Моноклональные антитела к антигенам Bac. anthracis: получение и применение тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, кандидат биологических наук Романов, Михаил Геннадьевич

• Романов, Михаил Геннадьевич
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Романов, Михаил Геннадьевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1Л Морфология Bacillus anthracis.

1.2 Секретируемые факторы вирулентности Вас.anthracis.

1.3 Сибирская язва и её диагностика.

1.4. Иммунитет и иммунизация.

1.5. Производство моноклональных антител и их практическое применение.

1.5.1. Применение моноклональных антител.

1.5.2. Диагностика бактериальных инфекций.

1.5.3. Перспективы терапевтического применения.

1.5.4. Принципы получения моноклональных антител.

1.6. Применение МкАт для изучения сибирской язвы и её обнаружение в объектах исследования.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Лабораторные животные.

2.2. Антигены.

2.3. Штаммы.

2.4. Сыворотки, антитела.

2.5. Антисыворотки.

2.6. Иммунизация.

2.7. Приготовление ультразвуковых дезинтегратов микробных клеток.

2.8. Синтез конъюгатов антител с пероксидазой хрена.

2.9. Миеломные клетки.

2.10. Культуральные среды.

2.11. Посуда.

2.12. Подготовка миеломных клеток к слиянию.

2.13. Приготовление слоя фидерных (подкормочных) клеток.

2.14. Получение иммунных спленоцитов.

2.15. Раствор полиэтиленгликоля. i 2.16. Гибридизация клеток.

2.17. Отбор гибридных культур-продуцентов специфических антител (первичное тестирование).

2.18. Клонирование гибридных клеток.

2.19. Заморозка и разморозка гибридных и миеломных клеток.

2.20.Культивирование гибридных клеток in vivo.

2.21. Очистка моноклональных антител.

2.22. Использование штаммов гибридных культивируемых клеток для получения моноклональных антител. ф 2.23. Исследование специфичности иммунохимических свойств МкАт.

2.23.1. Твердофазный иммуноферментный анализ.

2.23.2. Иммуноблоттинг.

2.23.3. Определение изотипа МкАт.

2. 24. Определение концентрации белка.

2. 25. Статистическая обработка результатов. ф

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К АНТИГЕНАМ Вас. anthracis, ИХ ВЫДЕЛЕНИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА.

3.1. Иммунизация.

3.2. Подбор условий постановки твердофазного иммунофермент-ного анализа (ИФА).

3.3. Гибридизация.

3.3.1. Подготовка клеток к слиянию, гибридизация.

3.3.2. Получение первичных культур гибридных клеток.

3.3.3. Получение гибридом при использовании спленоцитов мышей, щ иммунизированных дезинтегратом спор вакцинного сибиреязвенного штамма 55 - ВНИИВВиМ.

3.3.4. Получение гибридом при использовании спленоцитов мышей, иммунизированных дезинтегратом вегетативных клеток (суточной культурой) вакцинного сибиреязвенного штамма 55 - ВНИИВВиМ.

3.3.5. Получение гибридом при использовании спленоцитов мышей, иммунизированных очищенным протективным антигеном Вас. anthracis

3.4. Изучение свойств моноклональных антител.

3.4.1. Изучение видовой специфичности моноклональных антител.

3.4.2. Культивирование гибридом-продуцентов, продуцирующих антитела in vivo.

3.4.3. Определение изотипа моноклональных антител.

3.4.4. Иммунохимический анализ.

ГЛАВА 4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ МКАТ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПА Вас. anthracis.

4.1. Приготовление конъюгатов на основе моноклональных антител.

4.2. Подбор пары МкАт для сэндвич-ИФА.

4.3. Сравнение различных вариантов ИФА для количественного определения ПА с использованием полученных МкАт.

ГЛАВА 5. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МКАТ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ПЕРСПЕКТИВЫ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ЛАБОРАТОРНОГО АНАЛИЗА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ.

5.1. Использование МкАт для идентификации Вас. anthracis.

5.2. Оценка возможной пригодности полученных МкАт для характеристики живых споровых вакцинных штаммов и для стандартизации бесклеточных вакцинных препаратов.

5.3. Перспективы использования МкАт для определения уровня защищенности животных от заражения сибирской язвой, привитых различными вакцинными штаммами.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Моноклональные антитела к антигенам Bac. anthracis: получение и применение»

Сибирская язва, болезнь, которая относится к числу особо опасных зоонозных инфекций, поражающая сельскохозяйственных животных (крупный и мелкий рогатый скот, лошадей, ослов, верблюдов), диких млекопитающих, а также человека, продолжает регистрироваться во многих странах и причиняет большой экономический ущерб [3, 7, 8]. Высокая заболеваемость обусловлена тем, что возбудитель сибирской язвы способен неопределённо долго сохранять жизнеспособность в почве в виде спор и образовывать стойкие стационарные очаги инфекции. Существование таких очагов в разных регионах мира, в том числе и на территории России, создает постоянную угрозу возникновения эпизоотий и заражения людей, которые могут инфицироваться в процессе переработки и использовании животноводческой продукции, полученной от больных животных (мясо, шкуры, шерсть и др.). По данным Всемирной организации здравоохранения в мире ежегодно заболевает около 20 тыс. человек, нередко отмечается и летальный исход [1-6].

В России в настоящее время зарегистрировано около 72 тыс., потенциальных очагов сибирской язвы [7]. Однако, в силу исторических, социальных и экономических обстоятельств большое количество скотомогильников, одиночных мест гибели или захоронений остаётся неучтённым, и по данным ряда исследователей именно они являются источником поступления возбудителя сибирской язвы в природную среду [7]. В итоге, государственный комитет санитарно-эпидемиологического надзора (Госкомсанэпиднадзор Минздрава РФ) оценивает эпидемическую обстановку в отдельных регионах страны как напряженную [3,7].

