Выявление и оценка диагностического значения гиперметилированных генов супрессоров при опухолях молочной железы и яичников тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.46, кандидат медицинских наук Потапова, Анна Анатольевна

• Потапова, Анна Анатольевна
• кандидат медицинских наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Потапова, Анна Анатольевна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Теории развития канцерогенеза.

1.1.1. Мутационная теория.

1. L .2. Эпигеномная теория.

1.1.3. Вирусная теория.

1.2. Протоонкогены и гены-супрессоры.

1.2.1. Гипотеза Кнудсона.

1.3. Механизмы действия генов-супрессоров.

1.3.1. Гены хранители клеточного цикла.

1.3.1.1. р16.

1.3.2. Гены общего контроля.

1.3.2.1. BRCA1, BRCA2.

1.4. Эпигенетические механизмы.

1.4.1. Метилирование-как вид эпигенетической модификации ДНК.

1.4.2. Метилирование ДНК в нормальных клетках.

1.4.3. Нарушения метилирования ДНК при канцерегенезе.

1.4.3.1. Тотальное гипометилирование генома.

1.4.3.2. Локальное гиперметилирование.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Сбор клинического материала.

2.2. Клеточные линии опухолей, использованные в работе.

2.3. Выделение геномной ДНК из клеточных линий опухолей.

2.4. Выделение геномной ДНК из лимфоцитов человеческой крови.

2.5. Выделение геномной ДНК из замороженных тканевых срезов.

2.6. Выделение геномной ДНК из тканевых срезов, фиксированных в парафине.

2.7. Бисульфитная модификация геномной ДНК.

2.8. Полимеразная цепная реакция.

2.8.1.Амплификация бисульфит-модифицированой геномной ДНК.

2.8.2.Амплификация бисульфит-модифицированой геномной ДНК с использованием метил-специфичной количественной ПЦР в реальном времени.

2.9. Обработка полученных данных методом статистического анализа.

2.10. Програмное обеспечение.

Глава 3. ОЦЕНКА СТАТУСА МЕТИЛИРОВАНИЯ ПРОМОТОРНОЙ ОБЛАСТИ ГЕНОВ СУПРЕССОРОВ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА ПРИ СПОРАДИЧЕСКОМ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ЯИЧНИКОВ.

Глава 4. АНАЛИЗ СТАТУСА МЕТИЛИРОВАНИЯ ИССЛЕДУЕМЫХ ГЕНОВ В ОБРАЗЦАХ МОРФОЛОГИЧЕСКИ НОРМАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ЛИМФОЦИТАХ ЧЕЛОВЕЧЕСКОЙ КРОВИ.■.

Глава 5. АНАЛИЗ СТАТУСА МЕТИЛИРОВАНИЯ ИССЛЕДУЕМЫХ ГЕНОВ ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ ВИДОВ ОПУХОЛЕЙ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ЯИЧНИКОВ.

Глава 6. АНАЛИЗ МЕТИЛИРОВАНОГО СТАТУСА ИССЛЕДУЕМЫХ ГЕНОВ В БИОПСИЙНОМ МАТЕРИАЛЕ, ПОЛУЧЕННОМ ОТ БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ЯИЧНИКОВ.

Глава 7. СТАТИСТИЧЕСКИЙ APIA ЛИЗ СТАТУСА МЕТИЛИРОВАНИЯ ИССЛЕДУЕМЫХ ГЕНОВ В ОПУХОЛЕВЫХ ОБРАЗЦАХ ДЛЯ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ЯИЧНИКОВ.

7.1. Сравнительный анализ статуса метилирования исследуемых генов в морфологически нормальных и опухолевых образцах для рака молочной железы и яичников.

7.2. Расчет диагностической чувствительности и специфичности для каждого исследованного гена при раке молочной железы и яичников.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выявление и оценка диагностического значения гиперметилированных генов супрессоров при опухолях молочной железы и яичников»

Актуальность работы

Гормонозависимые опухоли, в том числе рак молочной железы и рак яичников, являются одной из главных причин смертности среди женщин от злокачественных новообразований. К сожалению, в последние годы наблюдается значительный рост обоих заболеваний (В.Ф. Семиглазов, 2008).

Из 10 млн. новых случаев злокачественных опухолей различных органов, выявляемых в мире, 10% приходится на молочную железу (Аксель Е.М., 2005). Если оценивать только женскую популяцию удельный вес рака молочной железы возрастает до 22%. В промышленно развитых странах удельный вес злокачественных новообразований молочной железы еще выше - 27%. В Российской Федерации ежегодно выявляется около 47 тыс. новых случаев этого заболевания. (В.Ф. Семиглазов, 2008). В то же время рак яичников занимает 3 место в структуре заболеваемости женских половых органов по России. При этом смертность от этого заболевания находится на 1 месте и составляет 43,1 % от общего числа умерших от злокачественных новообразований женских половых органов (В.А.Медик и др., 2001).

Скрытое течение обоих заболеваний и трудности в диагностике приводят к тому, что до 80% случаев выявляются на поздних стадиях, а смертность от них стойко опережает смертность от рака тела и шейки матки вместе взятых (В. М. Мерабишвили и др., 2001).

Надежды сократить число смертей от данных заболеваний основаны на раннем выявлении патологии, точности прогноза и эффективном лечении болезни в ее начальной стадии. В связи с этим, очевидна необходимость поиска и внедрения в клиническую практику новых методов, которые сделают возможным определение злокачественных новообразований на ранних стадиях развития.

