиума по ветеринарной лабораторной диагностике (Иерусалим, Израиль, 1996 г.); 1 Конгресса Федерации иммунологов стран Азии-Океании (Аделаида, Австралия, 1996 г.); 13 Европейского симпозиума по иммунологии (Амстердам, Нидерланды, 1997 г.); 4 Конгресса по ветеринарной вирусологии (Эдинбург, Шотландия, 1997 г.), а также в материалах международных симпозиумов и конференций, проводимых в России и странах СНГ (1990- 1997 гг.).

По теме диссертации опубликовано 49 научных работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 258 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований и их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы и приложения. Материалы диссертации иллюстрированы 57 рисунками и 27 таблицами. Список литературы включает 334 источника ( 56 отечественных и 278 зарубежных авторов).

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Верховский, Олег Анатольевич

6. выводы

1. Унифицированы методы выделения и очистки различных изотипов иммуноглобулинов животных и их структурных субъединиц. Получены и охарактеризованы иммунохимически чистые препараты 1^01,1§02, ^М и э^А свиней и собак, у1- цепи свиньи, Р(аЬ)2- и Бс- фрагменты мыши.

2. Получено 22 гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к иммуноглобулинам и легким цепям ^ свиньи. Разноплановыми иммунохимическими методами определена аффинность, специфичность и перекрестная реактивность полученных МкА. Установлено, что охарактеризованная панель моноклональных антител позволяет распознавать изотип- специфические эпитопы, локализованные на молекулах ^О всех субизотипов, субизотипические эпитопы у1- цепей 1^01, эпитопы специфичные для ^М, б^А, к- и Х- легких цепей ^ свиньи.

3. Проведен анализ специфичности и перекрестной реактивности моноклональных антител ^О, и э^А крупного рогатого скота и к ^М человека. С помощью панели охарактеризованных МкА изучены общие (межвидовые) эпитопы иммуноглобулинов животных и человека. Показана принципиальная возможность использования МкА к межвидовым эпитопам для разработки разноплановых иммунохимических методов для выявления специфических антител и/или количественного определения уровня ^ в биологических жидкостях нескольких видов животных и человека.

4. С помощью иммуноблоттинга установлена локализация и структура эпитопов нативных молекул иммуноглобулинов и их субъединиц (тяжелых и легких цепей), с которыми специфически взаимодействуют МкА. На основе моноклональных антител синтезированы иммунопероксидазные конъюгаты, высокоаффинные МкА использованы для разработки разноплановых тест-систем.

5. Получены и охарактеризованы моноспецифические антисыворотки к свиньи и собак и моноспецифическая антисыворотка к ^А собак. Предложены тест-системы на основе РИД для выявления и количественной оценки иммуноглобулинов данных изотипов в биологических жидкостях организма животных.

6. Получено шесть гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к основным структурным белкам аденовируса собак 1 серотипа. С использованием иммуноблоттинга, ИФА, РДП, РТГА и РН определена специфичность и активность полученных МкА. С помощью моноклональных антител идентифицированы и охарактеризованы конформационные эпитопы гексона и конформационные и линейный эпитопы отростка пентона С АУ-1.

7. На основе моноклональных антител для анализа гуморального иммунного ответа разработаны следующие тест- системы:

• РИД для количественного определения уровня в биологических жидкостях организма свиней и собак (на основе МкА №4);

• РИД для количественного определения уровня э^А в секретах свиней (на основе МкА 9Е7);

• «Сэндвич»- ИФА для количественного определения уровня ^О и 1^01 в биологических жидкостях организма свиней (на основе МкА 6С5, 2Р1,4Н12 );

• Непрямой ИФА по выявлению изотип/субизотип- специфических антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней в секретах молочных желез свиноматок (на основе МкА 6С5, 4Н12, 1Р4, 9Е7,4ЕЗ, 7В9, меченых пероксидазой);

• Конкурентный ИФА для эпитопного картирования у1- цепей ^ свиньи (на основе 11 МкА меченых пероксидазой);

• «Сэндвич»- ИФА для детекции гексона аденовируса собак 1 серотипа и диагностики инфекционного гепатита плотоядных (на основе МкА 4В6-С8).

8. Проведены исследования по изучению антигенной структуры у1- цепи свиньи и индивидуальных свойств формирующих ее эпитопов. Определена эпитопная карта антигенного участка у1- цепи, в состав которого входят 7, различных по своим свойствам, эпитопов. По результатам эпитопного картирования отобраны МкА к топографически удаленным эпитопам у1- цепи и на их основе разработан «сэндвич»- ИФА для выявления и количественного определения уровня 1^01 в биологических жидкостях организма свиньи.

9. Проведен анализ распределения в гуморальном иммунном ответе изотип-специфических антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней в секретах молочных желез супоросных свиноматок после иммунизации ассоциированной вакциной против трансмиссивного гастроэнтерита, ротавирусной инфекции и колибактериоза, а также изучена их роль в формировании лактогенного иммунитета у новорожденных поросят. Установлено, что двукратная вакцинация ассоциированной вакциной ведет к достоверному повышению в секретах молочных желез свиноматок как вирус-специфических антител, так и общего уровня 1§0, э^А и ^М. Показано, что основным суб-изотипом в молоке и молозиве свиноматок является

10. Впервые изучена роль антител, содержащих различные типы легких цепей, в формировании иммунитета слизистых при трансмиссивном гастроэнтерите свиней. Установлено, что ведущая роль в гуморальном иммунном ответе к ВТГС принадлежит высокоаффинным антителам, имеющим в своем составе к - цепи. При этом, соотношение к: X цепей в молозиве и молоке вакцинированных животных составило 57:43, 55:45, а в молозиве и молоке контрольных свиноматок 60:40, 57:43 соответственно.

11. Определено содержание ^О, и ^А в сыворотке крови клинически здоровых собак, которое у взрослых животных составляет 11.92 ± 1.82, 2.50 ± 0.17 и 0.77 ± 0.10 мг/мл соответственно. При этом установлено, что с возрастом животных происходит увеличение количества ^О и ^А и снижение концентрации ^М. В сыворотке крови щенков уровень иммуноглобулинов данных изотипов соответственно составляет 6.50 ± 1.16, 0.42 ± 0.06 и 2.94 ± 0.25 мг/мл.

12. Проведена количественная оценка уровня ^М и ^А в сыворотке крови собак при демодекозе, дерматитах неинфекционной и непаразитарной этиологии в сравнении с показателями уровня иммуноглобулинов у здоровых животных. Установлено, что при демодекозе и дерматитах у собак наблюдается снижение уровня сывороточного 1§А и увеличение концентрации При этом у больных демодекозом животных содержание указанных классов иммуноглобулинов в сыворотке крови зависит от возраста и степени демодекозной инвазии.

13. Предложены методы иммуноанализа («сэндвич»- и непрямой- ИФА), позволяющие осуществлять диагностику инфекционного гепатита плотоядных на основе выявления гексона и антител к нему, а также оценку гуморальных факторов иммуногенеза в постинфекционный и поствакцинальный периоды.

Заключение

В ветеринарии, также как и в медицине, с появлением гибридомной технологии и методов молекулярного клонирования, развиваются новые методы иммуноанализа с использованием большого числа новых иммунологических реагентов, что дает возможность ветеринарным иммунологам проводить достоверную оценку и анализ иммунологических процессов, возникающих в организме животных в ответ на иммуногены различной природы.

Крупные достижения в развитии теоретической и прикладной иммунологии и прогресс в области биотехнологии, привели с созданию самостоятельного направления на стыке этих дисциплин, получившего название «иммунная биотехнология», существом которого является наработка и использование для профилактических, лечебных, диагностических, а также технологических целей действующих начал, продуктов и производных иммунной системы (Р.В.Петров, 1988). Одной из важнейших составляющих иммунной биотехнологии, имеющих как фундаментальный, так и прикладной характер, является разработка и совершенствование методов иммунохимического анализа.

Настоящая работа является результатом исследований в области ветеринарной иммунной биотехнологии и включает в себя как теоретические, так и практические аспекты, связанные с получением, иммунохимической характеристикой поли- и моноклональных антител к иммуноглобулинам животных и их использованием в качестве иммунодиагностических реагентов в разработанных тест- системах на основе различных вариантов ИФА и РИД. В процессе проведенных исследований определена роль изотипов, субизотипов, к- и Х- цепей иммуноглобулинов в формировании гуморального иммунного ответа на иммуногены различной природы у свиней и собак, дана характеристика эпитопов иммуноглобулинов и их структурных субъединиц.