Перспективы совершенствования методов борьбы с сибирской язвы, как в медицинской, так и в ветеринарной практике напрямую связаны с созданием и применением в повседневной работе быстрых и достоверных методов обнаружения и идентификации возбудителя, а также с совершенствованием существующих средств профилактики.

Традиционные методы бактериологической индикации и идентификации возбудителя включающие: приготовление и окраску мазков, посев на питательные среды, биопробу, а также проведения ряда дополнительных исследований (тест «жемчужного ожерелья», лизабельность фагом, иммунофлюоресцентный тест), обеспечивают получение окончательного результата в сроки не ранее 2-3 суток от момента начала исследования, что существенно тормозит и соответственно усложняет проведение адекватных мер по локализации очага инфекции.

Иммунохимические методы, которые успешно применяются для индикации патогенных микроорганизмов и соответствующих антител уже более 50 лет, позволят во многом решить эту проблему [8, 51]. Примером могут служить созданные за последние годы лабораторные тест-системы для диагностики таких болезней как бруцеллез, туберкулёз, бешенство, иерсиниоз и др. [76, 109].

В основу всех без исключения иммунохимических методов анализа положено образование высокоспецифического комплекса между антигеном и антителом, в котором в качестве антигена могут выступать низкомолекулярные химические соединения (гаптены), белковые молекулы микробного или растительного происхождения, а также различные микробиологические объекты: бактерии, риккетсии, вирусы и тд. Главная задача при разработке иммунодиагностической тест-системы состоит в визуализации единичных взаимодействий антигена с антителом путем регистрации макроскопического сигнала или по изменению физических свойств среды, а также увеличение чувствительности и специфичности иммуноанализа, достигаемое за счёт получения антител с максимальным аффинитетом к искомому антигену и разработке молекулярных систем усиления результата специфического взаимодействия антигена с антителом. Наиболее яркими примерами в этой области являются создание гибридомной технологии для получения моноклокнальных антител (МкАт) с заданными свойствами. Их использование в диагностических тест-системах в сравнении с поликлональными антителами обеспечивает получение более стабильных результатов при сохранении высокой чувствительности и специфичности, а стабильность свойств МкАт является определяющим фактором изготовления стандартных образцов препаратов в достаточно больших количествах. [35, 108].

Существующая потребность в более совершенных методах диагностики, выявления Bacillus anthracis и его токсических субстанций позволило нам определить следующую цель работы.

Цель работы

Получить панель гибридом-продуцентов антител к специфичным антигенам Вас.anthracis и исследовать возможность их применения для иммунохимического анализа сибиреязвенных антигенов и конструирования диагностикумов.

Задачи исследования

При выполнении работы необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести культивирование сибиреязвенного возбудителя и сапрофитных бацилл и приготовить антигенные препараты для иммунизации животных и тестирования гибридом.

2. Подобрать схемы иммунизации мышей антигенными препаратами Bacillus anthracis оптимальные для получения гибридом-продуцентов.

3. Получить гибридомы-продуценты моноклональных антител к видоспецифичным антигенам Bacillus anthracis.

4. Изучить иммунохимическую характеристику и эффекторные свойства моноклональных антител.

5. Разработать методы использования моноклональных антител для качественного и количественного определения распознаваемых ими антигенов.

Научная новизна

Создана оригинальная коллекция стабильных гибридом-продуцентов моноклональных антител к протективному антигену Bacillus anthracis.

Представлены доказательства преимущества применения тестов на основе моноклональных антител по сравнению с классическими методами диагностики и идентификации возбудителя.

Положения, выносимые на защиту

Получение оригинальной коллекции технологичных клонов гибридом-продуцентов антител к протективному антигену сибиреязвенного микроба.

На основе полученных моноклональных антител разработаны специфичные и чувствительные иммуноферментные методы качественного и количественного определения протективного антигена сибиреязвенного токсина в биологическом материале и метод выявления антител к протективному антигену в сыворотке вакцинированных животных. Апробация работы

Материалы, изложенные в диссертации, доложены:

• на VIII Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2004» 23-25 мая 2004 г.

• На межлабораторном совещании специалистов ФГУ ВГНКИ 31 мая 2005 года.

• На межлабораторной конференции ГУ НИИВС им. И. И. Мечникова 3 июня 2005 года.

По материалам диссертационной работы опубликовано в периодической печати 3 научные статьи.

Структура диссертации

Диссертация изложена на 98 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырёх глав собственных исследований,

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Романов, Михаил Геннадьевич

Выводы

1. Получена оригинальная коллекция гибридом-продуцентов моноклональных антител к протективному антигену Вас. anthracis, распознающих четыре различных антигенных детерминанты.

2. На основе отобранных моноклональных антител разработаны варианты количественного сэндвич-ИФА, позволяющие достоверно определять протективный антиген Вас. anthracis в культуральных жидкостях с чувствительностью 5-7 нг/мл. Данный тест видоспецифичен и дифференцирует возбудителя сибирской язвы от других представителей рода Bacillus по признаку токсинообразования.

3. Разработанный метод ИФА с использованием моноклональных антител пригоден для характеристики вакцинных штаммов Вас. anthracis по их способности продуцировать протективный антиген и формировать анти-ПА иммунитет.

4. Предложен метод оценки степени защищенности вакцинированных животных по уровню антител к протективному антигену.

