Полиморфные и STS-маркеры хромосомы 3 человека и локализация делеций на коротком плече хромосомы 3 в опухолях легкого, молочной железы и шейки матки тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Пугачева, Елена Михайловна

• Пугачева, Елена Михайловна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пугачева, Елена Михайловна

Оглавление

Введение

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.Гены - супрессоры рака

1.2. Подходы при локализации районов, содержащих гены-супрессоры рака

1.2.1. Цитогенетический анализ

1.2.2. Анализ аллельных потерь

1.2.3. Анализ нестабильности микросателлитных последовательностей

1.3. Тонкая локализация и идентификация генов в

клонированнных фрагментах ДНК

1.3.1. Noil-библиотеки для картирования генов человека, в том числе ассоциированных с развитием опухолей

1.3.2. CpG участки, их связь с NotI - клонами и генами

1.4. Делеционное картирование короткого плеча хромосомы 3 в опухолях легкого, молочной железы, шейки матки и других органов

1.4.1. Делении на коротком плече хромосомы 3 при раке легкого

1.4.2. Делеции на коротком плече хромосомы 3 при раке молочной железы

1.4.3. Делеции на коротком плече хромосомы 3 при раке женских репродуктивных органов

1.4.4. Делеции на коротком плече хромосомы 3 в опухолях других органов

1.5. Гены-кандидаты на хромосоме Зр

1.5.1. Область 3р13-р14

1.5.2. Область Зр21

1.5.3. Область Зр25

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Реактивы и ферменты

2.2 Буферные растворы

2.3. Бактериальные штаммы и плазмиды

2.4. Not! - библиотека и контиг космид

2.5. Выделение ДНК

2.5.1. Выделение ДНК плазмид и космид

2.5.2. Выделение геномной ДНК из ткани человека с помощью протеиназы К и экстракции фенол-хлороформом (Grimberg, 1989)

2.6. Расщепление ДНК рестриктазами и реакции лигирования

2.7. Получение компетентных клеток E.coli JM109 и их трансформация плазмидной ДНК

2.8. Электрофоретическое разделение ДНК

2.9. Определение нуклеотидной последовательности

2.10. Мечение олигонуклеотидных зондов с применением полинуклеотидкиназы фага Т4 и гибридизация по

С ау зерну

2.11. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2.12. Окрашивание фрагментов ДНК в ПААГ азотнокислым серебром (согласно Budowle et al., 1991)

2.13. Популяционная выборка для анализа новых полиморфных локусов

2.14. Сбор материала

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Новые маркеры на хромосоме 3 человека

3.1.1. Частота встречаемости и особенности распределения микросателлитов различных мотивов в составе Notl -библиотеки хромосомы 3 и контига космид из области 3р21.31

3.1.2. Микросателлиты в Notl-связующих и прыжковых клонах как маркеры генов

3.1.3. Получение и анализ реклонов, содержащих

микро сателлиты

3.1.4. Характеристика локусов микросателлитов с помощью ПЦР

3.1.5. Применение новых маркеров хромосомы 3

3.2. Делеционное картирование хромосомы Зр в трех видах эпителиального рака

3.2.1. Анализ аллельных потерь и нестабильности микросателлитов; учет потерь Н и L-аллелей

3.2.2, Аллельные изменения на коротком плече хромосомы 3 в образцах рака легкого

3.2.3. Аллельные изменения на коротком плече хромосомы 3 в образцах рака молочной железы

3.2.4, Аллельные изменения на коротком плече хромосомы 3 в образцах рака шейки матки

3.2.5. Сравнение аллельных изменений на хромосоме Зр в разных формах эпителиального рака

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Полиморфные и STS-маркеры хромосомы 3 человека и локализация делеций на коротком плече хромосомы 3 в опухолях легкого, молочной железы и шейки матки»

Введение

Поиск генов, подавляющих развитие опухоли (tumor suppressor genes), является важным подходом в изучении молекулярных основ канцерогенеза. С целью обнаружения генов-супрессоров проводят картирование областей ДНК, делетируемых в раковых клетках, и исследуют подавление роста опухоли под действием фрагментов ДНК из этих областей.

Анализ делеций ДНК в раковых клетках с помощью цитогенетических методов и с использованием полиморфных маркеров -первый этап в поиске генов-супрессоров. В злокачественных новообразованиях человека делении и перестройки обнаруживают на многих хромосомах: 3, 8, 9, 13, 17 и в других (Mertens, 1997; Todd et al., 1997; Fujii et al., 1998; Ingvarsson et al., 1998). В некоторых видах опухолей, например, в светлоклеточной карциноме почки и во всех видах рака легкого в наибольшей степени повреждается короткое плечо хромосомы 3 (Kok, 1997; Leong et al., 1998; Ulimann et al., 1998). Аллельные потери в области Зр обнаружены и в опухолях многих других органов: молочной железы, шейки матки, желудка, прямой кишки, яичников и мочевого пузыря (Chen et al., 1994; Jshwad et al., 1996; Su et al., 1998). Ряд наблюдений: высокая частота потери гетерозиготности в некоторых районах Зр, обнаружение в этих же районах гомозиготных делеций и активности подавления опухолевого роста позволяют предположить, что аллельные делеции в области Зр являются критическим событием в патогенезе некоторых видов рака. В связи с этим на коротком плече хромосомы 3 проводится интенсивный поиск генов, ассоциированных с развитием рака легкого, почки, шейки матки и других органов.

Представленная работа посвящена поиску генов-супрессоров рака на коротком• плече хромосомы 3. Первый этап работы состоял в формировании новых полиморфных и STS-маркеров Зр-плеча, необходимых для анализа и картирования областей, содержащих потенциальные гены-супрессоры. Полиморфные локусы микро сателлитов, расположенные непосредственно внутри или вблизи

генов, более надежны для исследования вовлеченности гена в заболевание, чем генетически сцепленные, но физически удаленные маркеры. Маркеры на основе таких локусов применяют также для локализации гена методом скрининга панелей гибридных клеточных линий и разнообразных клонотек с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Ранее для нуклеотидных последовательностей, прилежащих к NotI-участкам в Notl-связующих и Notl-прыжковых клонах хромосомы 3 человека (Zabarovsky et al., 1990), показано повышенное содержание CpG-островов, ассоциированных с генами, и последовательностей, гомологичных мРНК и известным генам (Allilcmets et al., 1994; Zabarovsky et al., 1995). В связи с этим, для создания маркеров к генам хромосомы 3 проведен скрининг на микросателлиты девяти мотивов 150 Notl-связующих и Notl-прыжковых клонов, субрегионально локализованных на хромосоме 3. Аналогичный поиск проведен также и для контига из 22 космид, покрывающих область гомозиготных делеций в районе Зр21.31, обнаруженных в опухолях легкого (Wei et al., 1997).

Полученные в этом исследовании данные по распределению микросателлитов девяти мотивов представляют самостоятельный интерес с точки зрения развития представлений о встречаемости в геноме повторяющихся последовательностей определенного типа. Так, в данной работе в ДНК обеих групп клонов выявлено трехкратное относительно генома человека в целом снижение частоты встречаемости СА-повторов и повышение частоты встречаемости мотивов CAG, GGA, ААТ, САС, AAAG, AATG и GATG, характерных для экзонов.