Известно, что одной из важнейших причин перерождения нормальной клетки в неопластическую является нарушение функционирования генов-супрессоров опухолевого роста. Изменения в работе этих генов приводят к возникновению и прогрессии развития рака, а восстановление функции -к существенному замедлению пролиферации опухолевых клеток. Исследования последнего десятилетия показали, что наряду с генетическими событиями, обуславливающими инактивацию клеточных генов вследствие структурных изменений в ДНК, важную роль в процессе канцерогенеза играют также эпигенетические явления, не затрагивающие первичную структуру ДНК, но влияющие на экспрессию генов (Jones et al., 2002). Одним из таких эпигенетических изменений является локальное гиперметилирование специфических последовательностей - CpG-островков, расположенных в 5'-регуляторных районах многих генов, которое влечет за собой подавление экспрессии гена либо в результате прямого ингибирования связывания транскрипционных факторов с ДНК, либо в результате привлечения корепрессоров транскрипции (Klose et al., 2006). До сих пор остается открытым вопрос о механизмах инициации гиперметилирования CpG-островков в процессе образования опухоли.

На данный момент известен ряд генов-супрессоров опухолевого роста, экспрессия которых нарушена вследствие гиперметилирования их CpG-островков и выявлена их ассоциация с различными видами опухолей (Esteller et al., 2002). В настоящее время все более актуальным становится поиск новых, ранее неизученных генов-супрессоров опухолевого роста, метилирование которых специфично для опухолей определенных видов, т.к. результаты подобных исследований открывают новые возможности, как для изучения механизмов канцерогенеза, так и для разработки методов диагностики, мониторинга, прогноза и терапии опухолей.

Тема диссертации является составной частью плана научно-исследовательской работы Волгоградского государтсвенного медицинского университета и утверждена на заседании Ученого совета Волгоградского государственного медицинского университета (протокол № 9 от «16» мая 2007г.)

Цель исследования:

Целью данного исследования является анализ метилированого статуса генов-супрессоров опухолевого роста, а также новых кандидатов в гены-супрессоры опухолевого роста, которые могут являться потенциальными маркерами опухолей молочной железы и яичников.

Задачи исследования:

1. Подбор для исследования генов-супрессоров опухолевого роста, а также новых кандидатов в гены-супрессоры опухолевого роста путем скрининга существующих библиотек генов и научных статей, принимая за критерий отбора снижение или полное отсутствие экспрессии этих генов при опухолях молочной железы и яичников.

2. Анализ статуса метилирования отобранных генов в морфологически нормальных тканях, первичных опухолях и клеточных линиях карцином молочной железы и яичников.

3. Отбор генов инактивированных в опухолях в результате метилирования, но в тоже время не метилированых в морфологически нормальных тканях молочной железы и лимфоцитах человеческой крови.

4. Определение диагностической чувствительности и специфичности маркеров метилирования при анализе биопсийного материала карцином молочной железы и яичников.

5. Создание диагностических панелей из отобранных генов для анализа биопсийного материала, полученного от пациентов с опухолями молочной железы и яичников.

Научная новизна работы

В результате работы с научной литературой, для оценки статуса метилирования промоторной области генов супрессоров опухолевого роста при спорадическом раке молочной железы и яичников, были отобраны 12 генов. Все гены имеют в составе своих промоторов CpG-островки и транскрипционно активны в клетках морфологически нормальной молочной железы и поверхностном эпителии яичников.

При анализе статуса метилирования CpG-островков двенадцати отобранных генов в клеточных линиях рака молочной железы и яичников, а так же морфологически нормальной ткани молочной железы и лимфоцитах человеческой крови, было показано, что гены RASSF1 А, Р16, RARP, АРС, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, MAL, OPCML и DKK1 метилированы в клеточных линиях, но не метилированы в норме.

Был проведен статистический анализ статуса метилирования генов RASSF1A, Р16, RARp, АРС, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, MAL, BRCA1, OPCML и DKK1 в нормальных и клинических образцах рака молочной железы и яичников различных стадий. Результат наличия метилирования в клинических образцах и его отсутствие в нормальных образцах делает возможным использование генов RASSF1A, Р16, RARJ3, АРС, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, MAL, BRCA1, OPCML и DKK1 в лабораторной диагностике рака молочной железы и яичников.

Практическая ценность работы

В результате проведенных исследований было показано, что комбинация генов RASSFA1, HIN1, MAL позволяет диагностировать опухоль молочной железы с чувствительностью 98%, а комбинация генов BRCA1, MAL, DKK1 - злокачественную опухоль яичников с чувствительностью 94%. Полученные данные являются экспериментальным обоснованием для разработки скрининговых тест-систем с целью диагностики рака молочной железы и яичников. Использование таких систем служит одним из новых молекулярно-биологических методов диагностики.

Материалы исследования также представляют интерес для получения новых дополнительных знаний об участии генов супрессоров опухолевого роста в процессе канцерогенеза, а также расширения понимания роли эпигенетических факторов в регуляции экспрессии этих генов при злокачественной трансформации клетки.

Реализация результатов исследования

Панели метилированных генов, составленные в результате проведенного исследования, используются в научной лаборатории ракового центра Фокс Чейз (Филадельфия, США) при анализе клинических образцов для изучения функционирования этих генов при раке молочной железы и яичников. А так же внедрены в практику работы Волгоградского Областного Онкологического диспансера.

Результаты исследования, отражающие молекулярные механизмы канцерогенеза и иллюстрирующие новые подходы в диагностике онкологических заболеваний включены в лекционные курсы по молекулярной биологии, медицинской генетики и клинической биохимии Волгоградского государственного медицинского университета и курсы лекций по клинической лабораторной диагностике Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. академика И.П.Павлова

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Гены RASSF1A, Р16, RAR0, АРС, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF и MAL метилированы в клеточных линиях рака молочной железы, но не метилированы в морфологически нормальных тканях молочной железы.