Таким образом, резюмируя весь изложенный в настоящей работе материал, можно сделать общее заключение о том, что проведенные комплексные исследования позволили научно и экспериментально обосновать перспективные подходы к анализу гуморальных факторов иммунитета с помощью разработанных современных методов иммуноанализа на основе поли- и моноклональных антител. Разработка и совершенствование методов иммунохимического анализа с использованием моноклональных антител предопределяют успехи в: изучении механизмов иммунологического распознавания и презентации антигенов; оценке иммунологического состояния организма на различных этапах онто- и иммуногенеза; характеристике гуморального иммунного ответа и изучении роли иммунных реакций в патогенезе инфекционных и инвазионных заболеваний животных и при контроле традиционных и разрабатываемых вакцин нового поколения; разработке препаратов, регулирующих отдельные звенья иммунной системы; понимании механизмов формирования иммунитета в целом.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Верховский, Олег Анатольевич, 1998 год

1.Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж. и др.-Молекулярная биология клетки М., Мир, 1987, т.5, 12-19.

2. Антитела. Методы./ Под ред. Д.Кэтти.- М., Мир, 1991, 287с.

3. Арсеньева Е.Л.- Антигенная структура L-цепей иммуноглобулинов человека,выявляемая с помощью моноклональных антител. Автореф. дисс.канд. биол. наук, М.,1989, 23с.

4. Башкиров О.Г.- Разработка иммуноферментной тест-системы на основе моноклональных антител для обнаружения ротавируса крупного рогатого скота. Автореф. дисс.канд. биол. наук, М, 1989, 7-8.

5. Верховская Л.В., Уласов В.И., Киселева Е.К. и др. Очистка и свойства гексонового антигена аденовируса собак серотипа CAV-1- Биохимия, 1990,5 (11), 1996-2001.

6. Верховская Л.В.- Изучение антигенов аденовирусов и разработка иммуноферментной диагностики аденовирусных инфекций сельскохозяйственных животных.-Дисс.канд. биол. наук, М., 1992, 152 с.

7. Вирусология/ Под ред. Б.Филдса, Д.Найпа,- М., Мир, 1989, т.1,277-299.

8. Власов H.A., Новиков Б.В., Анохина Е.Г. и др.- Межвидовая перекрестная реактивность моноклональных антител к ИгДжи свиньи.- Тез.докл. научно- практ. конф. «Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии», Покров, 1994, 190-191.

9. Грен Э.Я., Пумен П.П.- Рекомбинантные вирусные капсиды новое поколение иммуногенных белков и вакцин.- Ж. Всесюзн. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева, 1988, т.ЗЗ (5), 531-536.

10. Ю.Грязева И.В., Климович В.Б., Пашкова С.Ф.- Моноклональные антитела к легким цепям иммуноглобулинов человека и их применение в иммуноанализе.- Иммунология, 1994, 3,31-37.

11. П.Егоров A.M.- Современный иммунохимический анализ и перспективы его развития.- Ж. Всесюзн. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева, 1988, т.ЗЗ (5), 494-501.

12. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. и др.- Теория и практика иммуноферментного анализа.- М., 1991,182-186.

13. Иммуноглобулины/Подред. Г. ЛитменаиР. Гуда М., Мир, 1981,235-240.

14. Иммунология/ Под ред. У.Пола.- М., Мир, 1989, т.З., 6-83.

15. Иммунологическая диагностика вирусных инфекций/ Под ред. Т.В.Перадзе и П.Халонена.- М., Медицина, 1985, 302 с.

16. Иммунологические методы/Под ред. Г.Фримеля- М., Медицина, 1987, 20-34.

17. Иммуноферментный анализ / Т.Т.Нго, Г.Ленкофф М., Мир, 1988, 194-198.

18. Исакова В.Р.- Получение и характеристика иммунологической специфичности моноклональных антител против структурных белков аденовирусов.- Автореф. дисс. канд. биол. наук, М., 1990, 24 с.

19. Ищенко Л.М., Балясников Б.И. и др.- Состояние иммунологической реактивности у детей при псориазе.- Сб.статей и тез. докладов: Дерматология и аллергология, Душанбе, 1988, 175-176.

20. Кадыров С.О.- Иммуноглобулины свиньи: ^М, ^А, в^А (выделение, очистка, идентификация, содержание).- Автореф. дисс. канд. биол. наук, М., 1986, 23 с.

21. Клиническая иммунология и аллергология. / Под ред. Л.Йегера.- М., Медицина, 1990, т. 1, 276-304.

22. Коробицын Л.П., Милютина И.В.- Моноклональные антитела в медицинской биотехнологии. Обзорная информация М., ВНИИСЭМТИ, 1988,1,1-36.

23. Кострова О.М., Алешкин В.А.- Иммуноглобулины для профилактики и лечения вирусных инфекций.- Иммунология, 1995,6, 6-11.

24. Крамаренко Е.В., Колганова Е.В., Алексеева Л.П.- Выделение иммуноглобулинов (^О) из асцитической жидкости мышей методом ПЭГ- преципитации и ионообменной хроматографии на БЕЛЕ- Тоуореаг1 650 М.-М., ВИНИТИ, 1990, 2-3.

25. Лимфоциты. Методы / Под ред. Дж. Клауса М., Мир, 1990, 360с.

26. Методические рекомендации по получению гибридом- продуцентов моноклональных антител к бактериальным антигенам / В.В.Свиридов, Г.М.Волгарева, Е.М.Зайцев и др.- М., 1986, 33-34.

27. Макашева Р.К., Кашлаков А.Д.- Клинико- иммунологические показатели у больных с распространенными и частично рецидивирующими формами экземы и нейродермита.- Сб.статей и тез. докладов: Дерматология и аллергология, Душанбе, 1988, 264-265.

28. Малоголовкин С.А., Митин Н.И., Реутова Е.Г.- Об использовании моноклональных антител в ветеринарной медицине и вирусологии (обзор)- С.-х. биология, 1996,2,25-30.

29. Методы исследований в иммунологии / И.Лефковиц, Б.Пернис и др.- М., Мир, 1983,54-59.

30. Мерингова Л.Ф., Евлашев А.Ю., Леонтьева Г.Ф. и др.- Углубленная оценка системного гуморального иммунного ответа при первичной и вторичной экспериментальной гриппозной инфекции.- Иммунология, 1997, 4, 31-36.

31. Моноклональные антитела / Р.Г.Кеннет, Г.Дж.Маккерн, К.Б.Бехтол.- М., Медицина, 1983,15-25.

32. Мисникова М.А., Самострельский А.Ю.- Усовершенствование методики получения моноспецифических антисывороток к растворимым антигенам.- Труды Ленинградского НИИ эпидем. и микробиол. им. Пастера, 1976, 44, 34-37.

33. Новиков В.В.- Характеристика и биотехнология моноклональных антител против лимфоцитарных антигенов. Автореф. дисс. докт. биол. наук, М., 1994,48 с.

34. Новохатский A.C., Малахова И.В., Михеева Т.Г.- Клонирование гибридом методом предельных разведений.- Вопр.вирусол., 1986, 30, 602-608.

35. Петров Р.В.- Иммунология.- М., Медицина, 1982, 368 с.

36. Петров Р.В., Хаитов P.M., Пинегин Б.В.- Иммунодиагностика иммунодефицитов,-Иммунология, 1997, 4, 4-7.

37. Ратнер Г.М.- Поликлональные антитела как реагенты для иммуноанализа: получение, характеристика, применение. Автореф. дисс. докт. мед. наук, Томск, 1996, 45с.

38. Рыбальский Н. Г., Серова М.А.- Гибридомная технология. Обзорная информация М., ВНИИПИ, 1987, 5-10.

39. Сергеев В.А., Рухадзе Г.Г., Алипер Т.И. и др.- Получение концентрированного очищенного препарата вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней и изучение его антигенных свойств.- Вопр.вирусологии, 1987, 6, 718-724.

40. Сидорова Е. В.- Молекулярные механизмы биосинтеза иммуноглобулинов.-Журнал Всесоюзного хим. об-ва им. Д.И.Менделеева, 1982,27,12-20.

41. Сюрин В.Н., Фомина Н.В.- Частная ветеринарная вирусология,- М., Колос, 1979, 111-115.

42. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В.- Ветеринарная вирусология.- М., Колос, 1984,376с.

43. Тарасишин Л.А.- Применение точечной иммуноферментной детекции для выявления вирусных антигенов.- Мол. генетика, микробиол. и вирусол., 1986, 5,45-46.

44. Уласов В.И.- Аденовирусные инфекции собак: диагностика, терапия и профилактика.- Болезни мелких домашних животных: Сборник мат.семинара ТОО Моск.вет.центр, М, 1991, 27-44.

45. Федосеева В.П., Г.В.Порядин, Л.В.Ковальчук и др.- Руководство по иммунологическим и аллергологическим методам в гигиенических исследованиях- М., Промедэк, 1993,13-93.

46. Федоров Ю.Н.- Факторы иммунологической защиты у овец в системе мать-плод- новорожденный.- Дисс. доктора биол. наук, М., 1984, с.209.