Практические предложения

Методические рекомендации по идентификации штаммов Вас. anthracis в

ИФА с помощью моноклональных антител». Утвержденные директором ФГУ

ВГНКИ академиком РАСХН А.Н. Паниным. Авторы: Романов М.Г., Яковлева

И.В., Кириллов J1.B., Свиридов В.В. Москва, 2005 г.

Заключение

Сибирская язва - одна из опасных остропротекающих инфекционных болезней животных и человека, раз возникнув в какой-либо местности, она может укорениться, сохраняя на многие десятилетия угрозу повторных вспышек. Разработка методов быстрой и точной идентификации возбудителя сибирской язвы актуально для своевременной диагностики заболевания.

Одним из направлений совершенствования лабораторной диагностики возбудителей инфекционных заболеваний является разработка и внедрение в практику новых методов и средств обнаружения патогенных микроорганизмов для своевременного проведения мероприятий по предотвращению распространения заболевания и выявлению очагов потенциальной инфекции. В части создания высокоактивных и высокоспецифичных диагностических препаратов для выявления возбудителя сибирской язвы и его токсических субстанций, одним из перспективных направлений исследований признано конструирование иммунодиагностических препаратов на основе МкАт.

В ряде зарубежных публикаций описано получение МкАт против антигенов трех основных компонентов токсина (летального, отечного и протективного факторов) [82, 83], а также к основному соматическому антигену Вас. anthracis, которые успешно применяют как в диагностических, так и в лечебных целях. Сведения об использовании подобных препаратов в нашей стране в доступной литературе нами не обнаружены.

Целью настоящей работы являлось получение МкАт к диагностически значимым видоспецифичным антигенам сибиреязвенной бациллы и изучение возможности создания на их основе высокоэффективных препаратов, пригодных для анализа проб из объектов внешней среды и клинического материала, а также оценка уровня экспрессии ПА различными вакцинными штаммами in vitro.

В работе использовали шесть вакцинных штаммов Вас. anthracis и пять видов сапрофитных бацилл, полученные из коллекции музея ФГУ ВГНКИ ветпрепаратов. Из штамма 55-ВНИИВВиМ Вас. anthracis, а также пяти основных видов сапрофитных бацилл, которые, по многочисленным литературным данным, имеют максимальный антигенный перекрест с возбудителем сибирской язвы, готовили антигенные препараты: УЗ-дезинтеграт микробных клеток и спор, споры инактивированные 1% формалином, а также культуральные жидкости выше перечисленных бацилл для определения токсических экзокомпонентов. В качестве экспериментальных животных применяли мышей линии BALB/c, массой 18-20 граммов, полученных из питомника РАМН «Крюково». Миеломными партнерами при гибридизации служили клетки мышиной линии P3-X63.Ag8.653. Получение гибридом-продуцентов МкАт к антигенам Вас. anthracis потребовало оптимизации ряда условий проведения различных этапов, в частности, подбор наиболее эффективных схем иммунизации мышей и получения стимулированных спленоцитов, выбор метода скрининга МкАт и тд.

В качестве последнего был использован непрямой вариант ИФА, удовлетворяющий требованиям специфичности и высокой чувствительности при выявлении минимальных концентраций белка в пробе. Для сенсибилизации планшетов использовали растворы антигенов с концентрацией 1-10 мкг/мл белка.

Сравнение различных схем иммунизации мышей линии BALB/c УЗ-дезинтегратами микробных клеток и спор Вас. anthracis, полученных из штаммов 55-ВНИИВВиМ и СТИ, с эффективностью гибридизации стимулированных этими антигенами спленоцитов с миеломными клетками и выходом активных и стабильных антителопродуцентов позволило установить, что при получении гибридом-продуцентов к соматическим антигенам Вас. anthracis не следует применять длительный цикл иммунизации мышей.

Наиболее эффективный выход клонов-продуцентов анти-ПА Вас. anthracis антител также наблюдался при использовании короткой схеме (не более 3-4 инъекций). Бустерную (заключительную) инъекцию вводили за 3 суток внутривенно или внутрибрюшинно.

Использование более продолжительных по времени схем иммунизации с многократным введением иммуногена и сочетания его с другими антигенными препаратами, например УЗ-дезинтегратом Вас. anthracis или при использовании неполного адъюванта Фрейнда приводило лишь к затягиванию опыта и не обеспечивали достаточного выхода позитивных клонов. Вероятно, при одновременном введении ПА с другими антигенными компонентами, иммунный ответ на балластные белки проявляется в большей степени. При этом антигенная нагрузка на одно животное не должна превышать 100 мкг/мл.

Первоначально в качестве антигенов были использованы дезинтеграты соматических клеток и спор Вас. anthracis. Во всех опытах по получению гибридом-продуцентов МкАт к эпитопам видоспецифичных антигенов клеточной стенки или споровых антигенов, отмечалась быстрая утрата признака антитело продукции большинством из первично позитивных (по результатам тестирования в ИФА) культур. При последующем определении видоспецифичности полученных антител все отобранные образцы пекрёстно взаимодействовали с антигенами многих видав из рода Bacillus как в ИФА так и в ИФлА. На втором этапе работы в качестве антигенов для иммунизации были использованы культуральные жидкости Вас. anthracis (содержащие компоненты токсина) и очищенный протективный антиген для получения антитоксических антител.

В результате, при использовании различных схем иммунизации в шести процедурах гибридизации нами было получено: 4 первичные гибридные культуры к споровым антигенам, 33 к антигенам вегетативной клетки и 85 первичных гибридом к протективному антигену, антитела от 5 из которых были проклонированны и полностью охарактеризованы. Первоначальным источником антител во всех случаях служили супернатанты гибридом, которые с целью концентрирования и увеличения сроков сохранности преципетировали сульфатом аммония при 50% насыщении. Полученные таким в результате препараты использовались для определения изотипа, специфичности и активности отобранных антител.