2. Установлено наличие метилирования генов RASSF1A, RARj3, АРС, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF и MAL в образцах карцином молочной железы всех стадий.

3. Гены MAL, OPCML, HIN1, BRCA1 и DKK1 метилированы в клеточных линиях карцином яичников, но не метилированы во всех образцах лимфоцитов крови, полученных от людей без онкологических заболеваний.

4. Выявлено наличие метилирования генов MAL, OPCML, HIN1, BRCA1 и DKK1 в образцах карцином яичников всех стадий.

5. Диагностическая чувствительность панели генов (RASSF1 A, MAL, HIN1) для выявления рака молочной железы составляет 98%, а при раке яичников она достигает 94% в случае одновременного определения статуса метилирования комбинации генов MAL, DKK1, BRCA1.

Апробация работы

Основные результаты работы докладывались на международных конференциях: «97th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research» (Washington, DC, USA, April 1-5, 2006); «15th SPORE meeting National Institutes of Health (Baltimore, MD,USA, 2007); «99th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research» (San Diego, CA,

USA April 12-16, 2008); XLVI международная научная студенческая конференция "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2008).

Диссертация обсуждена на совместном заседании кафедр теоретической биохимии с курсом клинической биохимии, молекулярной биологии и генетики, биологии, патологической анатомии с участием НИИ фармакологии, ФГУЗ НИПЧИ (6 мая 2009 года, протокол № 14).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи в реферируемых журналах.

Структура и объем диссертации

Заключение диссертации по теме «Клиническая лабораторная диагностика», Потапова, Анна Анатольевна

ВЫВОДЫ.

1. Промоторные области генов RASSFIA, Р16, RARp, АРС, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, MAL оказались не метилированы в образцах морфологически нормальной ткани молочной железы.

2. Гены RASSFIA, Р16, RARp, АРС, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, MAL были метилированы хотя бы в одной из пяти изученных клеточных линий рака молочной железы.

3. Во всех образцах все проанализированные гены метилированы при злокачественных новообразованиях молочной железы, при этом гены RASSFIA, RARp, АРС, HIN1, CTGF и MAL имеют высокую диагностическую чувствительность, а гены GSTP1, NTRK2 и Р16 обладают низкой диагностической чувствительностью.

4. Наиболее высокая диагностическая чувствительность при раке молочной железы достигается при совместном метилировании генов RASSFIA, MAL, HIN1 и составляет 98%.

5. Промоторные области генов MAL, OPCML, HIN1, BRCAl и DKK1 были не метилированы во всех образцах лимфоцитов крови, полученных от людей без онкологических заболеваний.

6. Гены MAL, OPCML, HIN1, DKK1 за исключением гена BRCA1 оказались метилированы хотя бы в одной из пяти исследуемых клеточных линий рака яичников.

7. Выявлено, что промоторные области всех проанализированных генов метилированы при злокачественых новообразованиях яичников, при этом гены OPCML и MAL имеют высокую диагностическую чувствительность, а гены HIN1, BRCA1 и DKK1 обладают низкой диагностической чувствительностью.

8. Установлено, что при раке яичников оптимальная диагностическая чувствительность достигается комбинацией генов MAL, DKK1, BRCA1 и составляет 94%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Характерной чертой опухолевых и трансформированных in vitro клеток млекопитающих является дисбаланс метилирования геномной ДНК, который вносит значительный вклад в создание генетической и фенотипической нестабильности. В тоже время, нестабильность 5-МеС в составе CpG динуклеотидов, приводящая к эпимутациям, может иметь тот же конечный результат. Таким образом, метилирование, являясь эпигенетической модификацией ДНК, может в случае нарушения приводить к генетическим изменениям, делая очевидной взаимосвязь между генетическими и эпигенетическими процессами при возникновении и развитии опухоли.Нарушение паттерна метилирования проявляется на ранних стадиях злокачественной трансформации клеток млекопитающих.

Таким образом определение статуса метилирования новых кандидатов в гены супрессоры опухолевого процесса является перспективным направлением исследований с целью создания новых высокоэффективных диагностических тестов для выявления злокачественных новообразований.

Представляется обоснованным следующий дизайн исследования, реализованный в данной работе. На первом этапе работа с существующими базами данных и выявление генов, имеющих нарушение уровня экспресии в сторону его понижения при опухолевом процессе. Затем исследование статуса метилирования промоторной зоны этих генов. На заключительном этапе необходимо провести оптимизацию панелей генов, при помощи анализа чувствительности и специфичности.

Реализация описанного подхода позволила нам предложить оптимальные наборы генов для диагностики злокачественных опухолей молочной железы и яичников. Комбинация RASSFA1, HTN1, MAL позволяет диагностировать опухоль молочной железы с чувствительностью 98%, а комбинация BRCA1, MAL, DKK1 позволяет диагностировать злокачественную опухоль яичников с чувствительностью 94%.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Потапова, Анна Анатольевна, 2009 год

1. Абелев, Г.И. Что такое опухоль? / Г.И. Абелев // Соросовский Образовательный Журнал. 1998.- № 11.- С. 85-90.

2. Аксель, Е.М. Статистика рака молочной железы в Москве/ Е.М. Аксель, Э.А. Михайлов // Вопросы онкологии. 2005.-№6. -С.656-658.

3. Баранова, А.В. Гены супрессоры опухолевого роста / А.В Баранова, Н.К. Янковский//Молекулярная биология. - 1998. - Т.32.- С.206-218.

4. Гвоздев, В.А Механизмы регуляции активности генов в процессе транскрипции / В.А. Гвоздев // Соросовский Образовательный Журнал.-1998.-№ 2,- С. 22-31.