47. Федоров Ю.Н., Сологуб В.К., Феоктистова Т.А. и др.- Получение и характеристика моноклональных антител к иммуноглобулинам класса М рогатого скота.- Труды ВИЭВ, 1988, т.66, 13-16.

48. Фукс Б. Ф., Сидорович И. Г., Игнатьева Г. А.- Гибридомы и моноклональные антитела.-Журнал Всесоюзного хим. об-ва им. Д.И.Менделеева, 1982,27,409-417.

49. Хаитов P.M., Б.В.Пинегин.- Современные подходы к оценке основных этапов фагоцитарного процесса- Иммунология, 1995, 4, 3-8.

50. Хаитов P.M., Б.В.Пинегин, Х.И.Истамов- Экологическая иммунология- М., ВНИРО, 1995, 6-41.

51. Хилько С.Н., Кирасова М.А., Пикер Е.Г. и др.- Иммуноферментный анализ гексона аденовирусов. Определение антител от гипериммунизированных кур.- Мол.генетика, микробиол. и вирусол., 1989, 9, 43-48.

52. Хилько С.Н., Кирасова М.А., Исакова В.Р. и др.- Иммуноферментный анализ гексона аденовирусов. Индикация и характеристика кроличьих и мышиных антител против гексонов.- Мол.генетика, микробиол. и вирусол., 1990, 7, 41-47.

53. Шишкин С.С.- О некоторых перспективах развития гибридомной биотехнологии для диагностики болезней человека. Проблемы выбора человеческого белка в качестве антигена.-Иммунология, 1997, 4, 13-15.

54. Ярилин А.А., И.М.Беляков- Тимус как орган эндокринной системы-Иммунология, 1996,1, 4-8.

55. Abbas A., Lichtman А.Н., Pober J.S.- Cellular and Molecular Immunology.-W.B.Saunders Company, Philadelphia/London/Toronto/ Montreal/ Sydney/ Tokyo, 1994,4-46.

56. Abraham K.M. and Teale J.M.- The contribution of parasite- specific T cells to isotype restriction in Mesocestoides corti- infected mice.- J.Immunol., 1987, 139, 2530-2537.

57. Adam E., Nasz I., Lengyel A. et al.- Différenciation of adenovirus hexon epitopes with monoclonal antibodies by gel diffusion assays.-Mol. Immunol., 1985,22,967-971.

58. Amina A.M.N., Abdel A., El-Ebiary A. et al.- Immune responses of immunized balb/c mice with avian reovirus.- Vet. Med. J., 1996,44(1), 41-47.

59. Anderson L.J., Godfrey E., Mcintosh K., Hierholzer J. Comparison of a monoclonal antibody with a policlonal serum in an enzyme linked immunosorbent assay ELISA for detecting adenovirus. - J. Clin. Microbiol., 1983, 18,463-468.

60. Antibody Techniques. Eds. by V.S.Malik, E.P.Lillehoj.- Academic Press, London, San Diego, New York, Boston, Sydney, Tokyo, Toronto, 1994, 23-58.

61. Antibody Technology. Eds. E.Liddell and I.Weeks.- BIOS Scientific Publishers (LTD), 1995,40-103.

62. Archetti I.L., Capucci L., Saalmuller A. et al.- Production and characterization of monoclonal antibodies differentiating subpopulations of porcine B lymphocytes in blood and lymphoid tissues.- J.Vet.Med., 1993,40(7), 485-493.

63. Arriens M.A., Summerfield A., Schaffner R., McCullough K.C.- Cross reactivity of antihuman CD monoclonal antibodies with porcine leukocytes.-Vet.Immunol.Immunopathol., 1996, 54, 113.

64. Atassi M.Z.- Antigenic structure of mioglobin. The complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins.- Immunochemistry, 1975, 12,423-438.

65. Ayers V.K., Collins J.K., Purdy C.W.- Epitope-specific antibody responses in market-stressed calves to bovine herpesvirus type 1.- Vaccine, 1994,12, 940-946.

66. Azwai S.M., Carter S.D., Woldehiwet Z.- Immunoglobulins of camel (Camelus dromedarius) colostrum.- J.Comp.Pathol., 1996,114(3), 273-282.

67. Bailey M., Hall L., Bland P.W. & Stokes C.R.- Production of cytokines by lymphocytes from spleen, mesenteric lymph node and intestinal lamina propria of pigs.- Immunology, 1994, 82, 557-583.

68. Balogh P., Bebok Z., Nemeth P.- Cellular enzyme- linked immunocircle assay. A rapid assay of hybridomas produced against cell surface antigens.- J. Immunol. Meth., 1992, 153, 141-149.

69. Barriga O.O. et al.- Evidence of immunosupression by Demodex canis- Vet.Immunol. Immunopathol., 1992, 32, 37.

70. Basic & Clinical Immunology. Eds. by D.P.Stites, A.I.Terr, T.G.Parslow.-Prentice-Hall Intern. Inc., 1994,622-629.

71. Beh K.E.- Production and characterization of monoclonal antibodies specific for sheep IgG subclasses IgGor IgG.- Vet.Immunol. Immunopathol., 1987,14,187-196.

72. Benjamini E., Sunshine G., Leskowitz S.- Immunology: A short course.- WILEY-LISS Inc., 1996, 86-441.

73. Berzofsky J.A., Schechter A.N.- The concepts of cross- reactivity and the specificity in immunology.- Mol. Immunol., 1981,18, 751-763.

74. Berzofsky J.A. and Berkower I.J.- Immunogenicity and antigen structure. In: Fundamental Immunology. Ed. by W.E.Paul.- Raven Press, New York, 1993,235-282.

75. Bianchi A.T.J., Sholten J.W., Jongenelen I.M.C.A. and Koch G.- The use of monoclonal antibodies in an enzyme immunospot assay to detect isotype-specific antibody-secreting cells in pigs and chickens.-Vet. Immunol. Immonopathol., 1990,24, 125-134.

76. Bianchi A.T.J., Zwart R.J., Jeurissen S.H.M. & Moonen- Leusen H.W.M.-Development of the B- and T- cells compartments in porcine lymphoid organs from birth to adult life: an immunohistological approach.- Vet. Immunol. Immonopathol., 1992,33, 201.

77. Bird P., Jones P., Allen D. et al.- Analysis of the expression and secretion of isotypes of sheep B cell immunoglobulins with a panel of isotype-specific monoclonal antibodies.- Res.Vet. Sci., 1995,59(3), 189-194.

78. Bohl E.H., Gupta R.K.P., Olquin M.V.F. and Saif L.- Antibody responses in serum, colostrum and milk of swine after infection or vaccination with transmissible gastroenteritis virus.-Infect. Immunol., 1972,6,289-301.

79. Bokhout B.A., Van Asten-Noordijk J.J.L. and Stok W.- Porcine IgG. Isolation of two IgG- subclasses and anti-IgG class- and subclass specific antibodies.- Mol. Immunol., 1986, 23, 675-683.

80. Borca M.V., Garmendia A.E., Baxt B. et al.- Cross-reactive idiotopes among anti-foot and mouth disease virus neutralizing antibodies.- Immunology, 1993, 79, 368-374.

81. Bouige P., Iscaki S., Budkowska A. et al.- Interest of immunomodulation as a mean to improve the preparation of polyclonal and monoclonal antibody reagents.- J.Immunol.Meth., 1997, 200,27-37.

82. Brocchi E., Berlinzani A., Gamba D., De Simone F.- Development of two monoclonal antibody- based ELISAs for the detection of antibodies and the identification of swine isotypes against swine vesicular disease virus.- J. Virol. Meth., 1995, 52,155-167.

83. Brodeur B.D.,Tsang P.and Larose Y.- Production of monoclonal antibodies in mouse ascitic. In: Schook L.B.(editor) Monoclonal antibody. Production. Techniques and Applications.-Canada, 1987, 99-112.

84. Bruderer U., Deusinger M., Schurch U., Lang A.B.- Analyses of affinity distributions within polyclonal populations of antigen- specific antibodies.- J. Immunol. Meth., 1992,151, 164.

85. Burnet F.M.- The clonal selection theory of acquired immunity.- Nashville Tn., Vanderbilt University Press, 1959.

86. Butler J.E., Brown W.R.- The immunoglobulins and immunoglobulin genes of swine.- Vet. Immunol. Immunopathol., 1994,43, 5-12.

87. Butler J.E., San J., Kacsovics I., Brown W.R, Navarro P.- The VH and CH immunoglobulin genes of swine: implications for repertoire development.- Vet. Immunol. Immunopathol., 1996, 54, 7-17.

88. Callebaut P., Cox E., Pensaert M., et al.- Induction of milk IgA antibodies by porcine respiratory coronavirus infection. In: Cavanaugh D., Brown T.D.K., Eds. Coronaviruses and their diseases. New York: Plenum Press, 1990, 421-428.