Таким образом из представленных МкАт требованию видоспецифичности отвечали только антитела полученные в опытах с использованием в качестве иммуногена очищенного ПА, предоставленный сотрудниками ГНЦ п. Оболенск.

Изучение специфичности антител в отношении отдельных субъединиц ПА, проводимое в иммуноблотинге, позволило выявить 4 варианта взаимодействия у 5 моноклональных антител к протективному антигену. Все антитела выявляли цельную молекулу ПА (ПА 83), но по-разному взаимодействовали с отдельными продуктами его деградации.

В ИФА оценивалось взаимодействие МкАт с очищенным ПА при первичном и повторном тестировании, а также проводился анализ видоспецифичности антител с культуральными жидкостями сибиреязвенного штамма 55-ВНИИВВиМ и сапрофитных бацилл. Все полученные МкАт обладали выраженными видоспеспецифичными свойствами и взаимодействовали только с культуральными жидкостями Вас. anthracis, связывая протективный антиген, секретируемый только сибиреязвенными штаммами. Наиболее активным оказалось МкАт ЗА2. Перекрестное взаимодействие, определяемое в ИФА с сапрофитами, было близко к фоновому уровню. Таким образом, реакционная способность и активность МкАт позволяет считать их потенциально пригодными для использования в качестве средства контроля за ПА Вас. anthracis.

Следующей задачей настоящей работы была разработка системы анализов на основе полученных и изученных МкАт для качественного и количественного определения ПА. Для создания подобных иммуноферментных анализов необходимо использовать стандартный препарат выделенного и очищенного антигена, который будет служить референтным образцом. Оценка содержания исследуемого антигена в тестируемых образцах в таком случае осуществляется посредством выражения концентрации вещества через интенсивность иммуноферментной реакции в соответствии с таковой для референс-образца. В качестве стандартного образца мы использовали очищенный ПА что позволило нам разработать и охарактеризовать несколько вариантов количественного ИФА для данного антигена.

Сначала необходимо было подобрать пару антител, не конкурирующих между собой при связывании с антигеном. Для этого были оценена активность приготовленных пероксидазных коныогатов каждого из МкАт к ПА.

Затем в ИФА исследовали попарно конкуренцию за связывание с ПА конъюгатов и немеченых моноклональных антител. Результаты исследования свидетельствуют о том, что отобранные 5 вариантов МкАт распознают 4 различных эпитопа в молекуле ПА и пригодны для двухсайтового связывания молекулы ПА парами МкАт и создания сэндвич-варианта ИФА для выявления ПА.

Далее была оценена способность моноклональных антител сохранять антигенсвязывающую способность после сорбции их на пластике, проанализированы все возможные сочетания отобранных антител для сенсибилизации планшетов и их пероксидазных конъюгатов.

В качестве сенсибилизирующих наилучшими оказались МкАт ЗА2. Другие антитела после адсорбции на пластике теряли антигенсвязывающую способность, что можно объяснить определенной ориентацией молекул сорбированных иммуноглобулинов.

Полученные в этой серии экспериментов результаты свидетельствуют о том, что наибольшей чувствительности удается достичь при использовании в качестве конъюгированных с пероксидазой МкАт 1А1 и 2G5. По данным титрования референтного препарата протективного антигена чувствительность теста составляет 5-7 нг ПА в мл.

В какой мере данная чувствительность достаточна и обеспечивает достоверное выявление ПА в биологическом материале было установлено в оцытах оценки продукции ПА различными вакцинными штаммами сибиреязвенного микроба. Оказалось, что концентрация протективного антигена в культуральной жидкости разных штаммов к 20 часу культивирования микроба достигает 1-2 мкг/мл, что в сотни раз выше чувствительности теста.

Таким образом, можно заключить, что данный вариант анализа пригоден как для характеристики вакцинных штаммов по интенсивности продукции ими протективного антигена, так и для выявления ПА в исследованиях по клонированию гена ПА и получении генноинженерных конструкций как вакцинных препаратов нового поколения.

Следует отметить, что не всегда удается подобрать оптимальную пару моноклонаольных антител для двухсайтового связывания антигена в сендвич-вариантах ИФА. Иногда исследователь располагает лишь одним образцом моноклональных антител требуемой специфичности. Для подобного случая опробован вариант выявления ПА на основе использования только одного варианта МкАт, примененных для сенсибилизации планшетов. В качестве вторых антител была использована антисибиреязвенная поликлональная лошадиная сыворотка. Для проявления реакции был использован пероксидазный конъюгат полученных в лаборатории гибридом моноклональных антител к иммуноглобулину лошади. Эти самым обеспечивалась большая специфичность выявления лошадиных антител по сравнению с применением поликлональных антилошадиных конгъюгатов. Кроме того, при этом варианте тестирования удавалось даже несколько повысить чувствительность реакции за счет связывания с ПА не одной, а большего числа молекул антител.

Заключительным этапом нашей работы явилась оценка содержания антител к протективному антигену в сыворотке морских свинок, вакцинированных различными дозами споровой сибиреязвенной вакцины из штамма 55-ВНИИВВиМ. В соответствии с принятым протоколом испытания через две недели после вакцинации животным вводили разрешающую дозу возбудителя и оценивали выживаемость свинок в группах. Перед заражением у животных отбирали кровь для определения уровня антител к ПА в ИФА. Поскольку для оценки уровня антител необходимо сенсибилизировать планшеты протективным антигеном, выделение и очистка которого весьма сложна и требует особых условий эксперимента, для сенсибилизации планшетов использовали культуральную среду вакцинного штамма Вас. anthracis, протективный антиген из которой заякоривался на планшете через моноклональные антитела ЗА2. Далее в лунки вносили пробы исследуемых образцов сыворотки в различных разведениях и соответствующий антивидовой пероксидазный конъюгат антител.