5. Гвоздев, В.А. Регуляция активности генов, обусловленная химической модификацией (метилированием) ДНК / В.А. Гвоздев // Соросовский Образовательный Журнал.- 1999.-№4.- С.15-17.

6. Гиббс, У. Рак: как распутать клубок?: Пер. С англ. / У. Гиббс // В мире науки.-2003.-№ 10.-С.55-85.

7. Жимулев, И.Ф. Общая и молекулярная генетика, 4-е изд./ И.Ф. Жимулев -Сибирское университетское изд-во, 2007. 479с.

8. Заридзе, Д.Г. Канцерогенез / Д.Г. Заридзе М.: Научный мир, 2000. -418с.

9. Карпов, B.JT. От чего зависит судьба гена / В.Л. Карпов // Биотехнология.- 2005.-ЖЗ.-С.10-11.

10. Киселев, Л.Л. Геном человека и биология XXI века / Л.Л. Киселев // Вестник Российской Академии наук. -2000.-Т.70.-№5.-С.412-424.

11. Киселев, С.Л. Эмбриональные стволовые клетки человека / С.Л. Киселев, М.А. Лагарькова //Природа.-2006.-№10.-С.31-32.

12. Кобзарь А.И. Справочник для инженеров и научных работников / А.И. Кобзарь. -М.: Физматлит, 2006.-814с.

13. Корочкин, Л.И. Как гены контролируют развитие клеток / Л.И. Корочкин // Соросовский Образовательный Журнал.- 1996. -№ 1.- С.17-22.

14. Лихтенштейн, А.В. Метилирование ДНК в канцерогенезе / А.В. Лихтенштейн, Н.П. Киселева //Биохимия.-2001.-№66.-С.293-317.

15. Логинов, В.И. Районы потенциальных генов-супрессоров эпителиальных опухолей почки, молочной железы и яичников на хромосоме 3 человека / В.И. Логинов, И.В. Базов // Генетика. -2008.- Т. 44.-№ 2.-С. 250-256.

16. Логинов, В.И. Уровень метилирования гена RASSF1A в эпителиальных опухолях почки, молочной железы и яичников/ В.И. Логинов, А.В. Малюкова//Молекуляр. биология.-2004.-Т.38.- С.654-667.

17. Новик, А.А. Генетика в клинической медицине / А.А. Новик, Т.А. Камилова, В.Н. Цыган. СПб.: Изд-во ВМедА, 2001.- 219 с.

18. Райе, Р.Х. Биологические эффекты токсических соединений / Р.Х. Райе, Л.Ф. Гуляева. Новосибирск: изд-во НГУ, 2003.-208с.

19. Свердлов, Е.Д. «Гены рака» и передача сигнала в клетке/ Е.Д. Свердлов // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.-1999.-№ 5.-С.З-22.

20. Семиглазов, В.Ф. Скрининг рака молочной железы / В.Ф. Семиглазов //Медицинский вестник. 2008.-№ 35.- С.-462.

21. Сойфер, В.Н. Репарация генетических повреждений / В.Н. Сойфер // Соросовский Образовательный Журнал.- 1997.-№ 8.- С.4-13.

22. Янковский, Н.К. Наша история, записанная в ДНК / Н.К. Янковский, С.А. Боринская // Природа,- 2001.-№ 6. -С. 10-17.

23. Ahuja, N. Aging and DNA methylation in colorectal mucosa and cancer/ N. Ahuja, Q. Li // Cancer Res. -1998- Vol. 23- P.5489-5494.

24. Angeloni, D. Molecular analysis of deletions in human chromosome 3p21 and the role of resident cancer genes in disease / D. Angeloni // Brief. Funct. Genomic Proteomic.- 2007-Vol.6. -P. 19-39.

25. Antequera, F. Number of CpG islands and genes in human and mouse / F. Antequera, A. Bird // Proc.NatJ.Acad.Sci.-1993-Vol. 90- P.l 1995-11999.

26. Araujo, F.D. Concurrent replication and methylation at mammalian origins of replication / F.D. Araujo, J.D. Knox // Mol Cell Biol.-1998-Vol.18-P.3475-3482.

27. Bachman, K.E. Methylation-associated silencing of the tissue inhibitor of metalloproteinase-3 gene suggest a suppressor role in kidney, brain, and other human cancers / K.E. Bachman, J.G. Herman //.Cancer Res. -1999 -Vol.4- P.798-802.

28. Baylin, S. B. Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect-of neoplasia / S.В. Baylin, J.G. Herman, J.R. Graff// Adv Cancer Res. -1998-Vol.72-P.141-196.

29. Belinsky, S.A. Aberrant methylation of p 161NK4a is an early event in lung cancer and potential biomarker for early diagnosis / S.A. Belinsky, K.J. Nikula, W.A. Palmisano // Proc. Natl. Acad. Sci. USA-1998-Vol.95-P.l 189111896.

30. Bestor, Т.Н. DNA methyltransferases / Т.Н. Bestor, G.L. Verdin // Caix.Opin. Cell Biol. 1994 -Vol.259-P.946-951.

31. Bestor,Т. H. DNA methylation: evolution of a bacterial immune function into a regulator of gene expression and genome structure in higher eukaryotes / Т.Н. Bestor//Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci. -1990-Vol.326-P.179-187.

32. Bhattacharya, S.K. A mammalian protein with specific demethylase . activity for mCpG DNA / S.K. Bhattacharya, S. Ramchandani, N. Cervoni //

33. Nature.-1999-Vol.397-P.579-583.

34. Bignell, G. Sequence analysis of the protein kinase gene family in human testicular germ-cell tumors of adolescents and adults / G. Bignell // Genes Chromosomes Cancer.- 2006-Vol.45-P.42-46.