89. Campbell K.L., Neitzel C. and Zuckermann F.A.- Immunoglobulin A deficiency in the dog.- Canine Practice, 1991,16, 7-11.

90. Campbell K.L. and Felsburg P.J.- IgA deficiency and skin disease. In: R.W.Krik (Ed.), Current Veterinary Therapy XI: Small Animal Practice.- W.B.Saunders, PA, 1992, 528-531.

91. Carmichael L. and Barnes F. Serological comparisons between infections canine hepatitis virus and human adenovirus types. - Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1961,107: 214-218.

92. Carvajal A., Lanza I., Diego R. et al.- Evaluation of a blocking ELISA using monoclonal antibodies for the detection of porcine epidemic diarrhea virus and its antibodies.- J. Vet. Diagn. Invest., 1995, 7,60-64.

93. Cepko C. L., Sharp P. A. Assembly of adenovirus maior capsid protein is mediated by a nonvirion protein.- Cell, 1982, 31, 407-415.

94. Chard T.-Ammonium sulfate and polyethylene glycol as reagents to separate antigen from antigen-antibody complexes.- Meth. Enzymol., 1980, 70, 280-291.

95. Chein S.H., Stadler B.M., Manfred W., De Week A.L.- Dot-immunobinding assay with monoclonal anti-IgE antibodies for the detection and quantitation of human IgE.-J.Immunol. Meth., 1986, 95,195-202.

96. Ciarlet M., Hidalgo M., Liprandi F.- Cross-reactive, serotype- and monotype- specific neutralization epitopes on VP7 of serotype G3 and G5 porcine rotavirus strains.- Arch.Virol., 1996, 141 (3-4), 601-614.

97. Comitti R., Racchetti C., Gnocchi P. et al.- A monoclonal-based, two-site enzyme immunoassay of human insulin.- J.Immunol. Meth., 1987, 99, 25-37.

98. Corbett R.B., Perryman L.E., Gorham J.R., Bell T.G.- The cell- mediated immune response, its inhibition and in vivo reversal in dogs with demodectic manage.- Fed.Proc., 1976, 35,589.

99. Coutelier J.P., Van der Logt J.T.M., Heesen F.W.A. et al.- IgG2a restriction of murine antibodies elicited by viral infections.- J. Exp.Med., 1987, 165, 64-66.

100. Coyle P.V., Wyatt D., McCaughey C. and OTSTeil H.J.- A simple standardised protocol for the production of monoclonal antibodies against viral and bacterial antigens.- J. Immunol. Meth., 1992,154, 111-119.

101. Cox F.E.G. and Liew F.Y.- T cell subsets and cytokines in parasitic infections.-Immunol. Today, 1992,13,445-448.

102. Coyle P.V., Wyatt D., McCaughey C. and O'Neil H.J.- A simple standardised protocol for the production of monoclonal antibodies against viral and bacterial antigens.- J.Immunol.Meth., 1992,152, 78-88.

103. Croce C.M., Linnenbach A., Hall W. et al.- Production of human hybridomas secreting antibodies to measles virus.-Nature, 1980, 288, 488-489.

104. Cukrowska B., Sinkora J., Mandel L. et al.- Thymic B cells of pig fetuses and germ- free pigs spontaneously produce IgM, IgG and IgA: detection by ELISPOT method.-Immunology, 1996, 87, 487-492.

105. Cukrowska B., Sinkora J., Rehakova Z. et al.- Isotype and antibody specificity of spontaneously formed immunoglobulins in pig fetuses and germ-free piglets: production by CD5" B cells.- Immunology, 1996, 88, 611-617.

106. Curtis J., Bourne F.J.- Immunoglobulin quantitation in sow serum, colostrum and milk and the serum of young pigs.- Biochem. Biophys.Acta, 1971,236, 319-322.

107. Czerny C-P., Waldmann R., and Scheubeck T.- Identification of three distinct antigenic sites in parapoxviruses.- Arch.Virol., 1997, 142, 807-821.

108. Davis W.C. and Larsen R.A.- Genetic markers identified by immunogenetic methods.-Am.Fisheris Soc.Symposium, 1990, 521-540.

109. Davis W.C., Hamilton M.J., Park Y.-H. et al.- Ruminant leucocyte differentiation molecules. In: Ed.O.Barta. MHC, Differentiation Antigens, and Cytokines in Animals and Birds. Monographs in Animal Immunology.- BAR-LAB, Inc., Blacksburg VA, 1990,47-70.

110. Desai A., Chandramuki A., Gourie-Devi M., Ravai V.- Detection of Japanese encephalitis virus antigens in the CSF using monoclonal antibodies.- Clin.Diagn.Virol., 1994, 2, 191-199.

111. Dvorak R., Dvorakova D. et al.- Monoclonal antibodies specific for pig serum and cell surface IgM.- Res. Vet. Sci., 1986, 41, 356-360.

112. Edelman G.M.- The structure and function of antibodies.- Sci.Am., 1970,223(2), 42.

113. Engstrom S.M., Shoop E., Johnson R.C.- Immunoblot interpretation criteria for serodiagnosis of early Lyme disease.- J.Clin.Microbiol., 1995, 33 (2), 419-427.

114. Estes D.M.- Differentiation of B cells in the bovine. Role of cytokines in immunoglobulin isotype expression.-Vet.Immunol.Immunopathol., 1996, 54, 61-67.

115. Fazekas de St.Groth S. and Schridegger D.- Production of monoclonal antibodies: strategy and tactics.-J. Immunol. Meth., 1980, 35,1-24.

116. Fisher M.M., Nady B., Bazin H., Underdown B.J.- Bihary transport of IgA: role of secretory component.- Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 2008-2012.

117. Fllenor W.A., Lucas D.O., Stott G.N. and Guidry A.J.- Characterisation of monoclonal antibodies to bovine IgG.-Vet.Immunol. Immunopathol., 1984, 6, 35-51.

118. Fogel N., Klemm P., Elling F.- Passive immunization of newborn piglets with anti-K88 murine monoclonal antibodies.- Proc. of 9 World Pig Vet. Ass. Congress, Barselona, 1986, 149-152.

119. Folz S.D.- Demodicosis (Demodex canis).- Cont.Educt.Art, 1983, 5 (2), 116-121.

120. Forgani B., Myoraku C.K.and Schmidt N.J.- Production of monoclonal antibodies to human IgM for assay of viral IgM antibodies.-J.Virol.Meth., 1982,5,317-327.

121. Forsberg M., Tagle R., Madej A. et al.- Radioimmunoassay of bovine, ovine and porcine luteinizing hormone with a monoclonal antibody and a human tracer.- Acta Vet.Scand., 1993,34(3), 255-262.

122. Frost P., Havarstein L.S., Lygren B. et al.- Mapping of neutralization epitopes on infectious pancreatic necrosis viruses.- J. Gen.Virol., 1995, 76(5), 1165-1172.

123. Galfre G., Howe S.C., Milstein C. et al.- Antibodies to major histocompatibility antigenes produced by hybrid cell lines.-Nature, 1977,266,550-552.

124. Galfre G. and Milstein C. Preparation of monoclonal antibodies: Strategies and procedures.- Meth. Enzymol., 1981, 73, 1-5.

125. Gemski M.J., Doctor B.P., Gentry M.K.et al.-Single step purification of monoclonal antibody from murine ascites and tissue culture fluids by anion exchange hidh performance liquid cromatography.- Bio.Techniq., 1985, 3, 378-385.

126. Gershwin L.J., Krakowka S., Olsen R.G.- Immunology and Immunopathology of Domestic Animals.-Mosby, St.Louis/ Baltimore/ Boston/ Chicago/ London/ Madrid/ Philadelphia/ Sydney/Toronto, 1995, 195p.

127. Ginel P.J., Margarito J.M., Molleda J.M. et al.- Biotin-avidin amplified enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the measurment of canine serum IgA, IgG and IgM.- Res.Vet. Sci., 1996,60(2), 107-110.

128. Ginsberg H.S.-Adenovirus structural proteins. Compreheusive Virology, New York, Plenum press, 1979, 13,409-457.

129. Goding J.W.- Monoclonal Antibodies: Principles and Practice.- Academic Press, London, San Diego, New York, Boston, Sydney, Tokyo, Toronto, 1996, 7-28.

130. Gorman N.T.- Immunology. In: Textbook of Veterinary Internal Medicine. Eds. S.J.Ettinger and E.C.Feldman.- W.B. Saunders Co., Philadelphia/ London/ Toronto/ Montreal/ Sydney/Tokyo, 1995, vol.2,1978.