Делеционное картирование хромосомы Зр проводится в солидных опухолях разных локализаций в разных лабораториях мира. При этом, даже для одной формы рака, например светлоклеточного рака почки, результаты весьма противоречивы и в отношении положения областей, наиболее подверженных делециям, и в отношении доли концевых, внутренних и множественных делеций (Van den Berg et al. ,1996, 1997; Chudek et al., 1997; Shridar et al., 1997; Clifford et al., 1998). Расхождение результатов, по-видимому, связано с использованием различных наборов маркеров и с отличием методов отбора материала (применение микродиссекции или линий клеток). Сопоставление данных, полученных

для разных форм рака в разных лабораториях, по этим же причинам затруднено еще в большей степени. Тем не менее обнаруженные перекрывания делетируемых областей Зр в RCC и в опухолях легкого (Кок et al,, 1997), а также перекрывание гомозиготных делений в опухолях легкого и молочной железы (Todd et al., 1997; Selcido et al., 1998) позволяют предположить существование на Зр общих генов-супрессоров рака, участвующих в патогенезе разных форм рака. Для их обнаружения требуется детальное делеционное картирование этой хромосомы в разных формах рака в сопоставимых условиях: с применением одинаковой техники отбора материала и одной и той же панели маркеров. На втором этапе нашей работы было проведено такое делеционное картирование короткого плеча хромосомы 3 с использованием ДНК из 74 пар образцов эпителиальных опухолей трех локализаций (рак легкого, молочной железы и шейки матки) с использованием плотной панели ди-, три- и тетрамерных полиморфных маркеров (13 локусов). Применение техники микродиссекций при отборе большинства образцов тканей обеспечило высокое (не менее 70%) содержание опухолевых клеток в исследуемом материале. Полученные результаты позволили впервые корректно сравнить частоты нестабильности микросателлитов, аллельных потерь и делеций разного типа на хромосоме Зр в эпителиальных опухолях разной локализации. Представление полученных данных в виде профилей аллельных потерь на Зр для трех разных форм эпителиального рака позволило определить критические зоны для каждой из форм и участки их перекрывания, потенциально содержащие гены-супрессоры, общие для нескольких форм. Следует отметить, что аналогичных исследований отдельных хромосом в нескольких формах рака методом аллелотинирования ранее не проводилось.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 Л.Гены - супрессоры рака

Рак ~ это заболевание генетического аппарата определенного типа клеток, при котором мутации в ДНК приводят к селекции клона клеток, способного к неконтролируемому росту (Киселев, 1998). Рост раковой опухоли и ее развитие, как правило, являются результатом множественных мутаций. Активация мутантных предонкогенов и инактивация генов-супрессоров рака играют ведущую роль в этом процессе.

В результате эпидемиологических исследований Кнадсон (Knudson, 1971) предположил, что возникновение и передача по наследству ретинобластомы связаны с дефектом - мутацией или потерей одного из аллелей гена этого заболевания. Наследуемая мутация вызывает предрасположенность к образованию опухоли, которая возникает в результате последующей делеции или инактивации другого аллеля. В спорадических случаях требуется два соматических события в клетке, инактивируюгцих последовательно оба аллеля. Потеря маркерами гетерозиготности в ДНК опухоли, рассматривалась, как указание на делеции в данном месте на одном из гомологов хромосомы 13. Ген ретинобластомы (RBI, 13q 14) - первый ген-супрессор, найденный на основании анализа делегируемых областей методами цитогенетики с применением маркеров ДНК (Yunis and Ramsey, 1978, Turleau et al., 1985). Эпидемиологические исследования, а также применение цитогенетических методов и анализа ДНК по Кавени (Cavenee et al., 1985) позволили локализовать ген ретинобластомы до того момента, как его удалось клонировать (Fiiend et al., 1985). Таким образом, на примере ретинобластомы, разработана стратегия идентификации супрессоров опухолевого роста.

Гемы-супрессоры, потеря которых является обязательным событием

для роста данного типа опухоли, могут играть определенную роль и в

развитии других типов опухолей. Так, ген RB1 показывает повсеместную

экспрессию во множестве тканей и делеции или мутации в различных

типах опухолей. Вторичные мутации гена RB1 наблюдаются при

остеоеаркоме и саркоме мягких тканей (Weichselbaum et al., 1988), а также

-8-

при лейкозе, лимфоме и мелко клеточном раке легкого (Horowitz et al., 1990). Однако инициирующая роль гена RB1 доказана только для возникновения ретинобластомы.

Гены-супрессоры опухолевого роста разделяются на две большие группы по их месту в системе функционирования эукариотической клетки. Биологическая функция генов-супрессоров может быть связана непосредственно с контролем клеточного цикла, сверки его механизмов, устранением апоптоза. Гены этого типа называются "привратниками" («genes-gatekeepers», Kinzler and Vogelsteln, 1997). Второй тип генов-супрессоров-это гены, которые поддерживают стабильность генома: их потеря или повреждение приводят к повышению нестабильности генома, увеличению скорости возникновения мутаций, а следовательно, и к повышению вероятности повреждения генов, в том числе и "генов-привратников". Гены этого типа называются "смотрителями" («genes-caretakers», Kinzler and Vogelsteln, 1997).

К группе "генов-привратников" относятся такие хорошо известные гены, как RBI, WT1 (опухоль Вильмса), NF1 (нейрофиброматоз типа 1), р53 (апоптоз), а также гены, способствующие образованию клеточных контактов (АРС, NF2, ММАС1, PTEN). Наиболее широкоизвестный ген-супрессор рака, относящийся к группе "генов-привратников"-это полифункциональный ген р53. Мутации и делеции этого гена наблюдали примерно в 50% всех злокачественных заболеваний. Основная функция р53, непосредственно связанная с канцерогенезом, - это выявление различных нарушений в ДНК и активация определенных генов для их ликвидации, что осуществляется с помощью апоптоза - программируемой гибели клеток с поврежденным геномом (Lowe et al., 1993; Lutzker and Levine, 1996). Во многих опухолевых клетках эта функция гена р53 нарушена и, как следствие, программа регулируемой гибели клеток переключается на программу фактически неограниченного долгожительства, характерного для опухолевых клеток

Классическими примерами "генов-смотрителей" являются гены, мутации в которых вызывают неполипозный рак толстой кишки (HNPCC), - MLH1 (3р21-р23) и MSH2 (2р15-р16). Гены - BRCA1 и BRCA2 вызывают наследуемый рак молочной железы и яичников и, по-видимому, также

относятся к группе "генов-смотрителей". Они отвечают за процессы репарации, и нарушение каждого из них вызывает резкое увеличение количества мутаций и, как следствие, увеличение опухолевого роста и степени злокачественности.

Следует отметить, что на коротком плече хромосомы Зр к настоящему времени открыты гены-супрессоры, относящиеся к обоим классам: УНЬ («ген-привратник», локализованный в районе Зр25) и МЬН1 («ген-смотритель», локализованный в районе 3р21-р23). Их функции описаны в главе 1.5.

Кроме генов, контролирующих пролиферацию клеток, таких как онкогены и гены-супрессоры, не менее важную роль в канцерогенезе играют и гены, осуществляющие стабилизацию молекулы ДНК, контролирующие ее размеры и правильность первичной и вторичной структуры. Это прежде всего гены, кодирующие комплекс теломеразы (т.е. РНК-затравку и белковые компоненты) - фермента, играющего ключевую роль при переключении клеток от программируемой гибели (апоптоза) к длительному персистированию, а затем и неконтролируемому росту. Эта группа генов контролирует ранние процессы, способствующие превращению нормальной клетки в иммортальную, но активность этих генов, по-видимому, необходима и для поддержания трансформированного фенотипа опухолевых клеток.

1.2. Подходы при локализации районов, содержащих

гены-супрессоры рака

В последнее время число выявленных генов-супрессоров существенно возросло. Это прежде всего связано с разработкой новых стратегии при поиске генов-супрессоров. Конкретный ген из данной области рассматривается как ген-супрессор рака на основании следующих

критериев;

1) Локализация в области делегируемого района;

2) Заметно уменьшенная экспрессия или синтез ненормального

транскрипта;

3) Подавление роста опухоли при переносе в раковые клетки.

Первый этап в поиске генов-супрессоров - картирование делеций и участков амплификации ДНК в раковых клетках, осуществляется с применением двух подходов: цитогенетического и с помощью анализа ДНК с использованием полиморфных маркеров, или аллелотипирования. Во втором случае наблюдают или (а) потерю гетерозиготности (loss of heterozygosity, LOH), которую рассматривают как делецию одного из аллелей, или (б) изменение длины одного или обоих аллелей, связанное с изменением числа повторов в микросателлите и получившее название -нестабильность микросателлитов (microsatellite instability, MI).

1.2.1. Цитогенетический анализ

Опухолевые клетки содержат не только структурные, но и численные хромосомные аномалии. Они меняются от клетки к клетке даже внутри опухоли одного типа. Такие гетерогенные изменения связаны с увеличением геномной нестабильности в раковых клетках по сравнению с нормальными соматическими клетками. Для идентификации определенных клонов опухолевых линий требуется анализ большого количества клеток из одной культуры. Клональная аберрация рассматривается как первостепенное событие, связанное с инициацией опухолевого роста, если она обнаруживается в большой доле образцов или вторичных клеточных линий из того же самого типа опухоли. Напротив, кдональное превращение, найденное в малой доле опухолевых клеток, рассматривается как событие, связанное с ростом или метастазированием. Микроскопический анализ непосредственно на клетках опухолей в отличие от препаратов из клеточных линий, выращиваемых in vitro, позволяет выявлять единичные аномалии.