35. Bird, A. Studies of DNA methylation in animals / A. Bird, P. Tate, X. Nan // J Cell Sci Suppl-1995-Vol.l9-P.37-39.

36. Bird, A.P. Functions for DNA methylation in vertebrates / A. Bird // Cold Spring Harb Symp Quant Biol.-1993-Vol.58-P.281-285.

37. Blin, N.A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes / N. Blin, D.W. Stafford // Nucleic Acids Res. -1976-Vol.3-P.2303.

38. Boyes, J. Repression of genes by DNA methylation depends on CpG density / J. Boyes, A. Bird // EMBO J.-1992-Vol. l l-P.327-333.

39. Brehm, A. Retinoblastoma protein mmets chromatin / A. Brehm, T. Kouzaridies // Trends in biochemical sciences.- 1999-Vol.24-P.142-145.

40. Bronner, C.E.Mutation in the DNA mismatch repair gene homologue hMLHl is associated with hereditary non-polyposis colon cancer / C.E. Bronner, S.M. Baker//Nature. -1994-Vol.368-P.258-261.

41. Buchkovich, K. The retinoblastoma protein is phosphorylated during specific phases of the cell cycle. / K. Buchkovich, L.A. Duffy, E. Harlow // Cell. -1989- Vol.6 -P.1097-1105.

42. Cairns, P. Gene methylation and early detection of genitourinary cancer: the road ahead / P. Caims // Nature Rev. Cancer -2007-Vol.7-P.531-543.

43. Campo, E. Prognostic significance of the loss of heterozygosity of Nm23-H1 and p53 genes in human colorectal carcinomas / E. Campo, R. Miquel, P. Jares // Cancer. -1994-Vol.73-P.2913-2921.

44. Chellappan, S.P. The E2F transcription factor is a cellular target for the RB protein. / S.P. Chellappan, S. Hiebert, M. Mudryj // Cell. -1991-Vol.6-P.1053-1061.

45. Chen, H. Loss of OPCML expression and the correlation with CpG island methylation and LOH in ovarian serous carcinoma / H. Chen, F. Ye // Eur. J. Gynaecol. Oncol.-2007-Vol.28-P.464-467.

46. Chen, R.Z. DNA hypomethylation leads to elevated mutation rates / R.Z. Chen, U. Pettersson, C. Beard // Nalure.-1998-Vol.395- P.89-92.

47. Choi, C.H. Hypermethylation and loss of heterozygosity of tumor suppressor genes on chromosome 3p in cervical cancer / C.H. Choi, K.M. Lee, J.J. Choi // Cancer Letters.- 2007-Vol.255.-P.26-33.

48. Chunming, D. Cantor Direct molecular haplotyping of long-range genomic DNA with Ml-PCR / D. Chunming, R. Charles // PNAS.- 2003 -Vol. 5-P.123-145.

49. Clark, S.J. Spl binding is inhibited by (m)Cp(m)CpG methylation / S.J. Clark, J. Harrison, P.L. Molloy // Gene.-1997-Vol.l95-P.67-71.

50. Coleman, K. Syntactic structure analysis in uveal melanomas. / K. Coleman, P.J. Diest, J.P. Baak// Br J Ophthalmol. -1994 -Vol.1 l-P.871-874.

51. Cooper, D.L. Methyl-directed mismatch repair is bidirectional / D.L. Cooper, R.S. Lahue, P. Modrich // J Biol Chem-1993-Vol. 268-P.l 1823-11829.

52. Costa, A. p53 gene point mutations in relation to p53 nuclear protein accumulation in colorectal cancers / A. Costa, R. Marasca, В. Valentinis // J Pathol-1995-Vol. 176-P.45-53.

53. Cunningham, C. Genetics of colorectal cancer / C. Cunningham, M.G. Dunlop // Br Med Bull.-1994-Vol.50-P.640-655.

54. Dobrovic, A. Methylation of the BRCA1 gene in sporadic breast cancer./

55. A. Dobrovic, D. Simpfendorfer // Cancer Res.-1997-Vol.16- P.3347-3350.

56. Dyson, N. Oncogenes and cell proliferation / N. Dyson, A. Balmain // Curr Opin Genet Dev.- 1999-Vol.l -P.ll-14.

57. Dyson, N. The regulation of E2F by pRB-family proteins./ N. Dyson // Genes Dev.-1998.-Vol.15 -P.2245-2262.

58. Erkko, H. A recurrent mutation in PALB2 in Finnish cancer families / H. Erkko, B. Xia // Nature.- 2007-Vol.446 -P.316-319.

59. Esteller, M. Cancer epigenetics and methylation./ M. Esteller, J.G. Hermann//Science.- 2002 -Vol. 5588- РЛ807-1808.

60. Esteller, M. Promoter hypermathylation and BRCA1 inactivation in sporadic breast and ovarian tumors / M. Esteller, J.M. Silva // J. Natl. Cancer -Inst.-2000-Vol.92-P.-564-569.

61. Fearon, E.R. A genetic model for colorectal tumorigenesis / E.R. Fearon,

62. B. Vogelstein//Cell. -1990-Vol.61- P.759-767.

63. Feinberg, A.P. The history of cancer epigenetics / A.P. Feinberg, B. Tycko // Nature Rev. Cancer.-2004-Vol.4-P. 143-153.

64. Fishel, R.The human mutator gene homolog MSH2 and its association with hereditary nonpolyposis colon cancer published erratum appears in Cell / R. Fishel, M. Lescoe // Cell.-1994-Vol.75-P.1027-1038.