Анализ данных позволяет заключить, что содержание антител к ПА у вакцинированных животных зависит от дозы веденной вакцины и определяет выживаемость животных при введении разрешающей дозы возбудителя.

Таким образом, можно заключить, что на основе использования полученных моноклональных антител разработаны специфичные и чувствительные иммуноферментные методы качественного и количественного определения протективного антигена сибиреязвенного токсина в биологическом материале и метод выявления антител к протективному антигену в сыворотке вакцинированных животных.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Романов, Михаил Геннадьевич, 2005 год

1. Anisimova Т.I., Pimenov E.V., Kozhukhov V.V. et al. Abst. Intern. Workshop on Anthrax. // Winchester (England), 1995. P.108.

2. Зубов В.В., Кожухов В.В., Алиев Т.К. и др. Материалы научно-практическая конференция, посвященной 100-летию образования противочумной службы России. // Саратов, 1997. Т. 2. С. 53.

3. Строчков Ю.И., Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики. // М., 1999. С. 165.

4. Smego R.A. Jr, Gebrian В., Desmangels G. Cutaneous Manifestation of Anthrax in Rural Haiti. //Clin Infect Dis. 1998, № 26 P. 97-102.

5. Kumar A., Kanungo R., Bhattacharya S., Badrinath S., Dutta Т.К., Swaminathan R.P. Human anthrax in India: urgent need for effective prevention. // J Commun Dis. 2000, № 32 P. 240-246.

6. Caksen H, Arabaci F., Abuhandan M., Tuncer O., Cesur Y. Cutaneous anthrax in eastern Turkey. 2001, № 67, P. 488-492.

7. Пименов E.B., Кожухов В.В., Строчков Ю.И. Создание вакцин против сибирской язвы. // Природа № 10, 2000г.

8. Бакулов И. А., Гаврилов В. А. Сибирская язва новые страницы в изучении старой болезни. // Владимир, 2001. С. 130.

9. Ипатенко Н.Г., Гаврилов В. А., Зелепукин B.C. и др. Сибирская язва. // М.: Колос, 1996. С. 335.

10. Doganay М., Aydin Neriman. Antimicrobial susceptibility of Bacillus an-thracis//Scand. J. Infect. Diseases, 1991. V. 23, № 3 P. 333-335.

11. Makino S.J., Sasacawa C., Uchida I. et al. Cloning and C02 dependent expression of the genetic region for encapsulation from Bacillus anthracis// Mol. Microbiol, 1988. Vol. 2. № 3 - P. 371-376.

12. Цыганкова О.И., Буравцева Н.П. Методы выявления гемолитической активности Bacillus anthracis. II НИИ. Противочумный институт Кавказа.

13. Leise J.M., Carter C.N., Fridlender Н.М., Freed S.W. Criteria for the identification of Bacillus anthracis //J. Bact.-1959. V.77. №5 P. 655-660.

14. Буравцева Н.П., Лопаткин O.H. Авирулентные капсульные S-формы сибиреязвенного микроба. //Сб. «Достижения и перспективы борьбы с сибирской язвой в СССР».

15. Шерстобаев К.Н. Тинкториальные свойства спор бактерий. // Научные записки Белоцерковского сельскохозяйственного института. Киев, 1956.-Т.4.-С. 113-117.

16. Vodkin М.Н., and S.H.Leppla. Cloning of the protective antigen gene of Bacillus an-thracis. // CelL-1983. Vol. 34. P. 693-697.

17. Robertson D.L., M.T.Tippetts, and S.H.Leppla. Nucleotide sequence of the Bacillus anthracis edema factor gene (cya): a calmodulin-dependent adenylate cyclase. // Gene, 1988. Vol. 73 - P. 363-371.

18. Leppla S.H. Anthrax toxins. In Bacterial toxinsand virulence factors in disease. // Ed. J. Moss, B. Iglevski, M. Vaughan, and A.T.Tu. N.Y. 1995, P. 543-572.

19. Petosa C.R., RJ.Collier, K.R.Klimpel, S.H.Leppla, and R.C. Liddington. Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen. // Nature- 1997.-Vol. 385.-P. 833-838.

20. Vesche J., Elliott J.L., Falnes P.O., Olsnes S., and Collier R. J. Characterization of membrane translocation by anthrax protective antigen. //Biochemistry, 1998. -Vol. 37. P. 15737-15746.

21. Robertson D. L., Lepla S. H. Molecular cloninng and expression in Escerichia coli of the lethal factor gene of Bacillus anthracis // Gene. -1986. Vol. 44. - № 1. P. 71-78.

22. Bhatnagar R., Batra S. Anthrax toxin. // Crit Rev Micr. 2001, № 27, P. 167

23. Васильев Н.Т. и др. Перспективы создания сибиреязвенных вакцин нового поколения // РЖ «Химическая и биологическая безопасность», 2001. ХБ, С. 267.

24. Pasteur L., Chamberlain С-Е, Roux Е. Compte rendu sommaire des experiences faites a Pouilly-le-Fort, pres Melun, sur la vaccination chrabonneuse French // Comptes Rendus des seances De LAcademie des Sciences 1881, Vol. 92 P. 1378-1383.

25. Price B.M., Liner A.L., Park S., Leppla S.H., Mateczun A., Galloway D.R. Protection against anthrax lethal toxin challenge by genetic immunization with a plasmid encoding the lethal factor protein. // Infect. Immun. 2001. Vol. 69 -P. 4509-4515.