Кроме классического кариотипирования опухолевых клеток с помощью микроскопического анализа хромосом разработаны методы гибридизации фрагментов ДНК на хромосомах in situ с использованием флуоресцентных красителей (fluorescence in situ hybridization, FISH), метод сравнительной геномной гибридизации (comparative genome hybridization, CGH), а также метод обратной гибридизации (reverse painting), которые позволяют цитогенетически выполнять детальное

картирование хромосомных областей и выявлять хромосомные перестройки, в том числе амплификации и делеции (Kok et al., 1997).

Размер минимальной делеции, выявляемой на метафазных хромосомах, составляет 10-20 млн.п.н. Таким образом, цитогенетический анализ делений в геноме опухолевой клетки позволяет сузить размер зоны, содержащей искомый ген-супрессор, до одной тысячной доли от всего генома человека. Один млн. п.н. соответствует области хромосомы, содержащей в среднем несколько десятков генов, среди которых лишь один может представлять собой искомый ген-супрессор. Дальнейшее сужение размера исследуемой области достигается посредством анализа делеции: на частично-компактизованных хромосомах интерфазных ядер (Traslc et al., 1989), что позволяет выявить делеции размером в несколько сот т.п.н., а затем и на полностью расправленном хроматине (Parra and Windle, 1993), выявляющем делеции в десятки т.п.н. Последняя величина примерно соответствует размеру, занимаемому одним геном в хромосоме человека, благодаря чему последний метод позволяет осуществлять локализацию в исследуемом районе хромосомы индивидуальных генов и кДНК-клонов.

1.2.2. Анализ аллельных потерь

Другой путь выявления делеций - это метод, регистрирующий потерю гетерозиготности (LOH) при сравнении препаратов ДНК, выделенных из опухолевого материала и из здоровой ткани. Он основан на применении полиморфных молекулярно-генетических маркеров с известной локализацией в геноме. Аллельные потери могут возникать вследствии нескольких причин - нерасхождения хромосом с последующей редупликацией, нерасхождения хромосом без последующей редупликации и рекомбинации при мейозе. В настоящее время практически во всех опухолях человека выявлена потеря гетерозиготности на тех или инных хромосомах. Причем, аллельные потери на некоторых хромосомах характерны для многих видов опухолей, так, например, LOH на коротком плече хромосомы 17 характерна для опухолей молочной железы, яичников, легкого и других органов, в то время как LOH на некоторых

других хромосомах специфична лишь для определенного типа опухолей (Dodson et al., 1993; Ingvarsson et al., 1998).

Метод аллельных потерь по сравнению с микроскопическим анализом имеет два главных преимущества:

1) Для анализа аллельных потерь используется ДНК, которую можно выделить из замороженной и парафинированной ткани. Для цитогенетических исследований такого типа материал не пригоден, или точнее, используется только для обратной гибридизации, возможности которой весьма ограничены.

2) Анализ делеций с ДНК маркерами обладает еще большей разрешающей способностью по сравнению с микроскопическим анализом метафазных хромосом. В связи с созданием огромного количества новых высокополиморфных маркеров, применяются все более плотные панели маркеров для анализа критических областей. Следует также учесть, что локализация нужных маркеров проводится не только генетически, но и с помощью молекулярного картирования данной области.

Большую опасность при анализе аллельных потерь методом ПЦР (полимеразная цепная реакция) представляет содержание в образце опухоли стромальной ткани, и как результат неполная потеря гетерозиготности. Микроскопический гистопатологический анализ применяется, чтобы отобрать пробу с ограниченным количеством неопухолевой ткани, и чтобы приблизительно подсчитать пропорцию нормальных клеток в исходном образце. Неполная потеря гетерозиготности может быть связана также с неоднородностью клеток в опухоли (Claen et al., 1992). Если найдены аллельные потери для одних маркеров, и сохранение гетерозиготности для других маркеров на той же самой хромосоме, то предполагаемая потеря гетерозиготности считается доказанной. Для тонкого изучения аллельных потерь применяют многочисленные наборы маркеров для одной и той же хромосомы и количественный анализ интенсивности аллелей. Плотность расположения молекулярно-генетических маркеров на данном участке хромосомы определяет разрешающую способность этого метода (Weber et al., 1989).

Гораздо реже встречается потеря обоих аллелей полиморфного локуса, которая служит указанием на гомозиготную делецию этого локуса.

В последнее время гомозиготные делеции стали главной мишенью для поиска генов-супрессоров опухолевого роста. Для их обнаружения применяются также неполиморфные STS-маркеры, количественная и мультиплексная ПЦР (Gonzalez et al., 1998).

В настоящее время для поиска делеций при раке все большее распространение получает новый метод - метод анализа отличительных особенностей (RDA-representational difference analysis), позволяющий обнаруживать различия между двумя близкими последовательностями ДНК (Lisitsyn, 1995). Метод основан на выделении участков ДНК, присутствующих только в одном из образцов, и позволяет увеличивать количество уникальных последовательностей в 107 раз. Это позволяет применять его для анализа малых отличий между сходными последовательностями ДНК. Метод RDA универсален и позволяет выявлять не только нестабильность микр о сателлитов и гетерозиготные делеции, но и гомозиготные делеции.

1,2.3, Анализ нестабильности микросателлитных

последовательностей

Микросателлиты представляют собой короткие нуклеотидные последовательности (2-5 п.н.), которые образуют в геноме кластеры, содержащие по 15-30 повторов. Эти фрагменты могут быть амплифицированы в полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, комплементарных уникальным последовательностям, фланкирующим эти повторы. Два родительских аллеля, как правило, различаются по числу микросателлитных повторов, т.е. являются полиморфными. Этот феномен, а также специфичность связывания праймеров позволяют использовать эти маркеры в качестве удобного инструмента для анализа стабильности данного локуса ДНК. Оказалось, что нарушения стабильности микросателлитов, как правило, отражаются в картине распределения повторов в локусах. В отличие от картины, наблюдаемой при LOH, связанной с утратой одного из аллелей, в случае Ml выявляется другая картина - вместо стандартных двух аллелей появляется один или два дополнительных, либо размеры одного из них изменяются,

Впервые анализ MI был проведен в карциномах кишечника, где обнаруженные вариации в Ml достаточно четко коррелировали с мутациями в генах - hMSH2 и hLHMl, причем этот анализ был существенно проще, чем выявление мутаций в отдельных экзонах (Ionov et al., 1993). Затем этот подход был использован для анализа опухолей человека различного происхождения.

Нестабильность микросателлитов наиболее характерна для наследственной аденомы кишечника, карциномы эндометрия, желудка, яичников и поджелудочной железы. В опухолях этих органов Ml варьировала от 5.5% в аденомах желудка, до 30-40% в злокачественных опухолях желудка и до 67% в злокачественных опухолях поджелудочной железы. В противоположность этому в опухолях головного мозга, молочной железы, мочевого пузыря, шейки матки, легкого, предстательной железы, мягких тканей и яичек процент опухолей с Ml был существенно ниже (Huddard et al., 1995; Seruca et al., 1995). Различия в частоте выявления MI могут быть объяснены несколькими факторами -вариациями в числе проанализированных локусов, использованием в качестве маркеров микросателлитов различного типа и клеточной гетерогенностью опухолевой популяции.

Есть наблюдения, что в опухолях различной локализации Ml связана с локусами различного типа. Так, в некоторых работах (Eiriksdottir et al., 1995; Dillon et al., 1997) в опухолях молочной железы и яичка Ml обнаружена в основном на три- и тетрануклеотидных локусах, и, в отличие от злокачественных опухолей кишечника, мутации в динуклеотидных повторах найдены существенно реже.

Геномная нестабильность в микросателлитных последовательностях может проявляться уже на ранних стадиях канцерогенеза: она характерна для доброкачественной опухоли и дисплазии толстого кишечника и желудка, метаплазии пищевода Барретта (Meltzer et al., 1994; Lothe et al., 1995) и для некоторых других новообразований. В злокачественных опухолях, судя по имеющимся данным, Ml присутствует в большем числе локусов, что позволяет думать о накоплении изменений в повторах микро сателлитов в процессе прогрессии опухолей.

Таким образом, анализ MI выявляет еще одну важную генетическую особенность опухолевых клеток - наличие нарушений в системе генов репарации ошибок спаривания нуклеотидных остатков. Очевидно, что нарушения в системе генов репарации могут способствовать накоплению мутаций в ДНК и приобретению самой клеткой мутантного фенотипа.