65. Ford, D. Risks of cancer in BRCA1-mutation carriers. Breast Cancer Linkage Consortium / D. Ford, D.F. Easton, D.T. Bishop // Lancet. -1994 -Vol. 8899- P.692-695.

66. Futscher, B.W. Role for DANN methylation of cell type specific maspin expression / B.W. Futscher, M.M. Oshiro // Nat. Genet.-2002-Vol.2-P.175-179.

67. Gardiner-Garden, V. CpG islands in vertebrate genomes / V. Gardiner-Garden, M. Frommer // J.Mol.Biol.-1987-Vol.l96- P.261-268.

68. Gayther, S.A. Regionally clustered APC mutations are associated with a severe phenotype and occur at a high frequency in new mutation cases ofadenomatous polyposis coli / S.A. Gayther, D. Wells // Hum Mol Genet.-1994-Vol. 3-P.53-56.

69. Greenblatt, M. S. Mutations in the p53 tumor suppressor gene: clues to cancer etiology and molecular pathogenesis / M.S. Greenblatt, W.P. Bennett, M. Hollstein // Cancer Res.-1994-Vol. 54-P.4855-4878.

70. Groeger, A.M. Independent prognostic role of pi6 expression in lung cancer / A.M. Groeger, M. Caputic, V. Espositoa // J Thorac Cardiovasc Surg.-1999-Vol.3 -P. 529-535.

71. Hanski, C. Low frequency of p53 gene mutation and protein expression in mucinous colorectal carcinomas / C. Hanski, F. Tiecke, M. Hummel // Cancer Lett. -1996-Vol.l03-P. 163-170.

72. Hanski, C. Is mucinous carcinoma of the colorectum a distinct genetic, entity? / C. Hanski // Br J Cancer. -1995-Vol.72-P.1350-1356.

73. Hendrich, B. Identification and characterization of a family of mammalian methyl-CpG binding proteins / B. Hendrich, A. Bird // Mol Cell Biol.-1998-Vol. 18-P. 6538-6547.

74. Herman, J.G. Silencing of the VHL tumor-supressor gene by DNA methylation in renal carcinoma / J.G. Herman, F. Latif // Proc. Natl. Acad. Sci. USA-1994-Vol.91 .-P.9700-9704.

75. Hermanek, P. Prognostic factors in rectal carcinoma. A contribution of the further developnemt of tumor classification / P. Hermanek, U. Mansmann, D. Staimmer // Dis Colon Rectum.-1989-Vol.32-P.593-599.

76. Huschtscha, L.I. Loss of pl6INK4 expression by methylation is associated with lifespan extension of human mammary epithelial cells / L.I. Huschtscha, J.R. Noble // Cancer Res.-1998-P.3508-3512.

77. Ikediobi, O.N. Mutation analysis of 24 known cancer genes in the NCI-60 cell line set / O.N. Ikediobi, H. Davies, G. Bignell // Mol Cancer Ther. -2006-Vol.5- P.2606-2612.

78. Issa, J.P. Methylation of the oestrogen receptor CpG island links ageing and neoplasia in human colon. / J.P. Issa, Y.L. Ottaviano, P. Celano // Nat Genet.-1994-Vol.4- P.536-540.

79. Jessup, J. M. The biology of colorectal carcinoma / J.M. Jessup, G.E. Gallick // Curr Probl Cancer-1992-Vol. 16- P.261-328.

80. Jin, Z. Adenomatus polyposis coli (APC) gene promoter hypermethylation in primary breast cancers / Z. Jin, G. Tamura // Br. J. Cancer.-2001-Vol.85-P.69-73.

81. Jirtl, R.L. Genomic imprinting and cancer / R.L. Jirtl // Exp. Cell Res.-1999-Vol. 248- P. 18-24.

82. Jones, P.A. The fundamental role of epigenetic events in cancer / P.A. Jones, S.B. Baylin // Nature Rev. Genet.-2002-Vol.3-P.415-428.

83. Jones, P.A. De novo methylation of the MyoDl CpG island during the establishment of immortal cell lines / P.A. Jones // Natl Acad Sci. -1990-Vol.16-P.6117-6121.

84. Kass, S. U. DNA methylation directs a time-dependent repression of transcription initiation / S.U. Kass, N. Landsberger, A.P. Wolffe // Curr Biol.-. 1997-Vol.7-P. 157-165.

85. Kennett, S.B. Sp3 encodes multiple proteins that differ in their capacity to stimulate or repress transcription. / S.B. Kennett // Nucleic Acids Res.-1997-Vol.l5-P. 3110-3117.

86. Kinzler, K.W. Cancer-susceptibility genes. Gatekeepers and caretakers / K.W. Kinzler, B.Vogelstein // Nature. -1997-Vol.386-P.761-763.

87. Kisseljova, N.P. De novo methylation of selective CpG dinucleotide clusters in transformed cells mediated by an activated N-ras / N.P. Kisseljova, E.S. Zueva, V.S. Pevzner // Int J Oncol.-1998-Vol.l2-P.203-209.

88. Klose, R.J. C-domain-containing proteins and histone demethylation / R.J. Klose, E.M. Kallin, Y. Zhang // Nat Rev Genet.- 2006 -Vol.9 -P.715-727.

89. Knudson, A. Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma / A. Knudson //Proc Natl Acad Sci. -1971-Vol.4 -P.820-823.

90. Lapidus, R.G. The loss of estrogen and progesterone receptor gene expression in human breast cancer./ R.G. Lapidus, S.J. Nass, N.E. Davidson // J Mammary Gland Biol Neoplasia.-1998 -Vol.1-P.85-94.