26. Шляхов Э. H., Груз E. В., Присакарь В. И. Сибирская язва. // Кишинев, 1975.-С. 162.

27. Ценковский JI. С. Сборник трудов Херсонского земства. // 1886, том 3.

28. Вышелесский С. Н. Вакцины сибирской язвы и противосибиреязвенная сыворотка, их получение и применение на практике. // СПБ, 1911.

29. Колесов С. Г., Михаилов Н. А. Биопрепараты вирусы микробы. // М., 1956. Т. 6. С. 242.

30. Колесов С. Г., Михаилов Н. А. Преснов И. Н. Диссиминация и элиминация сибиреязвенных микробов у вакцинированных животных. // Труды ГНКИ. М., 1962.

31. Anthrax vaccines. // Med Lett Drugs Thera 1998; 40:52-3.

32. Friedlander M., Pittman R., Parker G.W. Anthrax Vaccine. Evidence for Safety and Efficacy Against Inhalational Anthrax. // JAMA 1999, Vol 282 -P. 2104-6.

33. Barski G., Sorieul S., Cornefert F. Production dans des cultures in vitro de deux souches cellulaires en association, de cellules de caractere "hybride" // C.R. Hebd. Seances Acad. Sci. 1960.Vol. 251. - P. 1825-1827.

34. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature. 1975. - Vol. 256. № 5517. - P. 495-497.

35. Абелев Г.И. Моноклональные антитела. // Соросовский образовательный журнал, Биология 1998 г.

36. Яковлева И. В. Получение моноклональных антител патогенным псевдомонадам. // Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва 1996 г.

37. Плотникова Э. М. // Ветеринарный врач.- 2002,- №1.

38. Новохатский А. С., Козловский В. Н. и др. Новый поверхностный антиген возбудителя туляримии, выявляемый с помощью моноклональных антител. // Сборник трудов НИИ вакцин и сывороток имени И. И. Мечникова. Москва, 1990 г.

39. Котова Л.Ю. Моноклональные антитела к L.interrogans серогруппы Pomona. // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, ВГНКИ, Москва 1991 г.

40. Верховский О. А. Моноклональные антитела в ветеринарии. // Сборник трудов ВИЭВ. Москва, 1989,- Т. 67. С. 11-21.

41. Leidinger Е. Produktion und mogluche Anwendungsgebiete von homologen monoklonalen Antikorpern in der Veterinarmedizin. // Wien Tierarzil Mschr.-77,- 1990,-P. 267-269.

42. Малоголовкин С. А. и др. Роль моноклональных антител в развитии отечественной медицины и вирусологии. // Ветеринария. 1998. №11. - С. 6-10.

43. Малоголовкин С. А. и др. Достижение ВНИИВВиМ в развитии отечественной гибридомной технологии. // Москва. Вестник РАСХН,-1998,- №5. С. 69-73.

44. Новохатский А. С. Миеломные клеточные линии. Моноклональные антитела в микробиологии. И тоги науки и техники. // Микробиология. 1983.-Т.12.-С. 9-10.

45. Новохатский А. С. Бактериальные инфекции. // Микробиология. 1983.-Т.12.-С. 39-45.

46. Рыбальский Н. Г., Серова М. А., Игнатьева Г. А., Старчеус А. П. Общая характеристика состояния и перспектив развития мирового рынка моноклональных антител. Моноклональные антитела. // М.,1989. С. 93.

47. Nielsen К.Н., Henning M.D. Duncan J.R. Monoclonal Antibodies in Veterinary Medicine Agriculture Canada. // Animal Diseases Research Institute, Nepean, PO Box 11300, Station H, Nepean, Ontario, Canada K2H 8Р9,- 2004.

48. Bastin, J.M., Kirkley, J. Mcmichael, A.J. Production of monoclonal antibodies: a practical guide. In Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine //A.J. McMichael and J.W. Fabre, Eds, Academic Press, London. 1982, P. 503-517.

49. Маринин JI.И. Онищенко Г.Г. и др. // Микробиологическая диагностика сибирской язвы. М.: ВНУНММЗРФ, 1999, - С 224.

50. Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики. // М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999, С. 448.

51. Бакулов И. А., Ведерников В. А., Харкевич А. А., Гаврилов В. А., Селиверстов В. В. Дальнейшее совершенствование системы мероприятийпо профилактике и борьбе с сибирской язвой животных. // Ветеринария, 1997,-№5,-С. 7-10.

52. Бакулов И. А., Гаврилов В. А., Селиверстов В. В. Сибирская язва (антракс): Новые страницы в изучении старой болезни. // Владимир, 2001,-С. 202-229.

53. Бакулов И.А. Сибирская язва сельскохозяйственных и диких животных и меры профилактики в России. // Вопросы микробиологии, эпизоотологии и вет. сан. экспертизы: Сб. науч. работ, Ульяновск, 1998. С. 10-20.

54. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature, 1970, V.227 P. 680-685.

55. Ristroph J. D., Ivins В. E. Elaboration of Bacillus anthracis antigens in a new, defined culture medium. // Infect. Immun. -1983. V. 39. - P. 483-486.

56. Berson S.A., Yalow R.S. Quantitative aspects of the reaction between insulin and insulin binding antibody // J. Clin. Invest. 1959. - Vol. 38. P. 1996-2016.

57. Engvall E., Perlmann P. Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G // Immunochmistry. 1971. - Vol. 8. -P. 871 -874.

58. Peruski A. H., Peruski L. F. Jr. Immunological methods for detection and identification of infectious disease and biological warfare agenst // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003. - Vol. 10 - P. 506 - 513.