131. Gosling J.P.- A decade of development in immunoassay methodology.- Clin.Chem., 1990, 36, 1408-1427.

132. Gray J.T., Fedorka-Gray P.J., Stabel T.J., Ackermann M.R.- Influence of inoculation route on the carrier state of Salmonella choleraesuis in swine.- Vet.Microbiol., 1995, 47, 43-59.

133. Greco D.S., Harpold L.M.- Immunity and the endocrine system-Vet.Clin.of North Am., Small Anim. Prac., 1994,24(4), 765-782.

134. Gregory D.W., Cardella M.A., Myers L.L.- Lamb model in the study of immunity to enteropathogenic Escherichia coli infections.- Am.J.Vet.Res., 1983,44, 1,2073-2077.

135. Gupta R.K., Siber G.R.- Method for quantitation of IgG subclass antibodies in mouse serum by enzyme- linked immunosorbent assay.-J. Immunol. Meth., 1995,181,75-81.

136. Haaijman J.J., Coolen J., Deen C. et al.- Monoclonal antibodies directed against human immunoglobulins: preparation and evaluation procedures. In: Reviews on Immunoassay Technology, Ed. S.B.Pal.- The Macmillan Press LTD, 1988, 59-93.

137. Hall E.J., Carter S.D., Barnes A., Batt R.M.-Immune responses to dietary antigens in gluten- sensitive enteropathy of Irish setters.- Res.Vet.Sci., 1992, 53,293-299.

138. Hall J.A., Campbell K., Mordecai S. et al.- Comparison of three commercial radial immunodiffusion kits for the measurement of canine serum immunoglobulins.- J. Vet. Diagn. Invest., 1995, 7, 559-562.

139. Halliwell R.E.W. and Gorman N.T.- Diseases associated with immunodeficiency. In: Veterinary Clinical Immunology. Eds. Halliwell R.E.W. and Gorman N.T.- W.B.Saunders Company, Philadelphia/London/Toronto/ Montreal/ Sydney/ Tokyo, 1989, 449-466.

140. Haverson K., Bailey M., Higgins V.R. et al.- Characterization of monoclonal antibodies specific for monocytes, macrophages and granulocytes from porcine peripheral blood and mucosal tissues.- J.Immunol.Meth., 1994,170,233-254.

141. Henning E.R., Thomas P.C.- Comparison of intramuscular and oral modified-live virus TGE vaccines.- Vet.Med. SAC, 1981, 76, 1789-1792.

142. Henning D.and Nielsen K.- Cross-reactivity of monoclonal antibodies to bovine immunoglobulins with immunoglobulins of other species.- Vet. Immunol. Immunophatol., 1992, 34, 235-243.

143. Hierholzer J. C., Phillips D. J., Humphrey D. D. et al. Application of a solid- phase immunofluorometric assay to the selection of monoclonal antibody specific for the adenovirus group- reactive hexon antigen.-Arch. Virol., 1984,80, 1-10.

144. Hill P.B., Moriello K.A., DeBoer D.J.- Concentration of total serum IgE, IgA, and IgG in atopic and parasitized dogs.- Vet.Immunol.Immunopathol., 1995,44,105-113.

145. Himba M.H. and Griffin J.F.T.- The purification and characterisation of cervine IgM and IgG.- Vet. Immunol. Immunopathol., 1990,26, 343- 352.

146. Hirsh D.S., Baker B.B., Wiger N. et al.- Suppression of in vivo lymphocyte transformation by serum from dogs with generalized demodicosis.- Am.J.VetRes., 1975, 36, 1591-1595.

147. Hites M.J., Kleinbeck M.L., Loker J.L. and Lee K.W.-Effect of immunotherapy on the serum concentrations of allergen- specific IgG antibodies in dog sera.- Vet. Immunol. Immunopathol., 1989,22, 39-51.

148. Holmdahl R., Moran T. and Andersson M.- A rapid and efficient immunization protocol for production of monoclonal antibodies reactive with autoantigens.- J. Immunol. Meth., 1985, 83, 379-384.

149. Horn C., Pescher P., Romain F., Marchal G.- Characterization of murine monoclonal antibodies specific for the 45/47 kDa antigen complex (APA) of Mycobacterium tuberculosis, M.bovis and BCG.- J. Immunol. Meth., 1996, 197, 151-159.

150. Hutchens T.W. and Porath J.- Thiophilic adsorption: A comparison of model protein behavior.- Biochemistry, 1987,26,7199.

151. Hutchinson J.M., Salman M.D., Garry F.B. et al.- Comparison of two commercially available single radial immunodiffusion kits for quantitation of llama immunoglobulin G.- J. Vet. Diagn. Invest., 1995,7, 515-519.

152. Immunoglobulins in Health and Disease. Ed. by M.A.H.French- MTP Press Limited, Lancaster/Boston/The Hague/Dordrecht, 1986, 123-141.

153. Jacobs L., Kimman T.G.- Epitope-specific antibody response against glycoprotein E of pseudorabies virus.- Clin.Diagn.Lab.Immunol., 1994, 1, 500-505.

154. Janeway C.A., Travers P.- Immunobiology. The Immune System in Health and Disease.- Current Biology Ltd/Churchill Livingstone/Garland Publishing Inc., 1996, 860p.

155. Jefferis R., Lowe J., Ling N.R. et al.- Cross- reactivity of murine monoclonal antibodies to human IgG with the immunoglobulins of certain animal species.- Immunology, 1982,45,71-77.

156. Jianmin Z., Linn M.L., Bulich R. et al.- Analysis of functional epitopes on the dengue 2 envelope (E) protein using monoclonal IgM antibodies.- Arch.Virol., 1995, 140 (5), 899-913.

157. Johanson M. E., Uhnoo I., Svensson L. etal. Enzyme- linked immunosorbent assay for detection of enteric adenovirus 41. - J. Med. Virol., 1985, 17, 19-27.

158. Jones D., Brook D.- Investigation of the GAMMA-CHECK-C test as a means of evaluating IgG levels in equine colostrum.- J.Equine Vet.Sci., 1995,15(6), 269-271.

159. Joo H.S., Park B.K., Dee S.A., Pijoan C.- Indirect fluorescent IgM antibody response of pigs infected with porcine reproductive and respiratory syndrome virus.- Vet. Microbiol., 1997, 55, 303-307.

160. Kacskovics I., Sun J., and Butler J.E.- Five putative subclasses of swine IgG identified from the cDNA sequences of a single animal.- J. Immunol., 1994, 153, 3565-3573.

161. Kaltreider H.B., Johnson J.S.- Porcine immunoglobulins. I. Identification of classes and preparation of specific antisera.- J. Immunol., 1972,109, 992-998.

162. Kasper K.C., Marr G. and Fashandi S.- The DiaStick PMSG test : Performance characteristics and clinical evaluation.- J.Anim.Sci.,1985, 61,389-392.

163. Kasper K.C., Marr G. and Fashandi S.- Field dipstik ELISA for PMSG and equine LH Biol.Reprod., 1985, 32,223-227.

164. Kearney J.F., Radbruch A., Liesegang B. and Rajewsky K.- A new mouse myeloma cell line that had lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody secreting hybrid cell lines.-Immunol., 1979,123,1548-1550.

165. Kelley K.W., Kleiss A.J. and Brief S.- Quality control criteria for quantitative enzyme- linked immunosorbent assay of porcine immunoglobulins A and M.- Am. J. Vet. Res., 1988, 49,944-949.

166. Kertesz G., Bourcier В., Barrande C. et al.- A novel method for the production of antibodies against ACTH: their characterization and use in epitope mapping.- J. Immunol. Meth., 1997,200,161-172.

167. Khilko S. N., Kirasova M. A., Kiseleva E.K., Tikhonenko Т. I.- Comparison of adenoviral hexon polypeptides (monomers) and of native hexson (trimers) by SDS-polyacrilamide gel electrophoresis. Acta Microbiologica Hungarica, 1990,37, 233-245.

168. Kimman T.G., Oei-Lie N., D. Van Zaan.- Role of memory B-cell responses in serum and mucosal fluids of swine for protective immunity against pseudorabies virus.- Am.J.Vet.Res., 1992, 53 (11), 1992-1998.

169. KohlerG. & Milstein C. Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity.- Nature (London), 1975,256,495-499.

170. Kosmidou A., Ahl R., Thiel H.J., Weiland E.- Differentiation of classical swine fever virus (CSFV) strains using monoclonal antibodies against structural glycoproteins.- Vet.Microbiol., 1995,47, 111-118.

171. Kumolosasi E., Bonhomme A., Berochia A. et al.- Kinetics study of the localization and quantitation of target antigens of immunoglobulin a antibodies in acquired and congential toxoplasmosis.- Parasitol.Res., 1996, 82(5), 402-409.

172. Kyhse-Andersen J.- Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose.- J. Biophys. Biochem. Meth., 1984,10,203-209.