1.3, Тонкая локализация и идентификация генов в

клонированнных фрагментах ДНК

После того как выявлены маркеры, ограничивающие делетируемую область хромосомы, необходимо получить данную область в виде набора клонированных фрагментов ДНК, перекрывающих ее в известной последовательности (такой набор называют контигом). Для обнаружения индивидуальных генов удобно оперировать рекомбинантными клонами, размер которых соответствует размеру индивидуальных генов, что составляет в среднем 34 т.п.и. (Fields et al., 1994). Построение таких, более удобных в работе контигов производится на основе YAC-, ВАС- и РАС-клонов ( искуственные дрожжевые, бактериальные и фаговые хромосомы, соответственно ), а также космидных клонов, покрывающих область этих гетеро- и гомозиготных делений (Fisher et al., 1996). Полученные контиги используют для поиска на них генов-супрессоров рака. Наиболее широко распространенный способ поиска гена-кандидата - отбор клонов кДНК, соответствующих перестроенной области. Затем устанавливают относительное расположение этих кДНК-клонов в нормальной хромосоме, а также направление их транскрипции и размер соответствующих им мРНК (нозерн-гибридизация). Полученная таким образом информация представляет собой транскрипционную карту данного района. Чаще всего клоны кДИК выявляют прямым скринингом кДНК-клонотек различного происхождения с помощью проб, представляющих собой фрагменты геномной ДНК (рекомбинантные космиды, РАС-, ВАС- или YAC-клоны). Недостаток данного метода состоит в том, что искомый ген может быть найден только, если он экспрессируется в ткани, на основе которой изготовлена тестируемая клонотека кДНК (Баранова, 1998).

Один из эксирессионно-независимых методов для картирования генома человека и поиска генов - это создание N011 - библиотек хромосом и поиск СрО - участков.

1,3,1.1Чо£[-библиотеки для картирования генов человека, в том числе ассоциированных с развитием

опухолей

в хромосомной ДНК

BamHI Notl BamЫ BamHI Notl

'связующий клон

3amHI

BamHI Notl BamHI BamHI Notl BamHI

хромосома

— — — -jiM^iM

Notl

amHI BamHI Notl

'прыжковый клон

в векторе

Notl Notl

R D

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Пугачева, Елена Михайловна

выводы

1. Проведен анализ на содержание микросателлитов 9 мотивов 150 Notl-евязующих и прыжковых клонов хромосомы 3 человека и 22 космид из области гомозиготных делений в опухолях легкого (3р21.31). В ДНК обеих групп клонов в сравнении с общим геномом человека выявлено трехкратное снижение частоты встречаемости СА-повторов и повышение частоты встречаемости мотивов CAG, GGA, ААТ, САС, AAAG, AATG и GATG, что, по всей видимости, связано с обогащением исследованных последовательностей хромосомы 3 генами.

2. Определены нуклеэтидные последовательности субклонированных фрагментов ДНК клонов NL1-212, NLM-216, NL-026, J32-135H и космид 6, 7 и 16 (всего более 11 т.п.н.), сформированы 7 STS-маркеров, идентифицируемых ПЦР, в том числе один полиморфный (число аллелей 6, гетерозиготность 0.73). Три новых маркера относятся к области, вовлеченной в канцерогенез, а четыре других - к известным генам. Новые маркеры локализованы в центральном районе короткого плеча хромосомы 3 и применяются в делеционном картировании этого района в опухолях разных локализаций.

3. Впервые с использованием одной и той же панели полиморфных маркеров проведен сравнительный анализ короткого плеча хромосомы 3 в трех формах рака. Показано, что в злокачественных опухолях легкого наблюдаются более протяженные делеции и выше частота потери гетерозиготности по каждому из маркеров (в среднем 109/232, 47%), чем в опухолях молочной железы (40/1 52, 26%) и шейки матки (57/251, 23%), что может быть связано с участием дополнительных генетических элементов в патогенезе рака легкого.

4. Для трех форм рака определены критичные районы и области их перекрывания. Найден новый локус-кандидат для генов-супрессоров опухолевого роста в районе маркера D3S2409 (3р21.31), общий для эпителиальной неоплазии трех разных локализаций. Специфичный для патогенеза рака легкого локус локализован вблизи D3S3047, 3р24.3.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Пугачева, Елена Михайловна, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Aburatani Н., Wang Y., Shibata H., Nöda Т., Schwartz d., and Housman d.E.

(1994) Am. J. Hum. Genet., 55, A51. Allikmets R.L., Kashuba v.l., Pettersson В., Gizatullin R., Lebedeva Т., Kholodnyuk I.D., Bannikov v.m., Petrov N., Zalcharyev V.M., Winberg G., Modi w., Dean M., Uhlem M., Kisselev L.L., Klein G., and Zabarovslcy E.R. (1994) Genomics, 19, 303-309. -Allikmets R.L., Kashuba v.l., Huebner K., LaForgia S., Kisselev L.L., Klein G., Dean M. and Zabarovsky E.R (1996) Chromosome Research, 4, 33-37. Ali I.U., Lidereau R., and Callahan R. (1989) Natl. Cancer Inst., 81, 18151820.

Armour J.A.L., Neumann R., Gobert S., Jeffreys A.J. (1994) Hum. Mol. Gen.,

3, 599-605.

Баранова a.B., Янковский h.k. (1998) Молек. биол., 32(2), 206-218. Barners L.D., Garrison P.N., Siprashvili Z. (1996) Biochemistry, 35, 1152911535.

Bello M.J,, and Rey J.A. (1990) Int. J. Cancer, 45,50-54. Bird a. (1986) Nature, 321, 209-213. Bird a. (1992) Cell, 70, 5-8.

Bieche I., Libereau R. (1995) Genes, Chromosomes and Cancer, 14, 227-251. Bieche I., de Murcia G., Lidereau R. (1996) Clin. Cancer Res., 2(7), 11631167.

Брага Э.а., Капанадзе б.и., Куприянова H.C., Иванова г.М., Бродянский В.М., Нечволодов К.К., Шкутов Г.А., Рысков А.П., Носиков В.В., Янковский Н.К. (1995) Молек. биол., 29, 1001-1010. Braga Е.А., Chistyalcov D.A., Ivanova G.M., Nosikov V.V., Kapanadze B.I., Aitova s.S., Kosilova A.V., Sulimova G.E., Yanlcovsky N.K., Yurov Yu.B., Krasilnikov A.S., Turetskaya R.L., Bannikov V.M., Kost-Alimova M.V., Zelenin A.V. (1996) Cytogenet. Cell Genet., 75, 105. Brauch H,, Johnson В., Hovis J., Yano Т., Gazdar A., Pettengill O.S., Graziano S., Sorenson G.D., Poiesz B.J., Minna J., Linehan M. and Zbar B. (1987) N. Eng, J. Med., 317, 1109-1113.

Brentnall T.A., Chen R., Lee J.G., Kimmey M.B., Bronner M.P., Haggit R.C., Kowdley K.V., Heclcer L.M., Byrd D.R. (1995) Cancer Research, 55, 42644267. '

Bronner C.E., Baker S.M., Morrison P.T. (1994) Nature, 368, 258-261.

Budowle B., Chakraborty R., Giusti A.M., Eisenberg A.J., Allen R.C. (1991). Am. J. Genet. 48, 137-144.

Buchhagen D.L., L.Qin and P.Etkmd (1994) Cancer, 57, 473-479.

Buttitta E, Marchetti A., Radi O., Bertacca G., Pellegrini S., Gadducci A., Genazzani A.R., Bevilacqua G. (1998) Br J Cancer, 77(7), 1048-1051.

Buys C.H.C., van der Veen A.Y. and de Leij L. (1984) Chromosomes Today, 8, 301.

Cavenee W.K., Hansen M.F., Nordenslcjold M., Koclc E., Maumenee I., Squire J.A,, Philips R.A. and Gallie B.L. (1985)Science, 228, 501-503.

Calabro V,, Pengue G., Bartoli PC., Pagliuca A., Featherstone T. and Lania L. (1995) Hum. Genet., 95,18-21.

Carritt B., Kok K., van der Berg A., Osinga J., Pilz A., Hofstra R., Davis M.B., van der Veen A.Y., Rabbitts PH., Gulati K. and Buys C.H.C.M. (1992) Cancer Res., 52, 1536-1541.

Chen L.-C,. Kurisu W., Ljung B.-M., Goldman E.S., Moor II, Smith H.S. (1992) Natl. Cancer Inst. 84, 506-510.

Chen L.-C,,Matsumura K., Deng G., Kurisu W., Ljung B.-M., Lerman M.I., Waldman F.M., Smith H.S. (1994) Cancer Res., 54, 3021-3024.