59. Engvall E., Perlmann P. Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA).3. Quantitation of specific antibodies by enzyme-labelled antiimmunoglobulin in antigen-coated tubes // J. Immunol. 1972. Vol. 109. - P. 129 - 135.

60. Kricka L. J. Chemiluminescent and bioluminescent techniques // Clin. Chem. 1991. Vol. 37. - P. 1442 - 1481.

61. Peruski A. H., Johnson L.H. Ill, Peruski L. F. // Jr. Rapid and sensitive detection of biological warfare agents using time-resolved fluorescence assays // J. Immunol. Meth. 2002. - Vol. 263. - P. 35 - 41.

62. Новохатский А. С. Моноклональные антитела к антигенным детерминантам возбудителей инфекционных заболеваний. // Итоги науки и техники, серия «Микробиология» т. 17, 1984.

63. Monoklonale Antikorper eine neue generazion von Immunoreagenzien. Wiss. Z. Karl-Marx-Univ. Leipzig. 1984, 33, № 6, - P. 607-612.

64. Кожевникова E. В., Свиридов В. В., Смирнов В. Д. // В сборник Моноклональные антитела в микробиологии и вирусологии, Москва,1985.-С. 174-179.

65. Колесов С. Г., Архипов В. В. Диагностика инфекционных и протозойных болезней сельскохозяйственных животных. // М., «Колос», 1968.

66. Колесов С. Г. Сибирская язва. // Москва, «Колос», 1976. С. 228.

67. Котова J1. Ю., Свиридов В. В., Синюкова И. В. и др. Получение моноклональных антител к лептоспирам. Сборник трудов НИИВС им. И. И. Мечникова. «Моноклональные антитела в медицине биотехнологии». //Москва, 1990,-С. 96-107.

68. Свиридов В. В., Волгарёва Г. М., Зайцев Е. М., Титова Н. Г. и др. Методические рекомендации по получению гибридом-продуцентов моноклональных антител к бактерийным антигенам. // М., 1986.

69. Hielsen К. Н., Henning М. D., Dunkan J.R. Monoclonal antibodies in veterinary medicine// Biotechnol. genet. Engg. Revs. Newcastle upen Tyne.1986. V. 4.-P. 311 -353.

70. Glinski Z., Wernicki A. Przeeiweala monoclonalne-mozliwosci wykorzystania// Med.Weter. 1985. R.31, N 11. - S. 643-647.

71. Lesnik F., Balent P., Jurcina A. et.al Monoclonalne protilatky vo veterinarnej medicine. // Veterinarstvi. 1988. - R. 38, c. 5. - S. 211 - 212.

72. Dreze F, Collard A, Coppe P. Production of monoclonal antibodies to study the molecular biology of bovine viral diarrhea virus. // Arch Virol Suppl. 1991, Vol. 3 P. 239-44.

73. Garin-Bastuji B. Anticorps monoclonaux-applications theoriques au diagnostic en bacteriologie, et serologie bacterienne veterinaries// Bull. Inform. Lab. Serv. Veter. 1986. N 21. - P. 9-20.

74. Свешников П. Г., Киселёв В. И., Северин П. Е., Пальцев М. А. // Биобизопасность: применение моноклональных антител для индикации опасных патогенов и диагностики инфекционных болезней. Москва, Издательство « Медицина». 2004. С. 67-75.

75. Васильев Н.Т. и др. Перспективы создания сибиреязвенных вакцин нового поколения //РЖ «Химическая и биологическая безопасность», 2001г, ХБ С. 267.

76. Turnbull Р.С.В., Doganay М., Lindeque P.M., et al. Serology and anthrax in humans, livestock and Etosha National Park wildlife. // Epidemiol Infect. 1992, Vol. 108 -P.299-313.

77. Пальцев М.А. Молекулярная медицина и прогресс фундаментальных наук // Вестник РАН. 2003, т.73, №2- с.99-109.

78. C.P.Quinn, V.A.Semenova, Ch.M.Elie et al. Specific, sensitive, and quantitative enzyme-linked immunosorbent assay for human immunoglobulin G antibodies to Anthrax toxin protective antigen. // Emerg. Infect. Dis., 2002, Vol.8, №.10-P.l 103-1111.

79. K.S.R.Sastry, U.Tuteja, P.K.Santhosh et al. // Identification of Bacillus anthracis by a sample protective antigen-specific mAb dot-ELISA. J.Med.Microbiol., 2003,Vol.52 P.47-49.

80. Кеннетф Р.Г., Дж. Мак-Керна, Бехтол К.Б. Моноклональные антитела. // М., Медицина. С 1983.-416.

81. Haber Е., Krause R.M. (eds) Antibodies of human diagnosis and Therapy. //New York: Raven Press, 1977.

82. Bell C.A., Uhl J.R., Hadfield T.L.et al. Detection of Bacillus anthracis DNA by Light Cycler PCR. // Am. J.Clin.Microbiol.,2002, Vol.40, №.8 P. 28972902.

83. Lee M.A., rightwellG.B., Leslie D.et al. // Fluorescent detection techniques for real-time multiplex strand specific detection of Вас. Anthracis using rapid PCR. J.Appl.Microbiol.,1999, Vol. 87. P. 218-223.

84. G.Brightwell, M.Pearce, D.Leslie. //Development of internal controls for PCR detection of Вас. anthracis. Mol.Cell Probes, 1999, Vol.12. № 6. P. 367-377.

85. Ellerbrok H, Nattermann H, Ozel M, Beutin L, Appel B, Pauli G. Rapid and sensitive identification of pathogenic and apathogenic Bacillus anthracis by real-time PCR. FEMS Microbiol Lett. 2002, Vol. 214, № 1, P. 51-59.