173. Kwan S.P., Yelton D.E. and Sharff M.D.- Production of monoclonal antibodies.-Monoclon.Antibod., 1980,1, 31-35.

174. Kwang J., Keen J., Cutlip R.C. et al.- Serological diagnosis of caprine lentivirus infection by recombinant immunoassays.-Small Rum.Res., 1995,16(2), 171-177.

175. Lacouture S., Mittal K.R., Jacques M., Gottschalk M.- Serotyping Actinohacillus pleuropneumoniae by the use of monoclonal antibodies.- J.Vet.Diagn.Invest., 1997, 9, 337-341.

176. Laemmli U.K.- Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.- Nature, 1970, 227,680-685.

177. Lando G., Berzofsky J. A., Reichlin M.- Antigenic structure of sperm whale myoglobin: I. Partition of specificities between antibodies reactive with peptides and native protein.-J.Immunol., 1982, 129, 206-211.

178. Lanza I., Shoup D.I., Saif L.J.- Lactogenic immunity and milk antibody isotypes to transmissible gastroenteritis virus in sows exposed to porcine respiratory coronavirus during pregnancy.- Am.J.Vet.Res., 1995, 56(6), 739-748.

179. Laver W.G., Air G.M., Webster R.G. and Smith-Gill S.J.- Epitopes on protein antigens: Misconceptions and realities.- Cell, 1990, 61, 553-556.

180. Leder L. and Bosshard H.R.- Immunoreactivity of cytochrome C: antibodies to horse cytochrome C distinguish between sequence related cytochromes only at the level of 3D structure.-Biochimie, 1994, 76, 465-469.

181. Lee B.J., Hampson D.J.- A monoclonal antibody reacting with the cell envelope of spirochaetes isolated from cases of intestinal spirochaetosis in pigs and humans.- FEMS-Microbiol. Let., 1995,131(2), 179-184.

182. Lee W.E., Thompson H.G., Hall J.G. et al.- Rapid immunofiltration assay of Newcastle disease virus using a silicon sensor.- J. Immunol. Meth., 1993,166,123-131. (t)

183. Lerner R.A.- Antibodies of predetermined specificity in biology and medicine.- Adv. Immunol., 1984, 36, 1-44.

184. Lewin H.A., Calvert C.C. and Bernoco D.- Cross- reactivity of a monoclonal antibody with bovine, equine, ovine and porcine peripheral blood B lymphocites.- Am. J.Vet. Res., 1985,46,785-789.

185. Lewis R.M., Picut C.A.- Veterinary Clinical Immunology. From classroom to clinics.-Lea & Febiger, Philadelphia* London, 1989, 207-228.

186. Lind P., Haugegaard J., Wingstrand A., Henriksen S.A.- The time course of the specific antibody response by various ELISAs in pigs experimentally infected with Toxoplasma gondii. -Vet.Parasitology, 1997, 71,1-15.

187. Lombardi S., Massi C., Tozzini F. et al- Epitope mapping of the V3 domain of feline immunodeficiency virus envelope glycoprotein by monoclonal antibodies.- J.Gen.Virol., 1995, 76, 1893-1899.

188. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. and Randall R.J.- Protein measurment with the Folin phenol reagent.- J.Biol.Chem., 1951, 193, 265-275.

189. Lunney J.K.- Monoclonal antibodies in the analysis of immune responses in swine. In: J.Stern and H.R.Gamble (Editors). Hybridoma technology in agricultural and veterinary research.- Rownran and Allanheld, Totawa,N.Y., 1984,298-301.

190. Madic J., Magdalena J., Quak J., van Oirschot J.T.- Isotype- specific antibody responses in sera and mucosal secretions of calves experimentally infected with bovine herpesvirus 1.- Vet. Immunol.Immunopathol., 1995,46,267-283.

191. Mancini G., Carbonara O. and Heremans J.F.- Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion.- Immunochem., 1965, 2,235-254.

192. Margulies D.H., Kuehl W.M., Sharff M.D.- Somatic cell hybridization of mouse myeloma cells.- Cell, 1976, 8, 405-415.

193. Marusyk R., Norrby E. and Lundqvist Biophysical comparison of two canine adenoviruses.- J. Virol., 1970, 5, 507-512.

194. Marusyk R. and Yamamoto T. Characterization of canine adenovirus hemagglutinin. - Can. J. Microbiol., 1971,17, 151-154.

195. Matisheck P., Emerson W., Searl R.C.- Results of laboratory and field tests of TGE vaccine.- Vet.Med. SAC, 1982, 77,262-264.

196. Matthes H.F., Harrison G.B.L., Shaw R.J. et al.- Cross-reacting antibodies to Sarcoptes suis, Chorioptes bovis and Notoedre cati and anti-P.ovis IgE in sera from sheep infested naturally with Psoroptes ovis.- Intern.J.Parasitol., 1996,26(4), 437-444.

197. Mayne P.D.- Clinical Chemistry in Diagnosis and Treatment.- Edward Arnold, London/ Sydney/Auckland, 1994,314-324.

198. Medical Immunology. Eds. by D.P.Stites, A.I.Terr, T.G.Parslow.- APPLETON & LANGE, Stamford, Connecticut, 1997,73-210.

199. Mercedes G.G., Stephane B., Sylvie O. et al- Purification of murine IgG and IgM monoclonal antibodies by euglobulin precipitation.-J.Immunol. Meth., 1988, 111, 17-23.

200. Morilla A., Klemm R.C., Spiro P., et al.- Neutralization of a transmissible gastroenteritis virus of swine by colostral antibodies elicited by intestine and cell culture-propagated virus.- Am. J. Yet. Res., 1976, 36, 267-271.

201. Morter R.- Genetically engineered monoclonal antibody for E.coli diarrhea in calves.- Mod.Vet.Pract., 1984, 65,427-428.

202. Murtaugh M.P., Baarsch M.J., Zhou Y. et al.- Inflammatory cytokines in animal health and disease.-Yet.Immunol.Immunopathol., 1996, 54,45-55.

203. Nakane P.K. and Kawaoi A.- Peroxidase- labelled antibody: a new method of conjugation.-J. Histochem. Cytochem., 1974,22,1084-1091.

204. Nawwar A.A.M., Farid A.F., Abdel-Gawwad A.F.- Quantitative studies of immunoglobulins in vaccined cows with a K99 vaccine.- Vet.Med.J., 1994, 42(3), 11-15.

205. Neoh S.H., Gordon C., Potter A. and Zola H.- The purificatin of mouse monoclonal antibodies from ascitic fluid.- J.Immunol.Meth., 1986, 91, 231-235.

206. Nezlin R., Freywald A. and Oppermann M.- Proteins separated from human IgG molecules.- Mol.Immunol., 1993, 30(10), 935-940.

207. Nezlin R., Mozes E.- Detection of antigens in immune complexes by a dot blot assay.-J.Immunol.Meth., 1995,184,273-276.

208. Nielsen K.- Cross-reaction of antihuman IgE and antibovine reaginic immunoglobulin antisera with sera from several species of mammals.- Can.J.Comp.Med., 1977,41, 345-348.

209. Paton D.J., Sands J.J., Lowings J.P. et al.- A proposed division of the pestivirus genus using monoclonal antibodies, supported by cross-neutralisation assays and genetic sequencing.- Vet. Res., 1995, 26(2), 92-109.

210. Paul P.S., Van Deusen R.A. and Mengeling W.L.- Monoclonal precipitating antibodis to porcine immunoglobulin M.- Vet. Immunol. Immunopathol., 1985, 8, 311-328.

211. Paul P.S., Mengeling W.L., Saif L.J.- Detection of classes of antibodies to transmissible gastroenteritis virus and rotavirus of swine using monoclonal antibodies to porcine immunoglobulins.- 9th. Int.Pig Vet.Soc. Congr., 1986,190-195.

212. Paul P.S., Mengeling W.L., Malstrom C.E., Van Deusen R.A.- Production and characterization of monoclonal antibodies to porcine immunoglobulin gamma, alpha and light chains.- Am. J. Vet. Res., 1989, 50, 471-479.

213. Peng Z., Yang M., Simons F.E.R., Becker A.B.- Cross- reactivity and molecular mass of the s chains of the IgE antibodies in dogs, humans, rats, and mice.- Int. Arch. Allergy Immunol., 1996, 110, 149-155.

214. Pereira H. G. and Laver W. G. -Comparison of adenovirus types 2 and 5 hexon by immunologycal and biochemical techniques.- J. Gen. Virol., 1970, 9,163-167.

215. Perosa F., Carbone R., Ferrone S. and Dammacco F.- Purification of human immunoglobulins by sequential precipitation with caprylic acid and ammonium sulfate.- J. Immunol. Meth., 1990,128, 9-16.

216. Pfeiffer N.E., Wylie D.E. and Schuster S.M.- Immunoaffinity chromatography utilizing monoclonal antibodies.- J.Immunol.Meth., 1987, 97,1-9.