Chen X., Stroun M., Magnenat J.-L,, Nicod L.P., Kurt A.-M., Lyautey

J., Lederrey Ch., Anker Ph. (1996) Nature Medicine, 2, 1033-1035.

Chong S.S., McCall A.E., Cota J., Subramony S.H., Orr H.T., Hughes M.R., Zoghbi H.Y. (1995) Natare Genet., 10, 344-350.

Chung G.T.Y., Huang D.P., Lo K.W., Chan M.K.M., and Wong F.W.S. (1992) Anticancer Res., 12, 1485-1490.

Chung G.T.Y., Sundaresan V., Hasleton P., Rudd R., Taylor R., Rabbits P.H. (1995) Oncogene, 11, 2591-2598.

Clifford S.C., Prowse A.H., AffaraN.A., Buys C.H., Maher E.R. (1998) Genes Chromosomes Cancer, 22(3), 200-209. ..

Collins F,, Drumm M., Cole J., Lockwood W., Vande Woude G., LannuzziM. (1987) Science, 235, 1046-1049.

Dalbagni G., Presti J., Reuter V., Fair W.R., and Cordon-Carbo C. (1993) Lancet, 342, 469-471.

Daly M.C., Xiang R.H., Buchhagen D., Hensel C.H., Garcia D.K., Killary A.M., Minna J.D., Naylor S.L. (1993) Oncogene, 8, 1721-1729.

De Fusco p.a., Frytak S., Dahl R.J., Weiland L.H., Unni K.K. and Dewald G.W. (1989) Mayo Clin. Proc., 64, 168-176.

Devilee P., van den Broek M., Kuipers - Dijlcshoorn N., Kolluri R., Meera Khan., Pearson P.L., and Cornelisse C.J. (1989) Genomics, 5, 554-560.

Dietrich C,U,, Pandis N., Teixeira M.R., Bardi G., Gerdes A.M., Andersen J.A., and Heim S. (1995a) Int. J. Cancer, 60, 49-53.

Dietrich C.U., Pandis N., Bardi G., Hagerstrand I., Andersen J.A., Mitelman F., Heim S. (1995b) Int. J. Oncology, 6, 559-561.

Dillon E.K., W.B. de Boer., Paradimitriou J.M., and Turbett G.R. (1997)Br. J. Cancer, 76(2), 156-162.

Dodson M.K., Hartman L.C., Cliby W.A., DeLacey K.A., Keeney G.L., Ritland S.R„ Su J.Q., Podratz K.C, and Jenkins R.B. (1993) Cancer Res., 53, 44504460.

Домнинский Д.А.,Прокунина Л.В., Козырев С.В., Банников В.М., Баев A.A., Полтараус А.Б., Захарьев В.М., Забаровский Е.Р., Киселев JI.J1. (1996) Молекулярная биология, Т.30,Вып. 1,84-92.

Drabkin H.A., Mendez M.J., Rabbitts Р.Н., Varlcony Т., Bergh J., Schlessinger J., Erickson P. and Gemmill R.M. (1992) Genes Chromosom. Cancer, 5, 6774.

Eiriksdottir G., Bergthorsson J.Т., Sigurdsson H., Gudmundsson J., Skirnisdottir S., Egilsson V., Barkardottir R.B., and Ingvarsson S. (1995) Int. J. Oncol., 6, 369-375.

Erlandsson R., Boldog F., Persson В., Zabarovsky E.R., Allikmets R.L., Sumegi J., Klein G. and Jornvall H. (1991) Oncogene, 6, 1293-1295.

Falor W.H., Ward-Skinner R. and Wegryn S. (1985) Cancer Genet. Cytogenet., 16, 175-177.

Fedorova l,, Kost-Alimova m., Gizatullin R.G., Alimov A., Zabarovslca V., Szeles a., Protopopov A.I., VorobiovaN.V., Kashuba V.l., Klein G., Zelenin A.V„ Sheer D., Zabarovsky E.R. (1997) Eur. J Hum. Genet., 5, 110-116.

Foster K., Crossey P.A., Cairns P., Hetherington J.W., Richards F.M., Jones M.H., Bentley E., Affara N.A., Fergusson-Smith M.A., Mathger E.R. (1994) Br.J.Cancer, 69, 230-234. Fields S., Adams M.D., White O., Venter J.C. (1994) Nature Genet., 7, 345346.

Fishel R., Ewel S., Lee M.K., Lescoc M.K., Griffith J. (1994) Science, 266, 1403-1408.

Fisher S.G., Cayanis E., Bonaldo M.D. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA,

93, 690-694.

Fouret P.J., Dabit D., Mergui J.L., Uzan S. (1998) Pathobiology, 66(6), 306310.

Friend S.H., Bernards R., Rogelj S., Weinberg R.A., Rapaport J.M., Albert

D.M. and Dryja T.P. (1986) Nature (London), 323, 643-646. Fujii S., Takeshima Y., Arihiro K., Kaneko M., Inai K. (1998) Hiroshima J.

Med. Sei., 47(3),89-97. Fujimori M, Tolcino T., Hino O., Kitagawa T., Imamura T., Olcamoto E.,

Mitsunobu M., and Nakamura Y. (1991) Cancer Res., 51, 89-93. Gastier J.M., Pulido J.C., Sunden S., Brody T., Buetow K.H., Murray J.C., Weber J.L., Hudson T.J., Sheffield Y.Q., Duyk G.M.(1995) Hum. Mol. Genet., 4, 1829-1836. Gastier J.M,, Brody T., Pulido J.C., Businga T., Sunden S., Hu X., Maitra S., Buetow K.H., Mun-ay J.C., Sheffield V.C., Boguski M., Duyk G.M., Hudson T.J. (1996) Genomics, 32, 75-85. Gazdar A.F., Bader S., Hung J., Kishimoto Y., Sekido Y., Sugio K., Virmani A., Fleming J., Carbone D.P. and Minna J.D. (1994) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 59, 565-572. Geil L„ Chen L.-C., Waldman F.M, Smith H.S. and Lerman M.I. (1994) Am.

J. Hum.Genet., 55, A56. Grimberg J., Nawoschilc S., Belluscio L., McKee R., Turclc A. and Eisenberg

A. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 8390. Gizatullin R.Z., Protopopov A.I., Zabarovska V., Zalcharyev V.M., Kashuba V.l., Klein G., Zabarovsky E.R. (1996) Cytogenet. Cell Genet., 74, 291292.

Glover a.J., Coyle-Morris J.F., Brown R.S. (1998) Cancer Genet. Cytogenet., 31,69-73.

Gonzalez i.l., Sylvester J.E. (1995) Genomics, 27, 320-328.

Guo Z, Wllander E, Sallstrom J, Ponten J (1998) Anticancer Res.,18(2A):707-12.

Hibi K., Takahashi Т., Yamakawa K, Ueda R., Selcido Y., Ariyoshi Y., Suyama M., Takagi H. and Nakamura Y. (1992) Oncogene, 7, 445-449.

Hoovere J.M.N., Mannens M., John R., Blielc J., van Heyningen V., Porteous DJ., Leschot N.J., Westerveld a. and Little P.F.R. (1992) Genomics, 12, 254-263,

Horowitz M., Parle S.H., Bogenmann E., Cheng J.C., Yandell D.W., Kaye F.J., Dryja T.P. and Weinberg R.A. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87, 27752779.

Huddard r,„ Wooster R., Horwich a. (1995) Brit. J. Cancer, 72, 642-645.

Hung J., Kishimoto Y., Sugio K., Virmani A., Mclntire D.D., Minna J.D. and Gazdar A.F. (1995) J.A.M.A.6 273, 558-563.

Hulsken J., Birchmeier W. and Behrens J. (1994) J. Cell Biol., 127, 2061-2069.

Ingvarsson S., Geirsdottir E.K., Johannesdottir G., Sigbjornsdottir B.I., Eiriksdottir G., Ragnarsson G., Agnarsson B.A., Gudmundsson J., Jonasson J.G., Sigurdsson A., Egilsson V., Barkardottir R.B. (1998) Cancer Res 1, 58(19), 4421-4425.

Ionov Y., Peinado M., Malkhosyan S. (1993) Nature, 363, 558-561.

Irving R.M., Moffat D.A., Hardy D.G., Barton D.E., Xuereb J.H., and Maher E.R. (1993) Arch. Otolar. Head Neck Surg., 119, 1222-1228.

Ichikawa H., Hosoda F., Arai Y., Shimizu K., Ohira M., Ohlei M.(1993) Nature Genetics, 4, 361-366.