86. Drage L., Lombardi A., de Vecchi E., Gismendo M.R. Real-Time PCR Assay for Rapid Detection of Bacillus anthracis Spores in Clinical Samples. J. Clin.Microbiol., 2002, Vol. 40, №. 11, P. 4399.

87. Tovey E. R., Baido В. A. I I Comparison of semi-dry and conventional tank buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes. Electrophoresis, 1987, Vol 8, P. 384-387.

88. Ломтатидзе M. В. // Получение, характеристика и применение моноклональных антител к антигенам синегнойной палочки. Автореферат на соискание ученой степени кандидата медицинских наук./ Москва, 2004.

89. Dixon Т. С., Meselson М., Guillemin J. et al. Anthrax. // Anthrax. N. Engl. J. Med. 1999. - Vol. 341, № 11, - P. 815 - 826.

90. Collier R. J., Young J. A. Anthrax toxin. // Annu. Rev. Biol. 2003, Vol. 19, - P. 45 - 70.

91. Duesbery N. S., Webb C. P., Leppla S. H. et al. Proteolytic inactivation of MAP-kinase-kinase by anthrax lethal factor. // Sciense. 1998. - Vol. 280. - P. 734 - 737.

92. Moayeri M., Haines D., Young H. A. et al. Bacillus anthracis lethal toxin induces TNF-alpha-independent hypoxia-mediated toxicity in mice. // J. Clin. Invest. 2003. - Vol. 112, № 5 -- P. 670 - 682.

93. Watters J. W., Dewar K., Lehoczky J. et al. // KiflC, a kinesin-like motor protein, mediates mouse macrophage resistance to anthrax lethal factor. Curr. Biol.-2001.-Vol. 11, N 19. P. 1503 1511.

94. Leppla S. H., Robbins J. В., Schneerson R. et al. Development of an improved vaccine for anthrax. // J. Clin. Invest. 2002. Vol. 110, № 2 - P. 141 - 144.

95. Panchal R. G., Hermone A. R., Nguyen T. L. et al. Identification of small molecule inhibitors of anthrax lethal factor. // Mol. Biol. 2004. - Vol. 11, № l.-P. 67-72.

96. Turk В. E., Wong Т. Y., Schwarzenbacher R. et al. The structural basis for substrate and inhibitor selectivity of the anthrax lethal factor. // Biol. 2004. -Vol. 11,№ 1-P. 60-66.

97. Wild M. A., Xin H., Maruyama T. et al. Human antibodies from immunized donors are protective against anthrax toxin in vivo. // Nat. Biotechnol. -2003. Vol. 21, № 11 - P. 1305 - 1306.

98. Носков A.H., Кравченко Т.Б., Носкова В.П. Определение функционально активных доменов в молекуле летального фактора сибиреязвенного экзотоксина // Молекулярная генетика микробиология и вирусология. 1996. - № 3. - С. 20-22.

99. Leppla S. Н. // Bacterial Toxins and Virulence Factors in Disease / Eds J. Moos et al. New York, 1995. - Vol. 8. - P. 543 - 572.

100. Petosa C., Collier R. J., Klimpel K. R. et al. Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen. // Nature. 1997. - Vol. 385, N 6619. - P833 - 838.

101. Milne J. C., Collier R. J. pH-dependent permeabilization of the plasma membrane of mammalian cells by anthrax protective antigen. // Mol. Microbiol. 1993. - Vol. 10, № 3 - P. 647 - 655.

102. Finkelstein A. The channel formed in planar lipid bilayers by the protective antigen component of anthrax toxin. // Toxicology. 1994. Vol. 87. № 1-3 -P. 29-41.

103. Henchal E. A., Teska J.D., Ludwig G.V. et al. Current laboratory methods for biological threat agent identification // Clin. Lab. Med. 2001. - Vol. 21. -P. 661 -678.

104. Kijek T.M., Rossi C.A., Moss D. et al. Rapid and sensitive immunomagnetic-electrochemiluminescent detection of staphylococcal enterotoxin В //J. Immunol. Meth. 2000. -Vol.236. - P. 9 - 17.

105. Terry C. Dixon, B.S., Matthew Meselson, Ph.D. et al. Anthrax. // The new England journal of medicine. Vol. 341, № 11. P. 815-826.

106. Cunningham К., Lacy D. В., Mogridge J. et al. Mapping the lethal factor and edema factor binding sites on oligomeric anthrax protective antigen. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - Vol. 99, № 10. - P. 7049 - 7053.

107. Little S.F., Ivins B.E., Fellows P.F. et al. Defining a serological correlate of protection in rabbits for a recombinant anthrax vaccine. // Vaccine. 2004. -Vol. 22, №3-4 P. 422-430.

108. Reuveny S., White M.D., Adar Y.Y. et al. Search for correlates of protective immunity conferred by anthrax vaccine. // Infect Immun. 2001. - Vol. 69, № 5. - P.2888 - 2893.1. Методические рекомендации

109. По применению препаратов моноклональных антител (МкАт) для идентификации возбудителя сибирской язвы в ИФА.1.ВВЕДЕНИЕ

110. Флаконы с нарушенной целостностью, не имеющие этикетки, с измененным цветом, наличием плесени и посторонних примесей, к использованию не пригодны.

111. ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ1. АНТИТЕЛ

112. Принадлежность штаммов, изолятов рода Bacillus к виду Вас. anthracis устанавливают с помощью препаратов МкАт в иммуноферментном анализе (ИФА).

113. Флаконы с препаратами МкАт вскрывают в асептических условиях, и отбирают необходимое количество антител, учитывая указанную концентрацию и активность.

114. Методика разработана Романовым М.Г., Яковлевой И.В., Кирилловым J1.B., Свиридовым В.В.