217. Porro M, Viti S., Antoni G.- Ultrasensitive silver-stain method for the detection of proteins in polyacrylamide gels and immunoprecipitates on agarose gels.-Anal. Biochem., 1982, 127,316-321.

218. Potier M.F., Abiven P., Kobisch M. et al.- A blocking ELISA using monoclonal antibody for the serological detection of Mycoplasma hyopneumoniae.- Res.Vet.Sci., 1994, 56, 345.

219. Price P. J.- Hybridoma technology.- La Ricerca Clin.Lab., 1984, 14,277-285.

220. Prokesova L., Kovaru F., Jaroskova L. et al.- Ontogeny of immunoglobulin synthesis production of IgM, IgG and IgA in newborn piglets.- Develop, and Comp. Immunol., 1979, 3, 138.

221. Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man. Ed. by M. Clark.- Academic Titles, Nottingham, 1993,145-163.

222. Ra C., Jouvin M.E., Kinet J.- Complete structure of mouse mast cell receptor for IgE (FceRI) and surface expression of chimeric receptors (rat-mouse-human) on transfected cells.-J.Biol. Chem., 1989,264,15323-15327.

223. Reimann K.A., Waite B.C., Lee Parritz D.E. et al.- Use of human leukocyte- specific monoclonal antibodies for clinically immunophenotyping lymphocytes of Rhesus monkeys.-Cytometry, 1994,17,102-108.

224. Reyero C., Stokl W.- Isolation of porcine colostral immunoglobulins and preparation of monospecific anti-y, anti-a, and anti-jn chain antibodies using agarose- linked immunosorbents.- J. Immunol. Meth., 1977,15,211-221.

225. Roe J.M., D.Patel and K.L.Morgan Isolation of porcine IgE, and preparation of polyclonal antisera. - Yet. Immunol. Immunopathol., 1993, 37, 83- 97.

226. Roitt I.- Essential Immunology.- Blackwell Scientific Publications, 1994, 54-335.

227. Roost H-P., Haag A., Burkhart C. et al.- Mapping of the dominant neutralizing antigenic site of a virus using infected cells.- J. Immunol. Meth., 1996,189, 233-242.

228. Roth J.A.- Immune system. In: A.D.Leman, B.E.Straw, W.L.Mengeling et al. (Eds.),th

229. Diseases of Swine, 7 edn. Iowa State Univ. Press, Ames, 1992,21-39.

230. Saalmuller A., Denham S., Haverson K. et al.- The Second International Swine CD Workshop.- Vet.Immunol. Immunopathol., 1996, 54, 155-158.

231. Saif L.J., Bohl E.H.- Immunoglobulinen classes of antibodies in milk of swine after intranasal exposure to Pseudorabies virus or transmissible gastroenteritis virus.- Infect. Immunol., 1977,16, 961-966.

232. SaifL.J. and Bohl E.H.- Passive immunity in transmissible gastroenteritis of swine: immunoglobulin classes of milk antibodies after oral- intranasal inoculation of sows with a live low cell culture- passaged virus.- Am.J.Vet.Res., 1979,40, 1, 115-117.

233. Saif L J., Bohl. E.H.- Role of secretory IgA in passive immunity of swine to enteric viral infections. In: Ogra P.L., Dayton D., Eds. Immunology of breast milk.- New York, Raven Press, 1979, 237-255.

234. Saif L.J. and Wesley R.D.- Transmissible gastroenteritis. In: A.D.Leman, B.E.Straw, W.L.Mengeling et al. (Eds.), Diseases of Swine, 7th edn. Iowa State Univ. Press, Ames, 1992, 386.

235. Saif L., Yuan L., Rosen B. and Ward L. Intestinal antibody-secreting cell (ASC) responses to human rotavirus in a piglet model of enteric disease.- Abstr. of the 9 Intern. Congr. of Immunology, USA, 1995, 154.

236. Saif L.J.- Mucosal immunity: an overview and studies of enteric and respiratory coronavirus infections in a swine model of enteric disease.- Vetlmmunol. Immunopathol., 1996, 54, 163-169.

237. Sarvas H.O., Aaltonen L.M., Peterfy S. et al.- IgG subclass distributions in anti-hapten and anti- polysaccaride antibodies induced by haptenated polysaccarides.- Eur. J. Immunol., 1983, 13,409-413.

238. Schmitt M., Esslinger J., Seeger K., Blobel.- Immunoglobulin A deficiency and impaired resistance to chronic dermatitis in dogs.- Monat. fur Veterinarmedizin, 1994, 49 (6), 287.

239. Schuh R., Kremmer E., Ego E. et al.- Determination of monoclonal antibody specificity by immunoadsorption and Western blotting.-J. Immunol. Meth., 1992,152,59-67.

240. Schwartzman R.M.- Immunologic studies of progeny of atopic dogs.-Am.J.Vet.Res., 1984,45 (2), 375-378.

241. Schreier M.H., Iscore N.N., Tees R. et al.- Clones of killer and helper T cells: growth requirement, specificity and retention of function in long-term culture.-Immunol. Rev., 1980,51, 315-336.

242. Schulman M., Wilde C.D. and Kohler G.- A better line for marcing hybridomas secreting specific antibodies.- Nature, 1978, 276, 269-270.

243. SelaM.- Antigenicity: Some molecular aspects.- Science, 1969,166,1365-1374.

244. Sestak K., Lanza I., Park S.-K. et al.- Contribution of passive immunity to porcine respiratory coronavirus to protection against transmissible gastroenteritis virus challenge exposure in sucking pigs.- Am.J.VetRes., 1996, 57 (5), 664-671.

245. Shapiro D.A., Adkison M.A., Kaattari S.L.- Antibody affinity analysis using the ELISA./ In: Immunology Methods Manual. Ed. by I. Lefkovits- Academic Press, Harcourt Brace & Co, Publishers, 1997,2354-2359.

246. Shaw R.J., McNeill M.M., Gatehouse T.K., Douch P.G.C.- Quantification of total sheep IgE concentration using anti-ovine IgE monoclonal antibodies in an enzyme immunoassay.- Vet. Immunol.Immunopathol., 1997, 57, 253-265.

247. Sherman D.M., Acres S.D., Sadowski P.L. et al.- Protection of calves against fatal enteric colibacillosis by orally administered Escherichia coli K99- specific monoclonal antibody. -Infectlmmun., 1983, 42, 653-661.

248. Sherry J.P.- Environmental chemistry: the immunoassay option.- Crit. Rev. Anal. Chem., 1992, 23, 217-300.

249. Sibille P., Avrameas A., Moraillon A. et al.- Comparison of serological tests for the diagnosis of feline immunodeficiency virus infection of cats.- Vet.Microbiol., 1995,45, 259-263.

250. Silva-Martins N.R., Mockett A.P.A., Cook J.K.A.- A method for the rapid purification of serum IgM for the diagnosis of recent viral infections of chickens.- J.Virol.Meth., 1990,29,125.

251. Sittampalam G.S., Smith W.C., Miyakawa T.W. et al.- Application of experimental design techniques to optimize a competitive ELISA.-J. Immunol. Meth., 1996, 190,151-161.

252. Slifka M.K., Ahmed R.- Limiting dilution analysis of virus- specific memory B cells by an ELISPOT assay.- J. Immunol. Meth., 1996, 199, 37-46.

253. Skjerve E., Bos W. and Bram van der Gaag.- Evaluation of monoclonal antibodies to Listeria monocytogenes flagella by checkerboard ELISA and cluster analysis.- J.Immunol.Meth., 1991,144,11-17.

254. Smith K., Gehle W. and Kniker W. Serologic evidence that infectious canine hepatitis virus commonly infects humans and is related to human adenovirus type 8.- J. Immunol., 1970,105,1036-1039.

255. Sopp P., C.J.Howard.- Cross-reactivity of monoclonal antibodies to defined human leucocyte differentiation antigens with bovine cells.- Vet. Immunol. Immunopathol., 1997, 56, 11-25.

256. Specter S., Bendinelly M. and Friedman H.- Viruses and Immunosuppression. General comments. In:Virus-induced immunosuppression. Eds. Specter S. et al.- Plenum Press, New York and London, 1989, 1-19.

257. Spira G., Pollock R.R., Bargellesi A., Scharff M.- Monoclonal antibodies: a potentially powerfull tool in the diagnosis and treatment of infections diseases.- Eur. J. Clin. Microbiol., 1985, 4, 251-256.

258. SpiraG. and Scharff M.D.- Identification of rare immunoglobulin switch variants using the ELISA spot assay.- J. Immunol. Meth., 1992,148, 121-129.

259. Spitz M., Spitz L., Thorpe R. and Eugui E.- Intrasplenic primary immunization for the production of monoclonal antibodies. J.Immunol.Meth., 1984, 70, 39-43.