Ishward C,S., Ferrell R.E., Rossie K.M., Appel B.N., Johnson J.T., Myers E.N., Law J.C., Srivastava S., and Gollin S.M. (1996) Int. J. Cancer, 69, 1-4.

Ito I., M.Yoshimoto, T.Iwase, S.Watanabe, T.Katagiri, Y.Harada, F.Kasumi, S.Yasuda, t.Mitomi, M.Emi, Y.Nakamura (1995) Cancer, 438-441.

Иванова Г.М., Чистяков Д.А., Федорова JI.И., Захарьев В.М., Котова Е.Ю., Банников В.М., Красилыгаков A.C., Турецкая P.JL, Ратманова К.И., Вейко В.П., Зеленин A.B., Янковский Н.К., Брага Э.А. (1997) Молек. биол., 31, 407-416.

Johnson В,В., Salcaguchi A.Y., Gazdar A.F., Minna J.D., Burhc D., Angus

M. and Naylor S.L. (1989) J. Clin. Invest., 82, 502-507. Jones W.A,, Scaloni A., Bossa F., Popowicz A.M., Schneewind О. and Manning

J.M. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88, 2194-2198. Jones M.H., and Nakainura Y. (1992) Oncogene, 7, 1631-1634. Jones M.H., Koi S., Fujimoto I., Hasumi K., Kato K., and Nakamura Y. (1994)

Genes Chromosom. Cancer, 9, 119-123. Kaplan R.} Morse В., Huebner К., Croce C., Howk R., Ravera M., Ricca G., Jaye M. and Schlessinger J. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87, 70007004.

Karran P. (1995) Science, 268,. 1857-1858.

Karisen F,, Rabbitts P.H., Sundresan V., and Hagmar B. (1994) Int. J. Cancer,

58, 787-792. Karran P. (1995) Science, 266, 1403-1408.

Kashuba V.l., Szeles A., Allikmets R.L., Nilsson A.S., Bergerheim S.R., Modi W., Graodatsky A., Dea1: M., Stan bridge E.J., Gosta Winberg, Klein G., and Zabarovsky E.R. (1995) Cancer Genet Cytogenet Kastury К, - Ohta M., Lasota J., Moir D., Dorman Т., LaForgia S., Druck Т.,

and Huebner К. (1996) Genomics, 225-235. Kersemaekers A.M.F., Hermans J., Fleuren G.J., M.J. van de Vijver (1998)

Br. I Cancer, 77(2), 192-200. Killary A.M., Wolf M.E., Giambernardi T.A. and Naylor S.L. (1992) Proc.

Natl. Acad, Sei., 89, 10877-10881. Киселев Ф.Л. (1998) Молек. биол., 32(2), 197-205. Knudson A.G. (1971) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 68, 820-823. Kohno Т., Takayama H., Hamaguchi M., Talcano H., Yamaguchi N., Tsuda H., Hirohashi S., Vissing H., Shimizu M., Oshimura M. and Yokota Y. (1993) Oncogene, 8, 1825-1832. Kohno Т., Otsuka Т., Inazawa J., Abe Т., and Yokota Y. (1996) DNA Research, 3, 421-424.

Kok K,, van den Berg A. and Buys C.H.C.M. (1989) Cancer Genet. Cytogenet., 38, 201,

Kok K, Naylor SL, Buys CH. (1997) Adv. Cancer Res.,71, 27-92

Koltsova g.T., Kirillov A.V., Bannikov V.M., Belyavsky A.V., Sablina O.V., Vorobieva N.V., Grafodatslcy A.S., Zakharyev V.M. (1994) 2-nd International Chromosome 13 Workshop, Groningen,. 13. Kovatich A., Friedland D.M., Druck T., Hadaczelc P., Huebner K., Comis R.L.,

Hauck W., McCue P.A. (1998) Cancer, 83(6), 1109-1117. Kraus C., Liehr T., Behrens J., Hulsken J., Birchmeier W., Grzeschik K.H.

and Ballhausen W.G. (1994) Genomics, 23, 272-274. La Forgia S., Morse B., Levy J., Bamea G., Cannizzaro L.A., Li F., Nowell P.C., Boghosian-Sell L., Glick J., Weston A., Harris C.C., Drablcin H., Petterson D., Croce C.M., Sclilessinger J. and Huebner K. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88, 5036-5040. Larsen F., Gundersen G., Lopez R., Prydz H. (1992) Genomics, 13, 1095-1107. Larson A.A., Kern S., Curtiss S., Cordon R., Cavenee W.K. and Hampton G.M.

(1997a) Cancer Res., 57, 4082-4090. Larson A.A., Liao S.-Y., Stanbridge E.J., Cavenee W.K. and Hampton G.M.

(1997b) Cancer Res., 57, 4171-4176. Latif., Tory K., Modi W.S., Graziano S.L., Gamble G., Douglas J., Heppell Parton A.C., Rabbitts P.H., Zbar B. and Lerman M.I. (1992) Genes Chromosom. Cancer, 5, 119-127. Latil A., Baron J.-C., Cussenot O., Fournier G., Soussi T., Boccon-Gibod L., Le Due A., and Lidereau R. (1994) Genes Chromosom. Cancer, 11, 119125.

Leong P.P., Rezai B., Koch W.M., Reed A., Eisele D., Lee D.J., Sidranslcy D.,

Jen J., Westra W.H J. (1998) Natl. Cancer Inst., 90(13), 972-977. Lisitsyn N.A., Lisitsina N.M., Calbagni G., Barker P., Sanchez C.A., Gnarra J., Lineban W.M., Reid B.J., and Wigler M.H. (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92, 151-155.

Lo K.W., Tsao S.-W., Leung S.-F., Choi P.N.K., Lee J.C.K., and Huang D.P.

(994) Intern. J. Oncol., 4, 1359-1364. Lothe R., Meling G., Nystrom-Lath M. (1995) Genes Chromosom. Cancer., 14, 182-188.

Lounis H., Mes-Masson A.M., Dion F., Bradey W.E., Seymour R.J., Provencher

D., Tonin P.N. (1998) Oncogene, 17, 2359-65. Lowe S., Schmiti E,. Smith S.(1993) Nature, 362, 847-849 .

Lubinslci J., Hadaczek P., Podolski J., Tolczlco A., Sikorski A., McCue P., Druck

T., Huebner K. (1994) Cancer Res., 54, 3710-3713. Lukeis R., Irving L., Garson M and Hasthorpe S. (1990) Genes Chrom. Cancer,

2, 116-124.

Lundin C., Mertens F. (1998) Breast Cancer Res Treat, 51(1), 1-15.

Lutzker S,, Levine A.(1996) Nature Medicine, 2, 804-810.

Maestro R., Gasparotto D., Vukosavljevic T., Barzan L., Boiocchi M. (1993)

Cancer Res., 53, 5775-5779. Mäher E.R., Yates J.R., Harries R., Benjamin C., Harris R., Moore A.T.,

Fergusson-Smith M.A. (1990) Q.J.Med., 77, 1151-1163. Matsumoto S., F.Kasumi, G.Sskamoto, M.Onda, Y.Nalcamura, M.Emi (1997)

Genes, Chromosomes and Cancer, 20, 268-274. Matturri L., and Lavezzi A.M. (1994). Eur. J. Histochem., 38, 53-58. Meitzer S., Richardson S., Chen N. (1994) Cancer Res., 54, 3379-3382. Miller Y.E., Minna J.D. and Gazdar A. (1989) J. Clin. Invest., 83, 2120-2124 Miller Y.E., Drabkin H., Jones C. and Fisher J.H. (1990) Genomics, 8, 149154,

Mitsudomi T, Oyama T, Nishida K, Ogami A, Osalci T, Sugio K, Yasumoto K,

Sugimachi K, Gazdar AF. (1996) Clin. Cancer. Res., 2(7), 1185-1189. Miura I., Siegfried J.M., Resau J., Keller S.M., ZhouJ.-Y. and Testa J.R. (1990)

Genes Chrom. Cancer, 2, 328-338. Mori N., Yolcota J., Oshimura M., Cavenee W.K., Mizoguchi H., Noguchi M., Shimosato Y., Sugimura T. and Terada M. (1989) Cancer Res., 49, 51305135.