91. Lee, W. H. The retinoblastoma gene: from its basic umderstanding as a signal mediator for growth fnd differentiation to its use in the treatment qf cancer / W.H. Lee, E.Y. Lee // Gan To Kagaku Ryoho. -1997-Vol.24-P. 1368-1380.

92. Lehmann, U. Quantitative assessment of promoter hypermethylation during breast cancer development / U. Lehmann, B. Hasemeier, R. Lilischkis // Am J Pathol. -2002-Vol.l60-P.605-612.

93. Lei, H. De novo DNA cytosine methyltransferase activities in mouse embryonic stem cells / H. Lei, S.P. Oh, M. Okano // Development.-1996-Vol.122-P.3195-3205.

94. Leonhardt, H. A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei / H. Leonhardt, A.W. Page, H.U. Weier// Cell. -1992-Vol.71-P. 865-873.

95. Li, E. Role for DNA methylation in genetic impinting / E. Li, C. Beard, R. Jaenisch // Nature.- 1993-Vol. 366- P.362-365.

96. Luo, J. Determination of interaction mechanism of sensorgrams by analysis of binding kinetics / J. Luo, J. Zhou, W. Zou // J Protein Chem. -1999 -Vol.6-P.709-719.

97. Monk M. Changes in DNA methylation during mouse embryonic development in relation to X-chromosome activity and imprinting / M. Monk // Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci.-1990-Vol.326-P.299-312.

98. Myohanen, S.K. Hypermethylation can selectively silence individual pl6ink4A alleles in neoplasia / S.K. Myohanen, S.B. Baylin, J.G. Herman // Cancer Res.-1998-P.591-593.

99. Nelson, W.G. Prostate canser / W.G. Nelson, A.M. De Marzo // N. Engl. J.Med.-2003-Vol.349-P.366-381.

100. Noyer-Weidner, M. Methylation of DNA in prokaryotes / M. Noyer-Weidner, T.A. Trautner //EXS-1993-Vol.64-P.39-108.

101. Nuovo, G.J. In situ detection of the pl6 gene as an early event in oncogenesis / G.J. Nuovo, T.W. Plaia // Proc. Natl. Acad. Sci. USA-1999-Vol.96-P.-l 2754-12759.

102. Oei, S.L. Clusters of regulatory signals for RNA polymerase II transcription associated with Alu family repeats and CpG islands in human promoters / S.L. Oei, V.S. Babich // Genomics.-2004 -Vol.5-P.873-882.

103. Okano, M. Dnmt2 is not required for de novo and maintenance methylation of viral DNA in embryonic stem cells / M. Okano, S. Xie, E. Li // Nucleic Acids Res.-1998-Vol.26-P.2536-2540.

104. Okano, M. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development / M. Okano, D.W. Bell, D.A. Haber // Cell.-1999-Vol.99-P.247-257.

105. Olopade, O.I. Molecular analysis of deletions of the short arm of chromosome 9 in human gliomas./ O.I. Olopade, R.B. Jenkins, D.T. Ransom // Cancer Res.- 1992-Vol .9-P.2523-2529.

106. Pogribny, I.P. A sensitive new method for rapid detection of abnormal methylation patterns in global DNA and within CpG islands / LP. Pogribny, P. Yi, S.J. James // Carcinogenesis.-1999-Vol. 16-P.2863-2867.

107. Pretlow, T. P. K-ras mutations in putative preneoplastic lesions in human colon / T.P. Pretlow, T.A. Brasitus, N.C. Fulton // J Natl Cancer Inst. -1993-Vol. 85-P.2004-2007.

108. Rahman, N. PALB2, which encodes a BRCA2-interacting protein, is a breast cancer susceptibility gene / N. Rahman, S. Seal, D. Thompson // Nat Genet.- 2007-Vol.39 -P. 165-167.

109. Razin, A. DNA methylation and embryogenesis / A. Razin, H. Cedar // EXS.-1993-Vol.64-P.343-357.

110. Razin, A. DNA methylation in early development / A. Razin, R. Shemer // Hum.Mol.Genetics.-1995-Vol.4-P. 1751-1755.

111. Reid, S. Biallelic mutations in PALB2 cause Fanconi anemia subtype FA-N and predispose to childhood cancer / S. Reid, D. Schindler, H. Hanenberg // Nat Genet. -2007-Vol.39-P. 162-164.

112. Robertson, K.D. The human DNA methyltransferases (DNMTs) 1, 3a and 3b: coordinate mRNA expression in normal tissues and overexpression in tumors / K.D. Robertson, E. Uzvolgyi, G. Liang // Nucleic Acids Res. -1999-Vol.27-P.2291-2298.

113. Robertson, K.D. DNA methylation: past, present and future directions / K.D. Robertson, P.A. Jones // Carcinogenesis.-2000-Vol. 21-P.461-467.

114. Ryan, G. Repression of Pax-2by. WT-I during normal kidney development / G. Ryan, V. Steele-Perkines, J.F. Morris // Development.-1995-Vol.l21-P.867-875.

115. Sasaki, H. DNA methylation and genomic imprinting in mammals / H. Sasaki, N.D. Allen, M. Azin // EXS.-1993-Vol.64-P.469-486.

116. Schmutte, C. Mechanisms for the involvement of DNA methylation in colon carcinogenesis / C. Schmitte, S.A. Yang, T. Tudung // Cancer Res.-1996-Vol.56-P.2375-2381.

117. Schmutte, C. Mutagenicity of nitric oxide is not caused by deamination of cytosine or 5-methylcytosine in double-stranded DNA / C. Schmitte, W.M. Rideout // Carcinogenesis.-1994-Vol.l5-P.2899-2903.