260. Steensgaard J.- The mechanism of immune precipitation.- Immunol.Today, 1984, 5,10.

261. Swango L., Wooding W. and Binn L. A comparison of the pathogecity and antigenicity of infectious canine hepatitis virus and the A 26/61 virus strain (Toronto).- J. Am. Vet. Med. Assoc., 1970,156, 1687-1696.

262. Temponi M., Kageshita T., Perosa F. et al.- Purification of murine IgG monoclonal antibodies by precipitation with caprylic acid: comparison with other methods of purification. -Hybridoma, 1989, 8, 85-87.

263. Tijssen P and Kurstak E Highly efficient and simple methods for preparation of peroxidase and active peroxidase- antibody conjugates for enzyme immunoassay.- Anal Biochem, 1984,136, 451-457.

264. Tizard I.R.- Veterinary Immunology. An Introduction.- W.B.Saunders Co., Philadelphia / London /Toronto/Montreal/Sydney/Tokyo, 1996, 890 p.

265. Thompson J.P.- Immunological diseases. In: Textbook of Veterinary Internal Medicine. Eds. S.J.Ettinger and E.C.Feldman.- W.B. Saunders Co., Philadelphia, London, Toronto, Montreal, Sydney, Tokyo, 1995, vol.2, 2002-2029.

266. Thompson J.P.- Disorders of the immune system. In: The Cat: Diseases and Clinical Management. Ed. Sherding R.G.- New York, Churchill Livingstone, 1994, 311-322.

267. Trebichavsky I., Jaroskova L., Sima P. et al-. Immunoglobulins on the surface of lymphocytes in ontogeny.- Folia Biologica (Prague), 1975,21,228-233.

268. Truitt K.E., Larrick J.W. et al.- Production of human monoclonal antibodies in mouse ascites.- Hybridoma, 1984, 3, 195-199.

269. Tsang V.C., Peralta J.M. and Simons A.R.- Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot techniques (EITB) for studying the specificities of antigens and antibodies separated by gel electroforesis.- Meth.Enzymol., 1983, 92, 377-379.

270. Tsang Y.T.M., Stephens P.E., Licence S.T. et al.- Porcine E-selectin: cloning and functional characterization.-Immunology, 1995, 85,140-146.

271. Underwood P.A.-Problems and pitfalls with measurement of antibody affinity using solid phase binding in the ELISA.- J. Immunol. Meth., 1993, 164,119-130.

272. Vajdy M. & Lycke N.- Mucosal memory B cells retain the ability to produce IgM antibodies 2 years after oral immunization.- Immunology, 1995, 86, 336-342.

273. Van Nerom A., Ducatelle R., Haesebrouck F. et al.- Monoclonal and polyclonal antibodies to chicken immunoglobulin isotypes specifically detect turkey immunoglobulin isotypes.-Vet. Immunol. Immunopathol., 1997, 57, 305-314.

274. Van Zaan D. and Ijzerman J.- Monoclonal antibodies against bovine immunoglobulin and their use in isotype specific ELISA for rotavirus antibody.- J. Immunol. Meth., 1984, 72, 444.

275. Van Zaan D.and Hulst M.M.-Monoclonal antibodies against porcine immunoglobulin isotypes.- Vet. Immunol. Immunophatol., 1987,16,23-36.

276. Vareckova E., Betakova T., Mucha V. et al.- Preparation of monoclonal antibodies for the diagnosis of influenza A infection using different immunization protocols.- J. Immunol. Meth., 1995, 180, 107-116.

277. Venkatesh N., Nagaraja G. and Murthy G.S.- Analysis of a conformation specific epitope of a a-subunit of human chorionic gonadotropin (hCG): study using monoclonal antibody probes.- Curr.Sci., 1995, 69,48-52.

278. Venkatesh N., Murthy G.S.- Dissociation of monoclonal antibody-antigen complexes: implication for the ELISA procedures.-J. Immunol. Meth., 1996,199,167-174.

279. Venkatesh N., Murthy G.S.- Immunochemical approach to the mapping of an assembled epitope of human chorionic gonadotropin: proximity of CTP- a to the receptor binding region of the p-subunit.- J. Immunol.Meth., 1997,202,173-182.

280. Wang L.F., Plessis D.H., White J.R. et al.- Use a gene-targeted phage display random epitope library to map an antigenic determinant on the bluetongue virus outer capsid protein VP5.-J.Immunol.Meth., 1995, 178, 1-12.

281. Watson G., Burdon M. G., Russel W. Antigenic analyses of the adenovirus type 2 fiber polypeptide.- J. Gen. Virol., 1988, 69, 525-535.

282. Waxier G.L.- Clinical and pathologic effects of oral administration of transmissible gastroenteritis vaccine to gnotobiotic pigs.-Am.J.Vet.Res., 1992, 53 (1), 116-122.

283. Wawrzynczak E.J.- Antibody Therapy.- BIOS Scient. Publishers, Oxford, U.K., 1995,5.21.

284. Wedege E. and Svenneby G.-Effects of blocking agents bovine serum albumin and Tween-20 in different buffers on immunoblotting of brain proteins and marker proteins.-J.Immunol.Meth.,1986, 88, 232-234.

285. Westerwoudt R.J., Blom A.M., Naipal A.M. and Van Rood J.J.- Improved fusion technique. I.Human umbilical cord serum, anewand potent growth promoter,compared with other B cell and hybridoma activators.-J.Immunol.Meth., 1983, 62, 59-68.

286. Westerwoudt R.J., Naipal A.M., Harrisson C.M.H.-Improved fusion technique II.Stability and purity of hybrid clones.-J.Immunol.Meth., 1984,68,89-101.

287. White T.J., Ibrahimi I.M., Wilson A.C.- Evolutionary substitutions and the antigenic structure of globular proteins.- Nature, 1978, 274, 92-94.

288. White J.R.- Validation of a quantitative ELISA for comparison of monoclonal antibody affinities for isolates of bluetongue virus.- J.Immunol.Meth., 1994, 177, 79-88.

289. Wieczorek-Krohmer M., Weiland F., Conzelmann K. et al.- Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV): Monoclonal antibodies detect common epitopes on two viral proteins of European and U.S. isolates.- Vet.Microbiol., 1996, 51,257-266.

290. Williams D.J.L., Newson J. and Naessens J.- Quantitation of bovine immuniglobulin isotypes and allotypes using monoclonal antibodies.- Vet. Immunol. Immunopathol., 1990,24, 283.

291. Wilkins P.A., Deman-Mix S.- Efficacy of intravenous plasma to transfer passive immunity in clinically healthy and clinically ill equine neonates with failure of passive transfer.-Corn.Vet., 1994, 84, 7-14.

292. Wood P.R., Seow H.-F.- T cell cytokines and disease prevention.-Vetlmmunol. Immunopathol., 1996, 54, 33-44.

293. Woods R.D.- Humoral and cellular responses in swine exposed to transmissible gastroenteritis virus.- Am.J.Vet.Res., 1979,40,108-110.

294. Woolley S.T., Whyte A., Licence S.T. et al.- Difference of E-selectin expression and leucocyte infiltration induced by inflamatory agents in a novel subcutaneus sponge matrix model.- Immunology, 1995, 84, 55-63.

295. Yelton D.E. and Scharff M.D.- Monoclonal antibodies: new method in biology and medicine.- Ann.Rev.Biochem., 1981, 82, 657-680.

296. Yilmaz H., Morgan K.L., Roe J.M.- Cross- reactivity of ovine IgE with antihuman IgE.-Int. Arch. Allergy Immunol., 1994, 104,277-280.

297. Yokohama M., Kondoh T., Amano T. et al.- Development of a monoclonal antibody specific equine serum proteins.- Animal Sci.Technol., 1996,67(4), 378-381.

298. Xu J.Z., Matsuo M., Kamiyama N. et al.- A new method, distribution-analyzing latex immunoassay (DALIA), to measure specific immunoglobulin G against mite and wheat allergen in human sera.- Allergy, 1994, 49(5), 323-329.

299. Zhou E.M., Afshar A., Heckert R.A., Nielsen K.- Anti-idiotypic antibodies generated by sequential immunization detect the shared idiotype on antibobies to pseudorabies virus antigens.-J.Virol.Meth., 1994,48(2-3), 301-313.

300. Zola H., Roberts-Thomson P. and McEvoy R.- Diagnostic Immunopathology.-Cambridge University Press, Great Britain, 1995, 114-175.

301. Zuckermann F.A. & Gaskins H.R.- Distribution of porcine CD4/CD8 double-positive T lymphocytes in mucosa-associated lymphoid tissues.- Immunology, 1996, 87,493-499.

302. Zuckermann F.A. & Husmann R.J.- Functional and phenotypic analysis of porcine peripheral blood CD4/CD8 double-positive T cells.- Immunology, 1996, 87, 500-512.