Muller C.Y., Boyle D.O., Fong K.M., Wistuba I.I., Biesterveid E., Ahmadin M., Miller D.S., Cazdar A.F., Minna J.D. (1998) J. of National Cancer Institut, 90 (6), 433-439. Murata Y., Tamari M., Takahashi T., Horio Y., Hibi K., Yokoyama S., Inazawa J., Takahashi T., Yamakawa A. and Nakamura Y. (1994) Human Mol. Genet.,

3, 1341-1344.

Mitra A.B., Murty V.S., Li R.G., Pratap M., LuthraU.K., and Chaganti R.S.K.

(1994) Cancer Res., 54, 4481-4487. Nawroz H,, van der Riet P., Hruban R.H., Koch W., Ruppert J.M. and Sidransky

D. (1994) Cancer Res. 54, 1152-1155.

Naylor S.L., Marshall A., Hensel C., Martinez P.F., Holley B. and Salcaguchy

A.Y, (1989) Genomics, 4, 355-361.

Ogasawara S., Maesawa C., Tamura G., and Satodate R. (1995) Cancer Res., 55, 891-894.

Ohta M., Inoue H., Cotticelli M.G., et al. (1996) Cell, 84,587-597. Pandis N.j Bardi G., Mitelman F., and Heim S. (1997) Genes, Chromosomes

and Cancer, 18, 241-245. Pandis N,, Jin J., Gorunova L., Petersson C., Bardi G., Idvall I., Johansson

B., Ingvar G., Mandahl N., Mitelman F., and Heim S. (1995a) Genes, Chromosomes and Cancer, 12, 173-185.

Pandis N., Teixeira M.R., Gerdes A - M., Limon J., Bardi G., Andersen J. A., Idvall L, Mandahl N., Mitelman F., and Heim S. (1995b) Cancer, 76, 250258.

Pandis N., Jin J., Limon J., Bardi G., Idvall I., Mandahl N., Mitelman F., and

Heim S. (1993) Genes, Chromosomes and Cancer, 6, 151-155. Parra L, and Windle B. (1993) Nature Genet., 5, 17-21. Partridge M,, Emilion G., and Langdon J.D. (1996) Br. J. Cancer, 73, 366371.

Paulson T.G., Wright F.A., Parker B.A., Russack V., Wahl G.M. (1996) Cancer

Research, 56, 4021-4026. Pejovie t,, Heim S., Mandahl N., Baldetorp B., Elmforst B., Floderus U.-M., Furgyik S., Helm G., Himmelman A., Willen H., and Mitelman F. (1992) Genes Chromosom. Cancer, 4, 58-68. Petersen I., Bujard M., Petersen S., Wolf G., Goeze A., Schwendet A., Langreclc H., Geliert K., Reichel M., Just K., du Manoir S., Cremer T., Ried T. and Dietel M. (1997) Cancer Res., 57, 2331-2335. Petersson C., Pandis n., Mertens F., Adeyinka A., Ingvar C., Ringberg A., Idvall I,, Bondeson I., Borg A., Olsson H., Kristoffersson U., Mitelman F. (1996) G.enes, Chromosomes and Cancer, 16, 185-188. Petersson C., Pandis n.. Rizou H., Mertens F., Dietrich C.U., Adeyinka A., Idvall L, Bondeson I., Georgiou G., Heim S., Mitelman F. (1997) Int. J. Cancer, 70, 282-286. Poston C.D., Jaffe G.S., Lubensky I.A., Solomon D., Zbar B., Linehan W.M., and Walther M.M. (1995) J. Urol., 153, 22-26.

Prayer Galetti T., D'Arngo L., De Zorzi L., Patarnello T. (1997) Arch. Ital.

Urol. Androl., 69(4), 241-246. Presti J.C.Jr., Reuter V., Cordon-Carbo C., Mazumdar M., Fair W.R., and

Jhanwar S.C. (1993) Cancer Res., 53, 5780-5783. Rabbitts P,5 Bergh J., Douglas J., Collins F. and Waters J. (1990) Genes Chrom.

Cancer, 2, 231-238. Rader J.S., Gerhard D.S., 0'Sullivan M.J., Li Y., Li L., Liapis H., Huettner

P.C. (1998) Genes Chromosomes Cancer, 22(l):57-65. Rader J.S,, Kamarasova T., Huettner P.C., Li L., LiY., Cerhard D.S. (1996)

Oncogene, 13, 2737-2741. SajantilaA., Budowle B., Strom M., Jöhnsson V., Lukka M., Peltonen L.,

Ehnholm C. (1992) Am. J. Hum. Genet., 50, 816-825. Sandros J., Stenman G., and Mark j. (1990) Cancer Genet. Cytogenet., 44, 153-167.

Sanford J., Kim B., Deaven L., Jones C., Higgins M., Nowak N., Shows T.

(1993) Genomics, 15, 653-658. Sanson M,, Zhang F., Demczuk S., Delattre O., DeJong P., Aurias A., Thomas

G., Rouleau G. (1993) Genomics, 17, 776-779. Sato T,, F.Akiyama, G.Sakamoto, F.Kasumi, Y.Nakamura (1991) Cancer Res. 51, 5794-5799.

Selcido Y., Ahmadian M., Wis tub a I.I., Latif F., Bader S., Wei M.H., Duh F.M., Gazdar A.F., Lerman ML, Minna J.D. (1998) Oncogene, 16(24),3151-3157. Seruca R., Dos Santos N., Seixas M (1995) Int.J.Cancer, 64, 32-36. Sharan S.K., Morimatsu M., Albrecht U. (1997) Nature, 386, 804-810. Sheffield V.C., Weber J.L., Buetow K.H., Murray J.C., Even D.A., Wiles K., Gastier J.M., Pulido J.C., Yandava C., Sunden S.L., Mattes G., Businga T., McClain A., Beck J., Scherpier T., Gilliam J., Zhong J., Duyk .M. (1995) Hum. Mol. Genet.,4, 1837-1843. Shiseki M., Kohno T., Adachi J., Okazaki T., Mizoguchi H., Noguchi M.,

Hirohashi S. and Yokota J. (1996) Genes Chrom. Cancer, 17, 71-77. Schneider G., Pulitzer D.R., Brown R.D., Prihoda T.J., Bostwiclc D.G., Saldivar V., Gutierrez-Diaz M.E., and O'Connell P. (1995) Genes Chromosom.Cancer, 13, 263-271.

Shibagaki i., Shimada y., Wagata t., Ilcenaga M., Imamura M., and Ishizalci K. (1994) Cancer Res., 54, 2996-3000.

Shridliar V., Wang L., Rosati R., Paradee W., Shridhar R., Mulline C., Sarlc W., Grignon D., Miller O.J., Sun Q.C, Petros J. and Smith D.I. (1997) Oncogene, 14, 1269-1277.

Sithanandam G., Latif F., Duh F.-M., Bernal R., Smola U., Li H., Kuzmin I., Wixler V., Geil L„ Shrestha S., Lloyd P.A., Bader S., Sekido Y., Tartof K.D., Kashuba V.l., Zabarovsky E.R., Dean M., Klein G., Lerman M.I., Minna J.D., Rapp U.R., Allikmets R. (1996) Molec. Cell. Biology, 16,. 868-876.

Sozzi G., Miozzo M., Pastorino U., Pilotti S., Donghi R., Giarola M., De Gregorio L., Manenti G., Radice P., Minoletti F., Delia Porta G. and Pierotti M.A. (1995) Cancer Res., 55, 135-140.

Stallings R.L., Ford A.F., Nelson D., Torney D.C., Hildebrand C.E., Moyzis R.K. (1991) Genomics, 10, 807-815.

Stallings R.L.(1994) Genomics, 21, 116-121.

Su TH, Wang JC, Tseng HH, Chang CP, Chang TA, Wei HJ, Chang JG (1998) Int j Cancer, 13;76(2):21.6-22.

Sutherland G.R. (1991) Genet. Anal. Tech. Appl, 8, 1616-1666.

Talcahashi T., Nau M., Chiba I., Birrer M.J., Rosenberg R.K., Vinocour M., Levitt M., Pass H., Gazdar A.F., Minna J.D. (1989) Science, 246, 491-494.

Takayama T., Shiozaki H., Shibamoto S., Oka H., Kimura Y., Tamura S., Inoue M., Monden T., I to F. and Monden M. (1996) Am. J. Pathol., 148, 39-46.

Talcita K., T.Sato, M.Miyagi, M. Watatani, F.Akiyama, G.Sakamoto, F.Kasumi, R.Abe, Y.Nalcamura (1992) Cancer Res. 52, 3914-3917.

Tavtigian S., Simard J., Rommens G. (1996) Nature, 12, 333-337.