118. Scully, R. Association of BRCAl with Rad51 in mitotic and meiotic cells./ R. Scully, J. Chen, A. Plug // Cell. 1997-Vol.2-P.265-275.

119. Selker, E.U. Tissue-specific silencing of a transgene in rice / E.U. Selker // Cell.-1999-Vol.6-P.56-58.

120. Serrano, M. Role of the INK4a locus in tumor suppression and cell mortality./ M. Serrano, H. Lee, L. Chin // Cell.- 1996 -Vol.l-P. 27-37.

121. Sharma, G. Promoter hypermethylation of pl6 (INK4A), pl4(ARF), CyclinD2 and Slit2 in serum and tumor DNA from breast cancer patients / G. Sharma, S. Mirza, C.P. Prasad // Life Sci.- 2007-Vol.80- P.1873-1881.

122. Shigematsu, H. Aberrant methylation of HIN-1 (high in normal-1) is a frequent event in many human malignancies / H. Shigematsu, M. Suzuki // Int. J. Cancer.-2005-Vol.l 13-P.600-604.

123. Singer-Sam, J. X chromosome inactivation and DNA methylation / J. Singer-Sam, A.D. Riggs // EXS.-1993-Vol.64-P.358-384.

124. Sjoblom, T. The consensus coding sequences of human breast and colorectal cancers / T. Sjoblom, S. Jones, L.D. Wood // Science.- 2006-Vol.314-P.268-274.

125. Smith, A. J. Somatic APC and K-ras codon 12 mutations in aberrant crypt foci from human colons / A.J. Smith, H.S. Stern // Cancer Res. -1994-Vol.54-P.5527-5530.

126. Tam, K.F. Methylation profile in benign, borderline and malignant ovarian tumors / K.F. Tam, V.W. Liu, S.S. Liu // J. Cancer Res. Clin. Oncol.-2007- Vol. 133.-P.331-341.

127. Tischkowitz, M. Analysis of PALB2/FANCN-associated breast cancer families / M. Tischkowitz, B. Xia, N. Sabbaghian // Proc Natl Acad Sci. 2007-Vol.l04-P.6788-6793.

128. Toyota, V.CpG island methylator phenotypes in aging and cancer / V. Toyota, J. Issa // Sem.Canser Biol.-1999-Vol.9- P.349-357.

129. Tuker M.S. Basic Mechanisms and Clinical Applications / M.S. Tuker // Semin Cardiothorac Vase Anesth.- 1999-Vol. 7- P.253.

130. Vertino, P.M. De novo methylation of CpG island sequences in human fibroblasts overexpressing DNA (cytosine-5-)-methyltransferase / P.M. Vertino, R.W. Yen, J. Gao // Moll.Cell.Biol.-1996-Vol.l6-P.4555-4565.

131. Walsh, C.P. Transcription of IAP endogenous retroviruses is contained by cytosine methylation / C.P. Walsh, J.R. Chaillet, Т.Н. Bestor // Nature Genet.-1998-Vol.20-P.116-117.

132. Wicha, M.S. Cancer stem cells: an old idea—a paradigm shift / M.S. Wicha, S. Liu // Cancer Res.- 2006-Vol.66 -P.1883-1890.

133. Wilentz, R.E. Pathology of cancer of the pancreas./ R.E. Wilentz, R.H. Hruban // Surg Oncol Clin N Am. -1998-Vol.l-P.43-65.

134. Wu, Q. DNA methylation profiling of ovarian carcinomas and their in vitro models identifies HOXA9, HOXB5, SCGB3A1, and CRABP1 as novel targets / Q. Wu, R.A. Lothe // Mol. Cancer.-2007-Vol.6-P.45.

135. Xia, B. Control of BRCA2 cellular and clinical functions by a nuclear partner, PALB2 / B. Xia, Q. Sheng, K. Nakanishi // Mol Cell.- 2006-Vol.22-P.719-729.

136. Xia, B. Fanconi anemia is associated with a defect in the BRCA2 partner PALB2 / B. Xia, J.C. Dorsman, N. Ameziane // Nat Genet.- 2007-Vol.39~P.159-161.

137. Xie, S. Cloning, expression and chromosome locations of the human DNMT3 gene family / S. Xie, Z. Wang, M. Okano // Gene.-1999-Vol.236-P.87-95.

138. Yamashita, N. Frequent and characteristic K-ras activation and absence of p53 protein accumulation in aberrant crypt foci of the colon / N. Yamashita, T. Minamoto, A. Ochiai // Gastroenterology.-1995-Vol.108- P.434-440.

139. Yao, K.L. Examination of the DNA methylation properties in nontumorigenic and tumorigenic breast epithelial cell lines / K.L. Yao, K.J. Pienta // Anticancer Res.-1998-P.2575-2642.

140. Yebra, M.J. A cytosine methyltransferase converts 5-methylcytosine in DNA to thymine / M.J. Yebra, A.S. Bhagwat // Biochemistry. -1995-Vol.341. P. 14752-14757.

141. Yen, R.W. Isolation and characterization of the cDNA encoding human DNA methyltransferase / R.W. Yen, P.M. Vertino, B.D. Nelkin // Nucleic Acids Res.-1992-Vol. 20-P.2287-2291.

142. Yoder, J.A. A candidate mammalian DNA methyltransferase related to pmtlp of fission yeast / J. A. Yoder, Т.Н. Bestor // Hum Mol Genet.-1998-Vol.7-P. 279-284.

143. Yonezawa, S. Expression of mucin antigens in human cancers and its relationship with malignancy potential / S. Yonezawa, E. Sato // Pathol Int. -1997-Vol.47-P.813-830.