Testa J.R, and Siegfried J.M. (1 992) Cancer Res., 52, 2702-2706.

Testa J.R., Siegfried J.M., Liu Z.M., Hunt J.D., Feder M.M., Litwin S., Zhou J.Y., Taguchi T. and Keller S.M. (1994) Genes Chrom. Cancer, 11, 178-194.

Thiberville L., Bourguignon J., Metayer J., Bost F., Diarra-Mehrpour M., Bignon J., Lam S., Martin J.-P. and Nouvet G. (1995) Int. J. Cancer, 64, 371-377.

Todd S., Roche J., Hahner L., Bolin R., Drabkin H.A. and Gemmill R.M, (1995)

Genomics, 25, 19-28.

Todd M.C., Xiang R.H., Garcia D.K., Kerbacher K.E., Moore S.L., Hensel C.H., Lui P., Siciliano M.J., Kok K., van der Berg A., Yeldhuis P.M.J.F., Buys C.H.C.M., Killary A.M. and Naylor S.L. (1996) Oncogene 13, 23872396.

Todd S., Franklin W.A., Varella-Garcia M, Kennedy T., Hilliker C.E.J., Hahner L., Anderson M., Wiest J.S., Drabldn H.A. and Gemmill R.M. (1997) Cancer Res., 57, 1344-1352.

Trask B., Pinkel D., van den Engh G. (1989) Genomics, 5(4), 710-717.

Tsuchiya E., Nakamura Y., Weng S.-Y., Nalcagawa K., Tsuchiya S., Sugano H. and Kitagawa T. (1992) Cancer Res., 52, 2478-2481.

Turleau C., DeGrouchy J., Chavin-Colin F., Schlienger L., Leblanc A. and Hage C. (1985) Cancer Genet. Cytogenet.,16, 321-334.

Ulimann R., Schwende! A., Kiemen H., Wolf G., Petersen I., Popper H.H. (1998) Hum. Pathol., 29(10), 1145-1149.

Varella-Garcia M., Gemmill R.M., Rabenhorst S.H., Lotto A., Drabkin H.A., Archer P.A., Franklin W.A. (1998) Cancer Res., 58(20), 4701-4707.

Van den Berg A., van der Veen A.Y., Hulsbeek M.M.F., Kovacs G., Gemmill R.M., Drabkin H.A., and Buys C.H.C.M. (1995) Genes Chromosom. Cancer, 12, 224-228.

Van den Berg A., Hulsbeek M.M.F., de Jong D., Veldhuis P.M.J.F., Roche J., and Buys C.H.C.M. (1996a) Genes Chromosom. Cancer, 15, 64-72.

Van den Berg A., Kooy R.F., Hulsbeek M.M.F., de Jong D., Kok K., van der Veen A.Y. and Buys C.H.C.M. (1996b) Cytogenet. Cell Genet., 72, 225228.

Van der Iiout A.H., Van der Vlies P., Wijmenga C., Li F.P., Oosterhuis J.W., Buys C.H.C.M. (1991) Genomics, 11, 537-542.

Van der Hout A.H., Van den Berg A., Van der Vlies P., Wijmenga C., Dijkhuizen T., Oosterhuis J.W., de Jong B., Buys C.H.C.M. (1993) Int. J. Cancer, 53, 353-357.

Van Hengel J., Nollet F., Berx G., van Roy N., Speleman F. and van Roy F. (1995) Cytogenet. Cell Genet., 70, 68-70/

Virgilio L, Shuster M., Gollin S.M., et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 93, 9770-9775.

Virmani A.K., Fong K.M., Kodagoda D., Mclntire D., Hung J., Tonic V., Minna J.D., Gazdar A.F. (1998) Genes Chromosomes Cancer, 21(4), 308-319.

Waber P.G.j Lee N.K., and Nisen P.D. (1996) Oncogene, 12, 365-369.

Walther M.M., Lubensky I.A., Venzon D., Zbar B., Linehan W.M. (1995) J.Urol., 154, 2010-2015.

Warburton D., Yu M.-T., Tantravahi U., Lee C., Cayanis E., Russo J., Fisher S. (1993) Genomics, 16, 355-360.

Waters J.J., lb son J.M., Twentyman P.R., Bleehen N.H. and Rabbitts P. (1988) Cancer Genet. Cytogenet., 30, 213-223.

Weber J.M. and May P.E. (1989) Am. J. Hum. Genet., 44, 388-396.

Wei M.-H, Latif F., Bader S., Kashuba V, Chen J.-Y., Duh F.-M., Selcido Y., Lee C.-C., Geil L., Kuzmin I., Zabarovsky E., Klein G., Zbar B., Minna J.D. and Lerman M.I. (1996) Cancer Res., 56, 1487-1492.

Weichselbaum R., Beckett M., Diamond A. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85, 2106-2109

Weinberg R. (1995) Cell, 81, 323-330

Weinberg R, (1996) Cell, 85,457-459

Wiest J.S., Franklin W.A., Drabkin H., Gemmill R., Sidransky D., Anderson M.W J. (1997) Cell Biochem. Suppl., 28-29, 64-73.

Whang-Peng J., Kao-Shan C.S., Lee E.C., Bunn P.N., Carney D.N., Gazdar A.F. and Minna J.D. (1982a) Science, 215, 181-182.

Whang-Peng J., Bunn P.A., Kao-Shan C.S., Lee E.C., Carney D.N., Gazdar A. and Minna J.D. (1982b) Cancer Genet. Cytogenet., 6, 119-134.

Willems P.J. (1994) Nature Genet., 8, 213-215.

Wooster R., Bignell G., Lancaster G. (1995) Nature, 378, 788-792.

Wu C.L., Sloan P., Read A.P., Hams R.H., and Thakker N.S. (1994) Cancer Res., 54, 6484-6588.

Yang-Feng T.L., Han H., Chen K.C., Li S.B., Claus E.B., Carcangiu M.L., Chambers S.K., Chambers J.T., and Schwartz P.E. (1993) Int. J. Cancer, 54, 546-551.

Yankovsky N.K., Kapanadze B., Baranova A., Koltsova G.I., Braga E.A., Zalcharyev V.M. (1994) 2-nd International Chromosome 13 Workshop,

Groningen, 27.

Yokoto J., Tsukada Y., Nakajima Т., Gotoh M., Shimosato Y., Mori N., Tsunokawa Y., Sugimura Т., and Terada M. (1989) Cancer Res. 49, 35983601.

Yokoyama S,, Yamakawa K., Tsuchiya E., Murata M., Skaiyam S. and Nakamura Y. (1992) Cancer Res., 52, 873-877.

Yoshino K, Enomoto T, Nakamura T, Nakashima R, Wada H, Saitoh j, Noda K, Murata Y (1998) Int J Cancer, 13;76(2): 176-181.

Yunis J.J. and Ramsey N. (1978) Am. J. Dis. Child., 132, 161-163.

Zabarovsky E.R., Boldog P., Thompson Т., Scanlot D., Winberg G., Marcsek Z., Erlandsson R., Stanbridge E., Klein G.,Sumegi J. (1990) Nucleic Acids Res,, 18,6319-6324.

Zabarovsky E.R., Boldog F., Erlandsson R., Kashuba V.I., Allilcmets R.L., Marcsek Z,, Kisselev L.L., Stanbridge E., Klein G., Sumegi J., Winberg. (1991) Genomics, 11, 1030-1039.

Zabarovsky E.R., Klein G. and Gosta Winberg. (1993) Gene, 127,1-14.

Забаровский E.P., Домнинскин Д.А., Киселев Л.Л. (1994), Т.28,Вып.6,1231-1243.

Zabarovsky E.R., Allikmets R.l., Kholodnyulc I.D., Zabarovslca V., Paulsson V., Bannikov V.M., Kashuba V.I., Dean M., Kisselev L.L., Klein G. (1994) Genomics, 20, 312-316.

Zhang R., Wiley J., Howard S.P., Meisner L.F., Gould M. (1989) Cancer Res., 49, 444-449.

Zhu Y., Cantor C., Smith C. (1993) Genomics, 18, 199-205.

Zhuang Z., Bertheau P., Emmert-Buck M.R., Liotta L.A., Gnarra J., Linehan W.M. and Lubensky I.A. (1995) Am. J. Pathol., 146, 620-625.

Zou T.T., Lei J., Shi Y.Q., Wang S., Souza R.F., Kong D., Shimada Y., Smolinski K.N., Greenwald B.D., Abraham J.M., Harpaz N. and Meltzer S.J. (1997) Oncogene, 15, 101-105.